CN101381738A - 一种胞内融合表达型前t载体及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种胞内融合表达型前T载体，由如下方法制备得到：(1)构建编码BspTI－GSGSG－HHHHHH－XcmI－Ampr－XcmI－HindIII的DNA1片段；(2)定点突变pET39质粒中LacI基因内部的三个XcmI位点，在编码氨基酸序列不变的情况下，改变DNA序列，使XcmI识别位点丧失，得到定点突变消除XcmI位点的pET39－1；(3)利用BspTI和HindIII将DNA1定向重组于pET39－2中；(4)去除pET39－2中DsbA信号肽基因，得到所述胞内融合表达型前T载体。本发明除了使用XcmI制备线形T载体外，不需要用其它限制性内切酶，可一步法构建融合表达基因工程菌，为大量制备活性肽工程菌库提供了可行的技术方法。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种可用于快速构建目的基因胞内融合表达工程菌的胞内融合表达型前T载体及其制备与应用。
(二)背景技术
利用大肠杆菌制备具有药用价值的生物活性肽是基因工程最常用的技术路线，但是目的基因表达产物在过表达时容易形成包含体，第一个氨基酸一般为甲硫氨酸，与天然生物活性肽的氨基酸序列不一致，作为药用时容易产生免疫原性。需要探索纯化工艺，难以表达分子量小的多肽。
利用融合蛋白表达策略可以很好地解决上述问题:目的基因融合表达以后，可以利用融合伴侣携带的纯化标签，用亲和纯化工艺纯化目标蛋白，快速高效纯化目标蛋白，融合蛋白用特异性蛋白酶酶切后可以得到氨基酸序列与天然生物活性肽完全一致的产物，可以表达分子量小的多肽。还可以利用融合伴侣增加表达产物的溶解性，从而有助于目标蛋白的纯化和后续复性。
大肠杆菌二硫键形成蛋白DsbA是一种周质蛋白，天然的DsbA基因上游有编码信号肽的基因序列，指导DsbA分泌于周质空间。DsbA具有很好的溶解性，具有分子伴侣的功能，帮助其他周质蛋白形成分子内二硫键。有文献报道，利用分子生物学技术，去除DsbA信号肽基因，定点突变Cys残基，使不含Cys残基的DsbA在胞内表达，许多单独表达容易形成包含体的生物活性肽与DsbA突变体融合后，表达产物以可溶性形式存在。
将目的基因重组于无信号肽DsbA基因的下游，在胞内可溶性表达目的基因，是新法制备各类生物活性肽的有效方法。但是常规的基因重组工序复杂，需要涉及基因拼接，DNA重组等。虽然现代分子生物学技术为这种重组提供了可行的多样的方法，但是过程较为复杂，耗时、耗材，需要使用多种限制性内切酶、DNA纯化等工序。
T-载体是近年发展起来的一种用于直接克隆PCR产物的新型载体。T-载体一般为线性，其分子末端各有一个3′dT(脱氧胸苷)突出。PCR技术是分子生物学和基因工程研究中的一项基本技术，它被广泛用于体外扩增已知或未知的特异DNA片段。利用Taq DNA聚合酶的末端转移酶活性，在扩增DNA的3′末端非模板依赖地加上一个核苷酸，通常为脱氧腺苷酸(dA)。这个3′dA突出端被用于把PCR产物插入到插入位点有一个3′dT突出的T-载体上。这样就将PCR产物以粘性末端连接的方式直接克隆到载体上。这种方式不仅克服了常规克隆方法的缺点，而且操作简便、方法快捷、连接效率高，因而其应用范围非常广泛。
有多种方法制备T载体，利用限制性内切酶制备T-载体是最为先进的方式，其中XcmI最适合于制备T-载体，该酶的特异性识别序列为5′CCANNNNN*NNNNTGG 3′，N可以是A、T、G、C的任意一种。酶法制备T载体首先要得到一个环状的前T质粒载体，经XcmI酶切两个位点后，载体的大片段DNA线性化，而且两个3’末端均带dT，从而得到可用于PCR产物快速克隆的T载体，如市场上供应pUCm-T。
目前市场上供应的主要是克隆型T载体，主要满足基因保存和测序的需要，如果构建一种表达型T载体，将PCR产物直接连接于表达型T载体上，使目的基因位于表达框架内，直接得到表达载体，即可一省略复杂的DNA重组步骤。不仅克隆目的DNA，而且还可以直接表达目的基因。
另外，用酶法制备T载体有可能存在以下几个方面的问题，一，如果酶切质粒DNA质量不高，外源基因不能插入载体中，而载体转化感受态细胞后能够在抗性平板上生长。pUCm-T载体设计了蓝白斑筛选方案以筛选目的DNA片段是否插入载体，如果插入载体，编码半乳糖苷酶α肽的基因LacZ被插入失活，细胞内没有半乳糖苷酶活性，在含有生色底物X-gal的筛选平板中白色菌落为插入失活阳性克隆，而兰色菌落为不含外源基因的阴性克隆。这种方法需要使用价格昂贵的X—gal，制备蓝白斑筛选平板也比较麻烦。在特定融合表达载体中不适合应用，需要采用别的筛选方案。二，如果两个XcmI酶切位点空间位置较近，将影响载体的酶切效率，即使载体DNA的纯度很高，酶的质量也很好，也会出现酶切载体一“刀”的情况，这种线性的载体不能和PCR产物连接，而是载体自连，从而导致阴性克隆的产生。
