CN108588049A

CN108588049A - 一种氨基葡萄糖合成酶、工程菌及其应用

Info

Publication number: CN108588049A
Application number: CN201810466170.7A
Authority: CN
Inventors: 程汝滨; 葛宇清; 方昀; 朱玲燕; 陈梦
Original assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Current assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Priority date: 2018-05-16
Filing date: 2018-05-16
Publication date: 2018-09-28
Anticipated expiration: 2038-05-16
Also published as: CN108588049B

Abstract

本发明公开了一种氨基葡萄糖合成酶、工程菌及其应用，该氨基葡萄糖合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明从一株枯草芽孢杆菌中克隆获得高活性的氨基葡萄糖合成酶基因BS‑glmS，利用BS‑glmS基因构建重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得的基因工程菌株在氨基葡萄糖发酵生产方面的能力显著提升，构建的基因工程菌株在发酵16h时的氨基葡萄糖和N‑乙酰氨基葡萄糖的总发酵产量可达26.51g/L，较大肠杆菌来源的glmS基因获得的基因工程菌株发酵产量提高了18.2％。

Description

一种氨基葡萄糖合成酶、工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物基因工程技术领域，尤其涉及一种氨基葡萄糖合成酶、工程菌及其应用。

背景技术

氨基葡萄糖(Glucosamine，GlcN)是一种重要的氨基己糖，它由葡萄糖的一个羟基被氨基取代而形成，其存在于所有生物体中，在人体中是透明质酸、硫酸软骨素及硫酸角质素等葡糖胺多糖的二糖单元前体，是体内多种糖蛋白和蛋白聚糖的主要成分。

氨基葡萄糖在保健食品和医药领域具有广泛应用，其能特异性地作用于关节软骨，有效治疗风湿性关节炎；可抑制多种肿瘤细胞的生长，诱导细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用；活化自然杀伤细胞等免疫细胞的功能，调节人体的免疫系统；也可参与肝肾解毒，发挥抗炎、护肝的作用等。在骨关节炎治疗领域，已有氨基葡萄糖相关的胶囊剂和片剂上市销售，需求量和销售额呈逐年上升趋势。此外，GlcN在食品保健领域也有着广泛的应用，在欧美等国家，GlcN因被视为天然无害的食品及保健品配料而得到大量推广，GlcN及其复合物作为食品保健品拥有多达数十亿美元的市场。

氨基葡萄糖广泛存在于真菌细胞壁及虾蟹的外骨骼中，是甲壳素与壳聚糖的组成成分。目前，氨基葡萄糖的生产方法主要有三种，分别是酸水解法、酶解法和微生物发酵法。

前两种方法的生产原料基本上来源于虾蟹的外骨骼，即从虾蟹壳中提取甲壳素与壳聚糖，再经酸解或酶解获得氨基葡萄糖(GlcN)。高浓度的盐酸在一定的反应条件下能够将虾蟹壳中的甲壳素与壳聚糖降解，经过滤和脱色处理后，最后蒸馏可得到GlcN，但由于浓盐酸的大量使用会带来严重的环境问题，将逐步受到国家相关政策的限制。

酶解法是利用壳聚糖酶对虾蟹壳进行水解，由于缺乏高效的壳聚糖降解酶，生产效率低下，转化时间较长，生产成本较高；并且，来源于虾蟹壳的GlcN在临床应用过程中易引起过敏体质患者的过敏反应。在这种背景下，近年来人们对微生物发酵法生产氨基葡萄糖产生了浓厚兴趣。相较于酸水解法与酶解法，微生物发酵法生产GlcN具有以下优点：生产周期短，强度高；对环境污染较小；消除了地域季节对原料来源的限制，产品无鱼腥味；产量的过敏等不良反应少。

在氨基葡萄糖的生物合成过程中，起始的底物为糖酵解过程产生的6-磷酸果糖，一分子的6-磷酸果糖和一分子的谷氨酰胺，在氨基葡萄糖合成酶(glmS)的催化作用下，生成一分子的氨基葡萄糖和一分子谷氨酸盐，该催化过程是GlcN合成途径中的关键步骤，也是第一个限速反应。利用大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖过程中，由于GlcN对细胞均有较大的刺激性，高浓度的GlcN会抑制细胞的生长，影响发酵产量。将GlcN通过氨基葡萄糖乙酰化酶转化为对细胞刺激性较小的GlcNAc分泌至胞外，可解除GlcN对细胞生长的抑制，提高胞外GlcN的发酵积累量。在大肠杆菌基因工程菌株构建时，强化氨基葡萄糖合成酶glmS的表达活性，并同时表达外源性的氨基葡萄糖乙酰化酶GAN1，可有效提高胞外GlcN的积累量(陈坚,堵国成,刘龙,等.一种通过同源重组敲除nagE的高产氨基葡萄糖工程菌及其构建方法[P],CN102268399A.2011)。

此外，氨基葡萄糖合成酶gmS基因的表达水平和酶活力对氨基葡萄糖的发酵产量具有重要影响，目前基因工程菌株构建的glmS基因均来源于大肠杆菌，在大肠杆菌工程菌发酵过程中，glmS基因的酶活受到GlcN的反馈抑制，制约了发酵法生产氨基葡萄糖的产量提高。高活性的glmS基因的筛选及其在大肠杆菌中的异源基因工程表达株构建，是提高发酵法生产氨基葡萄糖的产量的关键。

发明内容

本发明提供了一种氨基葡萄糖合成酶、工程菌及其应用，该氨基葡萄糖合成酶的活性高，构建的工程菌经发酵培养后可高效表达氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖。

具体内容如下：

本发明提供了一种氨基葡萄糖合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了一种编码所述的氨基葡萄糖合成酶的基因。

具体地，所述氨基葡萄糖合成酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

上述氨基葡萄糖合成酶基因来源于枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilissubsp.subtilis)1.2163(购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号为1.2163)，基因全长序列为1803bp。

本发明提供的氨基葡萄糖合成酶不仅是由SEQ IN No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；还可以是将SEQ IN No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有氨基葡萄糖合成酶活性的由SEQ ID No.1衍生的蛋白质。

