CN104293724A - 一种高效生产n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高效生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，所述基因工程菌是将大肠杆菌的染色体缺失nagDCABE基因簇并整合分别由T7启动子和Trc启动子介导的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶突变基因和N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因串联基因表达盒获得，其中，所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶突变基因是由大肠杆菌W3110菌株来源的野生型6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因突变成A38T/R249C/G471S突变体获得。本发明构建的基因工程菌具有N-乙酰氨基葡萄糖发酵产量高、菌种稳定性好的优点，具有广泛的工业应用前景。

Description

一种高效生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，是关于一种高效生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌。

背景技术

N-乙酰氨基葡萄糖(N-Acetylglucosamine，GlcNAc)，又名2-乙酰胺-2-脱氧-D-葡萄糖(2-Acetamido-2-Deoxy-D-Dlucose)，分子式：C₈H₁₅NO₆，分子量：221.0，熔点：205℃，白色结晶粉末，易溶于水，结构式如下所示：

N-乙酰氨基葡萄糖是生物细胞内许多重要多糖的基本组成单位，尤其是甲壳类动物的外骨骼含量最高。它是合成双歧因子的重要前体，在生物体内具有许多重要生理功能。它在临床上是治疗风湿性及类风湿性关节炎的药物。它也可以作为食品抗氧化剂及婴幼儿食品添加剂，糖尿病患者甜味剂。主要用于临床增强人体免疫系统的功能，抑制癌细胞或纤维细胞的过度生长，对癌症和恶性肿癌起到抑制和治疗作用；对于各种炎症，能起到有效的治疗，对骨关节炎及关节疼痛也有治疗作用。此外，它还可以用于化妆品、饲料添加剂和食品添加剂。

目前，人们从蟹壳和虾壳中提取甲壳素，再经过酸水解得到氨基葡萄糖。浓盐酸水解N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰直接生成氨基葡萄糖。乙酸酐可使氨基葡萄糖乙酸化生产N-乙酰氨基葡萄糖。研究发现丝状真菌细胞壁中含有壳聚糖(一种线型的氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖聚合物，氨基葡萄糖含量约65％)。但是真菌菌体中壳聚糖的含量低，一般低于25％干细胞重。由于柠檬酸或者其它初级产品原因，从成本上限制了利用真菌菌体生产氨基葡萄糖。

如图1所示，N-乙酰氨基葡萄糖的合成和代谢途径在大肠杆菌和其它生物体中已经研究地很清楚。谷胺酰胺作为氨基酸供体，氨基葡萄糖合酶(glmS基因编码)转化6-磷酸果糖(F-6-P)生成6-磷酸氨基葡萄糖(GlcN-6-P)。在G+阴性细菌中肽聚糖和脂多糖是细胞壁重要组成部分，6-磷酸氨基葡萄糖在磷酸葡萄糖胺突变酶(glmM基因编码)作用下转换成1-磷酸氨基葡萄糖(GlcN-1-P)，再在双功能酶作用下，即1-磷酸氨基葡萄糖-N-乙酰转移酶/1-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖尿苷酰转移酶(glmU基因编码)作用下，生成1-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc-1-P)，最后生成尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)。

氨基葡萄糖(GlcN)和N-乙酰氨基葡萄糖也可以作为替代碳源和氮源，甘露糖转运蛋白(操纵子manXYZ编码)和葡萄糖转运蛋白(ptsG基因编码)能够转运和磷酸化氨基葡萄糖。N-乙酰氨基葡萄糖则有甘露糖转运蛋白和N-乙酰氨基葡萄糖特异性转运蛋白(nagE基因编码)负责转运，6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶(nagA基因编码)转化6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc-6-P)生成6-磷酸氨基葡萄糖，在6-磷酸氨基葡萄糖脱胺酶(nagB基因编码)作用下生成6-磷酸果糖。大肠杆菌基因组中，glmS和glmU组成操纵子glmUS，而nagA,-B,-C,-D和-E组成调节子，nagC基因编码一个调节蛋白用作nag调节子的抑制物，同时也可作为glmUS操纵子的激活物和抑制物。nagD功能目前还不清楚，由于它处在nag调节子中，nagD可能与氨基糖代谢有关。

由于以葡萄糖为主要原料通过基因工程大肠杆菌发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖具有生产成本稳定，不受原材料供应限制的优点，因此采用发酵法能够低成本大量生产N-乙酰氨基葡萄糖，具有很好的市场前景。在Deng等(Deng MD,Severson DK,GrundAD,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for industrial production ofglucosamine and N-acetylglucosamine.Metabolic Engineering,2005,7:201-214)的研究中描述了选用pET-24d来源的T7lac启动子构建N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌。其中，对不同来源的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因进行了筛选，通过易错PCR随机筛选获得能高产氨基葡萄糖的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶突变基因，并在大肠杆菌K-12株染色体上敲除nagDCABE基因簇的基础上整合了T7lac启动子介导的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶突变基因glmS*54和若干个拷贝的酿酒酵母来源的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因ScGNA1，结果显示发酵72h时，大肠杆菌染色体上包含两个拷贝的ScGNA1的基因工程菌的N-乙酰氨基葡萄糖的产量达到110g/L，然而，其存在着6-磷酸氨基葡萄糖合成酶酶活不稳定，在发酵过程中呈下降趋势的缺陷。因此，有必要提供一种发酵稳定性高的N-乙酰氨基葡萄糖高产菌。

