CN113528553B

CN113528553B - 一种密码子优化的n-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因及其应用

Info

Publication number: CN113528553B
Application number: CN202110770920.1A
Authority: CN
Inventors: 邱益彬; 丁振中; 张超; 朱萌; 方祥; 高小燕; 徐俊山; 张万宏
Original assignee: YANGZHOU RIXING BIO-TECH CO LTD
Current assignee: YANGZHOU RIXING BIO-TECH CO LTD
Priority date: 2021-07-07
Filing date: 2021-07-07
Publication date: 2023-09-12
Anticipated expiration: 2041-07-07
Also published as: CN113528553A

Abstract

本发明公开了一种密码子优化的N‑乙酰氨基葡萄糖转移酶基因及其应用，属于生物工程技术领域。本发明以苜蓿中华根瘤菌来源的Nodc基因为出发序列，按照解淀粉芽孢杆菌的密码子偏好性将该N‑乙酰氨基葡萄糖转移酶优化密码子后全基因合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将密码子优化后的N‑乙酰氨基葡萄糖转移酶构建重组载体，转入宿主解淀粉芽孢杆菌中，得到能够发酵生产几丁寡糖的基因工程菌。该基因工程菌胞外发酵液中几丁寡糖浓度达到676mg/L，其中几丁四糖和几丁五糖的含量分别为246mg/L和430mg/L，表明利用该重组菌株可实现胞外合成几丁四糖、几丁五糖等几丁寡糖为主的新发酵工艺。

Description

一种密码子优化的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种密码子优化的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因及其应用。

背景技术

壳寡糖(Chitooligosaccharides，COs)又称几丁寡糖、寡聚氨基葡糖、甲壳低聚糖，是由2～10个N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1，4糖苷键连接而成的低聚物(图1)。相比于碱性多糖壳聚糖，壳寡糖具有更高的水溶性、吸收利用度和生物活性，使其在抗菌活性、抑制肿瘤、调节植物免疫等方面都具有广泛的应用。

目前，壳寡糖的制备方法主要有物理法、化学法和酶解法三大类。采用物理、化学法对制备特定分子量壳寡糖可控性差，并且易对环境造成污染。近年来，酶解法因反应条件温和、副产物含量低，产物得率高等优势，是制备壳寡糖的主要方法。然而采用这种方式通常降解不彻底，且产物组成难以控制，工业生产需要与物理法或化学法结合使用。

利用安全级微生物发酵合成寡糖是近年来新兴的一类寡糖合成技术。作为N-乙酰氨基葡萄糖转移酶，NodC酶可以聚合2～5糖基组成的N-乙酰氨基葡萄糖寡聚体，而糖链的聚合度由不同来源的nodC基因决定，这为特定聚合度的壳寡糖提供了新的合成方式。在之前的期刊报道中，通过在大肠杆菌中共表达了根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)来源的几丁质寡糖合成酶基因nodC和Bacillus circulans的几丁质酶基因chiA，成功实现了几丁质寡糖的合成(Cottaz S，Samain E.Metabolic Engineering，2005，7(4)：311-317)。而专利CN108531436A报道了一种积累几丁寡糖重组枯草芽孢杆菌及其应用，即在枯草芽孢杆菌(Bacillus_subtilis168)中引入百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)的N-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶编码基因nodC，得到了积累几丁寡糖枯草芽孢杆菌基因工程菌，产量达到136mg/L，其中几丁三糖、几丁四糖和几丁五糖的含量分别为8mg/L，28mg/L和100mg/L。

申请人根据N-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶nodC的氨基酸特征序列，在NCBI数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov)进行基因组探矿，挖掘到了存在于苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae)的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶SmNodc，该酶与Azorhizobiumcaulinodans来源的AcNodC具有47％的同源性，与百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)的M1NodC具有67％的同源性。猜测苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae)同样具有几丁寡糖的合成能力。而该酶SmNodc未见任何期刊进行报道和验证其功能。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种密码子优化的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因。本发明还要解决的技术问题在于提供密码子优化的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因在生产几丁寡糖中的具体应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种密码子优化的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因，是核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的多核苷酸。

含有所述的密码子优化的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因的载体。

进一步地，所述载体为pMA5-nodC。

一种基因工程菌，是含有所述载体的宿主菌。

进一步地，所述宿主菌是解淀粉芽孢杆菌。

所述的密码子优化的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因或所述的含有密码子优化的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因的载体或所述基因工程菌在制备几丁寡糖中的应用。

