CN110862979A

CN110862979A - 碱性蛋白酶的突变体及其应用

Info

Publication number: CN110862979A
Application number: CN202010062139.4A
Authority: CN
Inventors: 张大伟; 付刚
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2020-01-20
Filing date: 2020-01-20
Publication date: 2020-03-06
Anticipated expiration: 2040-01-20
Also published as: CN110862979B

Abstract

本发明公开的碱性蛋白酶突变体，其相对于原始氨基酸序列，其在第113位氨基酸由Ile变为Ala，或更进一步地第140位氨基酸由Ile变为Glu。通过将突变体编码基因分别构建了表达所述突变体的重组菌枯草芽孢杆菌，其发酵上清液在pH7.0条件下的酶活分别为5673 U/mL和6733 U/mL，比表达野生型碱性蛋白酶subC的枯草芽孢杆菌酶活分别提高了130％和154％。

Description

碱性蛋白酶的突变体及其应用

技术领域

发明属于生物技术领域和蛋白质工程领域，具体涉及一种碱性蛋白酶突变体蛋白。

背景技术

碱性蛋白酶(alkaline protease)指在碱性条件下（pH在9～11范围内）能够水解蛋白质肽键的酶，其主要成分是一种内切蛋白酶，催化部位为丝氨酸，广泛应用于洗涤剂、食品、医疗、酿造、丝绸、制革等行业。目前所采用的碱性蛋白酶多是经细菌原生质体诱变方法培育的来源于枯草芽孢杆菌2709通过深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，属于一种丝氨酸碱性蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力。生产工艺是采用微滤超滤膜分离、喷雾干燥或真空冷冻干燥等先进技术。碱性蛋白酶是目前市场上流行的洗涤添加剂，能大幅度提高洗涤去污能力，特别对血渍、汗渍、奶渍、油渍等蛋白类污垢,具有独特的洗涤效果，是工业用酶中占据比例最大的酶类，约占全世界每年总销售量的 60％左右。而在生产中，尤其是粉状洗涤剂用的颗粒碱性蛋白酶的质量要求为无粉尘、安全卫生；同洗涤剂相容性好；在洗涤剂中稳定性好等。因此，还需要开发性能列好，适用性更强的碱性蛋白酶。

定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向编码目的蛋白的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。体外定点突变技术是当前生物、医学各领域研究中的一种重要实验手段，是改造、优化基因的便捷方案，也是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。近几年酶的定点突变技术应用主要集中于提高酶的催化活性、改善底物特异性、提高热稳定性、对映立体选择等方面。酶的定点突变技术为酶的结构和功能开辟了崭新的途径。比如，通过使碱性蛋白酶突变而提升其比活性或稳定性等，从而提高其清洁性能的研究(日本专利特开2010-273673号公报、日本专利第5202690号公报)。例如CN109312323A公开了碱性蛋白酶的突变体是将亲本碱性蛋白酶的氨基酸序列中的第294位上的氨基酸残基取代为苏氨酸而获得，因而提高了比活性。CN105176951A以来源于克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶aprE为基础，通过突变获得三种突变体，比亲本的活性提高42％、180％和130％。

因此，在对具体的蛋白进行突变时，其突变位点的选择，突变方向的确定往往具有事先难以预期性或不可预料性，尤其对于碱性蛋白酶，现有技术对其酶的结构与功能关系认知比较有限，因而也就不能事先通过理论分析获得具有预期功能性状的蛋白突变体，而为了能够获得性能向期望方向的突变，需要进行前期探索。

发明内容

本发明针对碱性蛋白酶进行了深入的研究，最终通过找到合适的突变位点和具体的替换氨基酸，由地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis) 碱性蛋白酶基因 subC 的成熟肽出发，最终获得酶活力得到显著提高的碱性蛋白酶突变体。

本发明一方面提供一种碱性蛋白酶突变体，是在亲本氨基酸序列为 SEQ ID NO:1的碱性蛋白酶基础上，其第 113 位氨基酸由 Ile 变为 Ala，突变体的氨基酸序列为SEQID NO:2。