发明内容

本申请的发明人在对大肠杆菌进行基因工程改造以构建高产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌的长期研究中发现，由T7启动子调控的整合菌种始终存在发酵不稳定的现象，而改用Trc启动子后意外地克服了这个问题，当将大肠杆菌染色体缺失nagDCABE基因簇，并在fucI基因和yabp基因内分别整合由T7启动子和Trc启动子介导的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶突变基因和N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因串联基因表达盒时，按照上述方法构建的重组大肠杆菌具有N-乙酰氨基葡萄糖发酵产量高、菌种稳定性好的优点。

因此，本发明的目的在于提供一种高效生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌。

为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种高效生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，所述基因工程菌是将大肠杆菌的染色体缺失nagDCABE基因簇并整合分别由T7启动子和Trc启动子介导的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶突变基因和N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因串联基因表达盒获得，其中，所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶突变基因是由大肠杆菌W3110菌株来源的野生型6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因突变成A38T/R249C/G471S突变体获得。

根据本发明的优选实施例，所述大肠杆菌为大肠杆菌W3110(DE3)菌株。

根据本发明的优选实施例，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因来源自酿酒酵母。

根据本发明的优选实施例，所述T7启动子来源自pET-28a(+)质粒，所述Trc启动子来源自pTrc99a质粒。

根据本发明的优选实施例，所述T7启动子介导的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶突变基因和N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因串联基因表达盒整合于大肠杆菌染色体的fucI基因内。

根据本发明的优选实施例，所述Trc启动子介导的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶突变基因和N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因串联基因表达盒整合于大肠杆菌染色体的yabp基因内。

根据本发明的优选实施例，所述基因工程菌的保藏号为CCTCC NO.M 2014383。

根据本发明，上述任一项基因工程菌可用于发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖。

根据本发明的优选实施例，所述发酵的条件如下：

种子培养基：KH₂PO₄ 0.6％(w/v)，K₂HPO₄·3H₂O3.145％(w/v)，柠檬酸钠·2H₂O0.1％(w/v)，硫酸铵1％(w/v)，MgSO₄·7H₂O0.06％(w/v)，CaCl₂ 0.003％(w/v)，葡萄糖2％(w/v)，微量元素母液0.01％(v/v)；

发酵培养基：KH₂PO₄ 0.667％(w/v)，一水柠檬酸0.355％(w/v)，MgSO₄·7H₂O0.25％(w/v)，CaCl₂·H₂O0.0025％(w/v)，葡萄糖0.5％(w/v)，消泡剂0.025％(w/v)，微量元素母液0.01％(v/v)；

其中，所述微量元素母液：CoCl₂·6H₂O0.1％(w/v)，H₃BO₃ 0.1％(w/v)，FeSO₄·7H₂O5％(w/v)，MnSO₄·H₂O0.33％(w/v)，ZnSO₄·7H₂O3.8％(w/v)，NaMoO₄ 2H₂O0.1％(w/v)，CoSO₄·5H₂O0.1％(w/v)；

发酵温度37℃，搅拌速度300～800rpm，通气量1～3V/V.M。

本发明的有益效果：本申请的发明人对大肠杆菌进行基因工程改造并构建了一系列生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，在对外源基因的拷贝数、宿主菌DE3溶源化、介导外源基因表达的启动子等多种因素的优化过程中发现，由T7启动子调控的整合菌种始终存在发酵不稳定的现象，而改用Trc启动子后意外地克服了这个问题。当将大肠杆菌染色体缺失nagDCABE基因簇，并在fucI基因和yabp基因内分别整合由T7启动子和Trc启动子介导的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶突变基因和N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因串联基因表达盒时，按照上述方法构建的重组大肠杆菌发酵后N-乙酰氨基葡萄糖产量达到120g/L，菌种稳定性达到100％，具有发酵产量高、稳定性好的优点。

本发明提供了一种高产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，发酵产量高、稳定性好，具有广泛的工业应用前景。

