CN105176903A - 一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105176903A
CN105176903A CN201510661135.7A CN201510661135A CN105176903A CN 105176903 A CN105176903 A CN 105176903A CN 201510661135 A CN201510661135 A CN 201510661135A CN 105176903 A CN105176903 A CN 105176903A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus subtilis
acetylglucosamine
recombined bacillus
glucosamine
subtilis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510661135.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105176903B (zh
Inventor
刘龙
陈坚
堵国成
李江华
徐小芳
刘延峰
马文龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201510661135.7A priority Critical patent/CN105176903B/zh
Publication of CN105176903A publication Critical patent/CN105176903A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105176903B publication Critical patent/CN105176903B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。本发明是以重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS作为出发菌株，通过过量表达来源于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis？elegans)的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因(CeGNA1)，加强氨糖合成途径，得到了积累乙酰氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌基因工程菌，摇瓶水平上产量达到7.31g/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。

Description

一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。
背景技术
氨基葡萄糖是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物，是一种重要的功能单糖，也是第一个被确认结构的氨基单糖。N-乙酰氨基葡萄糖是氨基葡萄糖的衍生物具有重要的生理功能，在保健食品和医药领域具有广泛应用，如能特异性地作用于关节软骨，有效治疗风湿性关节炎；可抑制白血病细胞K562的生长，是新型抗癌药物氯脲霉素的主要成分；可参与肝肾解毒，发挥抗炎、护肝的作用等。
氨基葡萄糖和的生产方法可分为三种：甲壳素水解法、生物转化法和微生物发酵法，其中甲壳素水解是目前生产氨基葡萄糖的主要方法。甲壳素水解是利用强酸强碱将虾壳或蟹壳中的甲壳素水解，再经过过滤和脱色处理，最后蒸馏结晶得到成品。水解法存在很多缺点，如原料来源受到一定的地域和季节限制，环境污染严重，部分消费者服用后会过敏等。生物转化法是指利用微生物的甲壳素水解酶将甲壳素进行酶解得到单体氨基葡萄糖。相对于水解法，生物转化法对环境的污染较小，但由于甲壳素水解酶的价格较高，目前仅限于实验室研究阶段。虽然用含有甲壳素水解酶的微生物细胞直接进行生物转化可降低生产成本，但转化时间很长，生产强度很低。在这种背景下，近几年人们对微生物发酵法生产氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖产生了浓厚的兴趣。相对于水解法和生物转化法，微生物发酵法具有以下优点:1)发酵时间较短，生产强度较高；2)原料来源不受地域和季节限制，产品无鱼腥味；3)对环境污染小；4)产品来自微生物，消费者服用后不会出现过敏。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是构建一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌。
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，是以枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS为出发菌株，将外源氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因，特别是秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)克隆到表达载体pP43NMK，然后转化重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS得到。
在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因经优化后，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
所述枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS是以枯草芽孢杆菌168为基础，基因型作如下改造：ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72，并以木糖诱导启动子PxylA调控表达glmS基因。
所述枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS的构建方法参见：ModularpathwayengineeringofBacillussubtilisforimprovedN-acetylglucosamineproduction.YanfengLiu,etal.MetabolicEngineering,23(2014)p42-52.
本发明优选是用表达载体pP43NMK表达氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种构建上述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，主要包括如下步骤：
1)构建重组质粒
将核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因(CeGNA1)，连接到质粒pP43NMK上，得到重组表达载体；
2)构建产乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌
将上述重组表达载体转化枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS，得到积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌。
本发明还提供了一种应用上述重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖的方法，将37℃、200rpm下培养12h的重组枯草芽孢杆菌以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下发酵30h。
重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：
种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10。
发酵培养基(g/L)：玉米浆干粉20，酵母粉20，K2HPO4·3H2O12.5，KH2PO42.5，CaCO35，微量元素15ml/L；微量元素溶液按g/L计含有：MnSO4·5H2O1.0，CoCl2·6H2O0.4，NaMoO4·2H2O0.2，ZnSO4·7H2O0.2，AlCl3·6H2O0.1，CuCl2·H2O0.1，H3BO40.05，含5MHCl。
培养条件：将37℃、200rpm下培养12h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养30h。