进一步地，本发明提供一种碱性蛋白酶突变体，是在亲本氨基酸序列为 SEQ IDNO:1 的碱性蛋白酶基础上，其第 113 位氨基酸由 Ile 变为 Ala，且第 140 位氨基酸由Ile 变为 Glu（其也就是在氨基酸序列为 SEQ ID NO:2 的碱性蛋白酶的基础上，进一步将第 140 位氨基酸由 Ile 变为 Glu），突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

本发明另一方面提供一种碱性蛋白酶突变体编码基因，其编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。

进一步地，本发明提供携带有上述的碱性蛋白酶突变体的编码基因的重组表达载体。

更进一步地，本发明提供转化/转染上述的重组表达载体的重组宿主细胞。优选地，所述重组宿主细胞，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

再一方面，本发明还提供所述的碱性蛋白酶突变体作为洗涤剂的添加剂的应用。进而，本发明也提供一种含有上述的碱性蛋白酶突变体的洗涤剂组合物。该洗剂组合物可为粉末洗涤剂组合物，但优选为液体洗涤剂组合物。其中，所述的碱性蛋白酶突变体以发酵粗酶液，或纯化的形式加入洗涤剂组合物中。

本发明以来源于地衣芽孢杆菌的碱性蛋白酶 subC为基础，通过定点突变技术获得了两个碱性蛋白酶突变体 subCM1 和 subCM2，并在枯草芽孢杆菌中对上述突变体进行了发酵，其发酵上清液酶活分别为5673 U/mL 和 6733 U/mL，比表达野生型碱性蛋白酶subC 的枯草芽孢杆菌酶活（4356 U/mL）分别提高了130％和 154％，其具有更广泛的用途。

附图说明

图1：碱性蛋白酶表达载体的质粒图谱；

图2：碱性蛋白酶突变体的相对酶活柱形图。

具体实施方式

本发明的以下实施例和附图仅说明实现本发明的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本发明的限制，任何在不脱离本发明的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本发明的保护范围之内。

本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，如J. 萨姆布鲁克 (Sambrook) 等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

对于本发明所涉及的术语及相关测定方法解释如下：

（1）蛋白酶酶活测定方法：采用中华人民共和国国家标准蛋白酶制剂测定方法(GB/T25327-2009)。

（2）酶活单位的定义：1g 固体酶粉 ( 或 1mL 液体酶 )，在一定温度和 pH 值条件下，1min 水解酪蛋白产生 1μg 酪氨酸，即为 1 个酶活力单位，以 U/g(U/mL) 表示。

（3）碱性蛋白酶运用福林法测定蛋白酶的活力，使用到的溶液包括：福林使用溶液( 一份市售福林溶液与两份水混合，摇匀 )，碳酸钠溶液 (42.4g/L)，三氯乙酸(65.4g/L)，梯度 pH 值缓冲液，酪蛋白溶液 (10.0g/L)。反应过程如下：试管中加入 1mL 酶液，40℃温浴2min，加入酪蛋白溶液 1mL，摇匀后 40℃温浴 10min，加入 2mL 三氯乙酸溶液，摇匀(空白对照先加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液)。取出静止10min，慢速定性滤纸过滤。取1mL 滤液，加碳酸钠溶液 5mL，加福林试剂使用溶液1mL，40℃显色 20min，于 680nm 波长，用10mm 比色皿测定吸光度。

（4）碱性蛋白酶突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示碱性蛋白酶突变体中突变的氨基酸。如 Ile113Ala，表示位置 113 的氨基酸由亲本碱性蛋白酶的Ile 替换成Ala，位置的编号对应于附件序列表SEQ ID NO:1中的编号。如 Ile113Ala/Ile140Glu，表示位置 113 和位置140 的氨基酸都发生了突变。

