CN109161539B

CN109161539B - 一种有机溶剂耐受性氨肽酶LapA及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109161539B
Application number: CN201811087825.6A
Authority: CN
Inventors: 张楠楠; 胡馨益; 葛宏华
Original assignee: Anhui University
Current assignee: Anhui University
Priority date: 2018-09-18
Filing date: 2018-09-18
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2038-09-18
Also published as: CN109161539A

Abstract

本发明公开了一种有机溶剂耐受性氨肽酶LapA及其制备方法和应用，属于基因工程、蛋白表达与纯化及酶学特征研究领域，该氨肽酶LapA来源于嗜肺军团菌，具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，该编码基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。该酶作为一种外切蛋白酶，具有良好的温度稳定性以及有机溶剂耐受性，能适应极端的高浓度有机溶剂反应条件，为氨肽酶LapA的产业化和在发酵食品加工工业的应用奠定了良好的基础。

Description

一种有机溶剂耐受性氨肽酶LapA及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术、蛋白表达与纯化及酶学特征研究领域，具体涉及一种有机溶剂耐受性氨肽酶LapA、其编码基因和应用、其重组大肠杆菌及其构建方法、LapA蛋白的体外表达与纯化的方法和LapA酶学性质鉴定。

背景技术

肽酶(EC 3.4)在洗涤剂，皮革，药物和食品工业中具有广泛应用，肽酶占全球酶市场的65％。肽酶是食品工业中提高消化率和溶解度以及食品蛋白质的风味和功能特性的有力工具。之前研究的大多数肽酶都是内切蛋白酶，近几十年来，外切蛋白酶由于其与内切蛋白酶和特定功能的不同切割位点而引起了很多关注。内切蛋白酶通常切割肽链内的肽键，产生各种长度的肽。外切蛋白酶通过去除单个氨基酸或二肽/三肽攻击末端(即N或C端)的肽链，导致释放游离氨基酸和小肽。氨肽酶LapA(EC 3.4.11)是外切蛋白酶家族的成员，其选择性地从肽中去除N端氨基酸残基。氨肽酶LapA的引入已经成为提高蛋白质水解效率的重要途径，当蛋白质大分子酶解时，肽链中含有的疏水性氨基酸暴露出来，接触味蕾而呈现苦味，而这些疏水性氨基酸一般位于肽链末端，而利用氨肽酶LapA进一步水解蛋白质水解液，可以脱去其苦味。尽管在食品工业中已经使用了许多商业氨肽酶LapA，但应用氨肽酶LapA的主要挑战之一是发现它们在极端温度，pH和有机溶剂中进行催化的独特能力。例如对于一些食物发酵过程，作为副产物的乙醇会影响许多酶的活性。因此，氨肽酶LapA具有很高的研究价值以及在酒精发酵食品加工工业中的应用潜力。

基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，在体外将分离到的或合成的目的基因,通过与质粒、病毒等载体重组连接，然后将其导入不含该基因的受体细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

发明内容

本发明的目的就在于提供一种有机溶剂耐受性氨肽酶LapA及其制备方法和应用，提供了该氨肽酶LapA体外重组表达纯化的方法，并鉴定出该酶为一种能够适应极端条件下催化需求的高性能氨肽酶LapA。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明提供了一种有机溶剂耐受性氨肽酶LapA，具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，该氨肽酶LapA来源于嗜肺军团菌，为一种外切蛋白酶，该氨肽酶LapA也可通过化学合成方法获得。

本发明还提供了一种产上述有机溶剂耐受性氨肽酶LapA的重组大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)基因克隆：以SEQ ID NO.1所示的有机溶剂耐受性氨肽酶LapA的编码基因为目标基因，设计特异性扩增引物，在引物中引入NcoⅠ和XhoⅠ限制性内切酶位点，进行PCR扩增，获得含有NcoⅠ和XhoⅠ限制性内切酶位点的目的基因片段；

(2)构建重组质粒：将含有NcoⅠ和XhoⅠ限制性内切酶位点的目的基因片段经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后，连接到经过同样处理的载体pET-28a上，获得重组质粒；

(3)构建重组大肠杆菌：将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta菌株感受态细胞，获得产有机溶剂耐受性氨肽酶LapA的重组大肠杆菌。

本发明还提供了一种上述有机溶剂耐受性氨肽酶LapA的体外表达与纯化方法，包括以下步骤：

(Ⅰ)将如权利要求2的方法构建获得的重组大肠杆菌进行扩大培养，待菌液OD₆₀₀到达0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mM IPTG，16℃摇床中培养20h，进行诱导表达；