氨基葡萄糖乙酰化酶属于GCN5相关的GNAT蛋白质超家族，催化N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸的生成，将乙酰辅酶A中的乙酰基转移到葡萄糖胺-6-磷酸的氨基上，是N-乙酰氨基葡萄糖合成途径上的关键性酶。对氨基葡萄糖乙酰化酶的改造对在重组枯草芽孢杆菌积累乙酰氨基葡萄糖有重要作用。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌可实现乙酰氨基葡萄糖在胞外积累，其浓度在摇瓶水平上可达到7.31g/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。
具体实施方式
乙酰氨基葡萄糖的测定方法：
高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent1260，RID检测器，HPX-87H柱(Bio-RadHercules,CA)，流动相：5mMH2SO4，流速0.6mL/min，柱温35℃，进样体积为10μL。
实施例1重组质粒的构建
根据NCBI上公布的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)中氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因(CeGNA1)核苷酸序列如NCBIGenBank:AB017628.1所示，进行枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化，得到核苷酸序列如SEQIDNO.1的基于，并由上海生工生物工程股份有限公司合成基因序列。设计引物CeGNA1-F:5’-GGGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGAGCCATATCTTCGACGCATCTG-3’，CeGNA1-R：5’-CCCAAGCTTTTAAAAGCGCTGGGTCATAAAATTA-3’。使用上述引物从合成的序列核苷酸序列SEQIDNO.1中扩增优化后的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因(CeGNA1)。扩增片段经KpnI和HIndIII双酶切后连接至pP43NMK表达载体。酶切验证并测序，确认重组质粒构建成功，命名为pP43-CeGNA1。表达载体pP43NMK的构建方法参见：High-LevelExpressionandSecretionofMethylParathionHydrolaseinBacillussubtilisWB800.Xiao-ZhouZhang,etal.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,71(4102-4103).
实施例2重组枯草芽孢杆菌的构建
将构建好的表达载体pP43-CeGNA1转化重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS。采用CeGNA1-F及CeGNA1-R引物挑选转化子进行菌落PCR，出现498bp条带，验证重组枯草芽孢杆菌构建成功。
实施例3发酵生产乙酰氨基葡萄糖
将37℃、200rpm下培养12h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养30h。最终发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到7.31g/L。对照菌株以BSGN6-PxylA-glmS为出发菌株，过量表达来源于酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaeS288C)的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1(核苷酸序列如NCBIGenBank:NM_001179949)，相同培养条件下最终发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到5.87g/L。通过比较，表达了秀丽隐杆线虫来源的CeGNA1基因的重组枯草芽孢杆菌发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖产量较表达了酿酒酵母来源GNA1基因的对照菌株提高了24.51％。通过量表达氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因(CeGNA1)，实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外的积累。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，是以枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS为出发菌株，表达了外源氨基葡萄糖乙酰化酶的编码基因CeGNA1。
2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS是以枯草芽孢杆菌168为基础，基因型作如下改造得到的：(1)ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72，(2)以木糖诱导启动子PxylA调控表达氨基葡萄糖合成酶基因glmS。
3.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因为秀丽隐杆线虫来源，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
4.权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以pP43NMK为表达载体表达氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因。
5.一种构建权利要求1-4任一所述重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)构建重组质粒
将核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因连接到载体pP43NMK得到重组表达载体；
2)构建产乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌
将上述重组表达载体转化枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS，得到积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌。
6.应用权利要求1-4任一所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，将37℃、200rpm下培养12h的重组枯草芽孢杆菌以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下发酵30h。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基按每L计含有：玉米浆干粉20g，酵母粉20g，K2HPO4·3H2O12.5g，KH2PO42.5g，CaCO35g，微量元素溶液15ml；微量元素溶液按g/L计含有：MnSO4·5H2O1.0，CoCl2·6H2O0.4，NaMoO4·2H2O0.2，ZnSO4·7H2O0.2，AlCl3·6H2O0.1，CuCl2·H2O0.1，H3BO40.05，含5MHCl。
CN201510661135.7A 2015-10-14 2015-10-14 一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用 Active CN105176903B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510661135.7A CN105176903B (zh) 2015-10-14 2015-10-14 一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510661135.7A CN105176903B (zh) 2015-10-14 2015-10-14 一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105176903A true CN105176903A (zh) 2015-12-23
CN105176903B CN105176903B (zh) 2018-03-16

