CN110066801A

CN110066801A - 一种枯草芽孢杆菌中唾液酸诱导表达元件及构建方法

Info

Publication number: CN110066801A
Application number: CN201910358649.3A
Authority: CN
Inventors: 刘延峰; 堵国成; 张晓龙; 王凤玲; 袁烁栎; 陈坚
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-04-30
Filing date: 2019-04-30
Publication date: 2019-07-30
Anticipated expiration: 2039-04-30
Also published as: CN110066801B

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌中唾液酸诱导表达元件及构建方法，属于遗传工程领域。本发明以pHT质粒为载体，在枯草芽孢杆菌中，P_ydjO启动子表达转录调控蛋白NanR，进一步在强启动子P_veg中整合NanR识别结合序列，并关联绿色荧光蛋白GFP，在发酵培养基中添加唾液酸进行发酵验证，成功构建枯草芽孢杆菌中唾液酸诱导表达元件，使其诱导表达强度达到4000a.u.，在不添加唾液酸的情况下，泄漏量为10％，为进一步优化枯草芽孢杆菌中唾液酸诱导表达元件奠定了基础。

Description

一种枯草芽孢杆菌中唾液酸诱导表达元件及构建方法

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌中唾液酸诱导表达元件及构建方法，属于遗传工程领域。

背景技术

在枯草芽孢杆菌中，可诱导激活表达的启动子元件，广泛应用于代谢工程领域。目前，枯草芽孢杆菌中常用的诱导启动子，有木糖诱导启动子P_xyl和IPTG诱导启动子P_grac。然而，木糖诱导启动子P_xyl的诱导剂木糖可被枯草芽孢杆菌代谢消耗，IPTG诱导启动子P_grac的诱导剂IPTG对细胞存在一定毒性的问题。以上缺陷，严重限制了其在枯草芽孢杆菌代谢工程领域的应用。唾液酸作为一种简单碳源，且对细胞无毒，且不会被枯草芽孢杆菌代谢消耗，是一种合适的诱导物。通过基因工程改造启动子，可以获得基于唾液酸诱导的更合适于枯草芽孢杆菌的响应元件。然而，如何改造启动子，以响应唾液酸实现较高的诱导表达是一个值得深入研究的问题。另外，枯草芽孢杆菌缺失唾液酸天然转运途径，不能转运胞外唾液酸至胞内，这限制了唾液酸诱导表达元件在枯草芽孢杆菌代谢工程领域的应用。

发明内容

为解决上述技术问题，实现响应于唾液酸的诱导表达启动子元件，本发明以组成型启动子P_ydjO表达转录调控蛋白NanR，进一步通过在组成型启动子P_veg中，整合转录调控蛋白NanR结合序列TTNANNTGGTATAACAGGTATANAGNTANNNNNTNN，实现以枯草芽孢杆菌添加唾液酸后，达到较高强度的诱导表达水平和较低的泄漏表达水平。

本发明的第一个目的是提供一种诱导表达启动子元件；该元件响应的诱导底物为唾液酸，所述元件含有NanR蛋白、P_ydjO启动子、P_veg和NanR结合序列的质粒；所述P_ydjO启动子为组成型启动子，表达转录调控蛋白NanR；组成型启动子P_veg与调控蛋白NanR结合序列TTNANNTGGTATA ACAGGTATANAGNTANNNNNTNN整合；启动子P_ydjO和启动子P_veg的转录方向相反。

在本发明的一种实施方式中，组成型P_ydjO启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，转录调控蛋白P_veg启动子的核苷酸序列如SEQ NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，转录调控蛋白NanR氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，唾液酸转运蛋白NanT氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，整合NanR结合位点序列的P_veg启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的第二个目的是提供含有所述唾液酸诱导表达元件的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌为宿主。

本发明的第三个目是提供一种唾液酸诱导表达元件在枯草芽孢杆菌代谢工程领域的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用为促进目的蛋白的表达。

