CN103160487A

CN103160487A - 肝素酶i融合蛋白

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Publication number: CN103160487A
Application number: CN2011104184960A
Authority: CN
Inventors: 曹林; 杨翔; 颜明
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-12-15
Filing date: 2011-12-15
Publication date: 2013-06-19

Abstract

本发明提供一种或几种肝素酶I融合蛋白及其编码基因。肝素酶I融合蛋白包含三个结构域：融合结构域、连接结构域和肝素酶I结构域。其中，融合结构域选自硫氧还蛋白Trx、小分子泛素样修饰蛋白SUMO或翻译起始因子2IF2，肝素酶I结构域包括肝素黄杆菌肝素酶I。本发明还提供上述肝素酶I融合蛋白的表达、纯化方法。

Description

肝素酶I融合蛋白

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种肝素酶I融合蛋白。

背景技术

肝素酶，也称肝素裂解酶，是目前已知仅有的可降解肝素的酶。肝素酶最早是在肝素黄杆菌Flavobacterium Heparinum中发现的，共有三种，分别为肝素酶I(EC 4.2.2.7)、肝素酶II(EC unassigned)、肝素酶III(EC 4.2.2.8)。其中，肝素酶I以肝素为主要底物，肝素酶II以肝素和硫酸乙酰肝素为底物，而肝素酶III以硫酸乙酰肝素为主要底物

肝素酶具有广泛而重要的用途。通过肝素酶选择性降解可以有助于研究多糖的结构和序列；肝素酶可以用于临床手术后血液的去肝素化；肝素酶可以用于制备低分子量肝素。其中，肝素酶I是制备低分子量肝素的主要酶。

目前，已发现肝素酶I在多种微生物中都有表达，包括肝素黄杆菌Flavobacterium Heparinum(Ram Sasisekharan et al.，Cloning and expression ofheparinase I gene from Flavobacterium heparinum.Proc.Natl.Acad.Sci 1993 vol.90：3660-3664)、粪便拟杆菌(Wan-Seok Kim et al.，Purification and Characterization ofHeparin Lyase I from Bacteroides stercoris HJ-15.J.Biochem.Mol.Biol 2000，vol.37：684-690)、多形拟杆菌(Yongde Luo et al.，High yield，purity and activity ofsoluble recombinant Bacteroides thetaiotaomicron GST-heparinase I fromEscherichia coli.Arch Biochem Biophys 2007，vol.460：17-24)等。肝素酶I可以从这些微生物的发酵液中提取，但产量很低，且通常需要多步色谱纯化，又进一步降低了得率。因此，采用天然提取的方法制备肝素酶I成本很高，限制了肝素酶I的工业化应用。

Ram Sasiekharan等(Ram Sasisekharan et al.，Cloning and expression ofheparinase I gene from Flavobacterium heparinum.Proc.Natl.Acad.Sci l 993vol.90：3660-3664)首先从肝素黄杆菌中克隆了肝素酶I基因，并在大肠杆菌中重组表达，证明重组肝素酶I具有与天然肝素酶I相同的活性。Steffen Ernst等(SteffenErnst et al.，Expression in Escherichia coli，purification and characterization ofheparinase I from Flavobacterium heparinum，Biochem.J.1996，vol 315：589-597)利用pET系统在大肠杆菌中实现了肝素酶I的高效表达，但绝大部分产物形成包涵体，需要经过变复性才能得到有活性的蛋白。

