CN108504678A

CN108504678A - 一种提高重组枯草芽孢杆菌几丁寡糖产量的方法

Info

Publication number: CN108504678A
Application number: CN201810325088.2A
Authority: CN
Inventors: 刘龙; 堵国成; 陈坚; 凌美希; 李江华; 刘延峰
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-04-12
Filing date: 2018-04-12
Publication date: 2018-09-07

Abstract

本发明公开了一种提高重组枯草芽孢杆菌几丁寡糖产量的方法，属于遗传工程领域。本发明是以枯草芽孢杆菌168，pP43NMK‑nodC为出发菌株，通过以组成型启动子Pveg调控6‑磷酸氨基葡萄糖合成酶编码基因glmS表达，解除Glms核酶反馈抑制，增加几丁寡糖合成途径中前体物质6‑磷酸氨基葡萄糖的供给，加强几丁寡糖合成。本发明的重组枯草芽孢杆菌与出发菌株相比，其几丁寡糖产量从136mg/L提高到248mg/L,比出发菌株提高82.4％，其中，几丁三糖、几丁四糖和几丁五糖的含量分别为10mg/L，38mg/L和200mg/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产几丁寡糖奠定了基础。

Description

一种提高重组枯草芽孢杆菌几丁寡糖产量的方法

技术领域

本发明涉及一种提高重组枯草芽孢杆菌几丁寡糖产量的方法，属于遗传工程领域。

背景技术

几丁寡糖是由N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接起来的低聚合度水溶性甲壳低聚糖，是几丁质经水解生成的一类低聚物。与几丁质相比，几丁寡糖具有更高的水溶性，很容易被吸收利用，它们不仅具有几丁质的部分相似性质，而且一些功能性质更加显著。据报道，几丁寡糖具有抗菌活性、抗肿瘤活性、抵抗细菌侵染的防御能力、降低胆固醇的能力和促进钙吸收的能力、促进双歧杆菌增殖及强的吸湿保湿性能等性质，因此几丁寡糖在食品、医药、农业、日化用品等领域均具有广泛应用。目前，几丁寡糖的合成主要通过化学降解法和酶降解法，但前者需利用强酸或者强氧化剂处理，环境污染较为严重，而后者需要利用虾壳蟹壳为原料制备几丁质底物，易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。

微生物细胞中存在着可能是最大数量的天然糖供体，利用微生物进行寡糖的生物合成，可直接或间接的利用天然糖供体进行目的寡糖的规模合成，使得许多天然或非天然的功能性寡糖的应用成为可能。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded assafe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级几丁寡糖的有效途径。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是构建一种能提高重组枯草芽孢杆菌生产几丁寡糖能力的方法，是通过以组成型启动子Pveg调控6-磷酸氨基葡萄糖合成酶编码基因glmS表达。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis 168，pP43NMK-nodC)。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：构建重组启动子替换片段，将重组启动子替换片段转化至枯草芽孢杆菌宿主(Bacillus subtilis 168，pP43NMK-nodC)细胞中。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168，pP43NMK-nodC)是将百脉根根瘤菌来源的N-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶编码基因(nodC)克隆到表达载体pP43NMK，然后转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)，通过改造代谢途径，实现几丁寡糖的积累。

在本发明的一种实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述N-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶的基因如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，采用载体pP43NMK表达N-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶nodC。

在本发明的一种实施方式中，所述重组启动子替换片段包括glmS原始启动子上游同源臂、标记基因、组成型启动子Pveg序列、glmS原始启动子下游同源臂。

在本发明的一种实施方式中，方法具体如下：克隆6-磷酸氨基葡萄糖合成酶编码基因glmS原始启动子两侧同源臂、博来霉素抗性基因zeo及组成型启动子Pveg序列，通过融合PCR构建重组启动子替换片段；将重组启动子替换片段转化至枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis 168，pP43NMK-nodC)中，得到高产几丁寡糖重组枯草芽孢杆菌。

本发明的第二个目的是提供一种按照上述方法构建获得的几丁寡糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌。

本发明的第三个目的是提供应用上述重组枯草芽孢杆菌发酵生产几丁寡糖的方法，是将所述重组枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基，于35～37℃发酵24～48h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将37℃、220rpm下培养10h的重组枯草芽孢杆菌以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、220rpm条件下发酵48h。

本发明还提供所述重组枯草芽孢杆菌在制备含几丁寡糖的产品方面的应用。

有益效果：本发明提供的重组枯草芽孢杆菌可提高几丁寡糖在胞外积累，其几丁寡糖产量从136mg/L提高到248mg/L，比出发菌株提高82.4％，其中，几丁三糖、几丁四糖和几丁五糖的含量分别为10mg/L，38mg/L和200mg/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产几丁寡糖奠定了基础。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。