为进一步提高胞外氨基葡萄糖和胞外N-乙酰氨基葡萄糖的表达量，本发明还提供了一种重组载体，其包含依次连接的氨基葡萄糖合成酶基因、核糖体结合序列、酿酒酵母氨基葡萄糖乙酰化酶基因和表达载体；所述氨基葡萄糖合成酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述核糖体结合序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述酿酒酵母氨基葡萄糖乙酰化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

作为优选，所述表达载体为pET-28a(+)。上述基因在表达载体pET-28a(+)的多克隆位点间插入。

本发明还提供了一种包含所述的重组载体的工程菌。

进一步地，所述工程菌的宿主细胞为大肠杆菌E.coli L21(DE3)。

本发明还提供了一种所述的工程菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，包括：将工程菌转入发酵培养基中进行发酵培养；发酵培养时加入诱导剂，诱导酶类的表达，获得氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖。

进一步地，所述发酵培养的时间为16～20h。

具体地，所述方法，包括：将37℃、180-200rpm下培养8-10h的重组菌以3％的接种量转入发酵培养基中继续培养，OD600达到0.4-0.6时，添加IPTG至终浓度为0.2-0.5mmol/L，在35℃、180-200rpm条件下培养16-20h。

所述发酵培养基为：葡萄糖8-15g/L酵母提取物20-26g/L，蛋白胨10-14g/L，甘油3-5mL/L，KH₂PO₄ 1.8-2.5g/L，K₂HPO₄K 10-15g/L，MgSO₄ 1.5-2.2g/L，MnCl₂·4H₂O 10-20mg/L，pH 6.8-7.4。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明从一株枯草芽孢杆菌中克隆获得高活性的氨基葡萄糖合成酶基因BS-glmS，利用BS-glmS基因构建重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得的基因工程菌株在氨基葡萄糖发酵生产方面的能力显著提升，构建的基因工程菌株在发酵16h时的氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖总的发酵产量可达26.51g/L，较大肠杆菌来源的glmS基因获得的基因工程菌株发酵产量提高了18.2％。

(2)本发明有效提高了发酵法生产氨基葡萄糖的生产效率，可广泛用于氨基葡萄糖的工业制备领域。

附图说明

图1为含有枯草芽孢杆菌来源的氨基葡萄糖合成酶基因的重组载体pET28a-ES-glmS-GNA1和含有大肠杆菌来源的氨基葡萄糖合成酶基因的重组载体pET28a-glmS-GNA1的构建示意图。

图2为含有不同微生物来源的氨基葡萄糖合成酶基因的工程菌的氨基葡萄糖发酵产量的检测结果。

图3为工程菌BL21(DE3)-pET28a-glmS-GNA1和BL21(DE3)-pET28a-ES-gl mS-GNA1在不同发酵时间下的氨基葡萄糖合成酶活性的检测结果。

图4为发酵菌BL21(DE3)-pET28a-glmS-GNA1和BL21(DE3)-pET28a-ES-gl mS-GNA1在不同发酵时间下的胞外氨基葡萄糖发酵产量的检测结果。

图5为发酵菌BL21(DE3)-pET28a-glmS-GNA1和BL21(DE3)-pET28a-ES-gl mS-GNA1在不同发酵时间下的胞外N-乙酰氨基葡萄糖发酵产量的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施案例对本发明做进一步阐述。下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下列实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1枯草芽孢杆菌来源的氨基葡萄糖合成酶基因的PCR扩增

本实施例中氨基葡萄糖合成酶基因来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CMGCC)保藏的菌种编号为1.2163的枯草芽孢杆菌枯草亚种。

具体内容如下：

取试管斜面保存的枯草芽孢杆菌进行平板活化，再取适量枯草芽孢杆菌活化后的种子接种到LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养12h。取培养液10mL，于10000r/min离心5min，收集菌体，用细菌基因组提取试剂盒进行总的基因组提取，提取步骤参照天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302-02)说明书。

从GenBank中检索同属不同菌株的氨基葡萄糖合成酶基因的核苷酸序列，针对保守序列设计一对引物ES-glmS-F和ES-glmS-R，引物的序列如下：

ES-glmS-F：5’-ATGTGTGGAATCGTAGGTTATA-3’；

ES-glmS-R：5’-TTACTCCACAGTAACACTTTTCGCA-3’。

以提取的枯草芽孢杆菌枯草亚种基因组为模板，采用上述引物进行扩增。

扩增条件如下：

总体积为25μL，包括2.5μL 10×LA Taq缓冲液、2.5μL 0.25mmol/L dNTPs；上游引物和下游引物各0.4μL，浓度为20μmol/L；0.2μL LATaq DNA聚合酶，1μL上述DNA模板，双蒸水补齐至25μL体系。

具体的PCR扩增程序如下：预变性温度94℃，时间5min；变性温度为94℃，时间为45s，退火温度58℃，时间1min，延伸温度72℃时间2min，此过程进行35个循环；终延伸温度72℃，时间15min。

取2μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在1％琼脂糖凝胶进行电泳检测(含有4sGreen 4μl)，以1×TAE为工作液，电泳结束后采用BIO-RAD凝胶成像系统检测。PCR产物经DNA凝胶回收试剂盒(购自碧云天生物技术有限公司，产品编号：D0056)切胶回收，获得的PCR片段连接至pUCm-T载体(购自碧云天生物技术有限公司，产品编号：D2006)中，将获得的载体pUCm-ES-glmS进行测序。所得产物即为枯草芽孢杆菌枯草亚种的氨基葡萄糖合成酶基因序列，以下简称测得序列如SEQ ID No.1。

该段核苷酸序列全长1803bp，是一个完整的ORF，编码600个氨基酸。该1803bp的ORF即为枯草芽孢杆菌来源的氨基葡萄糖合成酶基因，其核苷酸序列及编码的氨基酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。

实施例2枯草芽孢杆菌来源的氨基葡萄糖基因重组表达载体的构建

以质粒pUCm-ES-glmS为模板，利用引物BamH I-glmS-F/Sal I-glmS-R，扩增获得两侧带有BamHI和Sal I酶切位点的枯草芽孢杆菌枯草亚种的氨基葡萄糖合成酶基因的全长序列。所用的引物序列如下：