在本发明的一种实施方式中，所述应用为降低泄露表达水平。

在本发明的一种实施方式中，所述应用为筛选表达目的基因的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述唾液酸诱导表达元件的激活条件为：培养环境中含有唾液酸盐；培养条件为30～37℃培养16～48h。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌用于验证唾液酸诱导表达元件，在唾液酸存在条件下可激活下游基因GFP表达。

有益效果：

(1)本发明通过将转录调控蛋白NanR结合位点序列TTNANNTGGTATAACAGGTATANAGNTANNNNNTNN，整合至较强的组成型表达启动子P_veg中，获得了激活强度较高的唾液酸诱导表达启动子元件。

(2)本发明提供的唾液酸诱导表达启动子元件，其在枯草芽孢杆菌中，激活表达强度达到4000a.u.。唾液酸诱导表达启动子元件在无唾液酸存在条件下的泄漏表达水平仅为10％左右。为进一步通过基因工程，改造枯草芽孢杆菌唾液酸诱导表达启动子奠定了基础。本发明提供的唾液酸诱导表达启动子构建方法简单，便于使用，具有很好的代谢工程应用前景。

具体实施方式

具体实施方式中涉及的引物序列如下：

组成型P_ydjO启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

转录调控蛋白P_veg启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

转录调控蛋白NanR的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

唾液酸转运蛋白NanT的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

整合NanR结合位点序列的P_veg启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

唾液酸诱导表达元件质粒pHT-BbL-veg的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

含唾液酸诱导表达启动子元件的枯草芽孢杆菌培养条件：

发酵培养基(g/L)：唾液酸5，胰蛋白胨6，酵母粉12，硫酸铵6，磷酸氢二钾12.5，磷酸二氢钾2.5，硫酸镁3。

培养条件：37℃、200rpm，条件下培养48h。

绿色荧光蛋白和菌体浓度检测方法：

Tecan酶标仪：绿色荧光蛋白检测，激发波长490nm，发射波长530nm，增益60。菌体浓度检测波长为600nm。

泄露表达量计算公式(％)：x＝(a-b)/c

其中，a为唾液酸诱导表达元件在未添加唾液酸盐时的荧光强度，b为枯草芽孢杆菌168菌株作为对照菌株的荧光强度，c为唾液酸诱导表达元件在添加唾液酸盐时的荧光强度。

实施例1构建基因组重组整合NanT片段

为了实现枯草芽孢杆菌转运诱导物唾液酸至胞内，将来源于大肠杆菌K12的NanT转运蛋白通过同源重组整合至枯草芽孢杆菌基因组中。以大肠杆菌K12基因组为模板，设计引物L-F:5’-GTATGTCATGATGCGTGAAGGATCAGTCGCCAAAAACACGC-3’和L-R:5’-GTTATCCGCTCAAAAAGAGGCACTCCCTAAGGGAGTGCCTCTTTTTATTGCAGTG-3’，扩增重组整合NanT片段左臂基因序列；设计引物S-F:5’-CCTTAGGGAGTGCCTCTTTTTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG-3’和S-R:5’-CACCTATCATAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’，扩增壮观霉素抗性左臂基因序列；设计引物P-F:5’-GACTGGGAAAACCCTGGCGTTATGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTGAACTTTTA-3’和P-R:5’-GGATATTCTGGGTTGTAGTACTCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTACCGC-3’，扩增P₄₃启动子基因序列；设计引物N-F:5’-TAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGAGTACTACAACCCAGAATATCCCGTGGTATCGCCATCTCAACCG-3’和N-R:5’-GGGGTTGACGACCGAGTAGTTCACCTTAACTTTTGGTTTTGACTAAATCGTTTTTGGCGCTGCCAAACGGCACG-3’，扩增唾液酸转运酶NanT基因序列；设计引物R-F:5’-TTAAGGTGAACTACTCGGTCGTCAACCCCATTAAACCTCCATAATGATCGGCAGGATCATTGGACGGCGCTTTG-3’和R-R:5’-CCATGTCTGAGCGCCGTGTAGGAGAAAGCATTCATGACATTTTCCG-3’，扩增重组片段NanT右臂基因序列；将以上5个基因片段通过融合PCR技术，构建成重组整合NanT基因片段，命名为LSPNR。