附图说明

图1为葡萄糖合成葡萄糖胺和N-乙酰氨基葡萄糖代谢路径示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

本发明中，本申请的发明人以大肠杆菌W3110(DE3)为出发菌株，对其进行了一系列改造以构建高产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌。具体地说，包括以下方面的优化：(1)缺失了宿主菌基因组上的氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖回流的nagDCABE基因簇，以阻断产物的分解代谢途径；(2)引入了酿酒酵母来源的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因ScGNA1并强化表达，打通氨基葡萄糖到N-乙酰氨基葡萄糖的合成途径；(3)引入了能耐受氨基葡萄糖反馈抑制的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因glmS突变体并强化表达，疏通葡萄糖到最终产物的通路；(4)通过CIChE法增加基因拷贝数，强化外源基因的表达；(5)由于使菌株溶源化的DE3基因丢失会造成T7启动子调控的整合菌株在发酵中不稳定，因而在基因组上整合外源DE3基因克服以上缺陷；(6)使用不同浓度的氯霉素筛选遗传稳定的整合菌株；(7)尝试表达元件位于质粒上和整合于宿主菌染色体上的不同情形；(8)使用不同的启动子介导外源基因的表达。

本发明涉及的重组大肠杆菌Escherichia coli W112菌株命名为Escherichia coliCIBT 1.14024，并已于2014年8月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号CCTCC NO.M 2014383。

以下实施例中涉及的菌株和质粒来源如下：

大肠杆菌W3110来源自Novagen公司，大肠杆菌W3110(DE3)为使用来源自MERCK公司的λDE3 lysogenization kit制备得到，酿酒酵母来源自文献Mio T,Yamada-Okabe T,Arisawa M,et al.Saccharomyces cerevisiae GNA1,an essential geneencoding a novel acetyltransferase involved in UDP-N-acetylglucosamine synthesis.J.Biol.Chem.,1999,274(1):424-429，pET-28a(+)和pTrc99a来源自Novagen公司，pIJ773和pIJ778来源自文献Gust B,Challis GL,Fowler K,et al.PCR-targeted Streptomycesgene replacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpenesoil odor geosmin.Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(4):1541-6)，pCP20和pKD46来源自文献Datsenko KA,Wanner BL.One-step inactivatiion of chromasomal genes inEscherichia coli K-12 using PCR products.Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(12):6640-5，pyabp-cm来源自文献Tyo KE,Ajikumar PK,Stephanopoulos G.Stabilized geneduplication enables long-term selection-free heterologous pathway expression.NatureBiotechnology,2009,27:760-5。

以下实施例中涉及的培养基组分如下(除特别注明外，以下涉及的％皆为质量体积比)：

LB培养基：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％。

SOB培养基：胰蛋白胨2％，酵母提取物0.5％，NaCl 0.05％，KCl 2.5mM，MgCl₂10mM。

M9A培养基：KH₂PO₄ 1.4％，K₂HPO₄·3H₂O2.1％，柠檬酸钠·2H₂O0.1％，硫酸铵0.75％，MgSO₄·7H₂O0.025％，CaCl₂ 0.002％，葡萄糖2％，微量元素母液0.01％(v/v)。

M9B培养基：KH₂PO₄ 0.6％，K₂HPO₄·3H₂O3.145％，柠檬酸钠·2H₂O0.1％，硫酸铵1％，MgSO₄·7H₂O0.06％，CaCl₂ 0.003％，葡萄糖2％，微量元素母液0.01％(v/v)。

发酵培养基：KH₂PO₄ 0.667％，一水柠檬酸0.355％，MgSO₄·7H₂O0.25％，CaCl₂·H₂O0.0025％，葡萄糖0.5％，消泡剂0.025％，微量元素母液0.01％(v/v)；

微量元素母液：CoCl₂·6H₂O0.1％，H₃BO₃ 0.1％，FeSO₄·7H₂O5％，MnSO₄·H₂O0.33％，ZnSO₄·7H₂O3.8％，NaMoO₄·2H₂O0.1％，CoSO₄·5H₂O0.1％。

以下实施例中涉及的引物序列信息如表1所示。

表1、引物序列

实施例1、重组质粒pET28a-glmS的构建

野生型6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因glmS来源于大肠杆菌W3110，NCBI登录号：89106884，大小1830bp。以大肠杆菌W3110基因组为模板，使用F-glmS-BsaI和R-glmS-BamHI引物对进行PCR扩增获得glmS基因，扩增产物回收后用BsaI和BamHI双酶切，pET-28a(+)载体质粒用NcoI和BamHI双酶切，将上述两个片段连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行卡那霉素抗性筛选，获得重组质粒pET28a-glmS。

实施例2、重组质粒pET28a-mglmS的构建

根据文献报道(Deng MD,Severson DK,Grund AD,et al.Metabolic engineering ofEscherichia coli for industrial production of glucosamine and N-acetylglucosamine.Metabolic Engineering,2005,7:201-214)，野生型6-磷酸氨基葡萄糖合成酶活性受该合成途径代谢产物氨基葡萄糖-6-磷酸的反馈抑制，是N-乙酰氨基葡萄糖产量受限的关键因素之一。