融合表达已被证明是一种增加重组蛋白可溶性的有效手段。将一些伴侣基因通过基因工程手段融合到目的基因的N端，可极大提高目的蛋白的可溶性。已发现的融合伴侣包括谷胱甘肽转移酶GST(P.A.Nygren et al，Engineering proteinsto facilitate bioprocessing，Trends Biotechnol.1994vol.12：184-188)、硫氧还蛋白Trx(Ai-Long Sun et al.，Fusion expression of human pro-urokinase with E.colithioredoxin，Biochemistry And Molecular Biology International 1998，vol 46：479-486)、麦芽糖结合蛋白MBP(S.Nallamsetty et al.，Solubility-enhancing proteinsMBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners，Protein Expr.Purif 2006，vol.45：175-182)、小分子泛素样修饰蛋白SUMO(J.G.Marblestone etal.，Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems：enhanced expression and solubility with SUMO.Protein Sci.2006，vol.15：182-189)、翻译起始因子2IF2(H.P.Sorensen et al.，A favorable solubility partner for therecombinant expression of streptavidin.Protein Expr.Purif.2003，vol.32：252-259)等。目前，已有报道，通过与GST(Yongde Luo et al.，High yield，purity and activityof soluble recombinant Bacteroides thetaiotaomicron GST-heparinase I fromEscherichia coli.Arch Biochem Biophys 2007，vol.460：17-24)和MBP(Yin Chen etal.，Construction of recombinant Escherichia coli for over-production of solubleheparinase I by fusion to maltose-binding protein.Biochemical Engineering Journal2005，vol.23：155-159)融合可实现肝素酶I的可溶性表达，且肝素酶融合蛋白均有活性。但这些融合伴侣分子量较大(GST 27kD，MBP 40kD，肝素酶I 42kD)，使得在相同表达量下，活性区域即肝素酶I所占的比例不高，使得融合蛋白的比活降低；且较大的融合伴侣会对肝素酶I产生空间位阻，进一步影响融合蛋白的活性(Yin Chen et al.，Production of MBP-HepA fusion protein in recombinantEscherichia coli by optimization of culture medium.Biochemical Engineering Journal2007，vol.34：114-121)。因此，减小融合伴侣的分子量，降低其空间位阻，提高肝素酶I融合蛋白的比活，具有重要的工业化意义。

发明内容

本发明提供一种或几种肝素酶I融合蛋白及其编码基因。肝素酶I融合蛋白包含三个结构域：融合结构域、连接结构域和肝素酶I结构域。其中，融合结构域是硫氧还蛋白Trx、小分子泛素样修饰蛋白SUMO和翻译起始因子2IF2其中的一种，肝素酶I结构域包括肝素黄杆菌肝素酶I。本发明还提供上述肝素酶I融合蛋白的表达、纯化方法。

本发明提供了一种肝素酶I融合蛋白，包含三个结构域：融合结构域、连接结构域和肝素酶I结构域，所述的融合结构域包括硫氧还蛋白(Trx)、小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)和翻译起始因子2(IF2)，肝素酶I结构域包括肝素黄杆菌肝素酶I。

所述的硫氧还蛋白(Trx)的编码基因是(SEQ ID No.12)；小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)的编码基因是(SEQ ID No.13)；翻译起始因子2(IF2)的编码基因是(SEQ ID No.14)；所述的连接结构域的编码基因是(SEQ ID No.15)；并且所述的肝素黄杆菌肝素酶I的编码基因是(SEQ ID No.16)。

并且所述Trx-FH heparinase I的编码基因是(SEQ ID No.17)，SUMO-FHheparinase I的编码基因是(SEQ ID No.18)，IF2-FH heparinase I的编码基因是(SEQ ID No.19)。

其中硫氧还蛋白(Trx)的氨基酸序列是：

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys AlaAsp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile AlaPro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu AsnIle Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu LeuLeu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln LeuLys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala

小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)的氨基酸序列是：

Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys ProGlu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys LysThr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met AspSer Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp LeuAsp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly

翻译起始因子2(IF2)的编码基因是：

Met Thr Asp Val Thr Ile Lys Thr Leu Ala Ala Glu Arg Gln Thr Ser Val Glu ArgLeu Val Gln Gln Phe Ala Asp Ala Gly Ile Arg Lys Ser Ala Asp Asp Ser Val Ser AlaGln Glu Lys Gln Thr Leu Ile Asp His Leu Asn Gln Lys Asn Ser Gly Pro Asp Lys LeuThr Leu Gln Arg Lys Thr Arg Ser Thr Leu Asn Ile Pro Gly Thr Gly Gly Lys Ser LysSer Val Gln Ile Glu Val Arg Lys Lys Arg Thr Phe Val Lys Arg Asp Pro Gln Glu AlaGlu Arg Leu Ala Ala Glu Glu Gln Ala Gln Arg Glu Ala Glu Glu Gln Ala Arg Arg GluAla Glu Glu Ser Ala Lys Arg Glu Ala Gln Gln Lys Ala Glu Arg Glu Ala Ala Glu GlnAla Lys Arg Glu Ala Ala Glu Gln Ala Lys Arg Glu Ala Ala Glu Lys Asp Lys Val

