CN111705050A

CN111705050A - 一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN111705050A
Application number: CN202010425190.7A
Authority: CN
Inventors: 崔恒林; 赵阳洁; 侯靖
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2020-05-19
Filing date: 2020-05-19
Publication date: 2020-09-25
Anticipated expiration: 2040-05-19
Also published as: CN111705050B

Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法及其应用；步骤为：首先基于嗜盐古菌DYF 46的基因组获得编码基因hly；通过分子克隆技术将hly连接到载体上构建重组质粒；将重组质粒转化原核生物宿主，得到转化后的重组宿主细胞在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养，经培养、诱导表达后低温离心收集菌体，于细胞裂解液中进行重悬，经超声破碎、离心收集上清液，用于重组蛋白纯化；采用镍亲和层析纯化蛋白结合柱上复性方法获得成熟酶，经凝胶过滤层析纯化后获得高纯度Hly。本发明得到的Hly具有优良的酶学特性，可应用于洗涤剂、废水处理、制药和环境修复等复杂、含盐的降解蛋白质的生产加工过程中。

Description

一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法及其应用。

背景技术

已发现的嗜盐古菌来源的丝氨酸蛋白酶前体均具有信号肽、前肽、催化结构域和C端延伸区(CTE)。前体分子通过TAT途径分泌至胞外，随后信号肽被切除，N端前肽帮助酶形成正确构象后被切除，最终形成成熟胞外蛋白酶。成熟的胞外蛋白酶由催化结构域和CTE组成，CTE可能与维持酶在高盐环境的稳定性或与大分子底物的结合有关。

目前，很多细菌来源的蛋白酶无法适应高盐碱的工业加工环境，嗜盐古菌来源蛋白酶虽然能够耐受盐碱环境，但它们大多需要较高2-5M NaCl浓度来维持酶的稳定性。例如，来源于嗜盐古菌的胞外蛋白酶172P1在5％的NaCl浓度下完全失活；由Halogeometricumborinquense所产的胞外蛋白酶至少需要1M NaCl维持酶的稳定性；来自Natronococcusoccultus的胞外蛋白酶则需要2M NaCl维持酶的稳定性。因此，挖掘能够在低盐到高盐条件下均能发挥活性的耐盐蛋白酶十分必要。

本发明涉及的新型丝氨酸蛋白酶基因所编码的新型丝氨酸蛋白酶不含嗜盐古菌胞外蛋白酶中广泛存在的CTE，并且在低盐环境下具有很高酶活且在高盐环境下也具有很好的稳定性，可以适应复杂工业加工过程，如精细化工、制药、洗涤、废水处理和环境修复等工业领域。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的技术缺陷，提供一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶编码基因、新型嗜盐古菌胞外蛋白酶及其应用，此蛋白酶可用于广泛盐浓度、pH和温度条件下蛋白质及肽类的降解。

本发明基于嗜盐古菌Haladaptatus sp.DYF 46的基因组获得一种新型胞外蛋白酶编码基因hly(下文简称hly)，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，基因大小为1191bp。hly编码的新型嗜盐古菌胞外蛋白酶Hly(下文简称Hly)的前体与以往发现的嗜盐古菌胞外蛋白酶均不同，具有信号肽、前肽和催化结构域，无CTE。Hly前体由396个氨基酸残基组成，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

为了实现以上目的，本发明包括以下步骤：

本发明涉及了新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)构建hly-pET28a重组表达质粒：

首先基于嗜盐古菌(Haladaptatus sp.)DYF 46的基因组获得一种新型胞外蛋白酶编码基因hly，进一步设计含有酶切位点的目的片段引物，利用常规PCR技术扩增目的片段hly；通过分子克隆技术将hly连接到载体上构建重组质粒；所述载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核表达载体，如pET系列载体，pQE系列载体，本发明具体选择大肠杆菌表达载体pET28a；

(2)重组质粒转化原核生物宿主，诱导表达：

将步骤(1)得到的重组质粒转化原核生物宿主，得到转化后的重组宿主细胞；所述原核生物宿主为E.coli BL21(DE3)；

转化后的重组宿主细胞在含有卡那霉素的LB液体培养基中摇瓶培养，细胞培养至生长对数期，达到一定OD₆₀₀值时，添加IPTG诱导剂，继续培养一段时间进行诱导表达；诱导表达之后，低温离心收集菌体；

(3)Hly的复性、纯化：

收集步骤(2)诱导表达后的菌体于细胞裂解液中进行重悬，重悬后超声破碎细胞，离心后收集上清液，用于重组蛋白纯化；采用镍亲和层析纯化蛋白结合柱上复性方法获得成熟酶；最后利用凝胶过滤层析进一步纯化蛋白，获得高纯度Hly。

优选的，步骤(1)中所述嗜盐古菌(Haladaptatus sp.)DYF 46保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号：CGMCC 19759，保藏日期：2020年4月29日。

优选的，步骤(1)中所述hly核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，基因大小为1191bp。