GlmS(A38T/R249C/G471S)是能耐受氨基葡萄糖抑制的突变体，能提高终产物的产量，因此，在克隆了野生型glmS的基础上，对glmS进行了定点突变，获得了glmS(A38T/R249C/G471S)突变体，命名为mglmS。

A38T位点的定点突变实验操作如下：

以重组质粒pET28a-glmS为模板，使用F-mglmS1-A38T和R-mglmS1-A38T引物对进行全质粒PCR扩增，将上述PCR扩增产物使用DpnI酶切，酶切产物回收后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行卡那霉素抗性筛选，获得经测序验证确认A38T位点突变的重组质粒。

R249C和G471S两个突变继续以上述A38T位点突变的重组质粒为模板，分别使用F-mglmS2-R249C和R-mglmS2-R249C以及F-mglmS3-G471S和R-mglmS3-G471S引物对同样操作，累积完成三个点突变，最终获得重组质粒pET28a-mglmS。

实施例3、重组质粒pET28a-ScGNA1的构建

N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因ScGNA1来源于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae(baker's yeast)，NCBI登录号：4115732，大小480bp。以酿酒酵母基因组为模板，使用F-ScGNA1-BsaI和R-ScGNA1-BamHI引物对进行PCR扩增获得ScGNA1基因，扩增产物回收后用BsaI和BamHI双酶切，pET-28a(+)质粒用NcoI和BamHI双酶切，将上述两个片段连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行卡那霉素抗性筛选，获得重组质粒pET28a-ScGNA1。

实施例4、T7启动子下mglmS和ScGNA1双表达质粒的构建

重组质粒pET28a-ScGNA1用BglII和HindIII双酶切后回收包含T7启动子的ScGNA1片段，重组质粒pET28a-mglmS用BamHI和HindIII双酶切，将上述两个片段连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行卡那霉素抗性筛选，获得重组质粒pET28a-mglmS-ScGNA1。该重组质粒上有两个T7启动子，第一个可以启动mglmS和ScGNA1的转录，第二个可以启动ScGNA1的转录。

实施例5、Trc启动子下mglmS和ScGNA1双表达质粒的构建

以重组质粒pET28a-mglmS-ScGNA1为模板，使用引物对glmS-BsaI-F和ScGNA1-BamHI-R进行PCR扩增获得mglmS-ScGNA1串联基因，扩增产物回收后用BsaI和BamHI双酶切，pTrc99a质粒用NcoI和BamHI双酶切，将上述两个片段连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行氨苄青霉素抗性筛选，获得重组质粒pTrc99a-mglmS-ScGNA1。

实施例6、nagDCABE基因簇的敲除

大肠杆菌W3110中nagDCABE基因簇内各基因大小及在大肠杆菌染色体中的定位如下：

nagD，753bp，699996..700748

nagC，1221bp，700796..702016

nagA，1149bp，702025..703173

nagB，801bp，703233..704033

nagE，1947bp，704366..706312

为阻断氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖的分解代谢途径，需要将上述基因簇整体敲除。

nagDCABE基因簇的敲除采用Red同源重组技术，以pIJ773质粒提供安普霉素(apramycinsulfate)抗性模板，操作如下：

将质粒pKD46转化大肠杆菌W3110(DE3)感受态细胞，获得携带有pKD46的重组菌株W3110(DE3)，于30℃过夜培养后以1:50接种于50mL含有氨苄青霉素的SOB培养基中培养，同时加入20mM L-阿拉伯糖，于30℃培养至OD₆₀₀＝0.6，使pKD46上Exo、Bet和Gam三个蛋白充分表达，冰上预冷10min，离心收集菌体，用预冷的10％甘油离心洗涤3次，浓缩成100～200μL的感受态细胞。

以pIJ773质粒为模板，使用F-nagDCABE-KO和R-nagDCABE-KO引物对进行PCR扩增，扩增产物回收后电转化上述携带有pKD46的W3110(DE3)感受态细胞并进行安普霉素抗性筛选，电转化条件为：电压2.5kV，电击时间4～5s，获得重组菌株W3110(DE3),Δnag。

实施例7、重组菌株W3110(DE3),Δnag,ΔfucI::T7-mglmS-ScGNA1的构建

为了避免代谢工程菌中表达质粒的不稳定性，拟将表达元件T7-mglmS和T7-ScGNA1整合至代谢工程菌染色体上，利用Red重组系统进行整合，操作如下：

将pIJ778质粒用BamHI和EcoRI酶切，回收包含链霉素抗性和两端FRT位点的1049bp大小的片段，pET28a(+)质粒用BamHI和EcoRI位点酶切，将上述两个片段连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行卡那霉素和链霉素双重抗性筛选，获得重组质粒pET28a-IJ778。

