CN105238724B - 一种敲除pckA促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法 - Google Patents
一种敲除pckA促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105238724B CN105238724B CN201510762271.5A CN201510762271A CN105238724B CN 105238724 B CN105238724 B CN 105238724B CN 201510762271 A CN201510762271 A CN 201510762271A CN 105238724 B CN105238724 B CN 105238724B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacillus subtilis
- pcka
- gene
- acetylglucosamine
- phosphoric acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 title claims abstract description 40
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 title claims abstract description 40
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 title claims abstract description 30
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 title claims abstract description 30
- DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N Lewis A pentasaccharide Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(NC(C)=O)C(OC2C(C(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)OC(CO)C2O)O)OC1CO DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 28
- 101150088738 pckA gene Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 101150067708 pckG gene Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000004907 flux Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims abstract description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 150000002085 enols Chemical class 0.000 claims description 17
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 claims description 15
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 11
- 101150056133 GNPNAT1 gene Proteins 0.000 claims description 10
- 101150100121 gna1 gene Proteins 0.000 claims description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 9
- 102100023951 Glucosamine 6-phosphate N-acetyltransferase Human genes 0.000 claims description 8
- 101150117187 glmS gene Proteins 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 claims description 5
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 claims description 4
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 claims description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 4
- 101100031707 Bacillus subtilis (strain 168) nagP gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 claims description 3
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims description 3
- 229910018890 NaMoO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 241001597008 Nomeidae Species 0.000 claims description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 3
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L calcium carbonate Substances [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 101150083237 glcK gene Proteins 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 claims description 3
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 3
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 claims description 3
- 229910021580 Cobalt(II) chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 2
- 101150070589 nagB gene Proteins 0.000 claims description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- VSCWAEJMTAWNJL-UHFFFAOYSA-K aluminium trichloride Chemical compound Cl[Al](Cl)Cl VSCWAEJMTAWNJL-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims 2
- 229910021592 Copper(II) chloride Inorganic materials 0.000 claims 1
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 abstract 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 abstract 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 abstract 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 abstract 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 abstract 1
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N aldehydo-N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 7
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N Acetoin Chemical compound CC(O)C(C)=O ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010016946 Food allergy Diseases 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010060820 Joint injury Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N ac1ldcw0 Chemical compound Cl.C1CN(C)CCN1C1=C(F)C=C2C(=O)C(C(O)=O)=CN3CCSC1=C32 LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000738 acetamido group Chemical group [H]C([H])([H])C(=O)N([H])[*] 0.000 description 1