BamH I-glmS-F：5’-CGGGATCCATGTGTGGAATCGTAGGTTATA-3’

Sal I-glmS-R：5’-ACGCGTCGACTTACTCCACAGTAACACTTTTC-3’

将PCR扩增产物利用BamH I和Sal I进行双酶切，回收目的片段，同时用BamH I和Sal I对原核表达载体pET28a(+)(购自德国Novagen公司，产品目录号为69864-3)进行双酶切，回收载体中较大的片段，将回收的目的基因片段与载体片段进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α(购自Invitrogen公司，产品目录号为18263-012)中，抗性筛选后，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在表达载体pET28a(+)的BamHI和Sal I酶切位点间插入了序列表中SEQ ID No.1所示的枯草芽孢杆菌ES-glmS基因片段，证明质粒构建正确，将重组载体命名为pET28a-ES-glmS。

以酿酒酵母S288C(购自ATCC美国模式培养物集存库，产品目录号为204508)的基因组为模板，利用引物SalI-rbs-GAN1-F和XhoI-GNA1-R引物进行PCR扩增，获得两侧带有SalI/XhoI酶切位点的酿酒酵母氨基葡萄糖乙酰化酶基因GNA1的全长序列，所用的引物序列如下:

SalI-rbs-GAN1-F:5’-ACGCGTCGACAAGAAGGAGAAAATACATGAGCTTACCCGATGGATT-3’；

XhoI-GAN1-R:5’-CCGCTCGAGCTATTTTCTAATTTGCATTTC-3’。

为增加酿酒酵母GNA1基因的蛋白表达效率，在其上游引物一端引入了长度为16bp的核糖体结合位点rbs序列，该序列可促使核糖体结合到mRNA上，有利于增加GNA1基因翻译效率，其中rbs序列的信息如下：

Rbs：5’-AAGAAGGAGAAAATAC-3’。

将上述PCR扩增产物利用SalI/XhoI进行双酶切，回收目的片段；同时利用SalI/XhoI对构建完成的重组载体pET28a-ES-glmS进行双酶切，回收载体中较大的片段，将回收的目的片段与载体骨架连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α(购自Invitrogen公司，产品目录号为18263-012)中，抗性筛选后，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在重组载体pET28a-ES-glmS的SalI和XhoI酶切位点间插入了酿酒酵母GNA1序列，获得了氨基葡萄糖合成酶基因的表达模块，具体序列信息见SEQID No.5；其中，第1位到1803位为ES-glmS基因序列，第1801位到1825位为核糖体结合位点rbs序列，第1826位到2305位为GNA1基因序列，测序结果表明重组载体构建正确，将重组载体命名为pET28a-ES-glmS-GAN1。重组质粒pET28a-ES-glmS-GAN1的结构示意图见图1。

实施例3大肠杆菌来源及其他微生物来源的氨基葡萄糖合成酶基因重组表达载体的构建

以大肠杆菌DH5α(购自Invitrogen公司，产品目录号为18263-012)的基因组为模板，利用引物BamH I-E-glmS-F/Sal I-E-glmS-R引物，扩增获得两侧带有BamHI和Sal I酶切位点的大肠杆菌来源的氨基葡萄糖合成酶基因的全长序列。所用的引物序列如下：

BamH I-E-glmS-F：5’-CGGGATCCATGTGTGGAATTGTTGGCGCG-3’

Sal I-E-glmS-R：5’-ACGCGTCGACTTACTCAACCGTAACCGATTTTG-3’

将PCR扩增产物利用BamH I和Sal I进行双酶切，回收目的片段，同时用BamH I和Sal I对构建完成的重组质粒pET28a-ES-glmS-GAN1进行双酶切，回收载体中较大的片段，将回收的目的基因片段与载体片段进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α(购自Invitrogen公司，产品目录号为18263-012)中，抗性筛选后，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明，在表达载体pET28a-ES-glmS-GAN1的BamHI和Sal I酶切位点间插入了SEQ ID NO.6所示的肠杆菌来源的E-glmS基因片段，证明重组质粒构建正确，将重组载体命名为pET28a-glmS-GAN1。重组质粒pET28a-glmS-GAN1的结构示意图见图1。

在重组载体pET28a-ES-glmS-GAN1的基础上，用BamH I和Sal I对构建完成的重组质粒pET28a-ES-glmS-GAN1进行双酶切，回收载体中较大的片段。将来源于解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens、地衣形芽孢杆菌Bacillus licheniformis和短小芽胞杆菌Bacillus pumilus的氨基葡萄糖那个合成酶基因BA-glmS、BL-glmS和BP-glmS扩增完成后，利用BamH I和Sal I酶切位点对PCR扩增产物进行酶切，将回收的目的基因片段与载体片段进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α(购自Invitrogen公司，产品目录号为18263-012)中，抗性筛选后，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证。将来源于不同微生物的重组载体分别命名为pET28a-BA-glmS-GA N1、pET28a-BL-glmS-GAN1和pET28a-BP-glmS-GAN1。

实施例4不同来源的氨基葡萄糖合成酶工程菌的性能评价

将重组载体pET28a-glmS-GAN1、pET28a-ES-glmS-GAN1、pET28a-BA-glmS-GAN1、pET28a-BL-glmS-GAN1和pET28a-BP-glmS-GAN1转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购自Invitrogen公司，产品目录号为C6000-03)，挑取菌落接种至含有卡那霉素的(50μg/mL)TB培养基中，置37℃摇床过夜培养，获得重组基因工程菌BL21(DE3)-pET28a-glmS-GAN1、BL21(DE3)-pET28a-ES-glmS-GAN1、BL21(DE3)-pET28a-BA-glmS-GAN1、BL21(DE3)-pET28a-BL-glmS-GAN1和BL21(DE3)-pET28a-BP-glmS-GAN1。