优选的，步骤(1)中所述酶切位点选择限制性内切酶NcoI和XhoI的酶切位点。

优选的，步骤(2)中所述卡那霉素在LB液体培养基中的终浓度为50μg/mL。

优选的，步骤(2)中所述摇瓶培养的温度为37℃。

优选的，步骤(2)中所述一定OD₆₀₀值为0.55～0.65；所述添加IPTG诱导剂的终浓度为0.5mM。

优选的，步骤(2)中所述继续培养一段时间为4～5h，温度为37℃；所述低温为0～4℃。

优选的，步骤(3)中所述获得成熟酶的具体操作为：首先20倍柱床体积的细胞裂解液中加入终浓度为2mM的β-巯基乙醇，用于平衡镍柱；于上清液中加入终浓度为2mM的β-巯基乙醇，上样；然后使用缓冲液I洗脱杂蛋白；在镍柱中加入5倍柱床体积的复性缓冲液，并将镍柱置于37℃保温24h；流尽复性缓冲液后，缓冲液II洗脱杂蛋白；再加入5倍柱床体积的洗脱液I得到成熟酶，记为Hly。

优选的，所述细胞裂解液成分为8M尿素，10mM CaCl₂，50mM Tris-HCl，pH 8.0。

优选的，所述缓冲液I成分为2mMβ-巯基乙醇，8M尿素，40mM咪唑，10mM CaCl₂，50mMTris-HCl，pH 8.0。

优选的，所述复性缓冲液成分为2M NaCl，10mM CaCl₂，50mM Tris-HCl，pH 8.0。

优选的，所述缓冲液II成分为2M NaCl，20mM咪唑，10mM CaCl₂，50mM Tris-HCl，pH8.0。

优选的，所述洗脱液I成分为2M NaCl，250mM咪唑，10mM CaCl₂，50mM Tris-HCl，pH8.0。

优选的，步骤(3)中所述凝胶过滤层析所用的流动相为复性缓冲液。

本发明还提供了Hly在工业上的应用，例如可用于催化蛋白类底物水解，具体包括对偶氮酪蛋白为代表的大分子蛋白质底物和小分子四肽底物的催化作用：

(1)以偶氮酪蛋白为底物测定Hly的催化活性的方法为：

以酶活测定缓冲液溶解0.2mM偶氮酪蛋白底物，以酶活测定缓冲液稀释0.1μg纯酶至20μL；20μL酶液和20μL底物于37℃反应1h，20μL酶液于反应结束后再加入20μL底物作为空白对照；加入40μL 10％TCA终止反应；静置30min，离心所得上清液与1M NaOH以1:1比例混合后，采用紫外可见光分光光度计测定吸光值A₄₄₀；以偶氮酪蛋白在该波长下的消光系数计算转化底物浓度；一个酶活力单位定义为特定条件下每分钟转化lμmol偶氮酪蛋白所需要的酶量。2M NaCl、37℃且pH 8.0条件下测得的以偶氮酪蛋白为底物的Hly比酶活为1430U/mg。

(2)以四肽Suc-AAPF-pNA为底物测定Hly的催化活性的方法为：

使用酶活测定缓冲液稀释0.1μg纯酶至300μL，并配制0.4mM Suc-AAPF-pNA底物。利用蛋白核酸分析仪DU 800的kinetics/time方法，反应温度为37℃；以300μL底物和300μL酶液为实验组，300μL缓冲液和300μL酶液为空白对照组；记录10min内初始反应速率。通过Suc-AAPF-pNA 410nm波长下消光系数计算产物浓度。三次平行试验。一个酶活力单位定义为特定条件下每分钟转化1μM底物所需的酶量。2M NaCl、37℃且pH 8.0条件下测得的以Suc-AAPF-pNA为底物的Hly比酶活为4.48×10⁸U/mg。

以偶氮酪蛋白为底物，Hly在所述的0.25～4M NaCl范围内最适为0.5M NaCl，在0.25、2和4M NaCl浓度下，1h后仍具有几乎100％的活性；Hly在30～60℃下均具有较高酶活，最适为45℃，在30℃和45℃下，1h后可以保持80％以上的活性；所述水解的pH值为6.0～10.5，优选为8.5或9。在pH为6、8、10条件下1h后仍具有60％以上的活性；其可耐受多种金属离子和有机试剂，而K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Sr²⁺、Ni²⁺以及Triton X-100对酶活略有促进作用。最适反应条件下，Hly以偶氮酪蛋白为反应底物最大反应速率V_max为6166μM/min/mg，动力学常数K_m为0.01831mM。Hly以Suc-AAPF-pNA为反应底物最大反应速率V_max为3.05×10⁹μM/min/mg，动力学常数K_m为0.319mM。

优选的，步骤(1)和(2)中所述酶活测定缓冲液为2M NaCl和50mM Tris-HCl，pH8.0。

本发明的优点和技术效果是：

(1)本发明从嗜盐古菌(Haladaptatus sp.)DYF 46中筛选获得新型胞外蛋白酶基因hly，发现该基因编码新型嗜盐古菌蛋白酶Hly无普遍认知的CTE；Hly与其他嗜盐古菌来源的胞外蛋白酶均为丝氨酸蛋白酶，但与之一致性低。因此新型嗜盐古菌胞外蛋白酶编码基因hly和新型嗜盐古菌胞外蛋白酶Hly均具有很高的研究价值。

