CN108410898A - 一种人工改造的dna分子、质粒载体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人工改造的DNA分子、质粒载体及其制备方法。利用本发明构建的质粒载体可以直接将目的蛋白装载于本发明所述载体上，目的蛋白与本发明制备的载体连接后，就形成了intein的C端断裂关键的三个氨基酸Cys‑Phe‑Asn(CFN)。由于在应用Npu split intein进行目的蛋白的纯化时，需要将intein的C片段(I_C)与目的蛋白通过PCR重叠技术融合，该过程操作复杂、耗时长、每一种目的蛋白都需要进行融合。本发明目的蛋白可直接与本发明制备的质粒载体连接，即可将I_C与目的蛋白融合，操作简单，可以重复使用，且I_C和目的蛋白之间避免了引入其他氨基酸。

Description

一种人工改造的DNA分子、质粒载体及其制备方法

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种人工改造的DNA分子、质粒载体及其制备方法。

背景技术

PCR作为分子生物学的一项基本技术，是目前体外DNA扩增最常用的方法，而PCR产物的克隆是对其进行鉴定、扩增以及实现PCR产物多种用途的必经之路。TA克隆是一种利用T载体快速地、一步将PCR产物插入到质粒载体的常用方法。T载体因其3’末端带有突出的T碱基，可直接与PCR扩增产物3’末端突出的A碱基配对，因此提高了PCR产物与载体的连接效率。

断裂内含肽在结构上N端区域(I_N)和C端区域(I_C)相互分离，其基因可以分布在同一个染色体不同的区域，且中间可以相隔很长的基因序列，而当I_N和I_C两个片段连接恢复结构后可按照标准内含肽剪接途径完成两端外显肽的拼接。这一剪接过程称为反式剪接。基于内含肽的断裂反应以及I_N和I_C片段之间亲和识别结合原理，可以将其应用于亲和纯化系统的构建。利用内含肽进行亲和纯化时，需要将I_C片段与目的蛋白基因融合，并且每一种目的蛋白都需要进行一次融合，I_C与目的蛋白的基因融合通常用PCR重叠技术，操作复杂且耗时长。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种人工改造的DNA分子。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：人工改造的DNA分子，其包括，在野生型内含肽Npu split intein的C片段基因的3’端人工添加碱基序列，所述人工添加碱基序列，为在利用野生型内含肽Npu split intein基因片段3’端原有序列基础上人工添加碱基序列设计出XcmI酶切位点的基因编码序列，并在所述XcmI酶切位点的序列内部设计出半胱氨酸基因编码序列，得到所述人工改造的DNA分子，所述的人工改造的DNA分子在经过XcmI酶切后，其3’端暴露出半胱氨酸基因编码序列。

作为本发明所述人工改造的DNA分子的一种优选方案，其还包括，在所述野生型内含肽Npu split intein的C片段基因的5’端添加一个Nde I酶切位点的基因编码序列。

作为本发明所述人工改造的DNA分子的一种优选方案，其中：在所述野生型内含肽Npu split intein的C片段基因的3’端添加核苷酸序列TGTTTCATGG，与所述野生型内含肽Npu split intein的C片段基因的3’端原有序列CCAAT形成Xcm I酶切位点，其中，核苷酸序列TGT编码半胱氨酸残基，所述人工改造的DNA分子的核苷酸序列见序列表SEQ ID No.1。

作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种质粒载体。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种质粒载体，其中：所述质粒载体上装载了权利要求1～3任一所述的人工改造的DNA分子，所述质粒载体为T载体。

作为本发明所述质粒载体的一种优选方案，其中：所述质粒载体为对质粒pMD-19-T进行人工改造，所述人工改造，其是将所述质粒pMD-19-T改造为质粒载体pMD-19-Ic-T，其核苷酸序列见序列表SEQ ID No.2。

作为本发明所述质粒载体的一种优选方案，其中：所述质粒载体经过XcmI酶切后暴露出半胱氨酸基因编码序列，与在5’端添加了苯丙氨酸-天冬酰胺二肽的基因编码序列的目的蛋白形成内含肽C端断裂的关键氨基酸半胱氨酸-苯丙氨酸-天冬酰胺基因编码序列。