(三)发明内容
本发明则是为了提供一种胞内融合表达型前T载体及其制备方法，可利用这种前T载体得到的T载体，简单地、快速地构建表达于胞内的DsbA融合蛋白基因工程菌。除使用XcmI外，无需其他限制性内切酶即可快速构建胞内融合表达型基因工程菌。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是:
一种胞内融合表达型前T载体，由如下方法制备得到:(1)构建编码BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Ampr-XcmI-HindIII的DNA片段——DNA1；(2)定点突变pET39质粒中LacI基因内部的三个XcmI位点，在编码氨基酸序列不变的情况下，改变DNA序列，使XcmI识别位点丧失，得到定点突变消除XcmI位点的pET39-1；(3)利用BspTI和HindIII将DNA1定向重组于pET39-1中，得到pET39-2，(4)去除pET39-2中的DsbA信号肽基因，得到所述胞内融合表达型前T载体。
所述胞内融合表达型前T载体质粒图谱如图1所示。
本发明还涉及所述的胞内融合表达型前T载体的制备方法，所述方法如下:(1)构建编码BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Ampr-XcmI-HindIII的DNA片段——DNA1；2)定点突变pET39质粒中LacI基因内部的三个XcmI位点，在编码氨基酸序列不变的情况下，改变DNA序列，使XcmI识别位点丧失，得到定点突变消除XcmI位点的pET39-1；(3)利用BspTI和HindIII将DNA1定向重组于pET39-1中，得到pET39-2，(4)去除pET39-2中的DsbA信号肽基因，得到所述胞内融合表达型前T载体。
所构建的BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Ampr-XcmI-HindIII目的结构如下:
所构建的BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Ampr-XcmI-HindIII目的基因序列，其序列可以有变化，前部分它只要编码这些氨基酸(GSGSG-HHHHHH)就可以，不过编码第五个组氨酸的密码子必须设计为CAC，使该密码子的第三个碱基与第六个组氨酸的密码子的前两个碱基组成XcmI识别序列(CCANNNNN*NNNNTGG的前半部分关键识别序列CCA，其下游第五个碱基N*设计为T)；因此，所述DNA1在满足编码所述氨基酸序列的前提下，还应满足如下条件:含有片段CCANNNNTNNNNTGG，N选自A、T、C、G中的一种，根据其编码的氨基酸进行设计。其中，下划线标记的为关键序列，中间的T是制备T载体所必须的碱基，可作为丝氨酸密码子第一个碱基，在本发明中第六个组氨酸密码子下游设计为氨基酸密码子，不可以设计为TAA、TAG或TGA等终止密码子，否则不能表达为融合蛋白。优选设计甘氨酸密码子。
优选的，所述DNA1序列如下:
5’-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCATCATCATCAT CACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTC-3’。
翻译情况如下:
5’-TAC TTA AGC GAG AAA AAA GGT TCT GGT
BspT I
Tyr Leu Ser Glu Lys Lys Gly Ser Gly
TCT GGT CAT CAT CAT CAT CAC CAT GGA
Ser Gly His His His His His His Gly
TCT AAT GGA TAG GTT AAT GTC-3’
Ser Xcm I
所述DNA1中含有卡那霉素除外的普通大肠杆菌敏感的抗生素抗性基因，如氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因或氯霉素抗性基因等。前T载体有双抗性，如果外源DNA成功地插入于两个XcmI位点之间，前T载体中位于两个XcmI位点之间的抗生素抗性消失，只留下卡那霉素抗性，有利于用影印法快速筛选阳性克隆。
所述DNA1构建方法如下:
(1)引物A、B互为模板进行PCR1反应:
A:5’-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCAT-3’；
B:
5’-GACATTAACCTATCCATTAGATCCATGGTGATGATGATGATGACCAGAACCAGAACC-3’；