(2)Hly具有优良的酶学特性，可以水解大分子蛋白质底物，同时对小分子肽也具有很好的催化作用；其对NaCl的耐受性尤为突出，在低盐到高盐范围内均具有很高的稳定性；在30～60℃下均具有较高酶活，在30℃和45℃下有很好的稳定性；在中性偏碱性的pH范围内具有很高活性和稳定性；可耐受多种金属离子、有机试剂和洗涤剂。具有优良性状的新型嗜盐古菌胞外蛋白酶Hly可应用于洗涤剂、废水处理、制药和环境修复等复杂、含盐的降解蛋白质的生产加工过程中。

附图说明

图1为基于Hly和其他相近蛋白酶的氨基酸序列构建的系统发育树。

图2为以质粒pET28a-hly为模板以引物hly-NcoI-F；hly-XhoI-R扩增目的片段(1206bp)的琼脂糖凝胶电泳分析图。

图3为经纯化复性后的Hly的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图。

图4为NaCl浓度对Hly催化活性的影响图。

图5为Hly对不同浓度NaCl的稳定性图。

图6为温度对Hly催化活性的影响图。

图7为Hly在不同温度下热稳定性图。

图8为pH对Hly催化活性的影响图。

图9为Hly在不同pH条件下稳定性图。

图10为不同金属离子对Hly催化活性的影响图。

图11为不同有机试剂和洗涤剂对Hly催化活性的影响图。

图12为不同蛋白酶抑制剂对Hly催化活性的影响图。PMSF为丝氨酸蛋白酶抑制剂；PCMB为半胱氨酸蛋白酶抑制剂；DTT为巯基蛋白酶抑制剂；pepstain A为天冬氨酸蛋白酶抑制剂；EDTA为金属蛋白酶抑制剂。

图13为Hly以偶氮酪蛋白为底物的动力学曲线图。

图14为Hly以四肽Suc-AAPF-pNA为底物的动力学曲线图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施实例对本发明做进一步说明。

实施例1：

新型嗜盐古菌胞外蛋白酶编码基因hly的获取；

基基于一株嗜盐古菌Haladaptatus sp.DYF 46(发明人分离自中国山东东营盐场，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，专利菌种保藏号：CGMCC 19759，保藏日期：2020.4.29)的全基因组、开放阅读框预测及基因注释结果，筛选疑似胞外蛋白酶基因。通过Blastp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对序列与数据库中已知水解酶基因序列的一致性。经数据库比对分析获得hly基因，大小为1191bp，碱基组成为238A(19.98％)、176T(14.78％)、395C(33.17％)和383G(32.16％)，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。编码蛋白大小为396个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

Hly氨基酸序列在GenBank中进行同源搜索结果显示其为Haladaptatus属的菌特有蛋白序列。其与已发表的SptA、SptC和Nep嗜盐古菌蛋白酶氨基酸序列的一致性分别为43.28％、33.33％和34.4％。系统发育分析表明，Hly以及Haladaptatus属内其他相近蛋白酶序列形成单独的分支，与已发表的SptA、SptC、Nep、172P1和R4等嗜盐古菌蛋白酶为不同分支(图1)。

综上所述，Hly应为嗜盐古菌来源蛋白酶中的一种新型蛋白酶。

实施例2：

hly的重组表达质粒的构建和诱导表达；

将本发明获得的基因hly克隆到表达载体上，构建重组表达菌株进行诱导表达。基于NCBI ORF Finder的ORF分析获得基因开放阅读框序列，设计扩增hly基因的上游引物hly-NcoI-F(5’-ATAccatggCAAGGAAAGCCAATGGCG-3’，NcoI)和下游引物hly-XhoI-R(5’-ATActcgagGTTGTCGCTGGAGTCGAG-3’，XhoI)，PCR扩增获得目的片段(1206bp)。采用酶切克隆的方法构建表达质粒，即用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切PCR产物，纯化后的片段与经NcoI和XhoI双酶切的质粒pET28a连接，得到重组质粒pET28a-hly，插入片段(NcoI和XhoI位点)的3’端含有6×His tag。CaCl₂转化法转化至E.coli DH5α中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒提取阳性克隆的质粒，以引物hly-NcoI-F；hly-XhoI-R确认阳性质粒(图2)由北京诺赛基因完成测序，鉴定为基因hly。将重组表达质粒转化E.coli BL21表达菌株中，构建表达重组菌株。将3mL重组表达菌液转接到100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至生长对数期(OD₆₀₀在0.55～0.65之间)，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导表达4h。低温离心收集菌体，用于蛋白酶Hly纯化复性。

上述限制性内切酶、T4 DNA连接酶购买自New England Biolabs；感受态细胞、pET28a质粒购买自上海生工；上述试剂盒购买自美国Axygen公司。