实施例2可转运唾液酸重组枯草芽孢杆菌的构建

将重组整合NanT的基因片段LSPNR转化至枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168，重组到基因组上，获得重组枯草芽孢杆菌工程菌，命名为BSnanT。

实施例3构建唾液酸响应元件工具质粒pHT-BbL-veg质粒

为了实现在不添加诱导物唾液酸时，启动子处于关闭状态，扩征来源于大肠杆菌K12的NanR蛋白为阻遏物，调控唾液酸相应元件的表达。以大肠杆菌K12基因组为模板，设计引物N-1F:5-AACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCTTATTTCTTTTTGTTGGTGGTCTGACCGAAAG-3’和N-1R:5-ACGTAAAAACAAAGGAGGTGAAATGTACACATGGGCCTTATGAACGCATTTGATTCGCA-3’，克隆编码转录调控蛋白的基因NanR片段；设计引物N-2F:5-GTGTACATTTCACCTCCTTTGTTTTTACGTAATACGATAAATAGGGCCAAAGGT-3’和N-2R:5-GTATTACGGAGCACTTCCCATATTATCAAGAAAGCGGGGAATTGTCCTATACC-3’，克隆P_ydjO启动子基因片段，设计引物N-3F:5-CCCGCTTTCTTGATAATATGGGAAGTGCTCCGTAATACGCTGACAAGAGA-3’和N-3R:5-CTTTAAACGATATACCTTTATACCTGTTATACCATTGTACAACACGAGCCCATTTTT GTCAAATAAAATTTAAATT-3’，克隆P_veg基因片段，设计引物N-4F:5-ATAACAGGTATAAAGGTATATCGTTTAAAGGAGGTGAAATGTACACATGGGTAAGGGAGAAGAACTTTTCACT-3’和N-4R:5-GCGTGACGTGAATTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTGTAATCCCAGCAG-3’，克隆GFP基因片段；设计引物N-5F:5-GAACTATACAAATAATTCACGTCACGCGTCCATGGAGA-3’和N-5R:5-GAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAAC-3’，克隆pHT质粒片段，共5个片段通过NEB Gibson AssemblyMaster Mix Kit进行组装，构建唾液酸响应元件工具质粒pHT-BbL-veg质粒。

实施例4构建唾液酸诱导表达元件枯草芽孢杆菌BSnanT-pHT-BbL-veg

将唾液酸响应元件工具质粒pHT-BbL-veg质粒，转化至上实施例2构建的枯草芽孢杆菌工程菌株BSnanT中，获得重组枯草芽孢杆菌工程菌，命名为BSnanT-pHT-BbL-veg。

实施例5枯草芽孢杆菌BSnanT-pHT-BbL-veg添加唾液酸诱导发酵

将按照实施例4的方法制备的菌株BSnanT-pHT-BbL-veg于37℃、200rpm下，在含有5g/L唾液酸钠的发酵培养基中培养48h。最终测定发酵液绿色荧光蛋白强度为4000a.u.，泄露表达量为10％，成功获得强诱导表达强度的唾液酸诱导表达元件。当发酵培养基中不添加唾液酸钠时，发酵48h，发酵液绿色荧光蛋白强度为240a.u.，泄漏表达量为10％。

对比例1：不同启动子对诱导表达元件调控效果的影响

应用论文Yang,S.,Du,G.,Chen,J.,Kang,Z.,2017.Characterization andapplication of endogenous phase-dependent promoters in Bacillus subtilis.Appl.Microbiol.Biotechnol.101,4151–61.公开的若干种启动子，按照实施例2的策略构建诱导表达元件，区别在于，将P_veg启动子启动子替换为P_asd启动子、P_sigh启动子、P_citz启动子和P_csbA启动子，采用实施例5所述的方法验证调控效果，结果显示以上4个启动子构建的诱导表达原件，均不能被激活表达。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种枯草芽孢杆菌中唾液酸诱导表达元件及构建方法

