CN105255802B - 一种表达nad(p)h氧化酶提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达NAD(P)H氧化酶提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法，属于遗传工程领域。本发明是以重组枯草芽孢杆菌BSGN6‑P_xylA‑glmS‑P₄₃‑GNA1作为出发菌株，首先用强启动子P43控制NAD(P)H氧化酶基因yodc表达，构建yodc表达盒，然后通过同源重组用上述yodc表达盒替换基因组上非必需区域skin，整合表达内源NAD(P)H氧化酶以再生NAD(P)⁺，调控胞内NAD(P)⁺/NAD(P)H比例，使胞内氧化还原水平更加有利于合成乙酰氨基葡萄糖。在使用半合成培养基的摇瓶发酵过程中，表达NAD(P)H氧化酶的重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖的产量达到7.1g/L，比整合表达前提高31％。为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。

Description

一种表达NAD(P)H氧化酶提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡 萄糖产量的方法

技术领域

本发明涉及一种表达NAD(P)H氧化酶提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法，属于遗传工程领域。

背景技术

乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级乙酰氨基葡萄糖的有效途径。

发明内容

本发明首先提供一种表达NAD(P)H氧化酶的重组枯草芽孢杆菌，乙酰氨基葡萄糖的产量提高。所述重组枯草芽孢杆菌以BSGN6-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1为出发菌株，同时整合表达内源NAD(P)H氧化酶。

所述BSGN6-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1，是以B.subtilis168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子P_xylA、P₄₃控制glmS、GNA1的重组表达。

所述整合表达是以强启动子P43控制NAD(P)H氧化酶基因yodc表达，通过同源重组替换基因组上非必需区域skin。非必需区域skin在Bacillus subtilis 168基因组NC_000964.3上的位置为2654942-2701732bp。

在本发明的一种实施方式中，重组枯草芽孢杆菌BSGN6-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1的构建方法参见文献Liu,Y.et al.Modular pathway engineering ofBacillus subtilis forimproved N-acetylglucosamine production.Metab.Eng.23:42-52,2014。

所述NAD(P)H氧化酶的编码基因yodc如NCBI-Gene ID:939506所示。

本发明还提供一种构建所述重组枯草芽孢杆菌的方法，是BSGN6-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1为出发菌株，通过同源重组在基因组上以强启动子P43控制NAD(P)H氧化酶基因yodc表达。

本发明还提供了一种应用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖的方法，将37℃、200rpm下培养12h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养30h。

重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：

种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

发酵培养基(g/L)：Glc 60，酵母粉6，NH₄SO₄7.74，K₂HPO₄·3H₂O 12.5,KH₂PO₄2.5，CaCO₃5，MgSO₄3，微量元素15ml/L。

微量元素溶液(g/L)：MnSO₄·5H₂O 1.0，Cocl₂·6H₂O 0.4，NaMoO₄·2H₂O 0.2，ZnSO₄·7H₂O 0.2，Alcl₃·6H₂O 0.1，Cucl₂·H₂O 0.1，H₃BO₄0.05，含5M HCl。

培养条件：将37℃、200rpm下培养12h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养30h。

本发明用强启动子P43控制NAD(P)H氧化酶基因yodc表达，构建yodc表达盒，然后通过同源重组用上述yodc表达盒替换基因组上非必需区域skin，整合表达内源NAD(P)H氧化酶以再生NAD(P)⁺，调控胞内NAD(P)⁺/NAD(P)H比例，使胞内氧化还原水平更加有利于合成乙酰氨基葡萄糖。在使用半合成培养基的摇瓶发酵过程中，表达NAD(P)H氧化酶的重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖的产量达到7.1g/L，比整合表达前提高31％。本发明为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。

具体实施方式

乙酰氨基葡萄糖的测定方法：

高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1260，RID检测器，HPX-87H柱(Bio-RadHercules,CA)，流动相：5mM H₂SO₄，流速0.6mL/min，柱温35℃，进样体积为10μL。

实施例1构建yodc表达盒

参考文献Genome engineering reveals large dispensable regionsinBacillus subtilis,Mol BiolEvol.2003 Dec；20(12):2076-90.Epub 2003 Aug 29，同时根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168，购自美国典型微生物保藏中心,ATCC No.27370)基因组序列，设计yodc表达盒同源臂扩增引物，左臂上下游引物分别为：yodc-skin-L-F：5’-GGTCCCTCGATGATTATCACTTTCATAAAATGC-3’和yodc-skin-L-R：