实施例3：

重组蛋白Hly纯化复性；

将低温离心收集菌体重悬于30mL细胞裂解液(8M尿素，10mM CaCl₂，50mM Tris-HCl，pH 8.0)中，在冰上进行超声波破碎处理。低温离心收集上清液。采用柱上复性方法(即镍亲和层析纯化蛋白的同时将蛋白酶处于高盐环境下体外复性)从上清液中获得成熟酶。具体操作如下：

1)10倍柱床体积(CV)的细胞裂解液中加入终浓度为2mM的β-巯基乙醇，平衡镍柱。

2)添加2mM终浓度β-巯基乙醇至上清液，上样。

3)加入5CV缓冲液I(2mMβ-巯基乙醇，8M尿素，40mM咪唑，10mM CaCl₂，50mM Tris-HCl，pH 8.0)洗脱杂蛋白。

4)加入5CV复性缓冲液(2M NaCl，10mM CaCl₂，50mM Tris-HCl，pH 8.0)，将镍柱置于37℃保温24h。

5)流尽复性缓冲液，加入5CV缓冲液II(2M NaCl，20mM咪唑，10mM CaCl₂，50mMTris-HCl，pH 8.0)洗脱杂蛋白。

6)加入5CV洗脱液I(2M NaCl，250mM咪唑，10mM CaCl₂，50mM Tris-HCl，pH 8.0)洗脱目的蛋白。

7)加入5CV洗脱液II(2M NaCl，500mM咪唑，10mM CaCl₂，50mM Tris-HCl，pH 8.0)清洗镍柱。再加入20CV ddH₂O清洗镍柱。最后5CV 20％乙醇溶液清洗镍柱，并将镍柱充满20％乙醇，于4℃保存。

8)收集所有目的蛋白样品，使用截留分子量为10kDa的Millipore超滤管浓缩样品，用Bradford法测定蛋白质浓度为1mg/mL以上。

9)所获得的蛋白利用凝胶过滤层析(superdex 200increase 10/300GL)进一步纯化蛋白，使用流动相为复性缓冲液(2M NaCl，10mM CaCl₂，50mM Tris-HCl，pH 8.0)。

10)所得目的蛋白进行SDS-PAGE检测。经复性纯化获得高纯度Hly(图3)，利用ExPAsy分子量预测工具(Compute pI/Mw tool)(https://web.expasy.org/compute_pi/)得到预测分子量为40.4kDa。

实施例4：

Hly的活性检测；

以偶氮酪蛋白为底物测定Hly的催化活性。具体操作：测定缓冲液为酶活测定缓冲液(2M NaCl，50mM Tris-HCl，pH 8.0)。以酶活测定缓冲液溶解0.2mM偶氮酪蛋白为反应底物，以酶活测定缓冲液稀释0.1μg纯酶。20μL的酶液和20μL底物于37℃反应1h，空白对照为20μL酶液于37℃孵育1h后再加入20μL底物。反应结束后加入40μL 10％TCA终止反应，静置30min，离心。上清液与1M NaOH以1:1比例混合后，采用紫外可见光分光光度计测定吸光值A₄₄₀，使用空白对照调零。以偶氮酪蛋白在该波长下的消光系数计算转化底物浓度，三次平行。一个酶活力单位定义为特定条件下每分钟转化lμmol偶氮酪蛋白所需要的酶量。2MNaCl、37℃且pH 8.0条件下测得的以偶氮酪蛋白为底物的蛋白酶比酶活为1430U/mg。

以四肽Suc-AAPF-pNA为底物测定Hly的催化活性。使用酶活测定缓冲液稀释0.1μg纯酶至300μL，并配制0.4mM Suc-AAPF-pNA底物。利用蛋白核酸分析仪DU 800，方法设置为kinetics/time，温度为37℃，以300μL缓冲液和300μL酶液为空白对照组；300μL底物和300μL酶液为实验组。迅速将比色皿放入槽中反应10min，记录反应斜率(初始反应速率)。通过Suc-AAPF-pNA 410nm波长下消光系数计算产物浓度。三次平行试验。一个酶活力单位定义为特定条件下每分钟转化1μM底物所需的酶量。2M NaCl、37℃且pH 8.0条件下测得的以Suc-AAPF-pNA为底物的Hly比酶活为4.48×10⁸U/mg。

上述底物购买自美国Axygen公司。

实施例5：

Hly最适反应条件分析；

以偶氮酪蛋白为底物测定Hly的最适反应条件。

酶活测定缓冲液适当稀释所得Hly至浓度为0.02mg/mL。取5μL(0.1μg)进行后续试验。蛋白酶Hly最适NaCl梯度在0.25～4M范围内测定。具体操作为：分别配制含0M和5.13MNaCl、50mM Tris-HCl pH 8.0的缓冲液，相互配比至NaCl浓度为0、0.286、0.857、1.429、2、2.571、3.143、3.714和4.286M，以上述各浓度分别配制0.2mM的偶氮酪蛋白底物溶液。最终，20μL的酶液(15μL缓冲液和5μL酶液)和20μL底物的反应体系NaCl终浓度为0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5和4M。分别设置各NaCl梯度下各自空白对照，37℃测定各梯度蛋白酶酶活(除酶活测定缓冲液中NaCl浓度不同外，其余方法同实施例4)，以最高酶活为100％计算其他梯度相对酶活，每组三次平行试验。结果表明最适NaCl浓度为0.5M(图4)。