肝素黄杆菌肝素酶I的氨基酸序列是：

Gln Gln Lys Lys Ser Gly Asn Ile Pro Tyr Arg Val Asn Val Gln Ala Asp Ser AlaLys Gln Lys Ala Ile Ile Asp Asn Lys Trp Val Ala Val Gly Ile Asn Lys Pro Tyr Ala LeuGln Tyr Asp Asp Lys Leu Arg Phe Asn Gly Lys Pro Ser Tyr Arg Phe Glu Leu Lys AlaGlu Asp Asn Ser Leu Glu Gly Tyr Ala Ala Gly Glu Thr Lys Gly Arg Thr Glu Leu SerTyr Ser Tyr Ala Thr Thr Asn Asp Phe Lys Lys Phe Pro Pro Ser Val Tyr Gln Asn AlaGln Lys Leu Lys Thr Val Tyr His Tyr Gly Lys Gly Ile Cys Glu Gln Gly Ser Ser ArgSer Tyr Thr Phe Ser Val Tyr Ile Pro Ser Ser Phe Pro Asp Asn Ala Thr Thr Ile Phe AlaGln Trp His Gly Ala Pro Ser Arg Thr Leu Val Ala Thr Pro Glu Gly Glu Ile Lys ThrLeu Ser Ile Glu Glu Phe Leu Ala Leu Tyr Asp Arg Met Ile Phe Lys Lys Asn Ile AlaHis Asp Lys Val Glu Lys Lys Asp Lys Asp Gly Lys Ile Thr Tyr Val Ala Gly Lys ProAsn Gly Trp Lys Val Glu Gln Gly Gly Tyr Pro Thr Leu Ala Phe Gly Phe Ser Lys GlyTyr Phe Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Asp Arg Gln Trp Leu Thr Asp Lys Ala Asp Arg AsnAsn Ala Asn Pro Glu Asn Ser Glu Val Met Lys Pro Tyr Ser Ser Glu Tyr Lys Thr SerThr Ile Ala Tyr Lys Met Pro Phe Ala Gln Phe Pro Lys Asp Cys Trp Ile Thr Phe AspVal Ala Ile Asp Trp Thr Lys Tyr Gly Lys Glu Ala Asn Thr Ile Leu Lys Pro Gly LysLeu Asp Val Met Met Thr Tyr Thr Lys Asn Lys Lys Pro Gln Lys Ala His Ile Val AsnGln Gln Glu Ile Leu Ile Gly Arg Asn Asp Asp Asp Gly Tyr Tyr Phe Lys Phe Gly IleTyr Arg Val Gly Asn Ser Thr Val Pro Val Thr Tyr Asn Leu Ser Gly Tyr Ser Glu ThrAla Arg