具体实施方式

重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：

种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖60，蛋白胨6，硫酸铵6，酵母粉12，木糖5，K₂HPO₄·3H₂O12.5，KH₂PO₄ 2.5，MgSO₄·7H₂O 3,微量元素10ml/L。

微量元素溶液(g/L)：MnSO₄·5H₂O 1.0，Cocl₂·6H₂O 0.4，NaMoO₄·2H₂O 0.2，ZnSO₄·7H₂O 0.2，Alcl₃·6H₂O 0.1，Cucl₂·H₂O 0.1，H₃BO₄ 0.05，含5M HCl。

培养条件：将37℃、220rpm下培养10h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、220rpm条件下培养48h。

几丁寡糖的测定方法：

高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1200，UV检测器，NH₂柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：70％乙腈，流速1mL/min，柱温35℃，进样体积为10μL。

实施例1重组质粒的构建

根据NCBI上公布的百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti，GenBank：MAFF303099)中的N-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶编码基因nodC，通过密码子优化，基因合成SEQ ID NO.2所示的序列，设计引物：nodC-F:5’-

ATAAAGTGATAGCGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGGGCAAAAACTACAAGCTCTG-3’，

nodC-R:5’-ACGATGTAGATGTTAGACATGTGTACATTCCTCTCTTACCCCGGGTTATGAAAGTGCTTCAAACTGTTGCC-3’，使用上述引物，以合成N-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶编码基因nodC为模板扩增nodC基因片段，质粒pP43NMK经KpnI和HindIII双酶切线性化后与以上扩增基因片段通过Gibson Assembly Clonging Kit(New England Biolabs)连接，构建重组质粒，双酶切验证及测序，确认重组质粒pP43NMK-nodC构建成功。

实施例2重组枯草芽孢杆菌的构建

将构建好的表达载体pP43NMK-nodC转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis168)。采用nodC-F及GNA1-R引物挑选转化子进行菌落PCR，出现1200bp条带，验证重组枯草芽孢杆菌构建成功。

实施例3构建6-磷酸氨基葡萄糖合成酶编码基因glmS启动子替换框

根据对NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168，购自美国典型微生物保藏中心,ATCC No.27370)6-磷酸氨基葡萄糖合成酶编码基因glmS进行序列分析获得glmS启动子区域(如SEQ ID NO.4所示)，根据其上下游序列设计启动子替换框同源臂扩增引物，左臂上下游引物分别为：glmS-L-F：5’-GGATTTAAGCTTTCTGATGAACAGGAGG-3’和glmS-L-R：5’-TATGCTATACGAACGGTATTACTCTAATCCCAT-3’；右臂上下游引物分别为：glmS-R-F:5’-GAGGTGGATGCAATGTGTGGAATC-3’和glmS-R-R:5’-GCGGCATGTTGTAGGAGAATTCAC-3’。运用上述引物从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组中扩增替换框中包含的左臂和右臂。根据NCBI上公布的p7Z6质粒序列(南京农业大学，闫新博士惠赠，NCBI accessionno.EU541492)，设计引物，扩增博来霉素抗性基因(zeo)，上下游引物分别为：glmS-Z-F:5’-GAAATGGGATTAGAGTAATACCGTTCGTATAGC-3’和glmS-Z-R:5’-GGAGCACTTCCCTACCGTTCGTAT-3’。根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)序列设计引物，扩增组成型启动子Pveg序列，上下游引物分别为：glmS-P-F:5’-TACGAACGGTAGGGAAGTGCTCC-3’和glmS-P-R：5’-CGATTCCACACATTGCATCCACCTC-3’。通过融合PCR方法，将替换框左臂、抗性基因、启动子序列和右臂融合为替换框。通过测序确认该启动子替换框构建成功。

实施例4重组枯草芽孢杆菌的构建

将构建好的启动子替换框转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168，pP43NMK-nodC)，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证，确认6-磷酸氨基葡萄糖合成酶编码基因glmS启动子替换成功，确定重组枯草芽孢杆菌构建成功。

实施例5发酵生产几丁寡糖

将37℃、220rpm下培养10h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、220rpm条件下培养48h。以Bacillus subtilis 168，pP43NMK-nodC为对照，在相同的条件下培养、发酵。最终重组枯草芽孢杆菌发酵上清液中几丁寡糖浓度从136mg/L提高到248mg/L，比出发菌株提高82.4％，其中，几丁三糖、几丁四糖和几丁五糖的含量分别为10mg/L，38mg/L和200mg/L。通过以组成型启动子Pveg调控6-磷酸氨基葡萄糖合成酶编码基因glmS表达，实现了几丁寡糖产量在重组枯草芽孢杆菌胞外的提高。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高重组枯草芽孢杆菌几丁寡糖产量的方法