一种几丁寡糖的生产方法，是利用所述的基因工程菌进行发酵培养获得几丁寡糖。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明以苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae)来源的Nodc基因在解淀粉芽孢杆菌通过合成途径重构，提供了一种微生物发酵合成特定聚合度的壳寡糖的新方法，且所使用的解淀粉芽孢杆菌为不产生几丁质酶的食品级安全微生物，发酵生产几丁寡糖的水平高，具有巨大的应用价值和工业化潜力。

附图说明

图1为几丁寡糖结构示意图；

图2为重组质粒pMA5-nodC的电泳检测示意图，注：泳道1：DL 15000Marker；泳道2：pMA5-nodC经Nde I和Bam HI双酶切(目的条带1282bp)；

图3为发酵时间与几丁寡糖产生量、生物量(干重DCW)关系图；

图4为发酵液检测几丁寡糖的色谱结果图；

图5为DNS测定发酵液中几丁质酶活性试验图；

图6为几丁寡糖在解淀粉芽孢杆菌中的合成途径示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

主要实验材料和实验试剂盒：E.coli GM2163去甲基化感受态(实验室保藏并制作感受态)，引物合成与DNA测序(南京金斯瑞生物科技有限公司)，PrimeSTAR高保真酶(Takara)，限制性内切酶Nde I和Bam HI(Takara)，DNA marker(Takara)，质粒提取试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)，胶回收试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)，一步克隆连接Exnase II试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)，pMA5质粒为商业化的芽孢杆菌表达质粒。

发酵液中几丁寡糖检测方法：产物使用LC-1260系统测定，分离柱为AlltechchromPrevail Carbohydrate ES5μ柱(4.6mm×250mm)，(Santa Clara，CA)。流动相由乙腈和水组成，梯度洗脱条件为：0min，75％乙腈；7min，75％乙腈；8min，65％乙腈；15min，65％乙腈；16min，75％乙腈；22min，75％乙腈。柱温为40℃，流速为1mL/min。产物的定性以标品为对照；定量以几丁寡糖(DP 2～6)标准品不同浓度峰面积计算得出。

菌株：所使用的菌株DSM7为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens模式标准菌株。

实施例1：

1、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶密码子优化

一种N-乙酰氨基葡萄糖转移酶，来源于苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummedicae)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。按照解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens DSM7)的密码子偏好性将该N-乙酰氨基葡萄糖转移酶优化后全基因合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，目的基因密码子优化和全基因合成交由通用生物系统(安徽)有限公司完成。

2、重组解淀粉芽孢杆菌构建

将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列克隆到表达质粒pMA5中得到pMA5-nodC，再将重组质粒pMA5-nodC通过电转化法转化至解淀粉芽孢杆菌中，得到能够发酵合成几丁寡糖的工程菌株，具体过程如下：

(1)利用引物F和引物R扩增SEQ ID NO.2所示的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的核苷酸序列。

引物F：5′-aaaaggagcgatttacatatgATGTACCTGCTGGATACGACGAG-3′；

引物R：5′-gagctcgactctagaggatccTTATTCTCCGCTGCATGTGCA-3′。

PCR扩增体系为：模板质粒pUC57-SmNodC：DNA 2μL，引物F和引物R：各2μL，PrimeSTAR高保真酶：12.5μL，ddH₂O：6.5μL；

PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性2min；然后55℃退火30s，72℃延伸2min，循环30次；

回收PCR扩增产物，与经过限制性内切酶Nde I和Bam HI双酶切后的质粒pMA5，使用一步克隆法在Exnase II作用下进行连接，得到重组质粒pMA5-nodC；

(2)将重组质粒pMA5-nodC转化至感受态大肠杆菌GM2163中，涂布含有25μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃恒温培养12～16h得到初步阳性克隆；分别挑取初步阳性克隆于5mL含有25μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，提取质粒，经限制性内切酶Nde I和Bam HI双酶切质粒，根据电泳结果判断具有序列表SEQ ID NO：2的DNA片段的质粒为重组质粒pMA5-nodC，具有该质粒的菌落为阳性克隆菌株(图2)。

(3)将验证成功后重组质粒pMA5-nodC进行质粒抽提，采用电击转化法(电转条件：200Ω，25μF，2.2kV)转化到解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens DMS7)菌株中，将复苏转化液涂布到含有卡那霉素抗性(25μg/mL)的LB琼脂平板平板，32℃，静置培养12h。从平板上挑取长出来的单菌落观察重组菌菌株菌落形态与菌落PCR验证阳性菌株，即为基因工程菌。