5’-CTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCGATTGCTGTAGCTGTTGGTGTATTTGGAATTC-3’；右臂上下游引物分别为：yodc-skin-R-F:

5’-CCGCTTTCAAAAGTATCAACTTGGCTGTAACTTAGACGCATTTTCCTATGAAAAAAGTCTTGATTTC-3’和yodc-skin-R-R:5’-CGCTTTTCCTTCTCTGCCCGATAAAACT-3’；运用上述引物从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组中扩增yodc表达盒中包含的左臂和右臂。

根据NCBI-Gene ID:939506所示NAD(P)H氧化酶编码基因yodc序列，设计引物扩增NAD(P)H氧化酶编码基因yodc，上下游引物分别为：P43-sk-yodc-F:

5’-CGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGACGAATACTCTGGATGTTTTAAAAGCACG-3’和P43-sk-yodc-R:

5’-GAAATCAAGACTTTTTTCATAGGAAAATGCGTCTAAGTTACAGCCAAGTTGATACTTTTGAAAGCGG-3’；运用上述引物从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组中扩增yodc表达盒中包含的NAD(P)H氧化酶编码基因yodc。

根据NCBI上公布的p7Z6质粒序列(NCBI accession no.EU541492)，设计引物，扩增博来霉素抗性基因(zeo)，上下游引物分别为：yodc-skin-Z-F:5’-GAATTCCAAATACACCAACAGCTACAGCAATCGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG-3’和P43yodc-sk-Z-R:5’-ATTTAAAAGTTCAAGCGAAAACATACCACCTATCAGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’。

根据NCBI上公布的pP4NMK质粒序列(NCBI-GenBank:DQ264732.1)，设计引物，扩增强启动子P43，上下游引物分别为：yodc-sk-P43-F:5’-GTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCTGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTGAACTTTTAAAT-3’和yodc-sk-P43-R:5’-CGTGCTTTTAAAACATCCAGAGTATTCGTCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTACCG-3’。

通过融合PCR方法，将敲除框左、右臂、抗性基因及NAD(P)H氧化酶编码基因融合为表达盒。通过测序确认yodc表达盒构建成功。

实施例2重组枯草芽孢杆菌的构建

将构建好的yodc表达盒转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证，确认yodc表达盒整合成功，得到重组枯草芽孢杆菌。

实施例3发酵生产乙酰氨基葡萄糖

将37℃、200rpm下培养12h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养30h。发酵30h，发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到7.1g/L。通过整合表达内源NAD(P)H氧化酶以再生NAD(P)⁺，调控胞内NAD(P)⁺/NAD(P)H比例，使胞内氧化还原水平更加有利于合成乙酰氨基葡萄糖。乙酰氨基葡萄糖的产量达到7.1g/L，比整合表达前提高31％

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以BSGN6-P _xylA-glmS-P₄₃-GNA1为出发菌株，在基因组上整合表达内源NAD(P)H氧化酶；所述BSGN6-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1，是以B.subtilis168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子P_xylA、P₄₃控制glmS、GNA1的重组表达；所述NAD(P)H氧化酶的编码基因yodc的核苷酸序列如NCBI-Gene ID:939506所示。

2.根据权利要求1所述的一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述整合表达是以强启动子P43控制NAD(P)H氧化酶基因yodc表达，通过同源重组替换基因组上非必需区域skin。

3.一种构建权利要求1或2所述重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，是以BSGN6-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1为出发菌株，以强启动子P43控制NAD(P)H氧化酶基因yodc表达，通过同源重组替换基因组上非必需区域skin。

4.一种应用权利要求1或2所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，将37℃、200rpm下培养12h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养30h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基按每L计含有：葡萄糖60g，酵母粉6g，NH₄SO₄ 7.74g，K₂HPO₄·3H₂O 12.5g，KH₂PO₄ 2.5g，CaCO₃ 5g，微量元素溶液15mL；微量元素溶液按每L计含有：MnSO₄·5H₂O 1.0g，CoCl₂·6H₂O 0.4g，NaMoO₄·2H₂O 0.2g，ZnSO₄·7H₂O 0.2g，AlCl₃·6H₂O 0.1g，CuCl₂·H₂O 0.1g，H₃BO₄ 0.05g，含5mol HCl。