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttatcaagaa agcggggaat tgtcctatac cggtccggct gtcccgccgc cgccaagtga 60

aaagggctgg aaagacacca ttcaagcgca tgcaggtgaa gtcctgagaa tcgcggcgac 120

attcggtccg tacagcggac gatacgtatg gcattgccat attctagagc atgaagacta 180

tgacatgatg agaccgatgg atataactga tccccataaa taacccgaca aacttgcctc 240

tagcaggcaa gttttttctt tatgaaacct ttggccctat ttatcgtatt acgtaaaaac 300

<210> 2

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tatgggaagt gctccgtaat acgctgacaa gagagaaagg gcttggaggt attgaaacaa 60

gaggagttct gagaattggt atgccttata agtccaatta acagttgaaa acctgcatag 120

gagagctatg cgggtttttt attttacata atgatacata atttaccgaa acttgcggaa 180

cataattgag gaatcataga attttgtcaa aataatttta ttgacaacgt cttattaacg 240

ttgatataat ttaaatttta tttgacaaaa atgggctcgt gttgtacaat aaatgtagtg 300

<210> 3

<211> 263

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

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1 5 10 15

Ala Ile Gly Arg Asn Leu Arg Ser Arg Pro Leu Ala Arg Lys Lys Leu

20 25 30

Ser Glu Met Val Glu Glu Glu Leu Glu Gln Met Ile Arg Arg Arg Glu

35 40 45

Phe Gly Glu Gly Glu Gln Leu Pro Ser Glu Arg Glu Leu Met Ala Phe

50 55 60

Phe Asn Val Gly Arg Pro Ser Val Arg Glu Ala Leu Ala Ala Leu Lys

65 70 75 80

Arg Lys Gly Leu Val Gln Ile Asn Asn Gly Glu Arg Ala Arg Val Ser

85 90 95

Arg Pro Ser Ala Asp Thr Ile Ile Gly Glu Leu Ser Gly Met Ala Lys

100 105 110

Asp Phe Leu Ser His Pro Gly Gly Ile Ala His Phe Glu Gln Leu Arg

115 120 125

Leu Phe Phe Glu Ser Ser Leu Val Arg Tyr Ala Ala Glu His Ala Thr

130 135 140

Asp Glu Gln Ile Asp Leu Leu Ala Lys Ala Leu Glu Ile Asn Ser Gln

145 150 155 160

Ser Leu Asp Asn Asn Ala Ala Phe Ile Arg Ser Asp Val Asp Phe His

165 170 175

Arg Val Leu Ala Glu Ile Pro Gly Asn Pro Ile Phe Met Ala Ile His

180 185 190

Val Ala Leu Leu Asp Trp Leu Ile Ala Ala Arg Pro Thr Val Thr Asp

195 200 205

Gln Ala Leu His Glu His Asn Asn Val Ser Tyr Gln Gln His Ile Ala

210 215 220

Ile Val Asp Ala Ile Arg Arg His Asp Pro Asp Glu Ala Asp Arg Ala

225 230 235 240

Leu Gln Ser His Leu Asn Ser Val Ser Ala Thr Trp His Ala Phe Gly

245 250 255

Gln Thr Thr Asn Lys Lys Lys

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<210> 4

<211> 496

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Ser Thr Thr Thr Gln Asn Ile Pro Trp Tyr Arg His Leu Asn Arg

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Ala Gln Trp Arg Ala Phe Ser Ala Ala Trp Leu Gly Tyr Leu Leu Asp

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Gly Phe Asp Phe Val Leu Ile Ala Leu Val Leu Thr Glu Val Gln Gly

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Glu Phe Gly Leu Thr Thr Val Gln Ala Ala Ser Leu Ile Ser Ala Ala

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Phe Ile Ser Arg Trp Phe Gly Gly Leu Met Leu Gly Ala Met Gly Asp