过夜培养上述重组菌后，按1％接种量接种于新鲜的含有卡那霉素的改良TB培养基中，37℃，220rpm的情况下，培养至OD600为0.5-0.7，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，在连续培养20h时，利用分光光度法检测胞外氨基葡萄糖的含量。其中，不含有重组载体的BL21(DE3)菌作为空白对照。

改良的TB培养基组成如下：按每L计含有蛋白胨12g，酵母提取物24g，葡萄糖5g，甘油4ml，KH₂PO₄ 2.3g，K₂HPO₄K 12.5g。

胞外氨基葡萄糖的检测方法如下：取发酵培养液5mL加入到离心管中，8000rpm室温离心10min，取0,5mL离心上清液加入乙酰丙酮试剂1mL，90℃水浴处理1.5h，冷却至室温后，缓慢加入96％(v/v)乙醇溶液10mL，然后加入DMAB试剂1mL，混合均匀。混合后室温放置1h，530nm处比色，根据标准曲线计算胞外氨基葡萄糖产量。

乙酰丙酮试剂的配制方法：在50mL 1.25M的Na₂CO₃溶液中加入1.5mL乙酰丙酮，现用现配；DMAB试剂配制方法：取30mL 96％的乙醇和30mL浓盐酸混匀后，加入1.6g对二甲氨基苯甲醛(DMAB)中，完全溶解后低温保存。

结果如图2所示，在大肠杆菌中强化表达氨基葡萄糖合成酶基因可显著提高胞外氨基葡萄糖的积累量。

发酵20h时，不含有基因工程重组载体的BL21(DE3)菌株胞外氨基葡萄糖的产量仅有3.6g/L，显著低于重组基因工程菌。不同微生物来源的氨基葡萄糖合成酶基因构建获得的基因工程菌，胞外的氨基葡萄糖产量有显著差异。来源的大肠杆菌的氨基葡萄糖合成酶构建获得重组基因工程菌BL21(DE3)-pET28a-glmS-GAN1的发酵产量可达9.7g/L，而来源于枯草芽孢杆菌氨基葡萄糖合成酶构建获得重组基因工程菌BL21(DE3)-pET28a-ES-glmS-GAN1和来源于解淀粉芽孢杆菌氨基葡萄糖合成酶构建获得重组基因工程菌BL21(DE3)-pET28a-BA-glmS-GAN1胞外氨基葡萄糖的发酵产量分别为12.24g/L和10.86g/L，较BL21(DE3)-pET28a-glmS-GAN1的发酵产量分别提高了26.2％和11.9％。而地衣形芽孢杆菌和短小芽胞杆菌来源的氨基葡萄糖合成酶构建获得重组基因工程菌的产量仅为8.6g/L和7.65g/L，要低于大肠杆菌基因工程菌BL21(DE3)-pET28a-glmS-GAN1的产量。

上述结果表明：不同微生物来源的氨基葡萄糖合成酶基因在大肠杆菌中的表达活性存在显著差异，有些来源的氨基葡萄糖合成酶基因在大肠杆菌中的表达活性较低，不能有效的提高氨基葡萄糖的体内生物合成。

基于上述结果，本发明对来源于枯草芽孢杆菌的氨基葡萄糖合成酶构建获得重组基因工程菌BL21(DE3)-pET28a-ES-glmS-GAN1的氨基葡萄糖合成酶活性和发酵条件进行了后续的评价和优化。

实施例5枯草芽孢杆菌来源的氨基葡萄糖合成酶的活性评价

将重组载体pET28a-glmS-GAN1和pET28a-ES-glmS-GAN1转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购自Invitrogen公司，产品目录号为C6000-03)，挑取菌落接种至含有卡那霉素的(50μg/mL)TB培养基中，置37℃摇床过夜培养。过夜菌体按1％接种量接种于新鲜的含有卡那霉素的TB培养基中，37℃，220rpm的情况下，培养至OD600为0.5-0.7，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，于不同的时间(4小时、6小时、8小时、10小时和12小时)取样，离心收集菌体后，检测不同重组菌的胞内氨基葡萄糖合成酶活性。其中不含有重组载体的BL21(DE3)作为空白对照。

TB培养基的组成如下：按每L计含有蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4ml，KH₂PO₄2.3g，K₂HPO₄K 12.5g。

菌体离心后，用1mL磷酸盐缓冲液重悬菌体，磷酸盐缓冲液配方如下：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄K，2mM KH₂PO₄，pH 7.4。重悬后的菌体在冰浴中利用超声破碎仪破碎至澄清，于4℃、12000rpm离心机离心20min，收集上清。采用Bradford蛋白定量检测试剂盒测定不同样品的蛋白浓度(购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号C503031)，利用磷酸盐缓冲液调整样品的蛋白浓度至1mg/mL。

氨基葡萄糖合成酶活性检测采用比色法：在1mL的反应体系中加入0.2mL的蛋白酶液，其中反应体系为100mM PBS缓冲液(pH 7.5)，包括20mM6-磷酸果糖，15mML-谷氨酰胺，2.5mM EDTA，37℃水浴处理反应液30min后，在100℃处理4min终止反应，离心取反应液上清0.5mL加入1mL的乙酰丙酮试剂，90℃反应1h，待冷却至室温后缓慢加入10mL 96％的乙醇溶液，最后加入1mL的DMAB试剂混匀后室温静置1h，分光光度法检测530mM的吸光度检测6-磷酸氨基葡萄糖的含量。氨基的葡萄糖合成酶的酶活单位定为为37℃下单位时间内反应生成1μM的6-磷酸氨基葡萄糖所需的酶量，酶活单位为U/mL。

乙酰丙酮试剂的配制方法：在50mL 1.25M的Na2CO3溶液中加入1.5mL乙酰丙酮，现用现配；DMAB试剂配制方法：取30mL 96％的乙醇和30mL浓盐酸混匀后，加入1.6g对二甲氨基苯甲醛(DMAB)中，完全溶解后低温保存。