PCR反应条件:94℃变性10min，48℃退火300s，72℃延伸10min；
(2)以pET11b为模板，利用引物Amp1、Amp2进行PCR2反应:
Amp1:
5′-CACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTCATGATAATA-3′；
Amp2:
5′-CTTAAGCTTCCAAGGGTATAATGGAAATGAAGTTTTAAATCA
ATC-3′；
Amp2引物的5’末端含有HindIII和XcmI识别序列(CCANNNNN*NNNNTGG，其中N*设计为T，N选自A、T、C、G中的一种)。
(3)将PCR1和PCR2所得片段用引物A和引物Amp2进行基因拼接，得到所述编码BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Ampr-XcmI-HindIII的DNA片段——DNA1；拼接反应条件:94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸120s，30个循环，72℃延伸10min。
所述的定点突变三个XcmI位点，采用常规SOE技术，在编码氨基酸序列不变的情况下，改变改变LacI的基因DNA序列，使XcmI识别位点丧失，得到定点突变消除XcmI位点的pET39-1
所述的DsbA信号肽基因的去除
(1)以pET39为模板，以DsbA-1:5’-AAGCATATGGCGCAGTATGAAGAT -3’、DsbA-2:5’-TCGCTTAAGTATTTCACTGT-3’为引物进行PCR3反应，PCR条件:94℃3min；94℃ 30s、40℃ 30s、72℃ 1min，3个循环；94℃ 30s、48℃ 30s、72℃ 1min，27个循环；72℃ 10min；4℃ 10min；
(2)以NdeI和BspTI酶切PCR3产物和pET39-2，使不含信号肽基因的DNA片段置换pET39-2中原有的DsbA基因，得到胞内融合表达型前T载体。
所述的胞内融合表达型前T载体主要用于制备胞内融合表达型T载体。
具体的，所述应用如下:将胞内融合表达型前T载体用限制性内切酶XcmI在37℃下酶切2h，再进行1％琼脂糖凝胶电泳，得到两条明显的亮带，切取大片段，用3S DNA Gel Purification Kit纯化回收，得到线性化的胞内融合表达型T载体。
本发明的有益效果主要体现在:利用本发明得到的T载体可简单地、快速地构建表达于胞内的DsbA融合蛋白基因工程菌。除使用XcmI外，无需其他限制性内切酶即可快速构建胞内融合表达型基因工程菌。
(四)附图说明
图1为本发明所述胞内融合表达型前T载体质粒图谱。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此(实施例中所有试剂、质粒、酶、引物等，均购自上海生工生物工程技术服务有限公司):
实施例1:LacI基因定点突变消除XcmI位点
采用SOE法，以pET39为PCR模板，六条引物分别设计为:
Lac-1:5’-ttaggatccgcgacccatttgct-3’(含BamHI位点)
Lac-2:5’-agagatatccgcaccaacgcgca-3’(含EcoRV位点)
Lac-3:5’-ctgattggcgttgctacctccagtctggccctgca-3’(用于突变位点1)
Lac-4:5’-gccagactggaggtagcaacgccaatcagcaacga-3’(用于突变位点1)
Lac-5:5’-tcccactgcgatgttagttgctaacgatcagatggcgct-3’(用于突变位点2、3)
Lac-6:5’-catctgatcgttagcaactaacatcgcagtgggaacgatgc3’(用于突变位点2、3)
表2:位点突变前后序列对比
| 原序列(有XcmI识别位点) | 新序列(无XcmI识别位点) | |
| 位点1 | GccacctccagtctggccGCC ACC TCC AGT CTG GCCAla Thr Ser Ser Leu Ala | gcTacctccagtctggccGCT ACC TCC AGT CTG GCCAla Thr Ser Ser Leu Ala |
| 位点2、3 | CccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgCCC ACT GCG ATG CTG GTT GCCPro Thr Ala Met Leu Val AlaAAC CAT CAG ATG GCGAsn Asp Gln Met Ala | cccactgcgatgTTAgttgcTaacgatcagatggCCC ACT GCG ATG TTA GCT AACPro Thr Ala Met Leu Val AlaGAT CAG ATGAsp Gln Met |