并且所述Trx-FH heparinase I的氨基酸序列是：

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys AlaAsp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile AlaPro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu AsnIle Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu LeuLeu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln LeuLys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly GlySer Asp Asp Asp Asp Lys Ala Gln Gln Lys Lys Ser Gly Asn Ile Pro Tyr Arg Val AsnVal Gln Ala Asp Ser Ala Lys Gln Lys Ala Ile Ile Asp Asn Lys Trp Val Ala Val Gly IleAsn Lys Pro Tyr Ala Leu Gln Tyr Asp Asp Lys Leu Arg Phe Asn Gly Lys Pro Ser TyrArg Phe Glu Leu Lys Ala Glu Asp Asn Ser Leu Glu Gly Tyr Ala Ala Gly Glu Thr LysGly Arg Thr Glu Leu Ser Tyr Ser Tyr Ala Thr Thr Asn Asp Phe Lys Lys Phe Pro ProSer Val Tyr Gln Asn Ala Gln Lys Leu Lys Thr Val Tyr His Tyr Gly Lys Gly Ile CysGlu Gln Gly Ser Ser Arg Ser Tyr Thr Phe Ser Val Tyr Ile Pro Ser Ser Phe Pro Asp AsnAla Thr Thr Ile Phe Ala Gln Trp His Gly Ala Pro Ser Arg Thr Leu Val Ala Thr ProGlu Gly Glu Ile Lys Thr Leu Ser Ile Glu Glu Phe Leu Ala Leu Tyr Asp Arg Met IlePhe Lys Lys Asn Ile Ala His Asp Lys Val Glu Lys Lys Asp Lys Asp Gly Lys Ile ThrTyr Val Ala Gly Lys Pro Asn Gly Trp Lys Val Glu Gln Gly Gly Tyr Pro Thr Leu AlaPhe Gly Phe Ser Lys Gly Tyr Phe Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Asp Arg Gln Trp Leu ThrAsp Lys Ala Asp Arg Asn Asn Ala Asn Pro Glu Asn Ser Glu Val Met Lys Pro Tyr SerSer Glu Tyr Lys Thr Ser Thr Ile Ala Tyr Lys Met Pro Phe Ala Gln Phe Pro Lys AspCys Trp Ile Thr Phe Asp Val Ala Ile Asp Trp Thr Lys Tyr Gly Lys Glu Ala Asn Thr IleLeu Lys Pro Gly Lys Leu Asp Val Met Met Thr Tyr Thr Lys Asn Lys Lys Pro Gln LysAla His Ile Val Asn Gln Gln Glu Ile Leu Ile Gly Arg Asn Asp Asp Asp Gly Tyr TyrPhe Lys Phe Gly Ile Tyr Arg Val Gly Asn Ser Thr Val Pro Val Thr Tyr Asn Leu SerGly Tyr Ser Glu Thr Ala Arg

SUMO-FH heparinase I氨基酸序列是：

Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys ProGlu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys LysThr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met AspSer Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp LeuAsp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Thr Ser GlyGly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys Ala Gln Gln Lys Lys SerGly Asn Ile Pro Tyr Arg Val Asn Val Gln Ala Asp Ser Ala Lys Gln Lys Ala Ile Ile AspAsn Lys Trp Val Ala Val Gly Ile Asn Lys Pro Tyr Ala Leu Gln Tyr Asp Asp Lys LeuArg Phe Asn Gly Lys Pro Ser Tyr Arg Phe Glu Leu Lys Ala Glu Asp Asn Ser Leu GluGly Tyr Ala Ala Gly Glu Thr Lys Gly Arg Thr Glu Leu Ser Tyr Ser Tyr Ala Thr ThrAsn Asp Phe Lys Lys Phe Pro Pro Ser Val Tyr Gln Asn Ala Gln Lys Leu Lys Thr ValTyr His Tyr Gly Lys Gly Ile Cys Glu Gln Gly Ser Ser Arg Ser Tyr Thr Phe Ser Val TyrIle Pro Ser Ser Phe Pro Asp Asn Ala Thr Thr Ile Phe Ala Gln Trp His Gly Ala Pro SerArg Thr Leu Val Ala Thr Pro Glu Gly Glu Ile Lys Thr Leu Ser Ile Glu Glu Phe LeuAla Leu Tyr Asp Arg Met Ile Phe Lys Lys Asn Ile Ala His Asp Lys Val Glu Lys LysAsp Lys Asp Gly Lys Ile Thr Tyr Val Ala Gly Lys Pro Asn Gly Trp Lys Val Glu GlnGly Gly Tyr Pro Thr Leu Ala Phe Gly Phe Ser Lys Gly Tyr Phe Tyr Ile Lys Ala AsnSer Asp Arg Gln Trp Leu Thr Asp Lys Ala Asp Arg Asn Asn Ala Asn Pro Glu Asn SerGlu Val Met Lys Pro Tyr Ser Ser Glu Tyr Lys Thr Ser Thr Ile Ala Tyr Lys Met Pro PheAla Gln Phe Pro Lys Asp Cys Trp Ile Thr Phe Asp Val Ala Ile Asp Trp Thr Lys TyrGly Lys Glu Ala Asn Thr Ile Leu Lys Pro Gly Lys Leu Asp Val Met Met Thr Tyr ThrLys Asn Lys Lys Pro Gln Lys Ala His Ile Val Asn Gln Gln Glu Ile Leu Ile Gly ArgAsn Asp Asp Asp Gly Tyr Tyr Phe Lys Phe Gly Ile Tyr Arg Val Gly Asn Ser Thr ValPro Val Thr Tyr Asn Leu Ser Gly Tyr Ser Glu Thr Ala Arg