- -1 acetylamino Grape sugar Chemical compound 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 125000000600 disaccharide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 210000005067 joint tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000008935 nutritious Nutrition 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种敲除pckA促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法，属于遗传工程领域。本发明以BSGNK‑PxylA‑glmS‑P43‑GNA1作为出发菌株，通过同源重组敲除磷酸烯醇式羧化酶编码基因pckA，阻断了宿主菌胞内磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸的反应，减少流向三羧酸循环的碳通量，促进了乙酰氨基葡萄糖积累。在使用复合培养基发酵过程中，敲除pckA的重组枯草芽孢杆菌的乙酰氨基葡萄糖的产量达到29.27g/L，比对照菌株提高了28.1％。本发明为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种敲除pckA促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法，属于遗传工程领域。
背景技术
乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。201510394205.7构建的重组枯草芽孢杆菌(BSGNK-PxylA-glmS-P43-GNA1)可在合成培养基中较快生长、发酵生产乙酰氨基葡萄糖，但是存在乙酰氨基葡萄糖产量(3g/L)较低的缺点。因此，如何提高乙酰氨基葡萄糖合成途径代谢通量以进一步提高GlcNAc产量，是提高乙酰氨基葡萄糖产量的亟待解决问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种敲除pckA促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法。由于培养基中含有葡萄糖时，枯草芽孢杆菌主要采用磷酸转运途径转运葡萄糖，利用磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸根将培养基中葡萄糖磷酸化并转运至胞内，在该过程中会产生大量的丙酮酸，而且磷酸烯醇式丙酮酸还可以通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶转化为丙酮酸。所以本发明通过阻断宿主菌胞内磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸的反应，减少流向三羧酸循环的碳通量，最终提高了乙酰氨基葡萄糖合成途径代谢通量、提高GlcNAc产量。
本发明的第一个目的是提供一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，所述重组芽孢杆菌是在枯草芽孢杆菌BSGNK的基础上，敲除了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因(pckA)，命名为重组枯草芽孢杆菌BSGNKA。
所述枯草芽孢杆菌BSGNK，以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达，并在此基础上敲除了葡萄糖激酶编码基因glcK(NCBI上Gene ID:938206)。
在本发明的一种实施方式中，通过pP43-GNA1质粒游离表达GNA1基因，通过pM7Z6M-PxylA-glmS质粒整合表达glmS基因。
在本发明的一种实施方式中，以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达的重组菌命名为BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1，具体构建方法可参见文献Liu,Y.et al.Modularpathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamineproduction.Metab.Eng.23:42-52,2014。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌BSGNK，是专利申请201510394205.7中构建的重组枯草芽孢杆菌BSGNK。
在本发明的一种实施方式中，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA是NCBI中gene ID：937235所示的基因。
本发明第二个目的是提供一种所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，是先构建磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因敲除框，经同源重组将敲除框中的博来霉素抗性基因zeo替代枯草芽孢杆菌BSGNK基因组中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因pckA，阻断了宿主菌胞内磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸的反应，减少流向三羧酸循环的碳通量，促进了乙酰氨基葡萄糖积累。
在本发明的一种实施方式中，所述敲除框的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第三个目的是提供一种促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法，是以所述重组枯草芽孢杆菌BSGNKA为生产菌株发酵生产乙酰氨基葡萄糖。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵，使用的发酵培养基按g/L计，含有：初始葡萄糖20，蛋白胨6，酵母粉12，(NH4)SO46,K2HPO4·3H2O 12.5，KH2PO42.5，CaCO35，微量元素溶液10-15ml；其中微量元素溶液按g/L计含有：MnSO4·5H2O 1.0，CoCl 2·6H2O 0.4，NaMoO4·2H2O 0.2，ZnSO4·7H2O 0.2，Alcl3·6H2O 0.1，Cucl2·H2O 0.1，H3BO40.05，含5M HCl(即1L微量元素溶液中含有5mol HCl)。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵，是将生产菌株活化后，以3％的接种量转入发酵培养基，接种2h后加入诱导剂木糖，于3L发酵罐、35-37℃、600-800rpm条件下培养52-72h。
本发明的有益效果：
本发明的重组枯草芽孢杆菌BSGNKA，是在枯草芽孢杆菌BSGNK的基础上敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因(pckA)得到的，与出发菌株BSGNK相比，其乙酰氨基葡萄糖胞外积累量提高了28.1％，浓度可达到29.27g/L。同时，本发明的BSGNKA菌株的乙酰氨基葡萄糖比合成速率比对照菌株BSGNK提高了46.5％，副产物乙偶姻的产量仅为对照菌株的68.5％。本发明通过敲除pckA基因，可以有效的减少副产物生成，提高GlcNAc的积累。本发明的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。
具体实施方式
乙酰氨基葡萄糖的测定方法：
高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1200，RID检测器，NH2柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：70％乙腈，流速0.75mL/min，柱温30℃，进样体积为10μL。
发酵液中葡萄糖浓度的检测：SBA生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所)。
种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。
发酵培养基(g/L)，为合成培养基：初始葡萄糖20，蛋白胨6，酵母粉12，(NH4)SO46,K2HPO4·3H2O 12.5，KH2PO42.5，CaCO35，微量元素10ml/L；微量元素溶液按g/L计含有：MnSO4·5H2O 1.0，Cocl 2·6H2O 0.4，NaMoO4·2H2O 0.2，ZnSO4·7H2O 0.2，Alcl3·6H2O0.1，Cucl 2·H2O0.1，H3BO40.05，含5M HCl。