结果如图3所示，IPTG诱导发酵时间的延长，氨基葡萄糖合成酶的活性不断增强，且基因工程菌的氨基葡萄糖合成酶活性要显著高于空白对照组。

发酵6h时，空白对照菌的氨基葡萄糖合成酶活性仅为0.04U/mL，而大肠杆菌来源的氨基葡萄糖基因工程重组菌BL21(DE3)-pET28a-glmS-GAN1氨基葡萄糖合成酶活性可达0.14U/mL，枯草芽孢杆菌来源的氨基葡萄糖基因工程重组菌BL21(DE3)-pET28a-ES-glmS-GAN1的氨基葡萄糖合成酶活性为0.12U/mL。发酵后期，基因工程重组菌BL21(DE3)-pET28a-ES-glmS-GAN1的酶活要显著高于大肠杆菌来源的氨基葡萄糖基因工程重组菌BL21(DE3)-pET28a-glmS-GAN1，发酵8h和10h时，基因工程重组菌BL21(DE3)-pET28a-glmS-GAN1的氨基葡萄糖合成酶活性分别是0.16U/mL和0.12U/mL；说明发酵后期酶活收到宿主的反馈性抑制，而枯草芽孢杆菌来源的氨基葡萄糖基因工程重组菌BL21(DE3)-pET28a-ES-glmS-GAN1在发酵8h和10h时的酶活是0.21U/mL和0.25U/mL，分别是工程菌BL21(DE3)-pET28a-glmS-GAN1酶活的1.31倍和2.08倍。

上述结果表明，在诱导的初期大肠杆菌来源的glmS基因可保持较高的酶活性，但随着培养时间的延长，后期的表达过程中其可受到自身调控途径的反馈抑制，限制了其酶活性的进一步提高。

枯草芽孢杆菌来源的氨基葡萄糖合成酶基因ES-glmS基因能够在大肠杆菌发酵宿主BL21(DE3)被诱导表达，且可持续发挥高活性氨基葡萄糖合成酶活性，其酶活要显著优于肠杆菌来源的氨基葡萄糖合成酶基因，以ES-glmS基因构建获得的基因工程菌BL21(DE3)-pET28a-ES-glmS-GAN1可用于后续的氨基葡萄糖发酵研究。

实施例6重组基因工程菌的胞外发酵产物研究

将获得的枯草芽孢杆菌来源的氨基葡萄糖基因工程重组菌BL21(DE3)-pET28a-ES-glmS-GAN1和大肠杆菌来源的氨基葡萄糖基因工程重组菌BL21(DE3)-pET28a-glmS-GAN1利用平板活化后，挑取菌落接种于含有卡那霉素的(50μg/mL)TB培养基中，置37℃摇床过夜培养。过夜菌体按3％接种量接种于新鲜发酵培养基中培养，37℃，220rpm的情况下，培养至OD600为0.5-0.6后加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，摇床温度调整为35℃，220rpm的情况下继续发酵培养，于不同的时间(4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时和24小时)取样，离心收集上清后，高效液相法检测不同重组菌在不同发酵时间胞外氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖的发酵产物积累量的变化情况。

其中，发酵培养基的组成如下：按每L计含有葡萄糖10g，酵母提取物20g，蛋白胨12g，甘油4mL，KH₂PO₄ 2.3g，K₂HPO₄K 12.5g，MgSO₄ 1.8g，MnCl2·4H₂O 10mg。

氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖的检测采用HPLC法进行检测，其具体的操作步骤如下：发酵液经12000rpm离心10min后，取适量的上清液用超纯水稀释后，将样品稀释液用0.22μM滤膜过滤。高效液相色谱法检测氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖含量采用氨基柱检测，流动相采用乙腈-磷酸盐缓冲液(65:35，pH 7.5)，流速为1.0mL/min，检测波长为195nm，进样体积为10μL。

结果如图4和5所示，基因工程菌BL21(DE3)-pET28a-ES-glmS-GAN1和BL21(DE3)-pET28a-glmS-GAN1胞外氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖的产量随发酵时间的延长而增加，在发酵后期由于细胞的自溶和降解，胞外氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖的积累量出现下降。

工程菌BL21(DE3)-pET28a-ES-glmS-GAN1的氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖在18h和16h分别达到最高值，其产量为12.98g/L和13.7g/L，氨糖总产量在16h、18h和20h时分别为26.51g/L、26.25g/L和24.74g/L。枯草芽孢杆菌来源的氨基葡萄糖基因工程重组菌BL21(DE3)-pET28a-ES-glmS-GAN1，氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖的胞外发酵产量要显著高于大肠杆菌来源的氨基葡萄糖基因工程重组菌BL21(DE3)-pET28a-glmS-GAN1，发酵16h、18h和20h时，BL21(DE3)-pET28a-glmS-GAN1的胞外氨糖总产量分别是22.43g/L、21.67g/L和20.24g/L，均显著低于基因工程菌BL21(DE3)-pET28a-ES-glmS-GAN1的胞外氨糖发酵积累量。

以上结果说明，枯草芽孢杆菌来源的氨基葡萄糖基因工程重组菌BL21(DE3)-pET28a-ES-glmS-GAN1要显著优于基因工程菌BL21(DE3)-pET28a-glmS-GAN1，枯草芽孢杆菌来源的氨基葡萄糖基因ES-glmS可有效提高大肠杆菌发酵法生产氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖的效率，降低生产成本，该基因和构建完成的基因工程菌在发酵法生产氨基葡萄糖领域具有广阔的应用前景。