Family

ID=54899337

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510661135.7A Active CN105176903B (zh) 2015-10-14 2015-10-14 一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105176903B (zh)

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106479945A (zh) * 2015-12-29 2017-03-08 山东润德生物科技有限公司 一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌
CN106635940A (zh) * 2016-10-19 2017-05-10 齐鲁工业大学 一株高产氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌的构建方法与应用
CN106929462A (zh) * 2017-04-25 2017-07-07 江南大学 一种积累n‑乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌及其应用
CN106929499A (zh) * 2017-04-26 2017-07-07 扬州日兴生物科技股份有限公司 一种定向改造的氨基葡萄糖合酶突变体及其应用
CN107604025A (zh) * 2017-10-12 2018-01-19 江南大学 一种提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法
CN107841505A (zh) * 2017-10-10 2018-03-27 江南大学 一种食品安全级菌株及其制备氨基葡萄糖的方法
CN108070602A (zh) * 2017-12-12 2018-05-25 山东隆科特酶制剂有限公司 一种减少及推迟芽孢杆菌芽孢生成的分子改造方法
CN108424870A (zh) * 2018-04-04 2018-08-21 江南大学 一种生产n-乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌及其应用
CN108531436A (zh) * 2018-04-12 2018-09-14 江南大学 一种积累几丁寡糖重组枯草芽孢杆菌及其应用
CN108588049A (zh) * 2018-05-16 2018-09-28 浙江中医药大学 一种氨基葡萄糖合成酶、工程菌及其应用
CN111607626A (zh) * 2020-06-24 2020-09-01 江南大学 一种环糊精酶在制备麦芽七糖中的应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108728392A (zh) * 2018-05-30 2018-11-02 江南大学 一种可高效表达角蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102978149A (zh) * 2012-12-25 2013-03-20 江南大学 一种高产乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌及其应用
CN103045527A (zh) * 2012-12-25 2013-04-17 江南大学 一种积累乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌及其应用
CN104498394A (zh) * 2014-11-27 2015-04-08 江南大学 一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102978149A (zh) * 2012-12-25 2013-03-20 江南大学 一种高产乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌及其应用
CN103045527A (zh) * 2012-12-25 2013-04-17 江南大学 一种积累乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌及其应用
CN104498394A (zh) * 2014-11-27 2015-04-08 江南大学 一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MIO，T.等人: "登录号：AB017628.1", 《GENBANK》 *
YANFENG LIU等人: "Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamine production", 《METABOLIC ENGINEERING》 *