培养条件：将37℃、220rpm下培养8h的种子以3％的接种量转入发酵培养基，接种2h后加入诱导剂木糖5g/L，于3L发酵罐、35-37℃、600-800rpm条件下培养。
实施例1：敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA
根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168购自美国典型微生物保藏中心，ATCC No.27370)的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA的上下游序列，以及博来霉素抗性基因的序列，构建序列如SEQ ID NO.1所示的敲除框。
将构建好的敲除框转化重组枯草芽孢杆菌BSGNK-PxylA-glmS-P43-GNA1(即专利申请201510394205.7中构建的重组枯草芽孢杆菌BSGNK)，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证，确认敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pckA)敲除成功，得到重组枯草芽孢杆菌BSGNKA。重组枯草芽孢杆菌BSGNK-PxylA-glmS-P43-GNA1是在文献(Liu,Y.et al.Modularpathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamineproduction.Metab.Eng.23:42-52,2014)构建的BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1的基础上敲除了葡萄糖激酶编码基因glcK，pP43-GNA1质粒游离表达GNA1基因，pM7Z6M-PxylA-glmS质粒整合表达glmS基因。
实施例2：发酵生产乙酰氨基葡萄糖
将37℃、220rpm下培养8h的种子以3％的接种量转入发酵培养基，于3L发酵罐、35-37℃、600-800rpm条件下培养52-72h。发酵52h时，发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到29.27g/L，与对照菌BSGNK-PxylA-glmS-P43-GNA1相比提高了28.1％(结果如表1所示)，实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量的提高。此外，本发明的BSGNKA菌株的乙酰氨基葡萄糖比合成速率达到0.085g/g DCW/h，与对照菌株BSGNK相比，提高了46.5％。同时本发明菌株副产物乙偶姻的产量为23.5g/L，是对照菌株的68.5％。因此通过敲除pckA基因，可以有效的减少副产物生成，提高GlcNAc的积累。
表1GlcNAc的比合成速率、产量以及副产物产量的比较
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (5)
1.一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组芽孢杆菌是在枯草芽孢杆菌BSGNK的基础上，敲除了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA；所述枯草芽孢杆菌BSGNK，以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达，并在此基础上敲除了葡萄糖激酶编码基因glcK；所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA是NCBI上Gene ID:937235的基因。
2.一种构建权利要求1所述乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述构建方法是先构建磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因敲除框，经同源重组，用敲除框中的博来霉素抗性基因zeo替代枯草芽孢杆菌BSGNK基因组中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因pckA，阻断了宿主菌胞内磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸的反应，减少流向三羧酸循环的碳通量，促进了乙酰氨基葡萄糖积累；所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA是NCBI上Gene ID:937235的基因。
3.一种促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法，是以重组枯草芽孢杆菌BSGNKA为生产菌株发酵生产乙酰氨基葡萄糖；BSGNKA是在枯草芽孢杆菌BSGNK的基础上，敲除了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA；所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA是NCBI上Gene ID:937235的基因。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵使用的发酵培养基，按g/L计含有：初始葡萄糖20，蛋白胨6，酵母粉12，(NH4)SO46，K2HPO4·3H2O 12.5，KH2PO42.5，CaCO35，微量元素溶液10-15ml；其中微量元素溶液按g/L计含有：MnSO4·5H2O 1.0，CoCl2·6H2O 0.4，NaMoO4·2H2O 0.2，ZnSO4·7H2O 0.2，AlCl3·6H2O 0.1，CuCl2·H2O 0.1，H3BO40.05，1L微量元素溶液中含有5mol HCl。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵是将生产菌株活化后，以3％的接种量转入发酵培养基，接种2h后加入诱导剂木糖，于3L发酵罐、35-37℃、600-800rpm条件下培养52-72h。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510762271.5A CN105238724B (zh) | 2015-11-10 | 2015-11-10 | 一种敲除pckA促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法 |
| US15/205,014 US9868970B2 (en) | 2015-11-10 | 2016-07-08 | Method for improving GlcNAc production of recombinant bacillus subtilis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510762271.5A CN105238724B (zh) | 2015-11-10 | 2015-11-10 | 一种敲除pckA促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105238724A CN105238724A (zh) | 2016-01-13 |
| CN105238724B true CN105238724B (zh) | 2017-11-17 |
Family
ID=55036544
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510762271.5A Active CN105238724B (zh) | 2015-11-10 | 2015-11-10 | 一种敲除pckA促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105238724B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108424869A (zh) * | 2018-04-04 | 2018-08-21 | 江南大学 | 一种促进枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖合成的方法 |
| CN108517330A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-09-11 | 江南大学 | 一种敲除ybbD提高重组枯草芽孢杆菌几丁寡糖的方法 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106148261B (zh) * | 2016-07-01 | 2019-09-03 | 江南大学 | 一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法 |
| CN106148262B (zh) * | 2016-07-01 | 2019-09-03 | 江南大学 | 提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法 |
| CN108486025A (zh) * | 2018-04-02 | 2018-09-04 | 山东润德生物科技有限公司 | 重组枯草芽孢杆菌及应用 |