以重组质粒pET28a-mglmS-ScGNA1为模板，使用F-glmS-BsaI和R-glmS-BamHI引物对进行PCR扩增获得mglmS-ScGNA1表达框，扩增产物回收后用BsaI和BamHI酶切，重组质粒pET28a-IJ778用NcoI和BamHI酶切，将上述两个片段连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行抗性筛选，获得重组质粒pEgS-IJ778。该载体上含有T7启动子介导的mglmS和ScGNA1基因、表达链霉素抗性的aadA基因和用于消除抗性的FRT位点。

选择大肠杆菌W3110(DE3)的fucI基因作为整合位点，该基因编码L-岩藻糖异构酶(L-Fucose isomerase)，不是大肠杆菌代谢必需，可以替换掉而不影响菌体在普通培养基中的生长。

以重组质粒pEgS-IJ778为模板，使用F-fucI-ET28和R-fucI-778引物对进行PCR扩增获得包含T7-mglmS-ScGNA1-aadA-FRT的片段，扩增产物回收后电转化携带有pKD46的W3110(DE3),Δnag感受态细胞并进行链霉素和安普霉素双重抗性筛选，获得重组菌株W3110(DE3),Δnag,ΔfucI::T7-mglmS-ScGNA1菌株，命名为W102。

实施例8、重组菌株W102,Δyabp::T7-mglmS-ScGNA1(CIChE),ΔrecA的构建

采用CIChE法(参见Keith E J Tyo et al.Stabilized gene duplication enableslong-term selection-free heterologous pathway expression.Nature Biotechnology,2009,27(8):760-767)多拷贝整合T7-mglmS-ScGNA1至W102菌株，操作如下：

以重组质粒pET28a-mglmS-ScGNA1为模板，使用P3和P4引物对进行PCR扩增获得T7-mglmS-ScGNA1片段，扩增产物回收后连接到pMD18-T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行抗性筛选，获得重组质粒pMD18-T-T7-mglmS-ScGNA1。

将重组质粒pMD18-T-T7-mglmS-ScGNA1用SacI和ScaI双酶切，回收包含T7-mglmS-ScGNA1的片段，将质粒pyabp-cm用SacI和HpaI双酶切，将上述两个片段连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行氯霉素抗性筛选，获得重组质粒pyabp-cm-T7-mglmS-ScGNA1。

将重组质粒pyabp-cm-T7-mglmS-ScGNA1用SwaI单酶切，回收整合盒抗性片段电转化携带有pKD46的W102菌株并进行氯霉素抗性筛选，获得重组菌株W102,Δyabp::T7-mglmS-ScGNA1(CIChE)。

将重组菌株W102,Δyabp::T7-mglmS-ScGNA1(CIChE)于37℃培养，起始氯霉素浓度为30μg/ml，培养过夜后按1％比例转接新鲜LB试管，抗生素浓度提高到100μg/ml,依次类推不断转接，抗生素浓度逐级提高，如：200μg/ml，400μg/ml，800μg/ml等，每个梯度获得的菌体涂布相应氯霉素浓度的平板，挑取单克隆进行发酵评估。

采用Red同源重组技术敲除recA基因以停止菌体内部的同源重组，操作如下：

以大肠杆菌BW26547(美国耶鲁大学菌种保藏中心CGSC#:7652)基因组DNA为模板，使用recAkos和recAkoas引物对进行PCR扩增，扩增产物回收后分别电转化氯霉素筛选浓度为30μg/ml和200μg/ml的携带有pKD46的重组菌株W102,Δyabp::T7-mglmS-ScGNA1(CIChE)并进行卡那霉素抗性筛选，获得重组菌株W102,Δyabp::T7-mglmS-ScGNA1(CIChE),ΔrecA，其中，氯霉素筛选浓度为30μg/ml的命名为W105-30，氯霉素筛选浓度为200μg/ml的命名为W105-200。

实施例9、重组菌株W102,ΔyaiT::T7-mglmS-ScGNA1的构建

重组菌株W102中存在链霉素和安普霉素抗性，与后续整合所需的安普霉素抗性筛选相冲突，因此首先需消除抗性，操作如下：

将质粒pCP20转化W102感受态细胞于30℃培养并进行氨苄青霉素抗性筛选，挑取单克隆于42℃于无抗LB固体培养基上划线培养，然后筛选在含氨苄青霉素、链霉素和安普霉素抗性的固体培养基上均不能生长而在无抗固体培养基上能够生长的单克隆即为抗性和pCP20均已消除的W102无抗菌株。

选择大肠杆菌W3110(DE3)基因组上假基因yaiT内部的序列为整合位点。

以重组质粒pEgS-IJ778为模板，使用F-yaiT-ET28和R-yaiT-778引物对进行PCR扩增获得包含T7-mglmS-ScGNA1-aadA-FRT的片段，扩增产物回收后电转化携带有pKD46的W102无抗菌株并进行链霉素抗性筛选，获得重组菌株W102,ΔyaiT::T7-mglmS-ScGNA1，命名为W106。