实施例1 碱性蛋白酶subC表达载体及重组菌株的构建

以pMA5质粒作为模板，通过载体上游引物5’-gccttggcgcaagtagctagcgaacctctcattaaagcggacaa-3’（SEQ ID NO:4）和载体下游引物5’-ttgtccgctttaaagctagcatatcgaagtgagggcgccaaggc-3’（SEQ ID NO:5）PCR扩增载体DNA序列，从而获得待克隆的载体骨架序列。以地衣芽孢杆菌基因组DNA作为模板，通过片段上游引物5’-agctatgcgatgctaggcatgatgcgcaaaaaaagcttctg-3’ （SEQ ID NO:6）和片段下游引物5’-gtgacgatggtcagctgtagctgggcggcagcttcaacgt-3’ （SEQ ID NO:7）PCR扩增subC完整基因核苷酸序列（GenBank:X03341.1），从而获得携带信号肽及成熟肽的碱性蛋白酶序列，其编码的氨基酸序列为SEQID NO：1。

上述PCR扩增条件为：94℃ 10min ；94℃ 60s，58℃ 60s，72℃ 2min，30 个循环；72℃ 10min。利用 E.Z.N.A.Gel Extraction Kit 回收 PCR 扩增产物。将回收获得的酶基因序列及载体骨架序列重叠延伸 PCR 形成多聚体，扩增体系如下：5×Phusion HFBuffer 10μL，2.5mM dNTPs 8μL，基因片段(subC片段)4μL，载体骨架片段(pMA5)6μL，Phusion DNA Polymerase 1μL，ddH₂O 21μL。扩增条件为 98℃ 10min ；98℃ 10s，72℃3min，20 个循环；98℃ 10s，72℃ 6min，15 个循环；72℃ 10min。将多聚体转化Bacillus subtilis 1A751宿主菌，筛选阳性转化子，得到表达野生型碱性蛋白酶subC的重组菌株，命名为枯草芽孢杆菌subC(Bacillus subtilis subC)。提取枯草芽孢杆菌subC里的质粒，将其命名为 pMA5-subC(含有野生型subC基因)，其质粒图谱如附图 1 所示。

上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1A751是利用感受态方法进行转化，具体转化过程如下：将新鲜活化的 B. subtilis 1A751 由 LB( 胰蛋白胨 1％，酵母粉0.5％，NaCl 1％) 平板接种到 5ml GM Ⅰ(GM I 配制方法为：1*最低盐溶液 95.6ml，20％葡萄糖 2.5ml，5％水解酪蛋白 0.4ml，10％酵母粉汁 1ml ；其中 1*最低盐溶液的配制方法为：K₂HPO₄ 14g/L，KH₂PO₄ 6g/L，(NH4)₂SO₄ 2g/L，柠檬酸三钠 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，在蒸馏水中依次溶解溶液，在 30℃、125rpm 振荡培养过夜。第二天取 2ml 转接到 18mlGMⅠ中，37℃、250rpm培养 3.5h。再取 10ml 上一步骤的培养液转接到 90ml GM Ⅱ (GMII配制方法为：1* 最低盐溶液96.98ml，20％葡萄糖2.5ml，5％水解酪蛋白0.08ml，10％酵母粉汁0.04ml，1M MgCl₂ 0.25ml，1M CaCl₂ 0.05ml 中，37℃、125rpm 培养 90min 后，5000g、10min 离心收集菌体。用10ml 原培养液上清液轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞。然后在 0.5ml 感受态中加入适量 DNA 于 37℃、200rpm 振荡培养 30min 后涂板，再在 37℃培养过夜，次日检查和验证转化子。

实施例2 利用点突变技术构建碱性蛋白酶突变体

通过对来源于地衣芽孢杆菌的碱性蛋白酶subC基因进行进化分析，比对其氨基酸序列与其他同源性较高的碱性蛋白酶的氨基酸序列，寻找潜在的具有改善其酶学性质的氨基酸突变位点。具体是选择ClustalX比对方法作为寻找突变位点的方法。ClustalX是Clustal多重序列比对程序的Windows版本。Clustal X可以为进行多重序列和轮廓比对和分析结果提供一个整体的环境，采用多色彩的模式可以在比对中加亮保守区的特征。本发明人选取了来源于细菌的数十条碱性蛋白酶氨基酸序列，将其导入ClustalX软件中，利用多重序列比对工具进行序列动态比对，采用ESPript方法进行着色增强。通过生成的比对结果进行分析，选择在进化中多种碱性蛋白酶序列保守性较差即突变发生频率较高的氨基酸位点进行突变，同时通过对上述候选突变位点结合PDB数据库三维结构辅助分析，最终选择了113位点和140位点的氨基酸残基进行突变。

