CN104928333A - 一种敲除glcK促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法 - Google Patents

一种敲除glcK促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种敲除glcK促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法，属于遗传工程领域。本发明是以重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1作为出发菌株，通过同源重组敲除葡萄糖激酶编码基因glcK，阻断了宿主菌胞内乙酰氨基葡萄糖转化为乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸的反应，促进乙酰氨基葡萄糖积累。在使用合成培养基发酵过程中，敲除glcK的重组枯草芽孢杆菌的比生长速率和乙酰氨基葡萄糖的产量分别达到0.15h-1和3.0g/L，分别是敲除前菌株的2.14倍和2.32倍。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌更适合工业应用。

Description

一种敲除glcK促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法
技术领域
本发明涉及一种敲除glcK促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法，属于遗传工程领域。
背景技术
乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种广泛使用的食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级乙酰氨基葡萄糖的有效途径。以往构建的重组枯草芽孢杆菌(BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1)在发酵生产乙酰氨基葡萄糖时需要使用复合培养基(Liu,Y.et al.Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improvedN-acetylglucosamine production.Metab.Eng.23:42-52,2014)，复合培养基成分包含玉米浆、酵母粉、蛋白胨、葡萄糖等。不同批次的复合培养基的成分往往差异较大，特别是玉米浆，成分差异严重影响了发酵过程的稳定性和可控性。同时，复合培养基成本较高，也成为制约重组枯草芽孢杆菌应用于工业化发酵生产乙酰氨基葡萄糖的主要因素。使用各种营养成分确定的合成培养基进行发酵，能够避免不同批次发酵培养基的差异，显著降低生产成本，同时有利于产物分离纯化。然而实验表明，在合成培养基中重组枯草芽孢杆菌(BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1)生长缓慢，并且乙酰氨基葡萄糖产量相比于在复合培养基中显著降低。如何提高重组枯草芽孢杆菌(BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1)在合成培养基中的乙酰氨基葡萄糖产量成为亟待解决的问题。
本发明旨在提供一种提高重组枯草芽孢杆菌在合成培养基中的乙酰氨基葡萄糖产量的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种提高重组枯草芽孢杆菌在合成培养基中乙酰氨基葡萄糖产量的方法，是敲除重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1的葡萄糖激酶编码基因glcK，所得重组菌用于生产乙酰氨基葡萄糖。所述重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1，是以B.subtilis168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达。
在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖激酶编码基因glcK如NCBI-Gene ID:938206所示。
在本发明的一种实施方式中，重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1的构建方法参见文献Liu,Y.et al.Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improvedN-acetylglucosamine production.Metab.Eng.23:42-52,2014。
在本发明的一种实施方式中，通过pP43-GNA1质粒游离表达GNA1基因，通过pM7Z6M-PxylA-glmS质粒整合表达glmS基因。
在本发明的一种实施方式中，所述敲除重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1的葡萄糖激酶编码基因glcK，是通过构建葡萄糖激酶编码基因敲除框，经同源重组将敲除框中的壮观霉素抗性基因spc替代重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1基因组中葡萄糖激酶编码基因glcK，以阻断乙酰氨基葡萄糖至乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸的反应，实现乙酰氨基葡萄糖产量的提高。
本发明还提供一种在合成培养基中乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，是在重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1的基础上进一步敲除葡萄糖激酶编码基因glcK，所得到的重组菌。所述重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1，是以B.subtilis168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达。
本发明还提供一种应用所述乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖的方法，采用的发酵培养基按g/L计，含有：葡萄糖20.0、Na2HPO46-8、KH2PO41-1.5、(NH4)2SO42-2.5、MgSO40.2-0.3、FeSO4·7H2O 0.5-1.0、MnSO4·4H2O 0.05-0.1、胸腺嘧啶0.01-0。05以及色氨酸0.01-0.05。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基按g/L计，含有葡萄糖20.0、Na2HPO47.1、KH2PO41.35、(NH4)2SO42、MgSO40.25、FeSO4·7H2O 1.0、MnSO4·4H2O 0.1、胸腺嘧啶0.01以及色氨酸0.01。
在本发明的一种实施方式中，活化后的种子以5％-10％的接种量转入发酵培养基，同时加入诱导剂木糖，于35-37℃、200-220rpm条件下培养28-30h。
发明人通过13C同位素标记实验及基因序列同源性分析，发现葡萄糖激酶为催化乙酰氨基葡萄糖合成反应中的逆反应的关键酶，其催化乙酰氨基葡萄糖生成乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸。为提高乙酰氨基葡萄糖的产量，需要敲除乙葡萄糖激酶编码基因(glcK)，阻断乙酰氨基葡萄糖至乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸的反应。本发明提供的敲除了glcK的重组枯草芽孢杆菌可提高使用合成培养基时乙酰氨基葡萄糖的产量，产量可达到3.0g/L。尽管在合成培养基中，本发明提供的重组枯草芽孢杆菌的产量略低于以往构建的重组菌BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1在复合培养基中的产量(3.55g/L)，但是本发明提供的重组枯草芽孢杆菌在合成培养基中的乙酰氨基葡萄糖的的得率达到150.00mg/g，产物得率分别是BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1在合成培养基和复合培养基中的2.3倍(65.00mg/g)和1.7倍(88.75)。并且，通过进一步培养基条件优化及补料分批发酵条件优化，本发明提供的重组枯草芽孢杆菌的乙酰氨基葡萄糖产量有希望进一步提高。本发明为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌和发酵条件优化提高氨基葡萄糖产量并应用于工业生产奠定了基础。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。
具体实施方式
乙酰氨基葡萄糖的测定方法：
高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1200，RID检测器，NH2柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：70％乙腈，流速0.75mL/min，柱温30℃，进样体积为10μL。
种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。
发酵培养基(g/L)，为合成培养基：葡萄糖20.0、Na2HPO47.1、KH2PO41.35、(NH4)2SO42、MgSO40.25、FeSO4·7H2O 1.0、MnSO4·4H2O 0.1、胸腺嘧啶0.01以及色氨酸0.01。
培养条件：将37℃、200rpm下培养12h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，同时加入诱导剂木糖5g/L，于37℃、200rpm条件下培养30h。
实施例1 敲除葡萄糖激酶编码基因(glcK)
根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168(购自美国典型微生物保藏中心,ATCC No.27370)的葡萄糖激酶编码基因glcK的上下游序列，以及壮观霉素抗性基因的序列，构建序列如SEQ ID NO.1所示的敲除框。
将构建好的敲除框转化重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1，通过壮观霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证，确认葡萄糖激酶编码基因(glcK)敲除成功，得到重组枯草芽孢杆菌BSGNK。重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1的构建方法参见文献Liu,Y.etal.Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamine production.Metab.Eng.23:42-52,2014。BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1是通过pP43-GNA1质粒游离表达GNA1基因，通过pM7Z6M-PxylA-glmS质粒整合表达glmS基因。
实施例2 发酵生产乙酰氨基葡萄糖
将37℃、200rpm下培养12h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养30h。发酵30h，发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到3.0g/L。通过敲除葡萄糖激酶编码基因(glcK)，在使用合成培养基发酵的过程中，敲除glcK的重组枯草芽孢杆菌的比生长速率和乙酰氨基葡萄糖的产量分别达到0.15h-1和3.0g/L，分别是对照菌株BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1的2.14倍和2.32倍，实现了采用合成培养基时，乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量的提高。尽管，本发明提供的重组枯草芽孢杆菌在合成培养基中取得的乙酰氨基葡萄糖的产量略低于BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1在复合培养基中取得的产量(3.55g/L)，但是本发明提供的重组枯草芽孢杆菌在合成培养基中的乙酰氨基葡萄糖相对葡萄糖的得率达到150.00mg/g，是BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1在合成培养基和复合培养基中的产物得率的2.3倍(65.00mg/g)和1.7倍(88.75mg/g)。通过进一步优化培养基条件及补料分批发酵条件优化，本发明提供的重组枯草芽孢杆菌的乙酰氨基葡萄糖产量有希望进一步提高，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌和发酵条件优化提高氨基葡萄糖产量并应用于工业生产奠定了基础。
表1 BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1在复合培养基和合成培养基中细胞生长和乙酰氨基葡萄糖合成情况
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，是敲除重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1的葡萄糖激酶编码基因glcK，所得重组菌用于生产乙酰氨基葡萄糖；所述重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1，是以B.subtilis168 ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖激酶编码基因glcK如NCBI中Gene ID:938206所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述敲除重组枯草芽孢杆菌
BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1的葡萄糖激酶编码基因glcK，是通过构建葡萄糖激酶编码基因敲除框，经同源重组将敲除框中的壮观霉素抗性基因spc替代重组枯草芽孢杆菌
BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1基因组中葡萄糖激酶编码基因glcK，以阻断乙酰氨基葡萄糖至乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸的反应，实现乙酰氨基葡萄糖产量的提高。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用合成培养基。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，采用合成培养基，合成培养基按g/L计，含有：葡萄糖20.0、Na2HPO4 6-8、KH2PO4 1-1.5、(NH4)2SO4 2-2.5、MgSO4 0.2-0.3、FeSO4·7H2O 0.5-1.0、MnSO4·4H2O 0.05-0.1、胸腺嘧啶0.01-0.05以及色氨酸0.01-0.05。
6.一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，在重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1的基础上进一步敲除葡萄糖激酶编码基因glcK，所得到的重组菌；所述重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1，是以B.subtilis168 ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达。
7.一种应用权利要求6所述乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，采用的发酵培养基按g/L计，含有：葡萄糖20.0、Na2HPO46-8、KH2PO4 1-1.5、(NH4)2SO4 2-2.5、MgSO4 0.2-0.3、FeSO4·7H2O 0.5-1.0、MnSO4·4H2O 0.05-0.1、胸腺嘧啶0.01-0。05以及色氨酸0.01-0.05。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基按g/L计，含有葡萄糖20.0、Na2HPO4 7.1、KH2PO4 1.35、(NH4)2SO4 2、MgSO4 0.25、FeSO4·7H2O 1.0、MnSO4·4H2O 0.1、胸腺嘧啶0.01以及色氨酸0.01。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，将活化后的种子以5％-10％的接种量转入发酵培养基，同时加入诱导剂木糖，于35-37℃、200-220rpm条件下培养28-30h。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，木糖用量为5g/L。
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