序列表

<110> 浙江中医药大学

<120> 一种氨基葡萄糖合成酶、工程菌及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1803

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 1

atgtgtggaa tcgtaggtta tatcggtcag cttgatgcga aggaaatttt attaaaaggg 60

ttagagaagc ttgagtatcg cggttatgac tctgctggta ttgctgttgc caacgaacag 120

ggaatccatg tgttcaaaga aaaaggacgc attgcagatc ttcgtgaagt tgtggatgcc 180

aatgtagaag cgaaagccgg aattgggcat actcgctggg cgacacacgg cgaaccaagc 240

tatctgaacg ctcacccgca tcaaagcgca ctgggccgct ttacacttgt tcacaacggc 300

gtgatcgaga actatgttca gctgaagcaa gagtatttgc aagatgtaga gctcaaaagt 360

gacaccgata cagaagtagt cgttcaagta atcgagcaat tcgtcaatgg aggacttgag 420

acagaagaag cgttccgcaa aacacttaca ctgttaaaag gctcttatgc aattgcttta 480

ttcgataacg acaacagaga aacgattttt gtagcgaaaa acaaaagccc tctattagta 540

ggtcttggag atacattcaa cgtcgtagca tctgatgcga tggcgatgct tcaagtaacc 600

aacgaatacg tagagctgat ggataaagaa atggttatcg tcactgatga ccaagttgtc 660

atcaaaaacc ttgatggtga cgtgattaca cgtgcgtctt atattgctga gcttgatgcc 720

agtgatatcg aaaaaggcac gtaccctcac tacatgttga aagaaacgga tgagcagcct 780

gttgttatgc gcaaaatcat ccaaacgtat caagatgaaa acggcaagct gtctgtgcct 840

ggtgatatcg ctgccgctgt agcggaagcg gaccgcatct atatcattgg ctgcggaaca 900

agctaccatg caggacttgt cggtaaacaa tatattgaaa tgtgggcaaa cgtgccggtt 960

gaagtgcatg tagcgagtga attctcctac aacatgccgc ttctgtctaa gaaaccgctc 1020

ttcattttcc tttctcaaag cggggaaaca gcagacagcc gcgcggttct tgttcaagtc 1080

aaagcgctcg gacataaagc cctgacaatc acaaacgtac cgggatcaac gctttctcgt 1140

gaagctgtct acacattgct gcttcatgcg ggtcctgaaa tcgctgttgc gtcaacgaaa 1200

gcatacactg cgcaaatcgc agtccttgcg gttcttgcat ctgtagctgc tgacaaaaac 1260

ggcattgata tcggatttga cctcgtcaaa gaacttggta tcgctgcgaa cgcaatggaa 1320

gccctttgcg accagaaaga cgaaatggaa atgatcgccc gtgaatactt gactgtatcc 1380

agaaacgctt tcttcatcgg acgcggcctt gactacttcg tatgtgtcga aggcgcactg 1440

aagctgaaag agatttctta catccaggca gaagcctttg ccggcggaga actgaagctc 1500

ggaacgattg ccttgatcga acaaggaaca ccagtattcg cactggcaac tcaagagcac 1560

gtaaacctaa gcatcagcgg aaacgtcaaa gaagttgctg ctcgcggagc aaacacatgc 1620

atcatctcac tgaaaggcct agacgatgcg gatgacagat tcgtactgcc ggaagtaaac 1680

ccagcgcttg ctccgttggt atctgttgtt ccattgcagc tgatcgctta ctatgctgca 1740

ctgcatcgcg gctgtgatgt tgataaaccg cgtaaccttg cgaaaagtgt tactgtggag 1800

taa 1803

<210> 2

<211> 600

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 2

Met Cys Gly Ile Val Gly Tyr Ile Gly Gln Leu Asp Ala Lys Glu Ile

1 5 10 15

Leu Leu Lys Gly Leu Glu Lys Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala

20 25 30

Gly Ile Ala Val Ala Asn Glu Gln Gly Ile His Val Phe Lys Glu Lys

35 40 45

Gly Arg Ile Ala Asp Leu Arg Glu Val Val Asp Ala Asn Val Glu Ala

50 55 60

Lys Ala Gly Ile Gly His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu Pro Ser

65 70 75 80

Tyr Leu Asn Ala His Pro His Gln Ser Ala Leu Gly Arg Phe Thr Leu

85 90 95

Val His Asn Gly Val Ile Glu Asn Tyr Val Gln Leu Lys Gln Glu Tyr

100 105 110

Leu Gln Asp Val Glu Leu Lys Ser Asp Thr Asp Thr Glu Val Val Val

115 120 125

Gln Val Ile Glu Gln Phe Val Asn Gly Gly Leu Glu Thr Glu Glu Ala

130 135 140

Phe Arg Lys Thr Leu Thr Leu Leu Lys Gly Ser Tyr Ala Ile Ala Leu

145 150 155 160

Phe Asp Asn Asp Asn Arg Glu Thr Ile Phe Val Ala Lys Asn Lys Ser

165 170 175

Pro Leu Leu Val Gly Leu Gly Asp Thr Phe Asn Val Val Ala Ser Asp

180 185 190

Ala Met Ala Met Leu Gln Val Thr Asn Glu Tyr Val Glu Leu Met Asp

195 200 205

Lys Glu Met Val Ile Val Thr Asp Asp Gln Val Val Ile Lys Asn Leu

210 215 220

Asp Gly Asp Val Ile Thr Arg Ala Ser Tyr Ile Ala Glu Leu Asp Ala

225 230 235 240

Ser Asp Ile Glu Lys Gly Thr Tyr Pro His Tyr Met Leu Lys Glu Thr

245 250 255

Asp Glu Gln Pro Val Val Met Arg Lys Ile Ile Gln Thr Tyr Gln Asp

260 265 270

Glu Asn Gly Lys Leu Ser Val Pro Gly Asp Ile Ala Ala Ala Val Ala

275 280 285

Glu Ala Asp Arg Ile Tyr Ile Ile Gly Cys Gly Thr Ser Tyr His Ala

290 295 300

Gly Leu Val Gly Lys Gln Tyr Ile Glu Met Trp Ala Asn Val Pro Val

305 310 315 320

Glu Val His Val Ala Ser Glu Phe Ser Tyr Asn Met Pro Leu Leu Ser

325 330 335

Lys Lys Pro Leu Phe Ile Phe Leu Ser Gln Ser Gly Glu Thr Ala Asp

340 345 350

Ser Arg Ala Val Leu Val Gln Val Lys Ala Leu Gly His Lys Ala Leu

355 360 365

Thr Ile Thr Asn Val Pro Gly Ser Thr Leu Ser Arg Glu Ala Val Tyr

370 375 380

Thr Leu Leu Leu His Ala Gly Pro Glu Ile Ala Val Ala Ser Thr Lys

385 390 395 400

Ala Tyr Thr Ala Gln Ile Ala Val Leu Ala Val Leu Ala Ser Val Ala

405 410 415

Ala Asp Lys Asn Gly Ile Asp Ile Gly Phe Asp Leu Val Lys Glu Leu

420 425 430

Gly Ile Ala Ala Asn Ala Met Glu Ala Leu Cys Asp Gln Lys Asp Glu

435 440 445

Met Glu Met Ile Ala Arg Glu Tyr Leu Thr Val Ser Arg Asn Ala Phe

450 455 460

Phe Ile Gly Arg Gly Leu Asp Tyr Phe Val Cys Val Glu Gly Ala Leu

465 470 475 480

Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile Gln Ala Glu Ala Phe Ala Gly Gly