实施例10、重组菌株W106,Δyabp::DE3(CIChE),ΔrecA的构建

采用CIChE法多拷贝整合DE3到W106菌株，操作如下：

以大肠杆菌BL21(DE3)基因组DNA为模板，使用DE3-SacI-F和DE3-SacI-R引物对进行PCR扩增获得DE3全长片段，扩增产物回收后用SacI和ScaI双酶切，质粒pyabp-cm用SacI和HpaI双酶切，将上述两个片段连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行氯霉素抗性筛选，获得重组质粒pyabp-DE3。

将重组质粒pyabp-DE3用SwaI单酶切，回收整合盒抗性片段电转化携带有pKD46的W106菌株，获得重组菌株W106,Δyabp::DE3(CIChE)。

按照前述的方法，在不同浓度氯霉素下筛选重组菌株W106,Δyabp::DE3(CIChE)稳定遗传的整合子并敲除recA基因，获得重组菌株W106,Δyabp::DE3(CIChE),ΔrecA，其中，氯霉素筛选浓度为30μg/ml的命名为W107-30，氯霉素筛选浓度为400μg/ml的命名为W107-400。

实施例11、重组菌株W102,Δlfh::DE3,ΔyihF::T7-mglmS-ScGNA和W106,Δlfh::DE3,ΔyihF::T7-mglmS-ScGNA1的构建

按照前述的方法，消除重组菌株W106的抗性，获得W106无抗菌株。

以大肠杆菌BL21(DE3)基因组DNA为模板，使用DE3-SwaI-F和DE3-SwaI-R引物对进行PCR扩增获得DE3全长片段，扩增产物回收后连接到pM18-T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行抗性筛选，获得重组质粒pMD18-T-DE3。

将质粒pIJ773用BamHI单酶切，回收包含安普霉素抗性和两端FRT位点的片段，重组质粒pMD18-T-DE3也用BamHI单酶切，将上述两个片段连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行氨苄青霉素抗性筛选，获得重组质粒pMD18-T-DE3773。

选择大肠杆菌W3110基因组上lfh基因内部序列为整合位点。

以大肠杆菌W3110(DE3)为模板，使用Lfh-SwaI-F和Lfh-SwaI-R引物对进行PCR扩增，扩增产物回收后连接到pMD18-T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行氨苄青霉素抗性筛选，获得重组质粒pMD18-T-lfh。

以重组质粒pMD18-T-lfh为模板，使用Lfhs和Lfhas引物对进行PCR扩增获得包含lfh上下游同源臂序列和T载体骨架序列的T-lfh片段，以重组质粒pMD18-T-DE3773为模板，使用DE3773s和DE3773as引物对进行PCR扩增获得DE3773片段，其中包含lacI基因、T7噬菌体基因1、pIJ773来源表达安普霉素的aac(3)IV基因和用于消除抗性的FRT位点。将T-lfh片段和DE3773片段进行Gibson连接，操作方法参见GibsonCloning kit说明书，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行抗性筛选，获得包含整合盒抗性片段的重组质粒，用SwaI单酶切，回收7.6kb大小的整合盒抗性片段，分别电转化携带有pKD46的W102无抗菌株和携带有pKD46的W106无抗菌株，获得重组菌株W102,Δlfh::DE3和W106,Δlfh::DE3。

以大肠杆菌W3110(DE3)基因组DNA为模板，使用yihF-SwaI-F和yihF-SwaI-R引物对进行PCR扩增获得yihF片段，扩增产物回收后连接到pMD18-T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行抗性筛选，获得重组质粒pMD18-Ts-yihF。

以重组质粒pEgS-IJ778为模板，使用pETGS778-F和pETGS778-R引物对进行PCR扩增获得T7GS778片段，其中包含T7启动子介导的mglmS和ScGNA1基因、pIJ778来源表达链霉素抗性的aadA基因和用于消除抗性的FRT位点。以重组质粒pMD18-Ts-yihF为模板，使用TyihF-F和TyihF-R引物对进行PCR扩增获得包含yihF上下游同源臂序列和T载体骨架序列的TyihF片段。将T7GS778片段和TyihF片段进行Gibson连接，操作方法参见GibsonCloning kit说明书，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行抗性筛选，获得包含整合盒抗性片段的重组质粒，用SwaI单酶切，回收5.6kb大小的整合盒抗性片段，分别电转化携带有pKD46的W102,Δlfh::DE3和携带有pKD46的W106,Δlfh::DE3，获得重组菌株W102,Δlfh::DE3,ΔyihF::T7-mglmS-ScGNA和W106,Δlfh::DE3,ΔyihF::T7-mglmS-ScGNA1，分别命名为W108和W109。