作为本发明所述质粒载体的一种优选方案，其中：所述目的蛋白的3’端添加HindIII酶切位点的基因编码序列。

作为本发明所述质粒载体的一种优选方案，其中：所述目的蛋白包括绿色荧光蛋白。

作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种质粒载体的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：质粒载体的制备方法，其特征在于：包括，

制备人工改造的DNA分子：在所述野生型内含肽Npu split intein的C片段基因的3’端添加核苷酸序列TGTTTCATGG，与所述野生型内含肽Npu split intein的C片段基因的3’端原有序列CCAAT形成Xcm I酶切位点，其中，核苷酸序列TGT编码半胱氨酸残基；在所述野生型内含肽Npu split intein的C片段基因的5’端添加一个Nde I酶切位点的基因编码序列；

制备质粒载体：将pMD-19-T载体与所述人工改造的DNA分子连接，转化到JM 109感受态细胞，转化产物涂布于氨苄青霉素LB平板上，37℃培养至有单菌落长出，挑取平板中的单菌落培养、提取质粒、酶切、测序鉴定出阳性重组质粒。

本发明的有益效果：本发明对Npu split intein的I_C片段进行改造。在其3’端人工添加TGT TTCATGG序列，与内含肽的C片段上原有序列CCAAT构成一个Xcm I酶切位点(CCAATTGT TTCATGG)，通过Xcm I酶识别CCAATTGT TTCATGG序列，酶切产生带T的粘性末端，形成T载体可直接用于目的基因的连接。通过连接T载的原理，可以将不同的目的基因与该T载连接，即可实现将不同目的基因与I_C片段连接，并且在I_C与目的蛋白之间引入内含肽C端断裂所需要的CFN三个氨基酸。

利用本发明构建的T载体，可以快速的将I_C片段和目的蛋白基因连接在一起，且没有在中间引入任何多余氨基酸，本发明T载体制备简单，成本低，酶切一次可获得大量载体。利用本发明构建的质粒载体pET-28a-I_C-T，可以直接将目的蛋白装载于本发明所述载体上，目的蛋白与本发明制备的载体连接后，就形成了Cys-Phe-Asn(CFN)，CFN是intein的C端断裂关键的三个氨基酸。由于在应用Npu split intein进行目的蛋白的纯化时，通常需要将intein的C片段(I_C)与目的蛋白通过PCR重叠技术融合，该过程操作复杂、耗时长、每一种目的蛋白都需要进行融合。在本发明中，目的蛋白可直接与本发明制备的质粒载体连接，即可将I_C与目的蛋白融合，操作简单，可以重复使用，且I_C和目的蛋白之间避免了引入其他氨基酸。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明pMD-19-Ic-T载体图谱示意图；

图2为本发明pMD-19-Ic-CFN-目的蛋白载体图谱示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明提供一种连接有Npu split intein的C片段(即I_C片段)的T载体，本发明新型T载体是由I_C片段与前T载体连接而成的一种新T载体。I_C片段在原Npu split intein的C片段改造而来，与原C片段相比，改造后的I_C片段在5’端添加一Nde I酶切位点，用以将I_C目的蛋白酶切；在其3’端进行人工改造，利用其3’端自然序列并与添加人工序列相结合，拼凑出Xcm I酶切位点，同时使得酶切位点中含有内含肽C端断裂的关键氨基酸Cys+1(C+1)。I_C与前T载体连接后，形成的质粒经Xcm I酶切后，产生3’T末端，构建出新的T载体。目的蛋白在经过PCR后，5’端引入Phe-Asn(FN)两个C端断裂所需要的氨基酸，3’端引入酶切位点HindIII。将目的蛋白与新T载体连接后，即可将I_C与目的蛋白融合，即I_C+CFN+目的蛋白，且避免了多余氨基酸的引入。

所述的新T载体的构建方法为：

1.本发明对Npu split intein的I_C片段进行分子改造，设计引物引入酶切位点Nde I、Xcm I(5’，3’)，在Xcm I酶切位点中，引入内含肽C端断裂的关键氨基酸Cys+1(C+1)。在本发明中，对目的蛋白进行分子改造，改造内容为在5’端添加两个氨基酸残基序列Phe-Asn(FN)，为内含肽C端断裂所需要，在3’端添加一个Hind III酶切位点，用于将I_C与目的蛋白融合后的酶切。