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Arg Tyr Gly Arg Arg Leu Ala Met Val Thr Ser Ile Val Leu Phe Ser

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Ala Gly Thr Leu Ala Cys Gly Phe Ala Pro Gly Tyr Ile Thr Met Phe

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Ile Ala Arg Leu Val Ile Gly Met Gly Met Ala Gly Glu Tyr Gly Ser

115 120 125

Ser Ala Thr Tyr Val Ile Glu Ser Trp Pro Lys His Leu Arg Asn Lys

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Ala Ser Gly Phe Leu Ile Ser Gly Phe Ser Val Gly Ala Val Val Ala

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Ala Gln Val Tyr Ser Leu Val Val Pro Val Trp Gly Trp Arg Ala Leu

165 170 175

Phe Phe Ile Gly Ile Leu Pro Ile Ile Phe Ala Leu Trp Leu Arg Lys

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Asn Ile Pro Glu Ala Glu Asp Trp Lys Glu Lys His Ala Gly Lys Ala

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Pro Val Arg Thr Met Val Asp Ile Leu Tyr Arg Gly Glu His Arg Ile

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Ala Asn Ile Val Met Thr Leu Ala Ala Ala Thr Ala Leu Trp Phe Cys

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Phe Ala Gly Asn Leu Gln Asn Ala Ala Ile Val Ala Val Leu Gly Leu

245 250 255

Leu Cys Ala Ala Ile Phe Ile Ser Phe Met Val Gln Ser Ala Gly Lys

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Arg Trp Pro Thr Gly Val Met Leu Met Val Val Val Leu Phe Ala Phe

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Leu Tyr Ser Trp Pro Ile Gln Ala Leu Leu Pro Thr Tyr Leu Lys Thr

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Gly Phe Gly Ala Ala Val Gly Cys Cys Val Gly Gly Phe Leu Gly Asp

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Trp Leu Gly Thr Arg Lys Ala Tyr Val Cys Ser Leu Leu Ala Ser Gln

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Ala Ala Gly Leu Gly Phe Thr Tyr Asn Val Gly Ala Leu Gly Gly Ala

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Leu Ala Pro Ile Ile Gly Ala Leu Ile Ala Gln Arg Leu Asp Leu Gly

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Thr Ala Leu Ala Ser Leu Ser Phe Ser Leu Thr Phe Val Val Ile Leu

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Leu Ile Gly Leu Asp Met Pro Ser Arg Val Gln Arg Trp Leu Arg Pro

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Glu Ala Leu Arg Thr His Asp Ala Ile Asp Gly Lys Pro Phe Ser Gly

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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gaggagttct gagaattggt atgccttata agtccaatta acagttgaaa acctgcatag 120

gagagctatg cgggtttttt attttacata atgatacata atttaccgaa acttgcggaa 180

cataattgag gaatcataga attttgtcaa aataatttta ttgacaacgt cttattaacg 240

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<210> 6

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Gly Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val

1 5 10 15

Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys

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Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

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Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg

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cattaggcct atctgacaat tcctgaatag agttcataaa caatcctgca tgataaccat 180

cacaaacaga atgatgtacc tgtaaagata gcggtaaata tattgaatta cctttattaa 240

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tgggcacaaa ttttctgtca gtggagaggg tgaaggtgat gcaacatacg gaaaacttac 2820