最适反应温度在30～65℃范围内测定。具体操作为：配制含0.5M NaCl、50mMTris-HCl pH 8.0的缓冲液，以此溶液配制0.2mM的偶氮酪蛋白底物溶液，于30、35、40、45、50、55、60和65℃下测定各梯度蛋白酶酶活，并分别设置温度梯度下各自空白对照(除酶活测定缓冲液中NaCl浓度、反应温度不同外，其余方法同实施例4)，以最高酶活为100％计算其他梯度相对酶活，每组三次平行试验。结果表明最适温度为45℃(图6)。

最适反应pH在6.0～10.5范围内测定。具体操作为：分别以磷酸盐缓冲液(pH 6～7.5)、Tris-HCl缓冲液(pH 7.5～9)和CHES-NaOH缓冲液(pH 9～10.5)配制终浓度为0.5MNaCl的缓冲液，分别设置各pH梯度下各自空白对照，最适温度45℃测定各梯度蛋白酶酶活(除酶活测定缓冲液中NaCl浓度、pH以及反应温度不同外，其余方法同实施例4)，以最高酶活为100％计算其他梯度相对酶活，每组三次平行试验。结果表明最适pH为8.5和9(图8)。

Hly最适反应条件为0.5M NaCl、45℃以及pH 8.5/9。

实施例6：

Hly酶学稳定性分析；

以偶氮酪蛋白为底物测定Hly的酶学稳定性。

Hly的NaCl稳定性分析具体操作为：将蛋白酶分别于NaCl终浓度为0.25、2和4M的50mM Tris-HCl pH 8.0缓冲液中放置0、30和60min，设置各NaCl梯度下的空白对照，最适温度45℃测定各梯度蛋白酶酶活(除酶活测定缓冲液中NaCl浓度、反应温度不同外，其余方法同实施例4)，各盐浓度梯度下以最高酶活为100％计算其他时间下相对酶活，每组三次平行试验。Hly在高盐浓度下酶活虽降低，但具有很好的稳定性。其在0.25、2和4M NaCl浓度下，1h后几乎未丧失活性(图5)。

Hly的热稳定性分析具体操作为：NaCl终浓度为最适浓度0.5M的50mM Tris-HClpH 8.0缓冲液，将蛋白酶分别于30、40和60℃放置0、30和60min，设置各温度梯度下各自空白对照，45℃测定各梯度蛋白酶酶活(除酶活测定缓冲液中NaCl浓度、反应温度不同外，其余方法同实施例4)，各温度梯度下以最高酶活为100％计算其他时间下相对酶活，每组三次平行试验。在30和45℃下，1h后可以保持80％以上的活性，在60℃下可保持40％的活性，具有较好的稳定性(图7)。

Hly的pH稳定性分析具体操作为：将蛋白酶于NaCl终浓度为最适浓度0.5M，且pH6.0(磷酸盐缓冲液)、pH 8.0(Tris-HCl缓冲液)和pH 10.0(CHES-NaOH缓冲液)中放置0、30和60min，设置各pH梯度下各自空白对照，最适温度45℃测定各梯度蛋白酶酶活(除酶活测定缓冲液中NaCl浓度、pH以及反应温度不同外，其余方法同实施例4)，各pH梯度下以最高酶活为100％计算其他时间下相对酶活，每组三次平行试验。Hly在pH 8.0条件下1h后仍具有80％的活性，pH 6.0和10.0条件下1h后仍具有60％以上的活性，说明具有较好的pH稳定性(图9)。

金属离子对Hly活性影响的测定具体操作为：反应体系为NaCl终浓度0.5M、pH为8.5，其中添加不同的金属离子(Fe³⁺、K⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Sr²⁺、Ni²⁺)使其终浓度为10mM，阳性对照体系中以ddH₂O代替金属离子。分别设置阳性对照和实验组各自空白对照，45℃测定酶活(除酶活测定缓冲液中NaCl浓度、pH以及反应温度更改为最适条件外，其余方法同实施例4)，以阳性对照结果为100％酶活，比较含金属离子的反应体系的相对酶活，每组三次平行试验。Fe³⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺可以抑制Hly几乎所有活性，Ni²⁺下可以保持60％左右活性，而K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Sr²⁺、Ni²⁺对酶活并无影响，甚至略有促进作用(图10)。

有机溶剂和洗涤剂对Hly活性影响的测定具体操作为：反应体系为NaCl终浓度0.5M、pH为8.5，其中添加15％的甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、丙酮、DMSO、DMF、甘油、吐温20、吐温80、SDS和Triton X-100，阳性对照体系中ddH₂O代替有机试剂和洗涤剂。分别设置阳性对照和实验组各自空白对照，45℃测定酶活(除酶活测定缓冲液中NaCl浓度、pH以及反应温度更改为最适条件外，其余方法同实施例4)，以阳性对照结果为100％酶活，比较含有机试剂和洗涤剂体系的相对酶活，每组三次平行试验。结果表明Hly对乙醇、异丙醇、SDS较敏感，而可以很好的耐受测试的其余有机试剂，尤其Triton X-100对其酶活有促进作用。说明其具有很好地的机试剂耐受性。(图11)。