以Lac-1和Lac-2为引物，pET-39质粒为模板，PCR扩增LacI序列。反应参数如下:94℃预变性3min，进入PCR循环:94℃变性0.5min，50℃退火0.5min，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min，产物标记为“Lac1/2”。
(1)定点突变979bp处的XcmI位点:
以Lac-1和Lac-4为引物、Lac1/2为模板进行PCR反应，参数为:94℃预变性3min，进入PCR循环:94℃变性0.5min，50℃退火0.5min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。其产物标记为“Lac1/4”。
以Lac-2和Lac-3为引物、Lac1/2为模板进行的PCR反应，其参数为:94℃预变性3min，进入PCR循环:94℃变性0.5min，48℃退火0.5min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。产物标记为“Lac2/3”，置-20℃保存。
(2)Lac-1和Lac-2为引物对Lac1/4和Lac2/3进行SOE拼接:
SOE参数:94℃预变性3min，进入PCR循环:94℃变性0.5min，56℃退火0.5min，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min。产物标记为“Lac979”。
(3)定点突变1495bp和1513bp两处的XcmI位点:
以Lac-1和Lac-6为引物、Lac979为模板进行PCR反应，其参数为:94℃预变性3min，进入PCR循环:94℃变性0.5min，50℃退火0.5min，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min。产物标记为“Lac1/6”。
以Lac-2和Lac-5为引物、Lac979为模板进行PCR反应，其参数为:94℃预变性3min，进入PCR循环:94℃变性0.5min，47℃退火0.5min，72℃延伸0.5min，4个循环；再94℃变性0.5min，50℃退火0.5min，72℃延伸0.5min，26个循环；72℃延伸10min。产物标记为“Lac2/6”。
(4)以Lac-1和Lac-2为引物对Lac1/6和Lac2/5进行SOE拼接:
SOE参数:94℃预变性3min，进入PCR循环:94℃变性0.5min，56℃退火0.5min，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min。产物标记为“LacI′”。
拼接产物LacI′利用BamH I和EcoRV定向重组于pET39中(具体方法为:以BamH I和EcoRV分别双酶切LacI′PCR产物和pET39，切胶回收pET39质粒的大片段DNA，与LacI′PCR产物的酶切回收产物连接，转化大肠杆菌克隆宿主DH5α)，得到LacI基因的三个XcmI位点定点突变的pET39-1质粒。
实施例2:XcmI酶切盒的制备及前T载体的构建
引物A、B互为模板进行PCR1反应:
A:5′-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCAT-3′
B:5′-GACATTAACCTATCCATTAGATCCATGGTGATGATGATGATGACCAGAACCAGAACC-3′
反应参数如下:94℃变性10min，48℃退火300s，72℃延伸10min。
以pET11b为模板，利用下列两条引物进行PCR2反应:
Amp1:5′-CACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTCATGATAATA-3′
Amp2:5′-CTTAAGCTTCCAAGGGTATAATGGAAATGAAGTTTTAAATCAATC-3′
反应参数如下:94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸120s，30个循环，72℃延伸10min。
上述两PCR1和PCR2产物片段用引物A和Amp2进行基因拼接反应，反应参数如下:94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸120s，30个循环，72℃延伸10min。
得到编码BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Ampr-XcmI-HindIII的DNA片段，利用BspTI和HindIII定向重组于实施例1已定点突变消除XcmI位点的pET39-1中，得到pET39-2。