IF2-FH heparinase I氨基酸序列是：

Met Thr Asp Val Thr Ile Lys Thr Leu Ala Ala Glu Arg Gln Thr Ser Val Glu Arg LeuVal Gln Gln Phe Ala Asp Ala Gly Ile Arg Lys Ser Ala Asp Asp Ser Val Ser Ala GlnGlu Lys Gln Thr Leu Ile Asp His Leu Asn Gln Lys Asn Ser Gly Pro Asp Lys Leu ThrLeu Gln Arg Lys Thr Arg Ser Thr Leu Asn Ile Pro Gly Thr Gly Gly Lys Ser Lys SerVal Gln Ile Glu Val Arg Lys Lys Arg Thr Phe Bal Lys Arg Asp Pro Gln Glu Ala GluArg Leu Ala Ala Glu Glu Gln Ala Gln Arg Glu Ala Glu Glu Gln Ala Arg Arg Glu AlaGlu Glu Ser Ala Lys Arg Glu Ala Gln Gln Lys Ala Glu Arg Glu Ala Ala Glu Gln AlaLys Art Glu Ala Ala Glu Gln Ala Lys Arg Glu Ala Ala Glu Lys Asp Lys Val Thr SerGly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys Ala Gln Gln Lys LysSer Gly Asn Ile Pro Tyr Arg Val Asn Val Gln Ala Asp Ser Ala Lys Gln Lys Ala Ile IleAsp Asn Lys Trp Val Ala Val Gly Ile Asn Lys Pro Tyr Ala Leu Gln Tyr Asp Asp LysLeu Arg Phe Asn Gly Lys Pro Ser Tyr Art Phe Glu Leu Lys Ala Glu Asp Asn Ser LeuGlu Gly Tyr Ala Ala Gly Glu Thr Lys Gly Art Thr Glu Leu Ser Tyr Ser Tyr Ala ThrThr Asn Asp Phe Lys Lys Phe Pro Pro Ser Val Tyr Gln Asn Ala Gln Lys Leu Lys ThrVal Tyr His Tyr Gly Lys Gly Ile Cys Glu Gln Gly Ser Ser Arg Ser Tyr Thr Phe Ser ValTyr Ile Pro Ser Ser Phe Pro Asp Asn Ala Thr Thr Ile Phe Ala Gln Trp His Gly Ala ProSer Arg Thr Leu Val Ala Thr Pro Glu Gly Glu Ile Lys Thr Leu Ser Ile Glu Glu PheLeu Ala Leu Tyr Asp Arg Met Ile Phe Lys Lys Asn Ile Ala His Asp Lys Val Glu LysLys Asp Lys Asp Gly Lys Ile Thr Tyr Val Ala Gly Lys Pro Asn Gly Trp Lys Val GluGln Gly Gly Tyr Pro Thr Leu Ala Phe Gly Phe Ser Lys Gly Tyr Phe TyrIle Lys AlaAsn Ser Asp Arg Gln Trp Leu Thr Asp Lys Ala Asp Arg Asn Asn Ala Asn Pro Glu AsnSer Glu Val Met Lys Pro Tyr Ser Ser Glu Tyr Lys Thr Ser Thr Ile Ala Tyr Lys Met ProPhe Ala Gln Phe Pro Lys Asp Cys Trp Ile Thr Phe Asp Val Ala Ile Asp Trp Thr LysTyr Gly Lys Glu Ala Asn Thr Ile Leu Lys Pro Gly Lys Leu Asp Val Met Met Thr TyrThr Lys Asn Lys Lys Pro Gln Lys Ala His Ile Val Asn Gln Gln Glu Ile Leu Ile Gly ArgAsn Asp Asp Asp Gly Tyr Tyr Phe Lys Phe Gly Ile Tyr Arg Val Gly Asn Ser Thr ValPro Val Thr Tyr Asn Leu Ser Gly Tyr Ser Glu Thr Ala Arg