实施例2：

利用基因工程菌株发酵生产几丁寡糖，步骤如下：

(1)将实施例1得到的基因工程菌于32℃～37℃培养温度下进行活化，将菌株接种到种子培养基中，摇床转速180～220rpm，32℃～37℃下培养10～16h至OD₆₆₀大于5.0，作为种子液。种子培养基组分为：葡萄糖50g/L，硫酸铵4g/L，酵母粉8g/L，蛋白胨4g/L，K₂HPO₄·3H₂O6g/L，KH₂PO₄2g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，其余为水，pH 6.0～8.0。

(2)将步骤(1)中获得的种子液以2％～6％的接种量接种于发酵培养基进行好氧发酵，检测可见胞外发酵液中富含几丁寡糖(图3)。发酵培养基组分为：葡萄糖50g/L，硫酸铵4g/L，酵母粉8g/L，蛋白胨4g/L，K₂HPO₄·3H₂O6g/L，KH₂PO₄2g/L，MgS0₄·7H₂O1.5g/L，其余为水，pH 6.0～8.0。

经检测，发酵48h时，该基因工程菌胞外发酵液中几丁寡糖浓度达到676mg/L，其中几丁四糖和几丁五糖的含量分别为246mg/L和430mg/L(图4)。检测结果表明利用该重组菌株可实现胞外合成几丁四糖、几丁五糖等几丁寡糖为主的新发酵工艺。

(3)为检测该基因工程菌是否会产生几丁质酶，取(2)中发酵液过滤后制得胞外粗酶液，分为对照和样品两组进行试验，对照组为经沸水浴后得到的失活粗酶液，酶活的具体检测方法为将1.4mL 50mmol/L PB缓冲液(pH 7.0)和0.5mL 0.5g/dL的胶体几丁质加100μL粗酶液组成的反应体系置于37℃水浴30min，沸水浴5min中止反应，冷却至室温后加入2mLDNS试剂，沸水浴5min，离心后取上清，在波长540nm下测吸光度，以灭活的等量酶液作空白对照。通过对比540nm下的吸光度发现样品中的还原糖含量相较对照并未增多，以此确定发酵液中未检出几丁质酶，酶活定义为37℃下1min转化底物胶体几丁质产生1μmol还原糖所需的酶量规定为1个活力单位U(图5)。该实验结果说明本申请构建的基因工程菌在发酵过程中不产生几丁质酶，从而有利于几丁寡糖在发酵液中的累积，推测其几丁寡糖的合成途径如图6所示。