利用点突变技术向地衣芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶subC基因中引入核苷酸突变。第一个突变使得其编码的多肽发生Ile113Ala位点的突变（SEQ ID NO：2）。其PCR的扩增体系为：5×Phusion HF Buffer 10μL，2.5mM dNTPs 8μL，模板DNA pMA5-subC质粒（100ng/μL）1μL，Phusion DNA Polymerase 1μL，ddH₂O 28μL，上游突变引物5’-gccttggcgcaaaccgttccttacggcgaacctctcattaaagcggacaa-3’（SEQ ID NO:8），下游突变引物5’-ttgtccgctttaatgagaggttcgccgtaaggaacggtttgcgccaaggc-3’（SEQ ID NO:9）。反应条件为：98℃10min；98℃ 10s，55℃ 20s，72℃ 3min，20个循环；72℃ 10min。将PCR 产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到阳性转化子后通过E.Z.N.A. Plasmid Extraction Kit提取质粒，命名为pMA5-subCM1。

第二个突变使得其编码的多肽进一步发生Ile140Glu位点的突变，即包括Ile113Ala/Ile140Glu叠加位点突变。其PCR的扩增体系为：5×Phusion HF Buffer 10μL，2.5mM dNTPs 8μL，模板DNA pMA5-subCM1质粒（100ng/μL）1μL，Phusion DNA Polymerase 1μL，ddH₂O 28μL，上游突变引物5’- gccgtcctggatacaggagaacaagcttctcatccggactt-3’（SEQ ID NO:10），下游突变引物5’- aagtccggatgagaagcttgttctcctgtatccaggacggc-3’（SEQ ID NO:11）。反应条件为：98℃ 10min；98℃ 10s，55℃ 20s，72℃ 3min，20个循环；72℃ 10min。将PCR 产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到阳性转化子后通过E.Z.N.A.Plasmid Extraction Kit提取质粒，命名为pMA5-subCM2。将质粒pMA5-subCM1和pMA5-subCM2转化Bacillus subtilis 1A751宿主菌，筛选阳性转化子，得到表达野生型碱性蛋白酶subC突变体的重组菌株，分别命名为枯草芽孢杆菌subCM1(Bacillus subtilis subCM1)和subCM2(Bacillus subtilis subCM2)。

实施例3 碱性蛋白酶突变体的评价

1、摇瓶发酵

将上述构建的2 株碱性蛋白酶突变体重组菌株 (subCM1和subCM2) 和对照菌枯草芽孢杆菌 subC，分别接种于 50mL 种子培养基 (酵母浸粉 0.5％，胰蛋白胨 0.5％，葡萄糖1％，K₂HPO₄ 1.8％，卡纳霉素 25μg/mL) 中，34℃、210rpm 振荡培养 8h。然后分别取 2.5mL发酵液接种到 50mL发酵培养基 (酵母粉 1～2％，豆饼粉 2～5％，麦芽糊精 5～10％，柠檬酸钠0.1～0.5％，CaCl₂ 0.1～0.5％，MgSO₄ 0.1～0.5％，K₂HPO₄ 0.5～2％) 中，34℃、250rpm 振荡培养 72h；离心取上清液。

2、酶活测定

采用中华人民共和国国家标准蛋白酶制剂测定方法 (GB/T 25327-2009)，在pH7.0 条件下，分别检测上述2 株重组菌株 (subCM1和subCM2) 和对照菌枯草芽孢杆菌subC发酵上清液的碱性蛋白酶酶活，其发酵上清液酶活分别为4356 U/mL，5673 U/mL 和 6733 U/mL，比表达野生型碱性蛋白酶 subC 的枯草芽孢杆菌酶活分别提高到130％和 154％，酶活数据见图2。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 碱性蛋白酶的突变体及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 379