实施例12、重组菌株W102/pET28a-mglmS-ScGNA1和W102/pTrc99a-mglmS-ScGNA1的构建

将重组质粒pET28a-mglmS-ScGNA1和pTrc99a-mglmS-ScGNA1分别转化W102感受态细胞并分别用卡那霉素和氨苄青霉素进行抗性筛选，获得重组菌株W102/pET28a-mglmS-ScGNA1和W102/pTrc99a-mglmS-ScGNA1，分别命名为W110和W111。

实施例13、重组菌种W102,Δyabp::pTrc-mglmS-ScGNA1的构建

将质粒pTrc99a-mglmS-ScGNA1和pIJ773分别用BamHI和SalI双酶切，回收pTrc99a-mglmS-ScGNA1片段和1.5kb大小的包含表达安普霉素的aac(3)IV基因和用于消除抗性的FRT位点IJ773片段，将上述片段连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行氨苄青霉素和安普霉素抗性筛选，获得重组质粒pTrc99a-mglmS-ScGNA1-IJ773。

以重组质粒pTrc99a-mglmS-ScGNA1-IJ773为模板，使用TrcGS773-F和TrcGS773-R引物对进行PCR扩增获得PTrcGS773片段，其中包含Trc启动子介导的mglmS和ScGNA1基因、pIJ773来源表达安普霉素的aac(3)IV基因和用于消除抗性的FRT位点。

以大肠杆菌W3110(DE3)基因组DNA为模板，使用yabp-SwaI-F和yabp-SwaI-R引物对进行PCR扩增，扩增产物回收后连接到pMD18-T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行氨苄青霉素抗性筛选，获得重组质粒pMD18-T-yabp。

以pMD18-T-yabp为模板，使用yabpF和yabpR引物对进行PCR扩增获得包含yabp上下游同源臂序列和T载体骨架序列的Tyabp片段。将PTrcGS773片段和Tyabp片段进行Gibson连接，操作方法参见GibsonCloning kit说明书，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行氨苄青霉素和安普霉素双重抗性筛选，获得包含整合盒的重组质粒，用SwaI单酶切，回收5.8kb大小的整合盒抗性片段电转化携带有pKD46的W102无抗菌株并进行链霉素抗性筛选，获得重组菌种W102,Δyabp::pTrc-mglmS-ScGNA1，命名为W112。

实施例14、发酵、菌种稳定性评估及产物检测

14.1、摇瓶发酵方法

先挑单菌落于装液量4ml LB培养基(含标准浓度的相应抗生素)试管中，37℃培养8h后取1.5ml种子液于50ml M9A培养基中，加入标准浓度的相应抗生素，37℃培养16h，作为二级种子。

取2.5ml二级种子接种于50ml M9B培养基中，加入标准浓度的相应抗生素，37℃培养16～18h。

取样检测，当OD₆₀₀＝1时，用1mM氢氧化钠调pH达到7.0左右，此时加葡萄糖母液(400g/l)1.5ml，加IPTG诱导至终浓度为0.2mM，37℃培养，至72h，其中每隔12h补加一次糖并且调pH到7.0左右。

14.2、发酵罐发酵方法

种子培养：从甘油管直接取100μl菌液于装有100ml M9B培养基的500mL的种子瓶中，加入标准浓度的相应抗生素，37℃，220rpm培养16h，OD₆₀₀≈2。

发酵罐培养：种子按照接种量5～10％接入4L发酵培养基，加入标准浓度的相应抗生素，37℃，搅拌和溶氧关联(控制溶氧不低于30％)，搅拌速度300～800rpm，通气量1～3V/V.M。待发酵液中葡萄糖耗完(4～6h)，以1～5％的速度补糖(通过pH值变化来判断，pH上升至所设置值往上提补糖流速)。当OD₆₀₀＝10，以5％的流速(5.5g/L.h)补加糖。当OD₆₀₀＝25，加入0.05mM ITPG诱导。诱导后先以5％流加8h再控残糖。在OD₆₀₀＝50左右加入0.05mM IPTG。发酵72h检测产物产量。

14.3、菌种稳定性评估方法：

将发酵结束后的菌液在无抗平板上划线，培养18h后挑取10个单菌落分别接到装有50ml M9B培养基的250mL摇瓶中，生长16～18h后加入0.2mM IPTG诱导，同时用氢氧化钠调pH到7.0补加8g葡萄糖，然后每隔12h调pH和补加葡萄糖，在诱导后24h检测产物产量。

14.4、产物检测方法

糖检测：启动运行按钮，测糖仪进入冲洗程序，待定标提示音响，取25μl葡萄糖标准液(1g/L)进行多针定标至进样提示音响进入测样阶段，将待测样的葡萄糖浓度稀释至0.1～1g/L，取25μl进样检测。葡萄糖浓度为：稀释倍数×显示值。