本发明的肝素酶I融合蛋白编码基因的表达载体。

本发明的表达载体为pFusion。

本发明的表达载体的工程菌为大肠杆菌。

本发明还提供了一种表达肝素酶I融合蛋白的方法，该方法是将含有肝素酶I融合蛋白编码基因的重组表达载体导入表达宿主菌，表达得到肝素酶I融合蛋白。

6.权利要求5所述的方法，其特征在于：表达载体为pFusion，所述的表达宿主菌为大肠杆菌。

本发明的肝素酶I融合蛋白的诱导表达条件为挑取单菌落至3ml LB培养基(含10μg/ml卡那霉素)，37℃培养至OD600＝0.5，加入终浓度为0.5mM的IPTG，继续在16℃培养12小时。

本发明还提供了一种纯化肝素酶I融合蛋白的方法，该方法是采用Ni亲和层析的方法纯化。10,000g离心收集lL 16℃表达的菌体，用100ml PBS(50mMNaH2PO4pH 8.0，300mM NaCl)重悬，超声破菌。裂解液在12,000g离心20分钟；上清通过预先用PBS(50mM NaH2PO4pH 8.0，300mM NaCl)平衡的Ni-NTAagarose亲和层析柱(Qiagen)；肝素酶I融合蛋白用50mM NaH2PO4pH 8.0，300mM NaCl，250mM imidazole洗脱。洗脱组分用20mM Tris-HCl，100mM NaCl在4℃透析过夜。

附图说明

图1为肝素酶I融合表达载体构建示意图。

图2为肝素黄杆菌肝素酶I融合蛋白表达分析的SDS-PAGE图谱。

具体实施方式

实施例1.融合表达载体的构建

融合表达载体pFusion的构建过程如图1所示，具体过程如下：合成两条寡核苷酸链，序列分别为：

Linker sense(SEQ ID No.1)

5’ctagcactagtggtggtggtggttctggtggtggtggttctgatgatgatgataaagcgg-3’

Linker antisense(SEQ ID No.2)

5’-gatcccgctttatcatcatcatcagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccaactagtg-3’

分别取100pmol寡核苷酸链混合，70℃加热15分钟后，自然冷却至室温，退火形成双链。将pET 28a载体用Nhe I和BamH I双酶切，胶回收得到线性化载体。将退火产物和线性化载体用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α。重组载体命名为pLinker。插入序列表达GGGGSGGGGSDDDDK连接肽序列，有助于减少融合伴侣和目的蛋白之间的空间位阻(R.Trinh et al.，Optimization of codonpair use within the(GGGGS)3linker sequence results in enhanced protein expression，Mol.Immunol.2004，vol.40：717-722)。该重组载体为构建融合表达载体的中间载体。用NdeI和SpeI双酶切pLinker载体，产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，大小为5324bp。

Trx基因用PCR方法获得，引物为

Trx F(SEQ ID No.3)：5’ggaattccatatgagcgataaaattattcacctg-3’

Trx R(SEQ ID No.4)：5’caccactagtggccaggttagcgtcgagg-3’

PCR反应体系为：100ng大肠杆菌基因组DNA，10pmol每种引物，0.2mM每种dNTP，1x扩增缓冲液，2单位pfu酶。PCR反应程序为：94℃5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，30个循环；72℃5分钟。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，大小为315bp。

SUMO基因用PCR方法获得，引物为

SUMO F(SEQ ID No.5)：5’ggaattccatatgtcggactcagaagtcaatc-3’

SUMO R(SEQ ID No.6)：5’caccactagtaccaccaatctgttctctg-3’

PCR反应体系为：100ng酿酒酵母基因组DNA，10pmol每种引物，0.2mM每种dNTP，1x扩增缓冲液，2单位pfu酶。PCR反应程序为：94℃5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，30个循环；72℃5分钟。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，大小为294bp。

IF2基因用PCR方法获得，引物为

IF2F(SEQ ID No.7)：5’ggaattccatatgacagatgtaacgattaaaac-3’