(Ⅱ)5000rpm离心10min，弃去上清，菌体用pH8.0的20mM Tris-HCl，200mM NaCl缓冲液重悬，超声破碎仪破碎，4℃低温条件下12000rpm离心30min，取上清液；

(Ⅲ)将上清液上样过Zn²⁺螯合亲和层析柱，柱子事先依次过5个柱体积超纯水、10个柱体积50mM NaAc(pH5.0)、10个柱体积超纯水、5mL 100mM ZnCl₂、10个柱体积超纯水及蛋白重悬缓冲液；然后用5个柱体积的蛋白重悬缓冲液过柱，再依次用5-10个柱体积的含有5mM-1M咪唑的蛋白重悬缓冲液过柱，收集各洗脱液，即为洗脱蛋白样品；

(Ⅳ)将洗脱蛋白样品用超滤离心管浓缩到5ml后，过凝胶层析柱，层析柱事先用蛋白重悬缓冲液平衡好，并用缓冲液进行洗脱；设置层析柱的柱压为0.5MPa、流速为1ml/min，即获得氨肽酶LapA。

本发明还提供了上述有机溶剂耐受性氨肽酶LapA酶学性质鉴定方法，该方法以L-亮氨酸-对硝基苯胺为底物，在不同的反应条件下，利用所述有机溶剂耐受性氨肽酶LapA催化L-亮氨酸-对硝基苯胺转化为对硝基苯胺，通过测定反应液在405nm处的吸光值，计算获得该LapA的酶活和最适催化反应条件等酶学性质。

本发明还提供了上述有机溶剂耐受性氨肽酶LapA的编码基因，具有如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列，全长1269bp。

本发明还提供了一种重组质粒，该重组质粒为含有上述有机溶剂耐受性氨肽酶LapA的编码基因的pET-28a重组质粒。

本发明还提供了一种产上述有机溶剂耐受性氨肽酶LapA的重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌为含有上述重组质粒的Rosetta菌株。

本发明还提供了上述有机溶剂耐受性氨肽酶LapA在极端环境下作为蛋白质的外切蛋白酶的应用，其中，所述极端环境指在高浓度有机溶剂反应条件下。

本发明的有益效果在于：本发明应用基因工程技术从嗜肺军团菌基因组文库中获得的氨肽酶LapA，还提供了LapA蛋白的体外表达与纯化的方法，并且本发明中重组大肠杆菌所表达的氨肽酶LapA具有有机溶剂耐受性以及良好的温度稳定性，为氨肽酶LapA的产业化和在发酵食品加工工业的应用奠定了良好的基础。

附图说明

图1是氨肽酶LapA(lapA)的扩增结果(M：Marker,1：目的基因)。

图2是重组质粒pET-28a-lapA的双酶切验证。

图3是本发明提供的氨肽酶LapA纯化的SDS-PAGE电泳图。

图4是本发明提供的分子筛蛋白纯化峰图。

图5是纯化的氨肽酶LapA的最适反应温度测定结果图。

图6是纯化的氨肽酶LapA的最适反应pH及缓冲液测定结果图。

图7是纯化的氨肽酶LapA在不同有机溶剂下酶活测定结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。

实施例1

1、材料

本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。

2、方法

2.1基因克隆

从生物信息学数据库中检索预测嗜肺军团菌的全基因组序列，并且找到目标基因序列(Gene ID:19834379)。根据目标基因序列，使用Primer Premier 5.0进行引物设计，在目的基因的5’端和3’端分别引入NcoⅠ和XhoⅠ限制性内切酶位点。设计引物序列如下：

上游引物：5'CCCGCCATGGGAATGTTGTTTGCAATATTCGTTTCATC 3'，下划线表示NcoⅠ酶切位点；

下游引物：

5'CCGCTCGAGCTCGGAAGCGAGTTCAATAGCGAAAG 3'，下划线表示XhoⅠ酶切位点；

PCR扩增目的基因；反应体系为：

FastPfu 1μL,10X FastPfu缓冲液5μL，dNTP Mix(2.5mM)4μL，模板2μL，引物F1和F2(10μM)各1μL，超纯水补足至50μL。PCR反应条件：95℃预变性2min；95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min，16℃。

将PCR产物用PCR产物回收试剂盒回收，结果如图1所示。

2.2重组质粒的构建

将回收的PCR产物用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切2h(37℃)，连接到经过同样处理的载体pET-28a上，获得连接产物。