485 490 495

Glu Leu Lys Leu Gly Thr Ile Ala Leu Ile Glu Gln Gly Thr Pro Val

500 505 510

Phe Ala Leu Ala Thr Gln Glu His Val Asn Leu Ser Ile Ser Gly Asn

515 520 525

Val Lys Glu Val Ala Ala Arg Gly Ala Asn Thr Cys Ile Ile Ser Leu

530 535 540

Lys Gly Leu Asp Asp Ala Asp Asp Arg Phe Val Leu Pro Glu Val Asn

545 550 555 560

Pro Ala Leu Ala Pro Leu Val Ser Val Val Pro Leu Gln Leu Ile Ala

565 570 575

Tyr Tyr Ala Ala Leu His Arg Gly Cys Asp Val Asp Lys Pro Arg Asn

580 585 590

Leu Ala Lys Ser Val Thr Val Glu

595 600

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

aagaaggaga aaatac 16

<210> 4

<211> 480

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 4

atgagcttac ccgatggatt ttatataagg cgaatggaag agggggattt ggaacaggtc 60

actgagacgc taaaggtttt gaccaccgtg ggcactatta cccccgaatc cttcagcaaa 120

ctcataaaat actggaatga agccacagta tggaatgata acgaagataa aaaaataatg 180

caatataacc ccatggtgat tgtggacaag cgcaccgaga cggttgccgc tacggggaat 240

atcatcatcg aaagaaagat cattcatgaa ctggggctat gtggccacat cgaggacatt 300

gcagtaaact ccaagtatca gggccaaggt ttgggcaagc tcttgattga tcaattggta 360

actatcggct ttgactacgg ttgttataag attattttag attgcgatga gaaaaatgtc 420

aaattctatg aaaaatgtgg gtttagcaac gcaggcgtgg aaatgcaaat tagaaaatag 480

<210> 5

<211> 2317

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

ggatccatgt gtggaatcgt aggttatatc ggtcagcttg atgcgaagga aattttatta 60

aaagggttag agaagcttga gtatcgcggt tatgactctg ctggtattgc tgttgccaac 120

gaacagggaa tccatgtgtt caaagaaaaa ggacgcattg cagatcttcg tgaagttgtg 180

gatgccaatg tagaagcgaa agccggaatt gggcatactc gctgggcgac acacggcgaa 240

ccaagctatc tgaacgctca cccgcatcaa agcgcactgg gccgctttac acttgttcac 300

aacggcgtga tcgagaacta tgttcagctg aagcaagagt atttgcaaga tgtagagctc 360

aaaagtgaca ccgatacaga agtagtcgtt caagtaatcg agcaattcgt caatggagga 420

cttgagacag aagaagcgtt ccgcaaaaca cttacactgt taaaaggctc ttatgcaatt 480

gctttattcg ataacgacaa cagagaaacg atttttgtag cgaaaaacaa aagccctcta 540

ttagtaggtc ttggagatac attcaacgtc gtagcatctg atgcgatggc gatgcttcaa 600

gtaaccaacg aatacgtaga gctgatggat aaagaaatgg ttatcgtcac tgatgaccaa 660

gttgtcatca aaaaccttga tggtgacgtg attacacgtg cgtcttatat tgctgagctt 720

gatgccagtg atatcgaaaa aggcacgtac cctcactaca tgttgaaaga aacggatgag 780

cagcctgttg ttatgcgcaa aatcatccaa acgtatcaag atgaaaacgg caagctgtct 840

gtgcctggtg atatcgctgc cgctgtagcg gaagcggacc gcatctatat cattggctgc 900

ggaacaagct accatgcagg acttgtcggt aaacaatata ttgaaatgtg ggcaaacgtg 960

ccggttgaag tgcatgtagc gagtgaattc tcctacaaca tgccgcttct gtctaagaaa 1020

ccgctcttca ttttcctttc tcaaagcggg gaaacagcag acagccgcgc ggttcttgtt 1080

caagtcaaag cgctcggaca taaagccctg acaatcacaa acgtaccggg atcaacgctt 1140

tctcgtgaag ctgtctacac attgctgctt catgcgggtc ctgaaatcgc tgttgcgtca 1200

acgaaagcat acactgcgca aatcgcagtc cttgcggttc ttgcatctgt agctgctgac 1260

aaaaacggca ttgatatcgg atttgacctc gtcaaagaac ttggtatcgc tgcgaacgca 1320

atggaagccc tttgcgacca gaaagacgaa atggaaatga tcgcccgtga atacttgact 1380

gtatccagaa acgctttctt catcggacgc ggccttgact acttcgtatg tgtcgaaggc 1440

gcactgaagc tgaaagagat ttcttacatc caggcagaag cctttgccgg cggagaactg 1500

aagctcggaa cgattgcctt gatcgaacaa ggaacaccag tattcgcact ggcaactcaa 1560

gagcacgtaa acctaagcat cagcggaaac gtcaaagaag ttgctgctcg cggagcaaac 1620

acatgcatca tctcactgaa aggcctagac gatgcggatg acagattcgt actgccggaa 1680

gtaaacccag cgcttgctcc gttggtatct gttgttccat tgcagctgat cgcttactat 1740

gctgcactgc atcgcggctg tgatgttgat aaaccgcgta accttgcgaa aagtgttact 1800

gtggagtaag tcgacaagaa ggagaaaata catgagctta cccgatggat tttatataag 1860

gcgaatggaa gagggggatt tggaacaggt cactgagacg ctaaaggttt tgaccaccgt 1920

gggcactatt acccccgaat ccttcagcaa actcataaaa tactggaatg aagccacagt 1980

atggaatgat aacgaagata aaaaaataat gcaatataac cccatggtga ttgtggacaa 2040

gcgcaccgag acggttgccg ctacggggaa tatcatcatc gaaagaaaga tcattcatga 2100

actggggcta tgtggccaca tcgaggacat tgcagtaaac tccaagtatc agggccaagg 2160

tttgggcaag ctcttgattg atcaattggt aactatcggc tttgactacg gttgttataa 2220