实施例3:DsbA信号肽基因的去除(保留ATG作为起始密码子):
设计引物:
DsbA-1:5’-AAGCATATGGCGCAGTATGAAGAT-3’，(划线部分为NdeI识别序列)
DsbA-2:5’-TCGCTTAAGTATTTCACTGT-3’，(划线部分为BspTI识别序列)
PCR模板:pET39质粒(或大肠杆菌基因组DNA也可，推荐pET39质粒作为模板)
PCR参数:94℃ 3min
94℃ 30s 40℃ 30s 72℃ 1min 3个循环
94℃ 30s 48℃ 30s 72℃ 1min 27个循环
72℃ 10min
4℃ 10min
以NdeI和BspTI酶切PCR产物和pET39-2，使不含信号肽基因的DNA片段置换pET39-2中原有的DsbA基因，获得不含DsbA信号肽基因的重组质粒，即胞内融合表达型前T载体，为实现DsbA融合蛋白胞内表达创造条件。
实施例4:目的基因与融合表达型T载体的重组
TnaA1:
5’-CTGATGACGATGACAAAATGGAAAACTTTAAACATCTC-3’38bp
TnaA2:5’-AAGCTTTTAAACTTCTTTAA-3’ 21bp
以E.coli K-12为模板，TnaA1和TnaA2为引物，用Taq plusDNA聚合酶PCR扩增色氨酸酶基因，反应参数如下:94℃预变性3min，94℃变性30s，42℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环，72℃延伸10min。
将实施例2的表达型前T载体用XcmI限制性内切酶在37℃下酶切2h，再进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。结果可见两条明显的亮带，切取大片段，用3S DNA Gel Purification Kit或其他DNA纯化试剂盒纯化回收，即得到线性化表达型T载体。
将PCR产物直接与线性化T载体用T4 DNA ligase在4℃冰箱中连接16h，连接产物用CaCl2法转化E.coli DH5α。
实施例5:正向连接重组子的筛选以及胞内融合表达基因工程菌的构建
表达型重组转化子的筛选:
引物check:5′-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTT-3′
首先，将连接产物的转化液在含100μg/mL卡那霉素的LB固体平板均匀铺开，35℃恒温箱培养16～20h。正向筛选能正常生长的菌落。
然后将在卡那霉素抗性LB固体平板上正常生长的菌落影印到含100μg/mL氨苄霉素LB固体平板上。30℃恒温箱培养16～20h。在卡那霉素抗性平板上挑选相应的不能在氨苄霉素抗性平板上生长的克隆。这一步可以将未酶切和只有一个位点酶切的重组质粒筛掉，称为反向筛选。
最后，将筛选到的克隆，用单菌落PCR法，以鉴定引物check和目的基因的下游引物和用PCR进行鉴定，这一步可以消除平板上残余的未转入宿主细胞的重组质粒的影响并能确定目的基因的插入方向，称为正向筛选。其体系和参数分别为:
10×Buffer(with Mg2+) 5μL
10mmol/L each dNTPs 2μL
10mmol TnaA1 2μL
10mmol/L check 2μL
相应阳性单克隆 无菌牙签蘸取
Taq DNA聚合酶 0.5μL
无菌双蒸水 补足至50μL
94℃预变性3min，进入PCR循环:94℃变性0.5min，42℃退火0.5min，72℃延伸1.5min，30个循环，最后72℃延伸10min。取部分PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并摄片，有分子量约1500bp条带出现的为阳性克隆。经check引物鉴定为阳性的克隆送英俊生物技术有限公司测序证实，正向测序引物为T7 promoter primer #69348-3，反向测序引物为T7 terminator primer #69337-3。
Claims (10)
1.一种胞内融合表达型前T载体，由如下方法制备得到:(1)构建编码BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Ampr-XcmI-HindIII的DNA片段——DNA1；(2)定点突变pET39质粒中LacI基因内部的三个XcmI位点，在编码氨基酸序列不变的情况下，改变DNA序列，使XcmI识别位点丧失，得到定点突变消除XcmI位点的pET39-1；(3)利用BspTI和HindIII将DNA1定向重组于pET39-1中，得到pET39-2，(4)去除pET39-2中的DsbA信号肽基因，得到所述胞内融合表达型前T载体。