将连接产物转化E.coli TOP10菌株，涂布于含卡那抗性的LB固体培养基上。

菌落PCR扩增目的基因、双酶切进行阳性鉴定，结果如图2所示，挑取阳性菌落到5mL含卡那抗性的LB液体培养基中进行扩大培养，取1mL菌液送测序，获得重组质粒。

2.3蛋白诱导表达与纯化

将重组质粒转化Rosetta菌株感受态细胞，待平板上长出可见菌落后，随机挑取3个菌落，进行扩大培养，待菌液OD₆₀₀到达0.6-0.8时，取1mL菌液作为诱前样品，余下菌液加入终浓度为0.5mM IPTG进行诱导表达，16℃摇床中培养20h，取1mL菌液作为诱后样品，5000rpm离心10min，弃去上清，菌体用少量20mM Tris-HCl(pH8.0)，200mM NaCl缓冲液重悬，超声破碎仪破碎(功率10％，开1s停4s)，4℃低温条件下12000rpm离心30min。

将上清液上样过Zn²⁺螯合亲和层析柱，柱子事先依次过5个柱体积超纯水、10个柱体积50mM NaAc(pH5.0)、10个柱体积超纯水、5mL100mM ZnCl₂、10个柱体积超纯水及蛋白重悬缓冲液。然后用5个柱体积的蛋白重悬缓冲液过柱，再依次用5-10个柱体积的含有5mM、10mM、15mM、20mM、50mM、100mM、250mM、500mM、1M咪唑的蛋白重悬缓冲液过柱，分别收集各洗脱液，取各洗脱液样品进行处理，并用SDS-PAGE检测各洗脱液目标蛋白洗脱情况以及纯度，结果如图3所示。

将洗脱蛋白样品用超滤离心管浓缩(millipore 10kDa)到5ml后，过凝胶层析柱Superdex S75(16/60，120ml柱体积，GE)，层析柱事先用蛋白重悬缓冲液平衡好，并用缓冲液进行洗脱。设置层析柱的柱压为0.5MPa、流速为1ml/min、收集体积为1.5mL/管。将收集的洗脱液分别取样处理，并用SDS-PAGE检测洗脱蛋白的均一性和稳定性，结果如图4所示，即获得氨肽酶LapA。

2.4氨肽酶LapA酶活测定

以L-亮氨酸-对硝基苯胺为底物，50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液为反应环境，反应体系200μl，再加入20μl稀释至0.05mg/mL的酶液，设置反应底物浓度依次为0.1mM,0.2mM,0.5mM,0.75mM,1.0mM,1.5mM,2.0mM,2.5mM,3.0mM,3.5mM,4.0mM的条件下，25℃测定吸光值A_405nm，计算酶活力。该氨肽酶LapA酶活定义：在一定条件下，每分钟催化1μM亮氨酸对硝基苯胺转化为对硝基苯胺所需要的酶量定为一个酶活力单位。测得的酶液酶活为6.046U/mg。

2.5氨肽酶LapA催化反应条件的测定

2.5.1最适反应温度的测定

50mM Tris-HCL缓冲液(pH8.0)，以1mM亮氨酸对硝基苯胺(Leu-pNA)为底物，加入纯化后的酶液20μl，分别在20、30、40、50、60、70、80、90℃测定吸光值A_405nm，定义最高酶活为100％。结果如图5所示。氨肽酶LapA在20～70℃都具有较高的催化活性，最适反应温度为60℃。

2.5.2最适反应pH的测定

以1mM亮氨酸对硝基苯胺(Leu-pNA)为底物，加入纯化后的酶液20μl，分别在pH6.0、7.0、8.0(50mM磷酸缓冲液)、pH 6.0、7.0、8.0(50mM HEPES缓冲液)、pH 8.0、9.0(50mM Tris-HCL缓冲液)、pH 6.0、7.0、8.0((50mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)及pH 9.0、10.0、11.0、12.0(50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)等不同pH及不同缓冲液条件下,25℃测定吸光值A_405nm，定义最高酶活为100％。结果如图6所示，氨肽酶LapA最适反应pH及缓冲液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液pH 8.0。

2.5.3有机溶剂耐受性的测定

50mM Tris-HCL缓冲液(pH 8.0)，以1mM亮氨酸对硝基苯胺(Leu-pNA)为底物，加入纯化后的酶液20μl，分别加入20％、60％有机溶剂(甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙腈)测定吸光值A_405nm，定义最高酶活为100％。结果如图7所示，氨肽酶LapA在有机溶剂中一样具备催化活性。