HPLC检测产物含量：

柱型号：Aminex HPX-87H 流动相：6mmol/L H₂SO₄

进样量：5μL           流速：0.55mL/Min

柱温：40℃             检测波长：210 nm。

实施例15、菌种稳定性评估及发酵产物检测结果

将上述通过基因工程构建的N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌株W102、W105～W112进行菌种稳定性评估以及摇瓶和发酵罐发酵检测N-乙酰氨基葡萄糖产量，结果如表2所示。

表2、菌种稳定性评估及发酵产物检测结果

由表2可见，由CIChE法构建的高氯霉素浓度代谢工程菌W105-200存在上罐生产不正常的现象，无法评估菌种稳定性和检测产物发酵产量，而W107-400上罐发酵的氨糖产量明显低于低氯霉素浓度菌，改造效果不佳，因而没有进一步评估菌种稳定性。并且，通过CIChE法强化外源基因的表达、整合外源DE3基因、表达元件位于质粒上构建的基因工程菌均存在不同程度的发酵产量低以及菌种不稳定的现象，而只有包含Trc启动子介导外源基因表达的W112菌种发酵N-乙酰氨基葡萄糖的产量高、菌种稳定性好，具有广泛的工业应用前景。

Claims (11)

1.一种高效生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是将大肠杆菌的染色体缺失nagDCABE基因簇并整合分别由T7启动子和Trc启动子介导的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶突变基因和N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因串联基因表达盒获得，其中，所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶突变基因是由大肠杆菌W3110菌株来源的野生型6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因突变成A38T/R249C/G471S突变体获得。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌W3110(DE3)菌株。

3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因来源自酿酒酵母。

4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述T7启动子来源自pET-28a(+)质粒，所述Trc启动子来源自pTrc99a质粒。

5.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述T7启动子介导的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶突变基因和N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因串联基因表达盒整合于大肠杆菌染色体的fucI基因内。

6.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述Trc启动子介导的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶突变基因和N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因串联基因表达盒整合于大肠杆菌染色体的yabp基因内。

7.如权利要求1～6中任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的保藏号为CCTCC M2014383。

8.如权利要求1～6中任一项所述的基因工程菌的应用，其特征在于，用于发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖。

9.如权利要求7所述的基因工程菌的应用，其特征在于，用于发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖。

10.如权利要求8所述的基因工程菌的应用，其特征在于，所述发酵的条件如下：

种子培养基：KH₂PO₄ 0.6％(w/v)，K₂HPO₄·3H₂O3.145％(w/v)，柠檬酸钠·2H₂O0.1％(w/v)，硫酸铵1％(w/v)，MgSO₄·7H₂O0.06％(w/v)，CaCl₂ 0.003％(w/v)，葡萄糖2％(w/v)，微量元素母液0.01％(v/v)；

发酵培养基：KH₂PO₄ 0.667％(w/v)，一水柠檬酸0.355％(w/v)，MgSO₄·7H₂O0.25％(w/v)，CaCl₂·H₂O0.0025％(w/v)，葡萄糖0.5％(w/v)，消泡剂0.025％(w/v)，微量元素母液0.01％(v/v)；

其中，所述微量元素母液：CoCl₂·6H₂O0.1％(w/v)，H₃BO₃ 0.1％(w/v)，FeSO₄·7H₂O5％(w/v)，MnSO₄·H₂O0.33％(w/v)，ZnSO₄·7H₂O3.8％(w/v)，NaMoO₄ 2H₂O.0.1％(w/v)，CoSO₄·5H₂O0.1％(w/v)；

发酵温度37℃，搅拌速度300～800rpm，通气量1～3V/V.M。

11.如权利要求9所述的基因工程菌的应用，其特征在于，所述发酵的条件如下：

种子培养基：KH₂PO₄ 0.6％(w/v)，K₂HPO₄·3H₂O3.145％(w/v)，柠檬酸钠·2H₂O0.1％(w/v)，硫酸铵1％(w/v)，MgSO₄·7H₂O0.06％(w/v)，CaCl₂ 0.003％(w/v)，葡萄糖2％(w/v)，微量元素母液0.01％(v/v)；

发酵培养基：KH₂PO₄ 0.667％(w/v)，一水柠檬酸0.355％(w/v)，MgSO₄·7H₂O0.25％(w/v)，CaCl₂·H₂O0.0025％(w/v)，葡萄糖0.5％(w/v)，消泡剂0.025％(w/v)，微量元素母液0.01％(v/v)；

其中，所述微量元素母液：CoCl₂·6H₂O0.1％(w/v)，H₃BO₃ 0.1％(w/v)，FeSO₄·7H₂O5％(w/v)，MnSO₄·H₂O0.33％(w/v)，ZnSO₄·7H₂O3.8％(w/v)，NaMoO₄·2H₂O0.1％(w/v)，CoSO₄·5H₂O0.1％(w/v)；

发酵温度37℃，搅拌速度300～800rpm，通气量1～3V/V.M。