gattatttta gattgcgatg agaaaaatgt caaattctat gaaaaatgtg ggtttagcaa 2280

cgcaggcgtg gaaatgcaaa ttagaaaata gctcgag 2317

<210> 6

<211> 1830

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 6

atgtgtggaa ttgttggcgc gatcgcgcaa cgtgatgtag cagaaatcct tcttgaaggt 60

ttacgtcgtc tggaataccg cggatatgac tctgccggtc tggccgttgt tgatgcagaa 120

ggtcatatga cccgcctgcg tcgcctcggt aaagtccaga tgctggcaca ggcagcggaa 180

gaacatcctc tgcatggcgg cactggtatt gctcacactc gctgggcgac ccacggtgaa 240

ccttcagaag tgaatgcgca tccgcatgtt tctgaacaca ttgtggtggt gcataacggc 300

atcatcgaaa accatgaacc gctgcgtgaa gagctaaaag cgcgtggcta taccttcgtt 360

tctgaaaccg acaccgaagt gattgcccat ctggtgaact gggagctgaa acaaggcggg 420

actctgcgtg aggccgttct gcgtgctatc ccgcagctgc gtggtgcgta cggtacagtg 480

atcatggact cccgtcaccc ggataccctg ctggcggcac gttctggtag tccgctggtg 540

attggcctgg ggatgggcga aaactttatc gcttctgacc agctggcgct gttgccggtg 600

acccgtcgct ttatcttcct tgaagagggc gatattgcgg aaatcactcg ccgttcggta 660

aacatcttcg ataaaactgg cgcggaagta aaacgtcagg atatcgaatc caatctgcaa 720

tatgacgcgg gcgataaagg catttaccgt cactacatgc agaaagagat ctacgaacag 780

ccgaacgcga tcaaaaacac ccttaccgga cgcatcagcc acggtcaggt tgatttaagc 840

gagctgggac cgaacgccga cgaactgctg tcgaaggttg agcatattca gatcctcgcc 900

tgtggtactt cttataactc cggtatggtt tcccgctact ggtttgaatc gctagcaggt 960

attccgtgcg acgtcgaaat cgcctctgaa ttccgctatc gcaaatctgc cgtgcgtcgt 1020

aacagcctga tgatcacctt gtcacagtct ggcgaaaccg cggataccct ggctggcctg 1080

cgtctgtcga aagagctggg ttaccttggt tcactggcaa tctgtaacgt tccgggttct 1140

tctctggtgc gcgaatccga tctggcgcta atgaccaacg cgggtacaga aatcggcgtg 1200

gcatccacta aagcattcac cactcagtta actgtgctgt tgatgctggt ggcgaagctg 1260

tctcgcctga aaggtctgga tgcctccatt gaacatgaca tcgtgcatgg tctgcaggcg 1320

ctgccgagcc gtattgagca gatgctgtct caggacaaac gcattgaagc gctggcagaa 1380

gatttctctg acaaacatca cgcgctgttc ctgggccgtg gcgatcagta cccaatcgcg 1440

ctggaaggcg cattgaagtt gaaagagatc tcttacattc acgctgaagc ctacgctgct 1500

ggcgaactga aacacggtcc gctggcgcta attgatgccg atatgccggt tattgttgtt 1560

gcaccgaaca acgaattgct ggaaaaactg aaatccaaca ttgaagaagt tcgcgcgcgt 1620

ggcggtcagt tgtatgtctt cgccgatcag gatgcgggtt ttgtaagtag cgataacatg 1680

cacatcatcg agatgccgca tgtggaagag gtgattgcac cgatcttcta caccgttccg 1740

ctgcagctgc tggcttacca tgtcgcgctg atcaaaggca ccgacgttga ccagccgcgt 1800

aacctggcaa aatcggttac ggttgagtaa 1830

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

atgtgtggaa tcgtaggtta ta 22

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

ttactccaca gtaacacttt tcgca 25

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

cgggatccat gtgtggaatc gtaggttata 30

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

acgcgtcgac ttactccaca gtaacacttt tc 32

<210> 11

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

acgcgtcgac aagaaggaga aaatacatga gcttacccga tggatt 46

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

ccgctcgagc tattttctaa tttgcatttc 30

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

cgggatccat gtgtggaatt gttggcgcg 29

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

acgcgtcgac ttactcaacc gtaaccgatt ttg 33

Claims

1.一种氨基葡萄糖合成酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种编码权利要求1所述的氨基葡萄糖合成酶的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.一种重组载体，其特征在于，包含依次连接的氨基葡萄糖合成酶基因、核糖体结合序列、酿酒酵母氨基葡萄糖乙酰化酶基因和表达载体；所述氨基葡萄糖合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述核糖体结合序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述酿酒酵母氨基葡萄糖乙酰化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述表达载体为pET-28a(+)。

6.一种包含权利要求5所述的重组载体的工程菌。

7.如权利要求6所述的工程菌，其特征在于，宿主细胞为大肠杆菌E.coli L21(DE3)。

8.一种利用权利要求6或7任一项所述的工程菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，包括：将工程菌转入发酵培养基中进行发酵培养；发酵培养时加入诱导剂，诱导酶类的表达，获得氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的时间为16～20h。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为：葡萄糖8-15g/L酵母提取物20-26g/L，蛋白胨10-14g/L，甘油3-5mL/L，KH₂PO₄ 1.8-2.5g/L，K₂HPO₄K 10-15g/L，MgSO₄ 1.5-2.2g/L，MnCl₂·4H₂O 10-20mg/L，pH 6.8-7.4。