3、结论

本发明应用基因工程技术从嗜肺军团菌基因组文库中获得了一种新的氨肽酶LapA，该酶的最适反应温度为60℃，最适反应pH为8.0，该酶具有有机溶剂耐受性以及良好的温度稳定性，能够满足发酵食品加工生产领域的产业化需要，具有良好的应用前景。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 安徽大学

<120> 一种有机溶剂耐受性氨肽酶及其编码基因和应用

<141> 2018-09-18

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 422

<212> PRT

<213> 嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)

<400> 1

Met Phe Ala Ile Phe Val Ser Ser Gly Ser Ile Lys Asn Asp Leu Asn

1 5 10 15

Asn Leu Gly Glu Asp Met Arg Phe Asn Gln Trp Met Thr Cys Ile Thr

20 25 30

Ser Gly Leu Ile Leu Ala Ser Asn Ser Ser Phe Ala Thr Thr Ser Pro

35 40 45

Val His Glu Gln Leu Gln Val Pro Gln Cys Leu Ala Ala Lys Ile Thr

50 55 60

Val Pro His Lys Ile Leu Ala Glu Asn Lys Glu Phe Lys Ile Ile Asp

65 70 75 80

Val Leu Ser Ser Asp Val Glu Thr Leu Thr Ile Leu Ala Asp Lys Val

85 90 95

Ser Cys Gly His Phe Val Asn Val Ser His Lys Leu Thr Gly Thr Leu

100 105 110

Ala Ala Asn Gln Gln Gln Ser Ala Gln Lys Leu Leu Gln Lys Lys Leu

115 120 125

Val Lys Pro Phe Gly Val Ser Lys Leu His Lys Asp Val Tyr Glu Ile

130 135 140

Lys His Glu Glu Glu Val Asn Ala Ala Leu Lys Glu Ile Val Ser Asp

145 150 155 160

Asn Ile Trp Gln Thr Leu Thr His Met Thr Ser Tyr Tyr Asn Arg Ser

165 170 175

Ala Thr Lys Asp Thr Gly Val Asp Thr Ala Asn Trp Leu Lys Ser Lys

180 185 190

Phe Glu Gln Met Ala Val Glu Tyr Gly Arg Thr Asp Thr Ser Thr Phe

195 200 205

Phe Val Lys Thr Gly Trp Tyr Lys Gln Pro Ser Leu Val Thr Val Ile

210 215 220

Gly Lys Asp Ile Lys Ala Pro Ala Ile Val Ile Gly Ala His Met Asp

225 230 235 240

Thr Leu Asp Gly Arg Met Pro Gly Ala Gly Asp Asp Gly Ser Gly Ser

245 250 255

Ser Ser Ile Met Glu Ala Ala Arg Val Ile Leu Ser Ser Lys Thr Thr

260 265 270

Phe Lys Arg Pro Ile Tyr Phe Ile Trp Tyr Ala Ala Glu Glu Arg Gly

275 280 285

Leu Val Gly Ser Gln His Val Val Gln His Phe Gln Glu Gln Ser Ile

290 295 300

Pro Val Lys Ala Val Val Gln Phe Asp Met Thr Gly Tyr Arg Asn Asp

305 310 315 320

Ala Asn Asp Pro Thr Met Trp Val Phe Thr Asp Tyr Thr Asp Arg Asp

325 330 335

Leu Ser Asn Tyr Leu Ala Lys Leu Ile Asp His Tyr Ile His Val Pro

340 345 350

Val Asp Tyr Ser Arg Cys Gly Tyr Gly Cys Ser Asp His Ala Ser Trp

355 360 365

Asn Glu Glu Asp Ile Pro Ala Ala Phe Pro Cys Glu Thr Ser Phe Ala

370 375 380

Asp His Asn Pro Tyr Ile His Thr Ser Ser Asp Lys Met Asp Leu Leu

385 390 395 400

Asn Leu Glu His Met Thr Asn Phe Ser Lys Leu Ala Val Ala Phe Ala

405 410 415

Ile Glu Leu Ala Ser Glu

420

<210> 3

<211> 1269

<212> DNA

<213> 嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)