2.将pMD-19-T载体与PCR后的I_C片段连接，转化到JM 109感受态细胞，转化产物涂布于氨苄青霉素LB平板上，37℃培养至有单菌落长出。挑取平板中的单菌落培养、提取质粒、酶切、测序鉴定出阳性重组质粒，命名为pMD-19-T-I_C。

3.应用质粒提取试剂盒提取pMD-19-T-I_C质粒，通过Xcm I酶切、凝胶回收试剂盒纯化、紫外分光光度计测定其浓度，调整质量浓度为50mg·L^-1；该载体可直接用于TA克隆，命名为pMD-19-I_C-T。

4.pMD-19-I_C-T载体的应用本发明根据步骤(1)所设计的目的蛋白的引物，以其基因组为模板进行PCR，PCR扩增目的基因。用T₄DNA连接酶将PCR后的产物连接于新T载体pMD-19-I_C-T。转化感受态细胞JM109，菌体电泳筛选重组子，得到重组克隆载体pMD-19-I_C-CFN-目的蛋白，送公司进行测序验证。

5.pMD-19-I_C-T载体克隆效率的鉴定随机挑取试验组菌落14个克隆，提取质粒，用Nde I和Hind III进行双酶切验证，根据验证结果推测阳性克隆的克隆效率。

6.测序验证后，利用Nde I和Hind III两个酶切位点将构建好的I_C-CFN-目的蛋白序列与表达质粒pET-28a进行酶切连接，得到重组表达质粒

pET-28a-I_C-CFN-目的蛋白，最后转化感受态E.coli BL21(DE3)，得到重组蛋白I_C+CFN+GFP的表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-I_C-目的蛋白，制备甘油冻管保藏备用。

本发明涉及的核苷酸序列如下：

编码经过本发明人工改造的I_C基因的核苷酸序列见序列表SEQ ID No.1；

编码本发明构建的T载体pMD-19-Ic-T的基因的核苷酸序列见序列表SEQ IDNo.2；

经过本发明人工改造的I_C的氨基酸序列见序列表SEQ ID No.5；

作为本发明其中一种实施方式使用的目的蛋白：绿色荧光蛋白GFP的核苷酸序列见序列表SEQ ID No.3；绿色荧光蛋白GFP的氨基酸序列见序列表SEQ ID No.6。

本发明编码I_C+CFN+目的蛋白GFP的基因具有序列表SEQ ID No.4所述的核苷酸序列。

本发明对Npu split intein的I_C片段进行改造。在其3’端人工添加TGT TTCATGG序列，与内含肽的C片段上原有序列CCAAT构成一个Xcm I酶切位点(CCAATTGT TTCATGG)，通过Xcm I酶识别CCAATTGT TTCATGG序列，酶切产生带T的粘性末端，形成T载体可直接用于目的基因的连接。通过连接T载的原理，可以将不同的目的基因与该T载连接，即可实现将不同目的基因与I_C片段连接，并且在I_C与目的蛋白之间引入内含肽C端断裂所需要的CFN三个氨基酸。

利用本发明构建的T载体，可以快速的将I_C片段和目的蛋白基因连接在一起，且没有在中间引入任何多余氨基酸，本发明T载体制备简单，成本低，酶切一次可获得大量载体。

实施例1：

使用分子技术对内含肽Npu split intein的C片段改造，以下简称为为I_C，根据Npu split intein的基因序列，设计I_C序列的正向引物F0和反向引物R0：

F0：GGGAATTC CATATGATCA AAATAGCCAC ACG

R0：CCATGAAACAATTGGAAGCTATG AAG

正向引物和反向引物分别引入Nde I和Xcm I酶切位点，其中下划线部分为添加的酶切位点。

I_C片段的基因序列为：

CATATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCCAATTGT TTCATGG

(下划线标记的是Nde I和Xcm I两个酶切位点，粗体为引入的Cys+1。)