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 424

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Asn Leu Phe Ala Ser Ala Ser Thr Val Ala Ile Cys Ser Tyr Ala

1 5 10 15

Leu Leu Ser Thr Val Tyr Lys Thr Ala Gln Val Phe Tyr Thr Leu Pro

20 25 30

Thr Asn Val Pro Pro Thr Ser Gly Asp Pro Pro Ser Gly Glu Pro Trp

35 40 45

Pro Ser Val Asp Val Ile Ile Pro Cys Tyr Asn Glu Ala Pro Arg Thr

50 55 60

Leu Ser Asp Cys Leu Ala Ser Ile Ala Ser Gln Asp Tyr Ala Gly Lys

65 70 75 80

Leu Gln Val Tyr Val Val Asp Asp Gly Ser Ala Asn Arg Asp Ala Leu

85 90 95

Val Gly Val His Glu Glu Tyr Ala Gly Asp Pro Arg Phe Asn Phe Val

100 105 110

Ala Leu Pro Lys Asn Val Gly Lys Arg Lys Ala Gln Ile Ala Ala Ile

115 120 125

Arg Arg Ser Cys Gly Asp Leu Val Leu Asn Val Asp Ser Asp Thr Ile

130 135 140

Leu Ala Pro Asp Val Ile Thr Arg Leu Ala Leu Lys Met Gln Asp Gln

145 150 155 160

Ala Val Gly Ala Ala Met Gly Gln Leu Ala Ala Ser Asn Arg Ser Glu

165 170 175

Thr Trp Leu Thr Arg Leu Ile Asp Met Glu Tyr Trp Leu Ala Cys Asn

180 185 190

Glu Glu Arg Ala Ala Gln Ala Arg Phe Gly Ala Val Met Cys Cys Cys

195 200 205

Gly Pro Cys Ala Met Tyr Arg Arg Ser Ala Leu Val Ser Leu Leu Asp

210 215 220

Gln Tyr Glu Thr Gln Arg Phe Arg Gly Lys Pro Ser Asp Phe Gly Glu

225 230 235 240

Asp Arg His Leu Thr Ile Leu Met Leu Lys Ala Gly Phe Arg Thr Glu

245 250 255

Tyr Val Pro Glu Ala Val Ala Ala Thr Val Val Pro Asn Ser Met Gly

260 265 270

Pro Tyr Leu Arg Gln Gln Leu Arg Trp Ala Arg Ser Thr Phe Arg Asp

275 280 285

Thr Leu Leu Ala Phe Gln Leu Leu Arg Gly Leu Asn Ile Tyr Leu Thr

290 295 300

Leu Asp Val Ile Gly Gln Asn Ile Gly Pro Leu Leu Leu Ser Leu Ser

305 310 315 320

Ile Leu Ala Gly Leu Ala Gln Phe Val Thr Thr Gly Thr Val Pro Trp

325 330 335

Thr Ala Cys Leu Met Ile Ala Ala Met Thr Ile Val Arg Cys Ser Val

340 345 350

Ala Ala Phe Arg Ala Arg Gln Leu Arg Phe Leu Gly Phe Ser Leu His

355 360 365

Thr Leu Ile Asn Ile Phe Leu Leu Leu Pro Leu Lys Ala Tyr Ala Leu

370 375 380

Cys Thr Leu Ser Asn Ser Asp Trp Leu Ser Arg Ser Ser Ala Ala Asn

385 390 395 400

Val Gln Asp Thr Gly Asp Ala Leu Pro Lys Pro Asn Leu Val Gly Ser

405 410 415

Asp Ala Ala Tyr Ser Glu Gln Gln

420

<210> 2

<211> 1275

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgaacctgt ttgcgagcgc gagcacggtg gcgatttgca gctacgcatt actgagcaca 60