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106479945A (zh) * 2015-12-29 2017-03-08 山东润德生物科技有限公司 一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌
CN106479945B (zh) * 2015-12-29 2019-10-01 山东润德生物科技有限公司 一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌
CN106635940A (zh) * 2016-10-19 2017-05-10 齐鲁工业大学 一株高产氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌的构建方法与应用
CN106635940B (zh) * 2016-10-19 2019-10-18 齐鲁工业大学 一株产氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌的构建方法与应用
CN106929462A (zh) * 2017-04-25 2017-07-07 江南大学 一种积累n‑乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌及其应用
CN106929499A (zh) * 2017-04-26 2017-07-07 扬州日兴生物科技股份有限公司 一种定向改造的氨基葡萄糖合酶突变体及其应用
CN107841505A (zh) * 2017-10-10 2018-03-27 江南大学 一种食品安全级菌株及其制备氨基葡萄糖的方法
CN107604025A (zh) * 2017-10-12 2018-01-19 江南大学 一种提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法
CN108070602B (zh) * 2017-12-12 2020-11-06 山东隆科特酶制剂有限公司 一种减少及推迟芽孢杆菌芽孢生成的分子改造方法
CN108070602A (zh) * 2017-12-12 2018-05-25 山东隆科特酶制剂有限公司 一种减少及推迟芽孢杆菌芽孢生成的分子改造方法
CN108424870A (zh) * 2018-04-04 2018-08-21 江南大学 一种生产n-乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌及其应用
CN108424870B (zh) * 2018-04-04 2021-07-27 江南大学 一种生产n-乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌及其应用
CN108531436A (zh) * 2018-04-12 2018-09-14 江南大学 一种积累几丁寡糖重组枯草芽孢杆菌及其应用
CN108588049B (zh) * 2018-05-16 2021-05-14 浙江中医药大学 一种氨基葡萄糖合成酶、工程菌及其应用
CN108588049A (zh) * 2018-05-16 2018-09-28 浙江中医药大学 一种氨基葡萄糖合成酶、工程菌及其应用
CN111607626A (zh) * 2020-06-24 2020-09-01 江南大学 一种环糊精酶在制备麦芽七糖中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105176903B (zh) 2018-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105176903A (zh) 一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用
CN106479945B (zh) 一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌
CN104928333B (zh) 一种敲除glcK促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法
Yun et al. Production of 3, 6-anhydro-L-galactose from agarose by agarolytic enzymes of Saccharophagus degradans 2-40
CN104498394A (zh) 一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌
Ning et al. Production of neo-fructooligosaccharides using free-whole-cell biotransformation by Xanthophyllomyces dendrorhous
CN105255803A (zh) 一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌
CN104293724A (zh) 一种高效生产n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌
US11028421B2 (en) Recombinant Pseudomonas plecoglossicida for producing L-xylose and application thereof
CN109321590B (zh) 利用乙酸生产l-乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用
US10633658B2 (en) Method for producing N-acetylglucosamine by co-utilizing glucose and xylose based on CRISPRi
CN105238724A (zh) 一种敲除pckA促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法
CN107604025A (zh) 一种提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法
CN103497922B (zh) 一种联产3-hp和p3hp的重组肺炎克雷伯氏菌及其制备方法和应用
CN105255849A (zh) 一种酶活提高的谷氨酸脱羧酶突变体构建及其应用
Abd El-Malek et al. Microorganism-mediated algal biomass processing for clean products manufacturing: Current status, challenges and future outlook
CN102978149A (zh) 一种高产乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌及其应用
Abbasi et al. Recent advances in producing sugar alcohols and functional sugars by engineering Yarrowia lipolytica
Inokuma et al. Ethanol production from N-acetyl-D-glucosamine by Scheffersomyces stipitis strains
CN104046586B (zh) 一株基因工程菌及其在生产(2r,3r)-2,3-丁二醇中的应用
Meng et al. Efficient biosynthesis of exopolysaccharide from Jerusalem artichoke using a novel strain of Bacillus velezensis LT-2
Anh et al. Production of pyruvate from Ulva reticulata using the alkaliphilic, halophilic bacterium Halomonas sp. BL6
CN105176879B (zh) 一种敲除argCJBD提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法
WO2022016641A1 (zh) 一种生产n-乙酰氨基葡萄糖的菌株及其构建方法和应用
Long et al. High-level production of cordycepin by the xylose-utilising Cordyceps militaris strain 147 in an optimised medium

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant