CN107604025A

CN107604025A - 一种提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法

Info

Publication number: CN107604025A
Application number: CN201710948053.XA
Authority: CN
Inventors: 刘龙; 陈坚; 堵国成; 李江华; 武耀康; 陈泰驰
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-10-12
Filing date: 2017-10-12
Publication date: 2018-01-19

Abstract

本发明公开了一种提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法，属于遗传工程领域。是以枯草芽孢杆菌BSGNKAP‑P_xylA‑glmS‑P₄₃‑GNA1为出发菌株，在质粒上将磷酸酶基因yqaB与氨基葡萄糖乙酰化酶的编码基因GNA1进行共表达，加强乙酰氨基葡萄糖合成途径，得到了积累乙酰氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌基因工程菌，摇瓶水平上产量达到14.5g/L，乙酰氨基葡萄糖得率达到0.255g/g葡萄糖，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。

Description

一种提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法

技术领域

本发明涉及一种提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法，属于遗传工程领域。

背景技术

乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级乙酰氨基葡萄糖的有效途径。然而，专利申请201510761678.6中构建的重组枯草芽孢杆菌(BSGNKAP-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1)存在产量不高、产物转化率较低的缺点。因此，提高乙酰氨基葡萄糖合成途径代谢通量，是提高乙酰氨基葡萄糖产量亟待解决的问题。目前枯草芽孢杆菌中催化乙酰氨基葡萄糖合成途径的最后一步反应，即6-磷酸乙酰氨基葡萄糖转化为乙酰氨基葡萄糖的酶尚不清楚。据报道在酿酒酵母中表达来自于大肠杆菌的HAD-like家族的三个磷酸酶后对乙酰氨基葡萄糖的合成都有明显的促进作用；而以大肠杆菌作为宿主菌时只需强化6-磷酸氨基葡萄糖合酶glmS与6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因GNA1便可达到很高的乙酰氨基葡萄糖产量，很可能是因为其周质空间中存在丰富的磷酸酶可以催化6-磷酸乙酰氨基葡萄糖转化为乙酰氨基葡萄糖。而枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，其不存在大肠杆菌那样的周质空间结构，因此推测在重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1中6-磷酸乙酰氨基葡萄糖转化为乙酰氨基葡萄糖的反应可能为其合成乙酰氨基葡萄糖的限速步骤(图1)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是构建一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌。

本发明的第一个目的是提供一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的磷酸酶。

在本发明的一种实施方式中，所述磷酸酶的编码基因yqaB是来源于大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌BSGNKAP-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1为出发菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌BSGNKAP-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1是以枯草芽孢杆菌168为基础，基因型作如下改造得到的：ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔptaΔglcKΔpckAΔpyk::lox72，并以木糖诱导启动子P_xylA调控表达glmS、在质粒上以启动子P₄₃调控GNA1的重组表达。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌BSGNKAP-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1，是申请号为201510761678.6的申请中构建的重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1。

在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1是来源于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)，表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以pP43NMK为表达载体共表达磷酸酶编码基因与氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌，将来自于大肠杆菌的磷酸酶基因yqaB与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1，克隆到表达载体pP43NMK上，然后转化重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP-P_xylA-glmS得到。

本发明的第二个目的是提供一种表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的磷酸酶的重组质粒，所述重组质粒还表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的氨基葡萄糖乙酰化酶。

本发明的第三个目的是提供一种构建上述重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)构建重组质粒

将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示磷酸酶的编码基因与氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示氨基葡萄糖乙酰化酶的编码基因通过融合PCR的方式构建表达框进行共表达，并连接到载体pP43NMK上得到重组表达载体；

2)构建产乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌

将上述重组表达载体转化枯草芽孢杆菌BSGNKAP-P_xylA-glmS，得到积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌。

本发明的第四个目的是提供所述重组枯草芽孢杆菌在药物、营养保健品或者化妆品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是利用所述重组枯草芽孢杆菌生产乙酰氨基葡萄糖。

在本发明的一种实施方式中，所述应用将35-38℃、200-240rpm下培养10-15h的重组枯草芽孢杆菌以5-10％的接种量转入发酵培养基，接种2-4h后加入诱导剂木糖，于35-38℃、200-240rpm条件下发酵30-60h。

在本发明的一种实施方式中，木糖用量为1-10g/L。

本发明的有益效果：

本发明提供的重组枯草芽孢杆菌可高效利用葡萄糖合成乙酰氨基葡萄糖，其摇瓶发酵产量可达到14.5g/L，同时本发明提供的重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵乙酰氨基葡萄糖得率已提高到0.255g/g葡萄糖，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。

附图说明

图1为重组枯草芽孢杆菌中乙酰氨基葡萄糖合成途径；

图2为不同磷酸酶对重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖的影响。

具体实施方式

种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨6，酵母粉12，(NH4)SO46，K₂HPO₄·3H₂O 12.5，KH₂PO₄2.5，CaCO₃5，微量元素10ml/L；微量元素溶液按g/L计含有：MnSO₄·5H₂O 1.0，CoCl₂·6H₂O0.4，NaMoO₄·2H₂O 0.2，ZnSO₄·7H₂O 0.2，AlCl₃·6H₂O 0.1，CuCl₂·H₂O 0.1，H₃BO₄0.05，含5M HCl。

乙酰氨基葡萄糖的测定方法：

高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1260，RID检测器，HPX-87H柱(Bio-RadHercules,CA)，流动相：5mM H₂SO₄，流速0.6mL/min，柱温35oC，进样体积为10μL。

乙酰氨基葡萄糖得率的计算：

乙酰氨基葡萄糖得率(Y_GlcNAc/Glc)＝乙酰氨基葡萄糖产量(g/L)/消耗的葡萄糖(g/L)

实施例1：重组质粒的构建

根据氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的来源于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)的氨基葡萄糖乙酰化酶的编码基因GNA1，设计序列如SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4所示的引物GNA1-yqaB-1-FKpnI：5’-TAGCGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGAGCCATATCTTCGACGC-3’，GNA1-yqaB-1-RRBS：5’-GTACATGTGTACGCCTCCTTTTATAATGTTAAAAGCGCTGGGTCATAAAAT-3’；使用上述引物从质粒pP43-GNA1中克隆出氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1。

根据氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的磷酸酶基因yqaB，设计序列如SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6的引物GNA1-yqaB-2-FRBS：5’-GCTTTTAACATTATAAAAGGAGGCGTACACATGTACGAGCGTTATGCAG-3’，GNA1-yqaB-2-RHi ndIII：5’-ACGCCAAGCTTTCACAGCAAGCGAACATCC-3’；使用上述引物分从大肠杆菌(Escherichia coli)基因组中扩增出磷酸酶基因yqaB，并在其上游引入RBS序列AAAGGA GG。

然后通过重叠延伸PCR的方式将两个基因通过融合PCR的方式构建共表达框，融合片段经KpnI和HIndIII双酶切后连接至pP43NMK表达载体。酶切验证并测序，确认重组质粒构建成功，命名为pP43-GNA1-yqaB。表达载体pP43NMK的构建方法参见：High-LevelExpression and Secretion of Methyl Parathion Hydrolase in Bacillus subtilisWB800.Xiao-Zhou Zhang,et al.Applied and Environmental Microbiology,71(4102-4103)。

实施例2：重组枯草芽孢杆菌的构建

将构建好的表达载体pP43-GNA1-yqaB转化重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP-P_xylA-glmS。采用GNA1-yqaB-1-FKpnI及GNA1-yqaB-2-RHindIII引物挑选转化子进行菌落PCR，出现1151bp条带，验证重组枯草芽孢杆菌构建成功。

实施例3：重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖

采用实施例1构建得到的重组芽孢杆菌进行摇瓶发酵，将37℃、220rpm下培养12h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，两小时后加入木糖进行诱导，于37℃、220rpm条件下培养48h。最终发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到14.5g/L，乙酰氨基葡萄糖得率达到0.255g/g葡萄糖。

对照菌株以BSGNKAP-P_xylA-glmS为出发菌株，将秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1连接到表达载体pP43NMK上，转化枯草芽孢杆菌BSGNKAP-P_xylA-glmS中，得到对照菌株，在相同培养条件下发酵培养，最终发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到11.1g/L，乙酰氨基葡萄糖得率为0.192g/g葡萄糖。

通过比较，共表达大肠杆菌来源的yqaB基因与秀丽隐杆线虫来源的GNA1的重组枯草芽孢杆菌发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖产量较只表达了秀丽隐杆线虫来源GNA1基因的对照菌株提高了30.6％(结果如表一所示)，乙酰氨基葡萄糖得率提高了32.8％。通过量表达磷酸酶yqaB，实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外的积累。

表1 表达磷酸酶前后细胞生长和乙酰氨基葡萄糖合成情况

对照例1：表达其他磷酸酶对重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖的影响

以大肠杆菌基因组为模板分别克隆出磷酸酶核苷酸序列如NCBI-Gene ID:948380所示的yihX、核苷酸序列如NCBI-Gene ID:948357所示的yigB与核苷酸序列如NCBI-GeneID:947904所示的yrfG，利用实施例1中融合PCR的方式构建分别含有6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1与不同磷酸酶的的共表达框，融合片段经KpnI和HIndIII双酶切后连接至pP43NMK表达载体。酶切验证并测序，确认重组质粒构建成功。将含有不同磷酸酶基因的表达载体转化重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP-P_xylA-glmS，采用实施例3的方式进行发酵验证，结果如图2所示，除yqaB外，均对产量无明显的促进作用，说明在重组枯草芽孢杆菌中只有yqaB可以特异性地催化6-磷酸乙酰氨基葡萄糖转化为乙酰氨基葡萄糖。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 165

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser His Ile Phe Asp Ala Ser Val Leu Ala Pro His Ile Pro Ser

1 5 10 15

Asn Leu Pro Asp Asn Phe Lys Val Arg Pro Leu Ala Lys Asp Asp Phe

20 25 30

Ser Lys Gly Tyr Val Asp Leu Leu Ser Gln Leu Thr Ser Val Gly Asn

35 40 45

Leu Asp Gln Glu Ala Phe Glu Lys Arg Phe Glu Ala Met Arg Thr Ser

50 55 60

Val Pro Asn Tyr His Ile Val Val Ile Glu Asp Ser Asn Ser Gln Lys

65 70 75 80

Val Val Ala Ser Ala Ser Leu Val Val Glu Met Lys Phe Ile His Gly

85 90 95

Ala Gly Ser Arg Gly Arg Val Glu Asp Val Val Val Asp Thr Glu Met

100 105 110

Arg Arg Gln Lys Leu Gly Ala Val Leu Leu Lys Thr Leu Val Ser Leu

115 120 125

Gly Lys Ser Leu Gly Val Tyr Lys Ile Ser Leu Glu Cys Val Pro Glu

130 135 140

Leu Leu Pro Phe Tyr Ser Gln Phe Gly Phe Gln Asp Asp Cys Asn Phe

145 150 155 160

Met Thr Gln Arg Phe

165

<210> 2

<211> 188

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Tyr Glu Arg Tyr Ala Gly Leu Ile Phe Asp Met Asp Gly Thr Ile

1 5 10 15

Leu Asp Thr Glu Pro Thr His Arg Lys Ala Trp Arg Glu Val Leu Gly

20 25 30

His Tyr Gly Leu Gln Tyr Asp Ile Gln Ala Met Ile Ala Leu Asn Gly

35 40 45

Ser Pro Thr Trp Arg Ile Ala Gln Ala Ile Ile Glu Leu Asn Gln Ala

50 55 60

Asp Leu Asp Pro His Ala Leu Ala Arg Glu Lys Thr Glu Ala Val Arg

65 70 75 80

Ser Met Leu Leu Asp Ser Val Glu Pro Leu Pro Leu Val Asp Val Val

85 90 95

Lys Ser Trp His Gly Arg Arg Pro Met Ala Val Gly Thr Gly Ser Glu

100 105 110

Ser Ala Ile Ala Glu Ala Leu Leu Ala His Leu Gly Leu Arg His Tyr

115 120 125

Phe Asp Ala Val Val Ala Ala Asp His Val Lys His His Lys Pro Ala

130 135 140

Pro Asp Thr Phe Leu Leu Cys Ala Gln Arg Met Gly Val Gln Pro Thr

145 150 155 160

Gln Cys Val Val Phe Glu Asp Ala Asp Phe Gly Ile Gln Ala Ala Arg

165 170 175

Ala Ala Gly Met Asp Ala Val Asp Val Arg Leu Leu

180 185

<210> 3

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tagcggtacc attataggta agagaggaat gtacacatga gccatatctt cgacgc 56

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtacatgtgt acgcctcctt ttataatgtt aaaagcgctg ggtcataaaa t 51

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcttttaaca ttataaaagg aggcgtacac atgtacgagc gttatgcag 49

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acgccaagct ttcacagcaa gcgaacatcc 30

Claims

1.一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的磷酸酶。

2.根据权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌BSGNKAP-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1为出发菌株。

3.根据权利要求2所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌BSGNKAP-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1是以枯草芽孢杆菌168为基础，基因型作如下改造得到的：ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔptaΔglcKΔpckAΔpyk::lox72，并以木糖诱导启动子P_xylA调控表达glmS、在质粒上以启动子P₄₃调控GNA1的重组表达。

4.根据权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌以pP43NMK为表达载体共表达磷酸酶编码基因与氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因。

5.一种表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的磷酸酶的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒还表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的氨基葡萄糖乙酰化酶。

6.一种构建权利要求1-4任一所述重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)构建重组质粒

将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示磷酸酶的编码基因与氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示氨基葡萄糖乙酰化酶的编码基因通过融合PCR的方式构建表达框进行共表达，并连接到载体pP43NMK上得到重组表达载体；

2)构建产乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌

7.权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌在药物、营养保健品或者化妆品中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述应用是利用所述重组枯草芽孢杆菌生产乙酰氨基葡萄糖。

9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，将35-38℃、200-240rpm下培养10-15h的重组枯草芽孢杆菌以5-10％的接种量转入发酵培养基，接种2-4h后加入诱导剂木糖，于35-38℃、200-240rpm条件下发酵30-60h。