IF2R(SEQ ID No.8)：5’caccactagtcactttgtctttttccg-3’

PCR反应体系为：100ng大肠杆菌基因组DNA，10pmol每种引物，0.2mM每种dNTP，1x扩增缓冲液，2单位pfu酶。PCR反应程序为：94℃5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，30个循环；72℃5分钟。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，大小为474bp。

将上述3个PCR产物分别用NdeI和SpeI双酶切，与用NdeI和SpeI双酶切的pLinker载体用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α。做菌落PCR鉴定重组载体：用引物T7promoter(SEQ ID No.9)：5’-taatacgactcactataggg-3’和Trx R(SEQID No.4)鉴定Trx融合表达载体，产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，阳性转化子的PCR产物大小为459bp；用T7promoter(SEQ ID No.9)和SUMO R(SEQ ID No.6)鉴定SUMO融合表达载体，产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，阳性转化子的PCR产物大小为448bp；用T7promoter(SEQ ID No.9)和IF2R(SEQ ID No.8)鉴定IF2融合表达载体，产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，阳性转化子的PCR产物大小为628bp。含有正确插入片段的载体统称为pFusion，根据融合伴侣的不同，分别命名为pTrx，pSUMO，pIF2。

实施例2.肝素黄杆菌肝素酶I融合表达载体的构建

肝素黄杆菌肝素酶I融合表达载体的构建过程如图1所示，具体过程如下：从肝素黄杆菌染色体DNA上扩增肝素酶I基因，引物为：

FH F(SEQ ID No.10)：5’-gatcggatcccagcaaaaaaaatccggtaac-3’

FH R(SEQ ID No.11)：5’-gatcctcgagttatctggcagtttcgctgtac-3’

PCR反应体系为：100ng肝素黄杆菌基因组DNA，10pmol每种引物，0.2mM每种dNTP，1x扩增缓冲液，2单位pfu酶。PCR反应程序为：94℃5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃2分钟，30个循环；72℃5分钟。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，大小为1092bp。

PCR产物用BamH I和Xho I双酶切，分别和用BamH I和Xho I双酶切的pTrx、pSUMO、pIF2用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α。做菌落PCR鉴定重组载体，引物为T7promoter(SEQ ID No.9)和T7terminator(SEQ No.12)：5’-gctagttattgctcagcgg-3’，产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。含有Trx-肝素酶I融合基因的转化子的扩增产物约为1500bp，阳性转化子命名为pTrx-FH Heparinase I；含有SUMO-肝素酶I融合基因的转化子的扩增产物约为1500bp，阳性转化子命名为pSUMO-FH Heparinase I；含有IF2-肝素酶I融合基因的转化子的扩增产物约为1700bp，阳性转化子命名为pIF2-FH Heparinase I。

实施例3.肝素酶I融合蛋白的表达

将pTrx-FH Heparinase I、pSUMO-FH Heparinase I、pIF2-FH Heparinase I分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，在LB固体培养基(含10μg/ml卡那霉素)上，37℃培养过夜。挑取单菌落至3ml LB培养基(含10u g/ml卡那霉素)，37℃培养至OD₆₀₀＝0.5，加入终浓度为0.5mM的IPTG，继续在16℃培养12小时。10,000g离心收集菌体，用400μl PBS(50mM NaH₂PO₄ pH 8.0，300mM NaCl)重悬，超声破菌。取200μl裂解液，12,000g离心10分钟，收集上清；沉淀用200μl PBS(50mM NaH₂PO₄ pH 8.0，300mM NaCl)重悬。将超声总蛋白、超声上清、超声沉淀用12％SDS-PAGE分析。肝素黄杆菌肝素酶I融合蛋白的表达结果如图2所示，泳道1、4、7分别为Trx-FH Heparinase I、SUMO-FH Heparinase I、IF2-FHHeparinase I总蛋白，泳道2、5、8分别为Trx-FH Heparinase I、SUMO-FHHeparinase I、IF2-FH Heparinase I超声上清，泳道3、6、9分别为Trx-FH HeparinaseI、SUMO-FH Heparinase I、IF2-FH Heparinase I超声沉淀。箭头所指位置为三种肝素黄杆菌肝素酶I融合蛋白所在位置。结果表明，三种肝素黄杆菌肝素酶I融合蛋白均以可溶形式表达。