ccttaaattt atttgcacta ctggaaagct tcctgttcct tggccaacac ttgtcactac 2880

tcttacttat ggtgttcaat gcttttcaag atacccagat catatgaagc ggcacgactt 2940

cttcaagagc gccatgcctg agggatacgt gcaggagagg accatcttct tcaaggacga 3000

cgggaactac aagacacgtg ctgaagtcaa gtttgaggga gacaccctcg tcaacagaat 3060

cgagcttaag ggaatcgatt tcaaggagga cggaaacatc ctcggccaca agttggaata 3120

caactacaac tcccacaacg tatacatcat ggcagacaaa caaaagaatg gaatcaaagt 3180

taacttcaaa attagacaca acattgaaga tggaagcgtt caactagcag accattatca 3240

acaaaatact ccaattggcg atggccctgt ccttttacca gacaaccatt acctgtccac 3300

acaatctgcc ctttcgaaag atcccaacga aaagagagac cacatggtcc ttcttgagtt 3360

tgtaacagct gctgggatta cacatggcat ggatgaacta tacaaataat tcacgtcacg 3420

cgtccatgga gatctttgtc tgcaactgaa aagtttatac cttacctgga acaaatggtt 3480

gaaacatacg aggctaatat cggcttatta ggaatagtcc ctgtactaat aaaatcaggt 3540

ggatcagttg atcagtatat tttggacgaa gctcggaaag aatttggaga tgacttgctt 3600

aattccacaa ttaaattaag ggaaagaata aagcgatttg atgttcaagg aatcacggaa 3660

gaagatactc atgataaaga agctctaaaa ctattcaata accttacaat ggaattgatc 3720

gaaagggtgg aaggttaatg gtacgaaaat taggggatct acctagaaag ccacaaggcg 3780

ataggtcaag cttaaagaac ccttacatgg atcttacaga ttctgaaagt aaagaaacaa 3840

cagaggttaa acaaacagaa ccaaaaagaa aaaaagcatt gttgaaaaca atgaaagttg 3900

atgtttcaat ccataataag attaaatcgc tgcacgaaat tctggcagca tccgaaggga 3960

attcatatta cttagaggat actattgaga gagctattga taagatggtt gagacattac 4020

ctgagagcca aaaaactttt tatgaatatg aattaaaaaa aagaaccaac aaaggctgag 4080

acagactcca aacgagtctg tttttttaaa aaaaatatta ggagcattga atatatatta 4140

gagaattaag aaagacatgg gaataaaaat attttaaatc cagtaaaaat atgataagat 4200

tatttcagaa tatgaagaac tctgtttgtt tttgatgaaa aaacaaacaa aaaaaatcca 4260

cctaacggaa tctcaattta actaacagcg gccaaactga gaagttaaat ttgagaaggg 4320

gaaaaggcgg atttatactt gtatttaact atctccattt taacatttta ttaaacccca 4380

tacaagtgaa aatcctcttt tacactgttc ctttaggtga tcgcggaggg acattatgag 4440

tgaagtaaac ctaaaaggaa atacagatga attagtgtat tatcgacagc aaaccactgg 4500

aaataaaatc gccaggaaga gaatcaaaaa agggaaagaa gaagtttatt atgttgctga 4560

aacggaagag aagatatgga cagaagagca aataaaaaac ttttctttag acaaatttgg 4620

tacgcatata ccttacatag aaggtcatta tacaatctta aataattact tctttgattt 4680

ttggggctat tttttaggtg ctgaaggaat tgcgctctat gctcacctaa ctcgttatgc 4740

atacggcagc aaagactttt gctttcctag tctacaaaca atcgctaaaa aaatggacaa 4800

gactcctgtt acagttagag gctacttgaa actgcttgaa aggtacggtt ttatttggaa 4860

ggtaaacgtc cgtaataaaa ccaaggataa cacagaggaa tccccgattt ttaagattag 4920

acgtaaggtt cctttgcttt cagaagaact tttaaatgga aaccctaata ttgaaattcc 4980

agatgacgag gaagcacatg taaagaaggc tttaaaaaag gaaaaagagg gtcttccaaa 5040

ggttttgaaa aaagagcacg atgaatttgt taaaaaaatg atggatgagt cagaaacaat 5100

taatattcca gaggccttac aatatgacac aatgtatgaa gatatactca gtaaaggaga 5160

aattcgaaaa gaaatcaaaa aacaaatacc taatcctaca acatcttttg agagtatatc 5220

aatgacaact gaagaggaaa aagtcgacag tactttaaaa agcgaaatgc aaaatcgtgt 5280

ctctaagcct tcttttgata cctggtttaa aaacactaag atcaaaattg aaaataaaaa 5340

ttgtttatta cttgtaccga gtgaatttgc atttgaatgg attaagaaaa gatatttaga 5400

aacaattaaa acagtccttg aagaagctgg atatgttttc gaaaaaatcg aactaagaaa 5460

agtgcaataa actgctgaag tatttcagca gtttttttta tttagaaata gtgaaaaaaa 5520

tataatcagg gaggtatcaa tatttaatga gtactgattt aaatttattt agactggaat 5580

taataattaa cacgtagact aattaaaatt taatgaggga taaagaggat acaaaaatat 5640

taatttcaat ccctattaaa ttttaacaag ggggggatta aaatttaatt agaggtttat 5700

ccacaagaaa agaccctaat aaaattttta ctagggttat aacactgatt aatttcttaa 5760

tgggggaggg attaaaattt aatgacaaag aaaacaatct tttaagaaaa gcttttaaaa 5820