本发明中实施的I_C与目的蛋白的融合以GFP蛋白为例。为了C端断裂，需要在I_C与GFP连接处提供三个氨基酸Cys-Phe-Asn(CFN)，以便提供C端断裂所需的关键氨基酸Cys+1，其中I_C的改造中已经提供了Cys+1，所以，在目的蛋白的设计中需要提供Phe-Asn(FN)两个氨基酸。根据GFP的基因序列，设计GFP序列的正向引物F1和反向引物R1：

F1:TTCAAT GTGA GCAAGGGCGA GG

R1:CCCAAGCTTTTAC TTGTACAGCT CGTCCATGC

(划线部分为Hind III酶切位点，斜体标记为添加的Phe-Asn(FN)序列)

实施例2：

提取Npu split intein的I_C质粒，分别利用实施例1设计的F0、R0为引物，I_C片段为模板，利用Ex-Taq DNA聚合酶对I_C序列进行PCR。按照Ex-Taq DNA聚合酶说明书，选择50μL进行。

PCR循环参数：95℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸10s，反应30个循环；最后72℃延伸10min。

利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收I_C片段。得到改造后的I_C序列，用碱基互补配对原则将I_C序列连接到T载体pMD-19-T上，得到重组质粒pMD19-T-I_C。将重组质粒转化感受态E.coli JM109，得到重组菌E.coli JM109/pMD19-T-I_C进行甘油冻管保藏备用。

实施例3：

以本实验室保存的GFP蛋白为模板，利用实施例1设计的F1、R1为引物利用Ex-TaqDNA聚合酶对GFP序列进行PCR。按照Ex-Taq DNA聚合酶说明书，选择50μL进行。

PCR循环参数：95℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸50s，反应30个循环；最后72℃延伸10min。

利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收GFP片段。得到改造后的GFP序列。

实施例4：

过夜培养实施例2得到的重组菌E.coli JM109/pMD19-T-I_C，质粒提取pMD19-T-I_C，使用Xcm I对重组质粒pMD19-T-I_C酶切，得到新的T载体pMD19-I_C-T。

实施例5：

将实施例3中回收得到的GFP片段连接到实施例4中的T载体pMD-19-I_C-T上。取实施例3中的PCR产物和实施例4中改建的新T载体建立10ul的连接体系。16℃连接过夜，连接产物转化感受态JM109，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜.转化得到重组菌E.coli JM109/pMD19-IC-CFN-GFP。长出的菌落巾随机挑取14个菌落，培养后提取质粒后用Hind III和Nde I进行双酶切鉴定。根据验证结果推测阳性克隆的克隆效率。

实施例6：

将实施例5中的重组菌提取质粒，利用限制性内切酶Nde I和Hind III对质粒pMD19-I_C-CFN-GFP进行酶切，将酶切产物胶回收后进行连接得到重组质粒pET-28a-I_C-CFN-GFP，转化感受态E.coli BL21(DE3)，得到I_C-CFN-GFP融合的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-I_C-CFN-GFP，甘油冻管保藏。

本发明对I_C片段进行改造后，与前T载体连接，再用制备T载的方法将酶切质粒，得到一种在缺口处含有I_C片段的新T载。得到的新T载可以与需要融合的目的蛋白进行连接，同时，在I_C与目的蛋白之间引入了CFN三个氨基酸，并且没有其他氨基酸的引入。这样就把I_C与目的蛋白融合于T载中。

本发明在I_C片段3’端进行人工改造，利用其3’端自然序列并与添加人工序列相结合，拼凑出Xcm I酶切位点，同时使得酶切位点中含有内含肽C端断裂的关键氨基酸Cys+1(C+1)。I_C与前T载体连接后，形成的质粒经Xcm I酶切后，产生3’T末端，构建出新的T载体。

本发明对Npu split intein的I_C片段进行改造。在其3’端人工添加TGT TTCATGG序列，与内含肽的C片段上原有序列CCAAT构成一个Xcm I酶切位点(CCAATTGT TTCATGG)，通过Xcm I酶识别CCAATTGT TTCATGG序列，酶切产生带T的粘性末端，形成T载体可直接用于目的基因的连接。通过连接T载的原理，可以将不同的目的基因与该T载连接，即可实现将不同目的基因与I_C片段连接，并且在I_C与目的蛋白之间引入内含肽C端断裂所需要的CFN三个氨基酸。