| CN108570441A (zh) * | 2018-05-15 | 2018-09-25 | 大自然生物集团有限公司 | 重组枯草芽孢杆菌及其过表达谷氨酰胺合成酶促进合成乙酰氨基葡萄糖的方法 |
| CN111363757B (zh) * | 2020-01-19 | 2022-08-09 | 江南大学 | 一种温度开关系统及其在提高氨基酸产量中的应用 |
| CN117965663B (zh) * | 2024-04-01 | 2024-06-04 | 山东润德生物科技有限公司 | 一种利用微生物发酵提高n-乙酰氨基葡萄糖产量的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104498394A (zh) * | 2014-11-27 | 2015-04-08 | 江南大学 | 一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌 |
| CN104928333A (zh) * | 2015-07-07 | 2015-09-23 | 江南大学 | 一种敲除glcK促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101906449B (zh) * | 2010-06-24 | 2012-07-04 | 山东大学 | 芽孢表面展示系统用于n-乙酰神经氨酸生产的方法 |
-
2015
- 2015-11-10 CN CN201510762271.5A patent/CN105238724B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104498394A (zh) * | 2014-11-27 | 2015-04-08 | 江南大学 | 一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌 |
| CN104928333A (zh) * | 2015-07-07 | 2015-09-23 | 江南大学 | 一种敲除glcK促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamine production;Yanfeng Liu等人;《Metabolic Engineering》;20140530;第23卷;43页右栏第1段-52页左栏第1段，图1 * |
| 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的敲除对于谷氨酸棒杆菌V1生理代谢的影响;仇爱梅等人;《微生物学通报》;20120920;第39卷(第9期);1216页右栏第1段-1217页左栏第1段，图1 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108424869A (zh) * | 2018-04-04 | 2018-08-21 | 江南大学 | 一种促进枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖合成的方法 |
| CN108424869B (zh) * | 2018-04-04 | 2020-05-08 | 江南大学 | 一种促进枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖合成的方法 |
| CN108517330A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-09-11 | 江南大学 | 一种敲除ybbD提高重组枯草芽孢杆菌几丁寡糖的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105238724A (zh) | 2016-01-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105238724B (zh) | 一种敲除pckA促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法 | |
| CN105255803B (zh) | 一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌 | |
| CN104928333B (zh) | 一种敲除glcK促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法 | |
| CN104498394B (zh) | 一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌 | |
| CN104293724A (zh) | 一种高效生产n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌 | |
| CN106148260B (zh) | 高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法 | |
| CN105176903B (zh) | 一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN107354188A (zh) | 大肠埃希氏菌JL‑GlcN发酵生产N‑乙酰氨基葡萄糖的工艺 | |
| CN106479945B (zh) | 一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌 | |
| CN103060252B (zh) | 一种高产乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌工程菌及其应用 | |
| CN103409480B (zh) | 一种生产不同分子量普鲁兰多糖的方法 | |
| CN103695485B (zh) | 一种高效生产γ‑聚谷氨酸的方法 | |
| CN102978149B (zh) | 一种高产乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN107604025A (zh) | 一种提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法 | |
| CN105176879B (zh) | 一种敲除argCJBD提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法 | |
| CN104388496A (zh) | 一种酶法降解几丁质生产n-乙酰氨基葡萄糖的方法 | |
| CN106148262B (zh) | 提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法 | |
| CN107384827A (zh) | 一株大肠埃希氏菌JL‑GlcN及其应用 | |
| CN108441461A (zh) | 一种利用人工双碳源高产n-乙酰神经氨酸的重组菌 | |
| CN106148261B (zh) | 一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法 | |
| CN102154389A (zh) | 补料发酵生产β-聚苹果酸的工艺 | |
| CN108486025A (zh) | 重组枯草芽孢杆菌及应用 | |
| CN105255802B (zh) | 一种表达nad(p)h氧化酶提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法 | |
| US20210171962A1 (en) | Bacillus subtilis for Producing N-acetylneuraminic Acid and Application thereof | |
| CN109161570A (zh) | 一种提高发酵产n-乙酰神经氨酸的方法及发酵液 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210323 Address after: No.888, Gangnan Road, New District, Zhenjiang City, Jiangsu Province, 212000 Patentee after: Jiangsu Haifei Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 1800 No. 214122 Jiangsu city of Wuxi Province Li Lake Avenue Patentee before: Jiangnan University |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A method of knocking out pckA to promote the synthesis of acetylglucosamine by Bacillus subtilis Granted publication date: 20171117 Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd. Zhenjiang Dagang sub branch Pledgor: Jiangsu Haifei Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2024980007025 |