序列表

<110> 扬州日兴生物科技股份有限公司

<120> 一种密码子优化的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因及其应用

<130> 100

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 426

<212> PRT

<213> Sinorhizobium medicae

<400> 1

Met Tyr Leu Leu Asp Thr Thr Ser Thr Ala Ala Ile Ser Ile Tyr Ala

1 5 10 15

Leu Leu Leu Thr Ala Tyr Arg Ser Met Gln Ala Leu His Ala Arg Pro

20 25 30

Ile Asp Gly Pro Ala Val Ser Ala Glu Pro Val Glu Thr Arg Pro Leu

35 40 45

Pro Ala Val Asp Val Ile Val Pro Ser Phe Asn Glu Asp Pro Gly Ile

50 55 60

Leu Ser Ala Cys Leu Ala Ser Ile Ala Asp Gln Asp Tyr Pro Gly Glu

65 70 75 80

Leu Arg Val Tyr Val Val Asp Asp Gly Ser Arg Asn Arg Glu Ala Ile

85 90 95

Val Arg Ala Arg Ala Phe Tyr Ser Arg Asp Pro Arg Phe Ser Phe Ile

100 105 110

Leu Leu Pro Glu Asn Val Gly Lys Arg Lys Ala Gln Ile Ala Ala Ile

115 120 125

Gly Gln Ser Ser Gly Asp Leu Val Leu Asn Val Asp Ser Asp Ser Thr

130 135 140

Ile Ala Phe Asp Val Val Ser Lys Leu Ala Ser Lys Met Gly Asp Pro

145 150 155 160

Glu Val Gly Ala Val Met Gly Gln Leu Thr Ala Ser Asn Ser Gly Asp

165 170 175

Thr Trp Leu Thr Lys Leu Ile Asp Met Glu Tyr Trp Leu Ala Cys Asn

180 185 190

Glu Glu Arg Ala Ala Gln Ala Arg Phe Gly Ala Val Met Cys Cys Cys

195 200 205

Gly Pro Cys Ala Met Tyr Arg Arg Ser Ala Leu Ala Ser Leu Leu Asp

210 215 220

Gln Tyr Glu Thr Gln Leu Phe Arg Gly Lys Leu Ser Asp Phe Gly Glu

225 230 235 240

Asp Arg His Leu Thr Ile Leu Met Leu Lys Ala Gly Phe Arg Thr Glu

245 250 255

Tyr Val Pro Asn Ala Ile Val Ala Thr Val Val Pro Asp Thr Leu Lys

260 265 270

Pro Tyr Leu Arg Gln Gln Leu Arg Trp Ala Arg Ser Thr Phe Arg Asp

275 280 285

Thr Phe Leu Val Leu Pro Leu Leu Arg Gly Leu Asn Pro Phe Leu Thr

290 295 300

Leu Asp Val Val Gly Gln Asn Ile Gly Pro Leu Leu Leu Ala Leu Ser

305 310 315 320

Val Val Thr Gly Leu Ala His Phe Ile Met Thr Ala Thr Val Pro Trp

325 330 335

Trp Thr Ile Leu Ile Ile Ala Ser Met Thr Ile Ile Arg Cys Ser Val

340 345 350

Val Ala Leu His Ala Arg Gln Leu Arg Phe Leu Gly Phe Val Leu His

355 360 365

Thr Pro Ile Asn Leu Phe Leu Leu Leu Pro Leu Lys Ala Tyr Ala Leu

370 375 380

Cys Thr Leu Ser Asn Ser Asp Trp Leu Ser Arg Tyr Ser Ala Pro Glu

385 390 395 400

Val Pro Val Ser Gly Gly Lys Gln Thr Pro Ile Gln Ala Ser Gly Arg

405 410 415

Val Thr Pro Asp Cys Thr Cys Ser Gly Glu

420 425

<210> 2

<211> 1281

<212> DNA

<213> Nodc DNA(Artificial)

<400> 2

atgtacctgc tggatacgac gagcacggcg gcgatcagca tctacgcgct gctgctgacg 60

gcgtaccgca gcatgcaggc gctgcatgcg cgccctattg atggcccggc ggtcagcgcg 120

gaaccggttg aaacgagacc gctgccggcg gtcgatgtca ttgtgccgag ctttaatgaa 180

gatccgggaa ttttaagcgc gtgcctggcg agcatcgcgg atcaagatta cccgggagaa 240

ctgagagtgt acgtggtcga tgatggaagc agaaatcgcg aagcgatcgt ccgcgcgaga 300

gcgttttata gcagagatcc gcgctttagc tttatcctgc tgccggaaaa tgtcggcaaa 360

agaaaagcgc aaatcgcggc gatcggacag agcagcggag atctggtcct gaatgtcgat 420

agcgatagca cgattgcgtt tgatgtcgtc agcaaactgg cgagcaaaat gggcgatccg 480

gaagtgggag cggtcatggg acagctgaca gcgagcaaca gcggagatac gtggctgacg 540

aaactgatcg atatggaata ctggctggcg tgcaatgaag aacgcgcggc gcaggcgaga 600

tttggcgcgg ttatgtgctg ctgcggcccg tgcgcgatgt atcgcagaag cgcgctggcg 660

agcctgctgg atcagtacga aacacaactg tttcgcggaa aactgagcga ttttggcgaa 720

gatagacatc tgacgatcct gatgctgaaa gcgggatttc gcacagaata tgtgccgaac 780

gcgattgtgg cgacagtggt gccggataca ctgaaaccgt acctgcgcca acaactgaga 840

tgggcgcgca gcacatttcg cgatacgttt ctggtcctgc cgctgctgcg cggactgaac 900

ccgtttctga cgctggatgt ggtgggccag aatattggcc cgctgctgct ggcgctgagc 960

gtcgttacgg gcctggcgca ttttattatg acagcgacgg tgccgtggtg gacgatcctg 1020

atcattgcga gcatgacaat tatcagatgc agcgtcgtgg cgctgcatgc acgccagctg 1080

agatttctgg gatttgtgct gcatacaccg attaatctgt ttctgctgct gccgctgaaa 1140

gcgtatgcgc tgtgcacgct gagcaatagc gattggctga gcagatacag cgcgccggaa 1200

gtcccggtca gcggaggaaa acaaacgccg atccaggcga gcggacgcgt cacaccggat 1260

tgcacatgca gcggagaata a 1281

Claims

1.一种密码子优化的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO .2所示。

2.含有权利要求1所述的密码子优化的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因的载体。

3.根据权利要求2所述的载体，所述载体为pMA5-nodC。

4.一种基因工程菌，是含有权利要求2或权利要求3所述载体的宿主菌。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，所述宿主菌是解淀粉芽孢杆菌。

6.权利要求1所述的密码子优化的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因、权利要求2或3所述的含有密码子优化的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因的载体、权利要求4或5所述基因工程菌在制备几丁寡糖中的应用。

7.一种几丁寡糖的生产方法，其特征在于，是利用权利要求4或5所述的基因工程菌进行发酵培养获得几丁寡糖。