<400> 3

ttgtttgcaa tattcgtttc atcaggtagt atcaaaaacg atttaaataa cttaggagag 60

gatatgcgtt ttaaccaatg gatgacctgt atcacatcag gattaatact cgccagtaat 120

tcaagttttg caacgacgtc gcctgttcat gagcaattgc aagtcccaca atgccttgct 180

gcaaaaataa ccgtacccca taagattttg gccgagaata aagaattcaa aattattgat 240

gtactttcat ctgatgtaga gaccttgact attctggctg ataaagtcag ttgcggccat 300

tttgtgaatg tgagtcataa attaacggga accttagcgg caaaccaaca gcaatctgct 360

caaaagttac tgcaaaaaaa gctcgttaag ccctttggtg tatccaaatt acataaagac 420

gtttatgaaa tcaagcatga agaagaagtc aatgcggcac taaaagaaat tgtctctgat 480

aacatatggc aaactctgac tcatatgact tcctattata accgctctgc aacaaaagat 540

acgggtgttg atacggccaa ttggttaaaa tccaaatttg aacagatggc cgttgagtat 600

ggacgaactg atacctcgac cttttttgta aaaacagggt ggtataaaca accttccctg 660

gttaccgtga ttggcaaaga catcaaagcc cccgctattg ttattggtgc tcatatggat 720

actcttgatg gccgtatgcc tggggctggt gatgatggaa gtggatcatc gagcattatg 780

gaagccgcac gggttatttt gtcttctaaa acaacattta agcgccccat ttattttatt 840

tggtatgctg ctgaagaaag aggtttggtc ggttcacaac acgtagtcca acactttcag 900

gaacaatcaa ttccagtgaa ggctgtggta caatttgaca tgaccggtta tcgaaatgat 960

gccaatgatc caactatgtg ggtatttact gattacacag atagagattt aagtaattat 1020

ttggccaaat taattgatca ttatattcat gtgccagtag attattcacg atgtggttat 1080

ggttgcagtg atcatgcttc ctggaatgaa gaagatattc ctgctgcatt cccatgtgaa 1140

accagtttcg ctgatcacaa cccatacatc catacttctt ctgataaaat ggatttattg 1200

aacctggaac atatgaccaa tttctccaaa ctcgcggtag ctttcgctat tgaactcgct 1260

tccgagtaa 1269

Claims

1.一种有机溶剂耐受性氨肽酶LapA在极端环境下作为蛋白质的外切蛋白酶的应用，其特征在于，所述氨肽酶LapA为如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或乙腈，所述极端环境指在高浓度有机溶剂反应条件下，所述高浓度有机溶剂指浓度为20％的有机溶剂。

2.根据权利要求1所述的有机溶剂耐受性氨肽酶LapA在极端环境下作为蛋白质的外切蛋白酶的应用，其特征在于，所述有机溶剂耐受性氨肽酶LapA的重组大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：

3.根据权利要求1所述的有机溶剂耐受性氨肽酶LapA在极端环境下作为蛋白质的外切蛋白酶的应用，其特征在于，所述有机溶剂耐受性氨肽酶LapA的体外表达与纯化方法，包括以下步骤：

(Ⅰ)将如权利要求2中的方法构建获得的重组大肠杆菌进行扩大培养，待菌液OD₆₀₀到达0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mM IPTG，16℃摇床中培养20h，进行诱导表达；

(Ⅲ)将上清液上样过Zn²⁺螯合亲和层析柱，柱子事先依次过5个柱体积超纯水、10个柱体积50mM pH5.0 NaAc、10个柱体积超纯水、5mL 100mM ZnCl₂、10个柱体积超纯水及蛋白重悬缓冲液；然后用5个柱体积的蛋白重悬缓冲液过柱，再依次用5-10个柱体积的含有5mM-1M咪唑的蛋白重悬缓冲液过柱，收集各洗脱液，即为洗脱蛋白样品；

4.根据权利要求1所述的有机溶剂耐受性氨肽酶LapA在极端环境下作为蛋白质的外切蛋白酶的应用，其特征在于，所述有机溶剂耐受性氨肽酶LapA的酶学性质鉴定方法，步骤包括：以L-亮氨酸-对硝基苯胺为底物，在不同的反应条件下，利用所述有机溶剂耐受性氨肽酶LapA催化L-亮氨酸-对硝基苯胺转化为对硝基苯胺，通过测定反应液在405nm处的吸光值，计算获得该LapA的酶学性质参数。

5.根据权利要求1所述的有机溶剂耐受性氨肽酶LapA在极端环境下作为蛋白质的外切蛋白酶的应用，其特征在于，所述有机溶剂耐受性氨肽酶LapA的编码基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。