不同蛋白酶抑制剂对Hly活性影响的测定具体操作为：反应体系为NaCl终浓度0.5M、pH为8.5，其中添加终浓度为1mM的PMSF(丝氨酸蛋白酶抑制剂)、PCMB(半胱氨酸蛋白酶抑制剂)、DTT(巯基蛋白酶抑制剂)、pepstain A(天冬氨酸蛋白酶抑制剂)、EDTA(金属蛋白酶抑制剂)，阳性对照体系中ddH₂O代替抑制剂。分别设置阳性对照和实验组各自空白对照，45℃测定酶活(除酶活测定缓冲液中NaCl浓度、pH以及反应温度更改为最适条件外，其余方法同实施例4)，以阳性对照结果为100％酶活，比较含有抑制剂的相对酶活，每组三次平行试验。结果表明Hly在pepstain A和EDTA抑制作用下仍能保持大部分活性。而PMSF对Hly抑制效果最强，说明Hly为丝氨酸蛋白酶。PCMB(半胱氨酸抑制剂)和DTT(巯基蛋白酶抑制剂)抑制大部分酶活，推测与其氨基酸序列中包含的大量半胱氨酸相关(图12)。

实施例7：

Hly的酶促反应动力学分析；

测定偶氮酪蛋白和四肽Suc-AAPF-pNA两种底物的酶促反应动力学曲线。对于偶氮酪蛋白，反应体系为NaCl终浓度0.5M、pH为8.5，以0.1μg酶与终浓度为0.01～0.8mM偶氮酪蛋白底物45℃反应30min，测定吸光度A₄₄₀，除酶活测定缓冲液中NaCl浓度、pH和反应温度更改为最适条件，以及底物浓度更改外，其余步骤同实施例4。

对于Suc-AAPF-pNA，以0.1μg酶测定酶活，底物浓度范围为终浓度0.01～1.5mM，反应缓冲液为NaCl终浓度0.5M、pH为8.5。反应体系包括酶液和底物各300μL，利用DU800(Beckman，美国)测定波长410nm、45℃下10min中反应速率，通过Suc-AAPF-pNA 410nm波长下消光系数计算产物浓度。每组三次平行试验。除酶活测定缓冲液中NaCl浓度、pH和反应温度更改为最适条件，以及底物浓度更改外，其余步骤同实施例4。

根据米氏方程(Michael-Menten equation)计算两种底物下Hly的动力学常数K_m和最大反应速率V_max。Hly以偶氮酪蛋白为反应底物最大反应速率V_max为6166μM/min/mg，动力学常数K_m为0.01831mM(图13)。Hly以Suc-AAPF-pNA为反应底物最大反应速率V_max为3.05×10⁹μM/min/mg，动力学常数K_m为0.319mM(图14)。

说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

hly核苷酸序列：Seq ID No.1

atggcaaggaaagccaatggcgtatcacgacgaaatattctcaaactaaccggcggttcactggcaacggccagtgccaccggtctggcctcggcggcaccgacggacaaagtggaggtgaacgtcggattcaacagcgcacgtggtcgtgcgatgactcggagcagtgcggacgacgtcgtccgcgagttcaactccatcgatgcgatgacgattcgcgttccgaagcgtgcggcgacggcactggaaaagaacccgaacatccgctacgtggaggagaacgggacgatggaagcgctcgcccagacgacgccgtggggcgtcgaccgcgtggatgccgacgtcgcacacgacaacggtgacacgggtgcgggtgccgacatcgccatcatcgacacgggcatcgacgacgaccacccggacctgcagtcgaacgtcggcgcaggaaaatcgttcgtctcttgcgggagcggcgggttcaccgggaactgtctcttctacggcaacgacaactcctgcaacgattcgtggtccgacgacaacaaccacggcacccactgcgccggtatcgcgaacggcgtggacaacgatcagggcgtcgtcggcgtctcgacgcaagcgacgctccacgcggtaaaggttctcgactgcgccggcagcggaacgttctccgacatcgcggccggcgtcgaatacgtcgccgaccaaggctgggacgtcgccagcatgagcctcggcgggtcatccggttcgcaggcgcttcacgacgcgattcagtacgcctacgacgcgggcgtcgtcctcgtggcggcggcggggaacgacggccagtgtaccgactgcgtcggctacccggcggcgtacgaggagaccgttacggtcgcgtcctcgaacagcgacgacgagcagtcctcgttctccagtcagggtcccgaggtcaacatcatcgcacccggtacggacatctattcgaccgttcccggtggctacgacacctactccggcacgtcgatggcgacgccgcacgtcgccggtgccgccggtcaactcatcgcgcagggctactcggcccgcgacgcggagagccgactcctcgatacggccgaggacctcggcctcccgagcaacgaacagggcagcggcctcctcgacgtcgccgcggcgctcggcctcgactccagcgacaactga