利用本发明构建的T载体，可以快速的将I_C片段和目的蛋白基因连接在一起，且没有在中间引入任何多余氨基酸，本发明T载体制备简单，成本低，酶切一次可获得大量载体。利用本发明构建的质粒载体pET-28a-I_C-T，可以直接将目的蛋白装载于本发明所述载体上，目的蛋白与本发明制备的载体连接后，就形成了Cys-Phe-Asn(CFN)，CFN是intein的C端断裂关键的三个氨基酸。由于在应用Npu split intein进行目的蛋白的纯化时，通常需要将intein的C片段(I_C)与目的蛋白通过PCR重叠技术融合，该过程操作复杂、耗时长、每一种目的蛋白都需要进行融合。在本发明中，目的蛋白可直接与本发明制备的质粒载体连接，即可将I_C与目的蛋白融合，操作简单，可以重复使用，且I_C和目的蛋白之间避免了引入其他氨基酸。

本发明设计的新构建的质粒载体pET-28a-I_C-T没有引入任何多余的其他氨基酸，在使用本发明方法制备的质粒载体pET-28a-I_C-T翻译出的内含肽能够保持其原有空间结构，而不会出现由于多余氨基酸加入造成的表达失败或者影响目的蛋白的空间构象，使用本发明制备的质粒载体pET-28a-I_C-T连接目的蛋白后，可准确地在内含肽I_C与目的蛋白之间的CFN出断裂，大大节省了操作步骤及时间，降低了生产成本。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种人工改造的DNA分子、质粒载体及其制备方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 121

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

catatgatca aaatagccac acgtaaatat ttaggcaaac aaaatgtcta tggcattgga 60

gttgagcgcg accataattt tgcactcaaa aatggcttca tagcttccaa ttgtttcatg 120

g 121

<210> 2

<211> 2815

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccccatt tgtttatttt 120

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220

accatgatta cgccaagttt gcacgcctgc cgttcgacga ttcatatgat caaaatagcc 2280

acacgtaaat atttaggcaa acaaaatgtc tatggcattg gagttgagcg cgaccataat 2340

tttgcactca aaaatggctt catagcttcc aattgtttca tggtatctct ggaagatccg 2400

cgcgtaccga gttctaattc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct 2460

ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc 2520

gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc 2580

ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact 2640

ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc 2700

gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc 2760

gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcga 2815

<210> 3

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

ttcaatgtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg 60

gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc 120

tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc 180

accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg 240

aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc 300

ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc 360

ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg 420

cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag 480

aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc 540

gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac 600

cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg 660

gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag 720

taaaagctt 729

<210> 4

<211> 843

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

catatgatca aaatagccac acgtaaatat ttaggcaaac aaaatgtcta tggcattgga 60

gttgagcgcg accataattt tgcactcaaa aatggcttca tagcttctaa ttgtttcaat 120

gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 180

gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 240

aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 300

gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 360

cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 420

aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 480

aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 540

ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 600

atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 660

cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 720

ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 780

ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaaaag 840

ctt 843

<210> 5

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

His Met Ile Leu Ile Ala Thr Ala Leu Thr Leu Gly Leu Gly Ala Val

1 5 10 15

Thr Gly Ile Gly Val Gly Ala Ala His Ala Pro Ala Leu Leu Ala Gly

20 25 30

Pro Ile Ala Ser Ala Cys Pro Met

35 40

<210> 6

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

Pro Ala Val Ser Leu Gly Gly Gly Leu Pro Thr Gly Val Val Pro Ile

1 5 10 15

Leu Val Gly Leu Ala Gly Ala Val Ala Gly His Leu Pro Ser Val Ser

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Thr Thr Gly Leu Leu Thr Leu Leu Pro