2.如权利要求1所述的胞内融合表达型前T载体，其特征在于所述胞内融合表达型前T载体质粒图谱如图1所示。
3.制备如权利要求1或2所述的胞内融合表达型前T载体的方法，所述方法如下:(1)构建编码BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Ampr-XcmI-HindIII的DNA片段——DNA1；(2)定点突变pET39质粒中LacI基因内部的三个XcmI位点，在编码氨基酸序列不变的情况下，改变DNA序列，使XcmI识别位点丧失，得到定点突变消除XcmI位点的pET39-1；(3)利用BspTI和HindIII将DNA1定向重组于pET39-1中，得到pET39-2，(4)去除pET39-2中的DsbA信号肽基因，得到所述胞内融合表达型前T载体。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述DNA1序列含有如下片段:CCANNNNTNNNNTGG。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述DNA1序列如下:
5’-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCATCATCATCATCACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTC-3’
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述DNA1中含有卡那霉素除外的普通大肠杆菌敏感的抗生素抗性基因。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述DNA1构建方法如下:
(1)引物A、B互为模板进行PCR1反应:
A:5’-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCAT-3’；
B:5’-GACATTAACCTATCCATTAGATCCATGGTGATGATGATGATGACCAGAACCAGAACC-3’；
PCR反应条件:94℃变性10min，48℃退火300s，72℃延伸10min；
(2)以pET11b为模板，利用引物Amp1、Amp2进行PCR2反应:
Amp1:5′-CACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTCATGATAATA-3′；
Amp2:
5′-CTTAAGCTTCCAAGGGTATAATGGAAATGAAGTTTTAAATCAATC-3′；
(3)将PCR1和PCR2所得片段用引物A和引物Amp2进行基因拼接，得到所述编码BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Ampr-XcmI-HindIII的DNA片段——DNA1；拼接反应条件:94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸120s，30个循环，72℃延伸10min。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的去除信号肽基因的方法如下:
(1)以pET39为模板，以DsbA-1:5’-AAGCATATGGCGCAGTATGAAGAT-3’、DsbA-2:5’-TCGCTTAAGTATTTCACTGT-3’为引物进行PCR3反应，PCR条件:94℃ 3min；94℃ 30s、40℃ 30s、72℃ 1min，3个循环；94℃ 30s、48℃ 30s、72℃ 1min，27个循环；72℃ 10min；4℃ 10min；(2)以NdeI和BspTI酶切PCR3产物和pET39-2，使不含信号肽基因的DNA片段置换pET39-2中原有的DsbA基因，得到胞内融合表达型前T载体。
9.如权利要求1或2所述的胞内融合表达型前T载体在制备胞内融合表达型T载体中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述应用如下:将胞内融合表达型前T载体用限制性内切酶XcmI在37℃下酶切2h，再进行1％琼脂糖凝胶电泳，得到两条明显的亮带，切取大片段，用DNA纯化试剂盒回收DNA，得到胞内融合表达型T载体。
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- 2007-09-06 CN CN2007100712133A patent/CN101381738B/zh not_active Expired - Fee Related
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