实施例4.肝素酶I融合蛋白的纯化

本发明中肝素酶I融合蛋白的N端均带有连续6个组氨酸标签(6x His tag)，因此可以用Ni亲和层析的方法纯化。10,000g离心收集1L 16℃表达的菌体，用100ml PBS(50mM NaH₂PO₄ pH 8.0，300mM NaCl)重悬，超声破菌。裂解液在12,000g离心20分钟。上清通过预先用PBS(50mM NaH₂PO₄ pH 8.0，300mM NaCl)平衡的Ni-NTA agarose亲和层析柱(Qiagen)。肝素酶I融合蛋白用50mMNaH₂PO₄pH 8.0，300mM NaCl，250mM imidazole洗脱。洗脱组分用20mMTris-HCl，100mM NaCl在4℃透析过夜。纯化的肝素酶I融合蛋白用12％SDS-PAGE检测。蛋白浓度用BCA法测定。

实施例5.肝素酶I融合蛋白的活性测定

肝素酶I融合蛋白的活性测定采用232nm法()。测活体系为：100mM MOPSpH 7.0，5mM Calcium acetate，25mg/ml Heparin，0.5μg肝素酶融合蛋白，总体积900μl。反应混合液在30℃孵育，每隔1分钟(至6分钟)取50μl，加入1.5ml 0.03N HCl终止反应，测定232nm吸光度。酶活定义为：30℃下，每分钟产生1μmol不饱和糖醛酸所需要的酶量定义为1个国际单位(IU)。肝素酶I融合蛋白的比活(以IU/mg表示)如表1所示。

表1.肝素酶I融合蛋白的活性测定

Claims

1.一种肝素酶I融合蛋白，包含三个结构域：融合结构域、连接结构域和肝素酶I结构域，其特征在于：所述的融合结构域选自硫氧还蛋白(Trx)、小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)或翻译起始因子2(IF2)其中的一种，肝素酶I结构域为肝素黄杆菌肝素酶I。

2.含有权利要求1所述的肝素酶I融合蛋白的编码基因，其特征在于：所述的硫氧还蛋白(Trx)的编码基因是(SEQ ID No.12)；小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)的编码基因是(SEQ ID No.13)；翻译起始因子2(IF2)的编码基因是(SEQ ID No.14)；所述的连接结构域的编码基因是(SEQ ID No.15)；并且所述的肝素黄杆菌肝素酶I的编码基因是(SEQ ID No.16)。

3.含有权利要求2所述的肝素酶I融合蛋白编码基因的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：表达载体为pFusion。

5.根据权利要求3所述表达载体的工程菌，其特征在于：工程菌为大肠杆菌。

6.一种表达肝素酶I融合蛋白的方法，其特征在于：将含有肝素酶I融合蛋白编码基因的重组表达载体导入表达宿主菌，表达得到肝素酶I融合蛋白。

7.权利要求6所述的方法，其特征在于：表达载体为pFusion，所述的表达宿主菌为大肠杆菌。

8.权利要求6所述的方法，其特征在于：所述肝素酶I融合蛋白的诱导表达条件为挑取单菌落至3ml LB培养基(含10μg/ml卡那霉素)，37℃培养至OD600＝0.5，加入终浓度为0.5mM的IPTG，继续在16℃培养12小时。

9.一种纯化肝素酶I融合蛋白的方法，其特征在于：Ni亲和层析的方法纯化。10,000g离心收集1L 16℃表达的菌体，用100ml PBS(50mM NaH2PO4 pH 8.0，300mM NaCl)重悬，超声破菌。裂解液在12,000g离心20分钟；上清通过预先用PBS(50mM NaH2PO4 pH 8.0，300mM NaCl)平衡的Ni-NTA agarose亲和层析柱(Qiagen)；肝素酶I融合蛋白用50mM NaH2PO4 pH 8.0，300mM NaCl，250mMimidazole洗脱。洗脱组分用20mM Tris-HCl，100mM NaCl在4℃透析过夜。