gataataata aaaagagctt tgcgattaag caaaactctt tactttttca ttgacattat 5880

caaattcatc gatttcaaat tgttgttgta tcataaagtt aattctgttt tgcacaacct 5940

tttcaggaat ataaaacaca tctgaggctt gttttataaa ctcagggtcg ctaaagtcaa 6000

tgtaacgtag catatgatat ggtatagctt ccacccaagt tagcctttct gcttcttctg 6060

aatgtttttc atatacttcc atgggtatct ctaaatgatt ttcctcatgt agcaaggtat 6120

gagcaaaaag tttatggaat tgatagttcc tctctttttc ttcaactttt ttatctaaaa 6180

caaacacttt aacatctgag tcaatgtaag cataagatgt ttttccagtc ataatttcaa 6240

tcccaaatct tttagacaga aattctggac gtaaatcttt tggtgaaaga atttttttat 6300

gtagcaatat atccgataca gcaccttcta aaagcgttgg tgaatagggc attttaccta 6360

tctcctctca ttttgtggaa taaaaatagt catattcgtc catctaccta tcctattatc 6420

gaacagttga actttttaat caaggatcag tccttttttt cattattctt aaactgtgct 6480

cttaacttta acaactcgat ttgtttttcc agatctcgag ggtaactagc ctcgccgatc 6540

ccgcaagagg cccggcagtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 6600

tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 6660

atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt 6720

attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 6780

gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac 6840

agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt 6900

aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt 6960

cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat 7020

cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac 7080

actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg 7140

cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc 7200

ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa 7260

ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag 7320

gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct 7380

gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat 7440

ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa 7500

cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac 7560

caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc 7620

taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 7680

cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg 7740

cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 7800

gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 7860

aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 7920

cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 7980

tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 8040

acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 8100

ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 8160

ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 8220

tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 8280

tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 8340

ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg 8400

gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag 8460

cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcatgct taagt 8515

Claims

1.一种诱导表达元件，其特征在于，响应的诱导底物为唾液酸，所述元件含有NanR蛋白、P_ydjO启动子、整合NanR结合位点的启动子P_veg；所述P_ydjO启动子为组成型启动子，表达转录调控蛋白NanR；所述启动子P_ydjO和启动子P_veg的转录方向相反。

2.根据权利要求1所述的诱导表达元件，其特征在于，组成型P_ydjO启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的诱导表达元件，其特征在于，整合NanR结合位点的启动子P_veg核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

4.含有权利要求1～3任一所述诱导表达元件的质粒。

5.根据权利要求4所述的质粒，其特征在于，以pHT01为出发质粒。

6.含有权利要求1～3任一所述诱导表达元件或权利要求4～5任一所述质粒的基因工程菌。

7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌为宿主，编码目的蛋白的基因连接在启动子P_veg之后。

8.权利要求1～3任一所述的诱导表达元件在枯草芽孢杆菌代谢工程领域的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括促进目的蛋白的表达、降低泄露表达水平或筛选表达目的基因的基因工程菌。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述诱导表达元件的激活条件为：在含有唾液酸盐的培养环境中；培养条件为30～37℃培养16～48h。