<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis

<400> 1

Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met

1 5 10 15

Leu Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro

20 25 30

Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val

35 40 45

Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys

50 55 60

Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp

65 70 75 80

Lys Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val

85 90 95

Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly

100 105 110

Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly

115 120 125

Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His

130 135 140

Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala

145 150 155 160

Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val

165 170 175

Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Val

180 185 190

Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Thr Tyr

195 200 205

Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp

210 215 220

Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys

225 230 235 240

Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala

245 250 255

Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro

260 265 270

Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser

275 280 285

Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala

290 295 300

Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Ser Thr Tyr Ala Thr

305 310 315 320

Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala

325 330 335

Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn

340 345 350

Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly

355 360 365

Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln

370 375

<210> 2

<211> 379

<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis

<400> 2

Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met

1 5 10 15

Leu Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro

20 25 30

Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val

35 40 45

Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys

50 55 60

Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp

65 70 75 80

Lys Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val

85 90 95

Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly

100 105 110

Ala Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly

115 120 125

Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His

130 135 140

Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala

145 150 155 160

Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val

165 170 175

Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Val

180 185 190

Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Thr Tyr

195 200 205

Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp

210 215 220

Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys

225 230 235 240

Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala

245 250 255

Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro

260 265 270

Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser

275 280 285

Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala

290 295 300

Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Ser Thr Tyr Ala Thr

305 310 315 320

Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala

325 330 335

Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn

340 345 350

Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly

355 360 365

Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln

370 375

<210> 3

<211> 379

<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis

<400> 3

Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met

1 5 10 15

Leu Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro

20 25 30

Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val

35 40 45

Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys

50 55 60

Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp

65 70 75 80

Lys Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val

85 90 95

Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly

100 105 110

Ala Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly

115 120 125

Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Glu Gln Ala Ser His

130 135 140

Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala

145 150 155 160

Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val

165 170 175

Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Val

180 185 190

Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Thr Tyr

195 200 205

Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp

210 215 220

Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys

225 230 235 240

Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala

245 250 255

Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro

260 265 270

Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser

275 280 285

Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala

290 295 300

Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Ser Thr Tyr Ala Thr

305 310 315 320

Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala

325 330 335

Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn

340 345 350

Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly

355 360 365

Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln

370 375

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gccttggcgc aagtagctag cgaacctctc attaaagcgg acaa 44

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

ttgtccgctt taaagctagc atatcgaagt gagggcgcca aggc 44

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

agctatgcga tgctaggcat gatgcgcaaa aaaagcttct g 41

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

gtgacgatgg tcagctgtag ctgggcggca gcttcaacgt 40

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

gccttggcgc aaaccgttcc ttacggcgaa cctctcatta aagcggacaa 50

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

ttgtccgctt taatgagagg ttcgccgtaa ggaacggttt gcgccaaggc 50

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

gccgtcctgg atacaggaga acaagcttct catccggact t 41

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

aagtccggat gagaagcttg ttctcctgta tccaggacgg c 41

Claims

1.一种碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述的碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列如SEQID NO:2或SEQ ID NO:3所示。

2.如权利要求1所述的碱性蛋白酶突变体的编码基因。

3.一种重组表达载体，其特征在于所述的重组表达载体携带有编码权利要求2所述的碱性蛋白酶突变体的编码基因。

4.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述的重组宿主细胞为转化/转染有权利要求2 所述的重组表达载体。

5.如权利要求4所述的重组宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

6.如权利要求1所述的碱性蛋白酶突变体作为洗涤剂的添加剂的应用。

7.含有如权利要求1所述的碱性蛋白酶突变体的洗涤剂组合物。

8.如权利要求7所述的洗涤剂组合物，其特征在于，其为液体组合物。

9.如权利要求7或8所述的洗涤剂组合物，其特征在于，所述的碱性蛋白酶突变体以发酵粗酶液，或纯化的形式加入洗涤剂组合物中。