Hly氨基酸序列：Seq ID No.2

MARKANGVSRRNILKLTGGSLATASATGLASAAPTDKVEVNVGFNSARGRAMTRSSADDVVREFNSIDAMTIRVPKRAATALEKNPNIRYVEENGTMEALAQTTPWGVDRVDADVAHDNGDTGAGADIAIIDTGIDDDHPDLQSNVGAGKSFVSCGSGGFTGNCLFYGNDNSCNDSWSDDNNHGTHCAGIANGVDNDQGVVGVSTQATLHAVKVLDCAGSGTFSDIAAGVEYVADQGWDVASMSLGGSSGSQALHDAIQYAYDAGVVLVAAAGNDGQCTDCVGYPAAYEETVTVASSNSDDEQSSFSSQGPEVNIIAPGTDIYSTVPGGYDTYSGTSMATPHVAGAAGQLIAQGYSARDAESRLLDTAEDLGLPSNEQGSGLLDVAAALGLDSSDN

序列表

<110> 江苏大学

<120> 一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1191

<212> DNA

<213> 嗜盐古菌DYF 46(Haladaptatus sp)

<400> 1

atggcaagga aagccaatgg cgtatcacga cgaaatattc tcaaactaac cggcggttca 60

ctggcaacgg ccagtgccac cggtctggcc tcggcggcac cgacggacaa agtggaggtg 120

aacgtcggat tcaacagcgc acgtggtcgt gcgatgactc ggagcagtgc ggacgacgtc 180

gtccgcgagt tcaactccat cgatgcgatg acgattcgcg ttccgaagcg tgcggcgacg 240

gcactggaaa agaacccgaa catccgctac gtggaggaga acgggacgat ggaagcgctc 300

gcccagacga cgccgtgggg cgtcgaccgc gtggatgccg acgtcgcaca cgacaacggt 360

gacacgggtg cgggtgccga catcgccatc atcgacacgg gcatcgacga cgaccacccg 420

gacctgcagt cgaacgtcgg cgcaggaaaa tcgttcgtct cttgcgggag cggcgggttc 480

accgggaact gtctcttcta cggcaacgac aactcctgca acgattcgtg gtccgacgac 540

aacaaccacg gcacccactg cgccggtatc gcgaacggcg tggacaacga tcagggcgtc 600

gtcggcgtct cgacgcaagc gacgctccac gcggtaaagg ttctcgactg cgccggcagc 660

ggaacgttct ccgacatcgc ggccggcgtc gaatacgtcg ccgaccaagg ctgggacgtc 720

gccagcatga gcctcggcgg gtcatccggt tcgcaggcgc ttcacgacgc gattcagtac 780

gcctacgacg cgggcgtcgt cctcgtggcg gcggcgggga acgacggcca gtgtaccgac 840

tgcgtcggct acccggcggc gtacgaggag accgttacgg tcgcgtcctc gaacagcgac 900

gacgagcagt cctcgttctc cagtcagggt cccgaggtca acatcatcgc acccggtacg 960

gacatctatt cgaccgttcc cggtggctac gacacctact ccggcacgtc gatggcgacg 1020

ccgcacgtcg ccggtgccgc cggtcaactc atcgcgcagg gctactcggc ccgcgacgcg 1080

gagagccgac tcctcgatac ggccgaggac ctcggcctcc cgagcaacga acagggcagc 1140

ggcctcctcg acgtcgccgc ggcgctcggc ctcgactcca gcgacaactg a 1191

<210> 2

<211> 396

<212> PRT

<213> 嗜盐古菌DYF 46(Haladaptatus sp)