35 40 45

Ile Cys Thr Thr Gly Leu Leu Pro Val Pro Thr Pro Thr Leu Val Thr

50 55 60

Thr Leu Thr Thr Gly Val Gly Cys Pro Ser Ala Thr Pro Ala His Met

65 70 75 80

Leu Gly His Ala Pro Pro Leu Ser Ala Met Pro Gly Gly Thr Val Gly

85 90 95

Gly Ala Thr Ile Pro Pro Leu Ala Ala Gly Ala Thr Leu Thr Ala Ala

100 105 110

Gly Val Leu Pro Gly Gly Ala Thr Leu Val Ala Ala Ile Gly Leu Leu

115 120 125

Gly Ile Ala Pro Leu Gly Ala Gly Ala Ile Leu Gly His Leu Leu Gly

130 135 140

Thr Ala Thr Ala Ser His Ala Val Thr Ile Met Ala Ala Leu Gly Leu

145 150 155 160

Ala Gly Ile Leu Val Ala Pro Leu Ile Ala His Ala Ile Gly Ala Gly

165 170 175

Ser Val Gly Leu Ala Ala His Thr Gly Gly Ala Thr Pro Ile Gly Ala

180 185 190

Gly Pro Val Leu Leu Pro Ala Ala His Thr Leu Ser Thr Gly Ser Ala

195 200 205

Leu Ser Leu Ala Pro Ala Gly Leu Ala Ala His Met Val Leu Leu Gly

210 215 220

Pro Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Ala Gly Leu Thr Leu

225 230 235 240

Claims (9)

1.一种人工改造的DNA分子，其特征在于：包括，在野生型内含肽Npu split intein的C片段基因的3’端人工添加碱基序列，所述人工添加碱基序列，为在利用野生型内含肽Npusplit intein基因片段3’端原有序列基础上人工添加碱基序列设计出XcmI酶切位点的基因编码序列，并在所述XcmI酶切位点的序列内部设计出半胱氨酸基因编码序列，得到所述人工改造的DNA分子，所述的人工改造的DNA分子在经过XcmI酶切后，其3’端酶切位点处暴露出半胱氨酸基因编码序列。

2.如权利要求1所述人工改造的DNA分子，其特征在于：还包括，在所述野生型内含肽Npu split intein的C片段基因的5’端添加一个Nde I酶切位点的基因编码序列。

3.如权利要求1或2所述人工改造的DNA分子，其特征在于：在所述野生型内含肽Npusplit intein的C片段基因的3’端添加核苷酸序列TGTTTCATGG，与所述野生型内含肽Npusplit intein的C片段基因的3’端原有序列CCAAT形成Xcm I酶切位点，其中，核苷酸序列TGT编码半胱氨酸残基，所述人工改造的DNA分子的核苷酸序列见序列表SEQ ID No.1。

4.一种质粒载体，其特征在于：所述质粒载体上装载了权利要求1～3任一所述的人工改造的DNA分子，所述质粒载体为T载体。

5.如权利要求4所述的质粒载体，其特征在于：所述质粒载体为对质粒pMD-19-T进行人工改造，所述人工改造，其是将所述质粒pMD-19-T改造为质粒载体pMD-19-Ic-T，其核苷酸序列见序列表SEQ ID No.2。

6.如权利要求4或5所述的质粒载体，其特征在于：所述质粒载体经过XcmI酶切后暴露出半胱氨酸基因编码序列，与在5’端添加了苯丙氨酸-天冬酰胺二肽的基因编码序列的目的蛋白形成内含肽C端断裂的关键氨基酸半胱氨酸-苯丙氨酸-天冬酰胺基因编码序列。

7.如权利要求6所述的质粒载体，其特征在于：所述目的蛋白的3’端添加Hind III酶切位点的基因编码序列。

8.如权利要求7所述的质粒载体，其特征在于：所述目的蛋白包括绿色荧光蛋白。

9.权利要求4～8任一所述的质粒载体的制备方法，其特征在于：包括，

制备人工改造的DNA分子：在所述野生型内含肽Npu split intein的C片段基因的3’端添加核苷酸序列TGTTTCATGG，与所述野生型内含肽Npu split intein的C片段基因的3’端原有序列CCAAT形成Xcm I酶切位点，其中，核苷酸序列TGT编码半胱氨酸残基；在所述野生型内含肽Npu split intein的C片段基因的5’端添加一个Nde I酶切位点的基因编码序列；

制备质粒载体：将pMD-19-T载体与所述人工改造的DNA分子连接，转化到JM 109感受态细胞，转化产物涂布于氨苄青霉素LB平板上，37℃培养至有单菌落长出，挑取平板中的单菌落培养、提取质粒、酶切、测序鉴定出阳性重组质粒。