gtttacaaaa cggcgcaagt tttttacacg ctgccgacca acgtgccgcc gacgagcgga 120

gatcctccga gtggagaacc gtggccgtct gttgatgtta ttattccgtg ctataatgag 180

gcgccgagaa cattatcaga ttgcctggct tcaattgcaa gtcaagatta cgcaggcaag 240

ctccaagttt atgtggttga tgatggctct gcaaatcgcg acgcactggt gggcgtgcat 300

gaagaatacg cgggcgatcc gcgctttaat tttgtagcat taccgaaaaa tgtgggaaaa 360

agaaaagcac aaatcgcagc aattcgcaga tcatgcggag atcttgttct gaatgttgat 420

agcgatacaa ttctggcacc tgatgtgatt acaagactgg cactgaaaat gcaagatcaa 480

gcagttggcg cggcaatggg ccaactggcg gcgagtaata gatctgaaac gtggctgaca 540

agactgattg atatggaata ttggctggca tgcaacgaag aaagagcagc acaagcaaga 600

tttggagcag taatgtgttg ctgtggaccg tgcgcaatgt acagaagaag cgctctggtg 660

agcctgctgg atcaatatga gactcaaaga ttcagaggaa aaccgtcaga ttttggcgag 720

gatagacatc tgacgattct gatgcttaaa gcaggcttta gaacagaata tgttccggaa 780

gctgttgcag caacagtagt tccgaattca atggggccgt atcttcggca gcaattaagg 840

tgggcaagat caacatttag ggatacatta ctggcgtttc aactgcttag aggcctgaat 900

atttatctga ccctggatgt tattggtcaa aatattggcc ctcttcttct cagcttatct 960

attctggcgg gcctggcaca atttgttaca acaggcacag ttccttggac agcttgctta 1020

atgattgcag caatgacaat tgtgagatgc tcagttgcag cttttagagc acggcaactg 1080

agatttctgg gcttttcact gcatacactc attaatattt tcctgctgtt gcctctgaaa 1140

gcgtatgcac tgtgcacatt gtcaaacagc gattggttga gtcgctcatc agcagcaaat 1200

gttcaagata cgggcgatgc actgccgaag ccgaacttgg ttggctcaga tgcagcatat 1260

tccgaacaac aataa 1275

<210> 3

<211> 308

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gggaagtgct ccgtaatacg ctgacaagag agaaagggct tggaggtatt gaaacaagag 60

gagttctgag aattggtatg ccttataagt ccaattaaca gttgaaaacc tgcataggag 120

agctatgcgg gttttttatt ttacataatg atacataatt taccgaaact tgcggaacat 180

aattgaggaa tcatagaatt ttgtcaaaat aattttattg acaacgtctt attaacgttg 240

atataattta aattttattt gacaaaaatg ggctcgtgtt gtacaataaa tgtagtgagg 300

tggatgca 308

<210> 4

<211> 433

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgaagtctat tatcagagag tgaacaagac aagcgaggtt tacataagat aattgtgaga 60

catacggcaa agttgcttaa aaaacaattg accgtttatg ccacatgttg taaaatcaag 120

cttgtcttgt tcttattttc tcaataggaa aagaagacgg gattattgct ttacctataa 180

ttatagcgcc cgaactaagc gcccggaaaa aggcttagtt gacgaggatg gaggttatcg 240

aattttcggc ggatgcctcc cggctgagtg tgcagatcac agccgtaagg atttcttcaa 300

accaaggggg tgactccttg aacaaagaga aatcacatga tcttccaaaa aacatgtagg 360

aggggacgat tgaaagtccc cttgaaattt gactttcttc gtctcctttt acaatcttag 420

gaggaagaaa aat 433

<210> 5

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ataaagtgat agcggtacca ttataggtaa gagaggaatg tacacatggg caaaaactac 60

aagctctg 68

<210> 6

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acgatgtaga tgttagacat gtgtacattc ctctcttacc ccgggttatg aaagtgcttc 60

aaactgttgc c 71

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggatttaagc tttctgatga acaggagg 28

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tatgctatac gaacggtatt actctaatcc cat 33

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaggtggatg caatgtgtgg aatc 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcggcatgtt gtaggagaat tcac 24

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gaaatgggat tagagtaata ccgttcgtat agc 33

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggagcacttc cctaccgttc gtat 24

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tacgaacggt agggaagtgc tcc 23

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cgattccaca cattgcatcc acctc 25

Claims

1.一种提高重组枯草芽孢杆菌生产几丁寡糖能力的方法，其特征在于，通过以组成型启动子Pveg调控6-磷酸氨基葡萄糖合成酶编码基因glmS表达。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168，pP43NMK-nodC。

4.根据权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：克隆6-磷酸氨基葡萄糖合成酶编码基因glmS原始启动子两侧同源臂、标记基因及组成型启动子Pveg序列，通过融合PCR构建重组启动子替换片段；将重组启动子替换片段转化至枯草芽孢杆菌168，pP43NMK-nodC中。

5.一种积累几丁寡糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以组成型启动子Pveg调控6-磷酸氨基葡萄糖合成酶编码基因glmS表达。

6.根据权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

7.一种构建权利要求5所述重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，克隆6-磷酸氨基葡萄糖合成酶编码基因glmS原始启动子两侧同源臂、标记基因及组成型启动子Pveg序列，通过融合PCR构建重组启动子替换片段；将重组启动子替换片段转化至枯草芽孢杆菌168，pP43NMK-nodC中。

8.一种生产几丁寡糖的方法，其特征在于，应用权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌进行发酵。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵是在35～37℃发酵24～48h。

10.权利要求5或6所述的重组枯草芽孢杆菌在制备含几丁寡糖的产品方面的应用。