<400> 2

Met Ala Arg Lys Ala Asn Gly Val Ser Arg Arg Asn Ile Leu Lys Leu

1 5 10 15

Thr Gly Gly Ser Leu Ala Thr Ala Ser Ala Thr Gly Leu Ala Ser Ala

20 25 30

Ala Pro Thr Asp Lys Val Glu Val Asn Val Gly Phe Asn Ser Ala Arg

35 40 45

Gly Arg Ala Met Thr Arg Ser Ser Ala Asp Asp Val Val Arg Glu Phe

50 55 60

Asn Ser Ile Asp Ala Met Thr Ile Arg Val Pro Lys Arg Ala Ala Thr

65 70 75 80

Ala Leu Glu Lys Asn Pro Asn Ile Arg Tyr Val Glu Glu Asn Gly Thr

85 90 95

Met Glu Ala Leu Ala Gln Thr Thr Pro Trp Gly Val Asp Arg Val Asp

100 105 110

Ala Asp Val Ala His Asp Asn Gly Asp Thr Gly Ala Gly Ala Asp Ile

115 120 125

Ala Ile Ile Asp Thr Gly Ile Asp Asp Asp His Pro Asp Leu Gln Ser

130 135 140

Asn Val Gly Ala Gly Lys Ser Phe Val Ser Cys Gly Ser Gly Gly Phe

145 150 155 160

Thr Gly Asn Cys Leu Phe Tyr Gly Asn Asp Asn Ser Cys Asn Asp Ser

165 170 175

Trp Ser Asp Asp Asn Asn His Gly Thr His Cys Ala Gly Ile Ala Asn

180 185 190

Gly Val Asp Asn Asp Gln Gly Val Val Gly Val Ser Thr Gln Ala Thr

195 200 205

Leu His Ala Val Lys Val Leu Asp Cys Ala Gly Ser Gly Thr Phe Ser

210 215 220

Asp Ile Ala Ala Gly Val Glu Tyr Val Ala Asp Gln Gly Trp Asp Val

225 230 235 240

Ala Ser Met Ser Leu Gly Gly Ser Ser Gly Ser Gln Ala Leu His Asp

245 250 255

Ala Ile Gln Tyr Ala Tyr Asp Ala Gly Val Val Leu Val Ala Ala Ala

260 265 270

Gly Asn Asp Gly Gln Cys Thr Asp Cys Val Gly Tyr Pro Ala Ala Tyr

275 280 285

Glu Glu Thr Val Thr Val Ala Ser Ser Asn Ser Asp Asp Glu Gln Ser

290 295 300

Ser Phe Ser Ser Gln Gly Pro Glu Val Asn Ile Ile Ala Pro Gly Thr

305 310 315 320

Asp Ile Tyr Ser Thr Val Pro Gly Gly Tyr Asp Thr Tyr Ser Gly Thr

325 330 335

Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala Gly Gln Leu Ile Ala

340 345 350

Gln Gly Tyr Ser Ala Arg Asp Ala Glu Ser Arg Leu Leu Asp Thr Ala

355 360 365

Glu Asp Leu Gly Leu Pro Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Leu Leu Asp

370 375 380

Val Ala Ala Ala Leu Gly Leu Asp Ser Ser Asp Asn

385 390 395

Claims

1.一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)构建hly-pET28a重组表达质粒：首先基于嗜盐古菌(Haladaptatus sp.)DYF 46的基因组获得一种胞外蛋白酶编码基因hly，进一步设计含有酶切位点的目的片段引物，利用常规PCR技术扩增目的片段hly；通过分子克隆技术将hly连接到载体上构建重组质粒；所述载体为大肠杆菌表达载体pET28a；所述嗜盐古菌(Haladaptatus sp.)DYF 46保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为CGMCC 19759；

(2)重组质粒转化原核生物宿主，诱导表达：将步骤(1)得到的重组质粒转化原核生物宿主，得到转化后的重组宿主细胞；所述原核生物宿主为E.coli BL21(DE3)；

(3)收集步骤(2)诱导表达后的菌体于细胞裂解液中进行重悬，重悬后超声破碎细胞，离心后收集上清液，用于重组蛋白纯化；采用镍亲和层析纯化蛋白结合柱上复性方法获得成熟酶；最后利用凝胶过滤层析进一步纯化蛋白，获得高纯度Hly。

2.根据权利要求1所述的一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述卡那霉素在LB液体培养基中的终浓度为50μg/mL。

3.根据权利要求1所述的一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述摇瓶培养的温度为37℃。

4.根据权利要求1所述的一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述一定OD₆₀₀值为0.55～0.65；所述添加IPTG诱导剂的终浓度为0.5mM。

5.根据权利要求1所述的一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述继续培养一段时间为4～5h，温度为37℃；所述低温为0～4℃。

6.根据权利要求1所述的一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述获得成熟酶的具体操作为：首先20倍柱床体积的细胞裂解液中加入终浓度为2mM的β-巯基乙醇，用于平衡镍柱；于上清液中加入终浓度为2mM的β-巯基乙醇，上样；然后使用缓冲液I洗脱杂蛋白；在镍柱中加入5倍柱床体积的复性缓冲液，并将镍柱置于37℃保温24h；流尽复性缓冲液后，缓冲液II洗脱杂蛋白；再加入5倍柱床体积的洗脱液I得到成熟酶，记为Hly。

7.根据权利要求6所述的一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述细胞裂解液成分为8M尿素，10mM CaCl₂，50mM Tris-HCl，pH 8.0；所述缓冲液I成分为2mMβ-巯基乙醇，8M尿素，40mM咪唑，10mM CaCl₂，50mM Tris-HCl，pH 8.0；所述复性缓冲液成分为2M NaCl，10mM CaCl₂，50mM Tris-HCl，pH 8.0；所述缓冲液II成分为2M NaCl，20mM咪唑，10mM CaCl₂，50mM Tris-HCl，pH 8.0；所述洗脱液I成分为2M NaCl，250mM咪唑，10mM CaCl₂，50mM Tris-HCl，pH 8.0。

8.根据权利要求1所述的一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述凝胶过滤层析所用的流动相为复性缓冲液。

9.根据权利要求1～8任意一项所述的方法制备的嗜盐古菌胞外蛋白酶应用于催化蛋白类底物水解的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述蛋白类底物包括对偶氮酪蛋白为代表的大分子蛋白质底物和小分子四肽底物。