JP2009171870A - トリプシン様酵素 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明のトリプシン様酵素は、IV型コラーゲン、I型コラーゲン、およびゼラチンに対する加水分解活性を有し、好適には、以下の性質:(1)至適反応pH:pH8.0〜9.0;(2)至適反応温度:カルシウムイオン不在下で50℃、およびカルシウムイオン存在下で55℃;(3)熱安定性:90%熱不活性化温度として、カルシウムイオン不在下で35℃、およびカルシウムイオン存在下で50℃;および(4)フェニルメチルスルホニルフルオリドによって阻害される;を有する。また、本発明のトリプシン様酵素は、ストレプトマイセス・オミヤエンシス(Streptomyces omiyaensis)84A06(FERM P−21453)株により産生される。
【選択図】図8
Description
(1)至適反応pH:pH8.0〜9.0;
(2)至適反応温度:カルシウムイオン不在下で50℃、およびカルシウムイオン存在下で55℃;
(3)熱安定性:90%熱不活性化温度として、カルシウムイオン不在下で35℃、およびカルシウムイオン存在下で50℃;および
(4)フェニルメチルスルホニルフルオリドによって阻害される;
を有する。
(A)配列表の配列番号2の1位から261位までのアミノ酸配列、
(B)配列表の配列番号2の1位から261位までのアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列、および
(C)配列表の配列番号2の1位から261位までのアミノ酸配列に対し、配列同一性が、少なくとも85%であるアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
(a)配列表の配列番号2の1位から261位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(b)配列表の配列番号2の1位から261位までのアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(c)配列表の配列番号2の1位から261位までのアミノ酸配列に対し、配列同一性が、少なくとも85%であるアミノ酸配列をコードする塩基配列、および
(d)配列表の配列番号2の1位から261位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列のアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする塩基配列、
からなる群より選択される塩基配列を有する。
コロニーサイズ:φ4.0〜5.0mm
コロニー表面の形状:綿状(72時間培養)および湿潤状(1週間以上培養)
コロニーの色調:表面(気菌糸)灰色および裏面(基生菌糸)黄土色
水溶性色素産生:−
なお、ISP培地No.3で生育させた場合、表面:淡黄色(湿潤)および基底:淡黄色(綿状);ISP培地No.4で生育させた場合、表面:白色(綿状)および基底:白色;およびISP培地No.5で生育させた場合、表面:白色(綿状)および基底:淡黄色であった。
気菌糸の形状:分岐あり、幅0.8〜0.9μm
ゼラチンの液化: +
デンプンの加水分解: +
硝酸還元反応: +
脱脂粉乳のペプトン化・凝固: ペプトン化
生育温度の範囲(℃):
20 +
25 +
30 +
37 +
45 −
耐塩性(%):
4.0 +
7.0 −
10.0 −
13.0 −
炭素源の利用性:
ISP培地No.9 −
グルコース +
L−ラムノース +
D−マンニトール −
D−フラクトース +
L−アラビノース −
ラフィノース −
シュクロース +
D−キシロース +
イノシトール −
メラニン様色素産生:
ISP培地No.6 −
ISP培地No.7 −
(A)配列表の配列番号2の1位から261位までのアミノ酸配列、
(B)配列表の配列番号2の1位から261位までのアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列、および
(C)配列表の配列番号2の1位から261位までのアミノ酸配列に対し、配列同一性が、少なくとも85%であるアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、トリプシン様酵素が挙げられる。
(1)グリシンおよびアラニン、
(2)バリン、イソロイシンおよびロイシン、
(3)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよびグルタミン、
(4)セリンおよびスレオニン、
(5)リジンおよびアルギニン、および
(6)フェニルアラニンおよびチロシン
からなる群より選択されるアミノ酸群に属するアミノ酸残基内で行われたものであるアミノ酸配列が挙げられる。
(a)配列表の配列番号2の1位から261位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(b)配列表の配列番号2の1位から261位までのアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(c)配列表の配列番号2の1位から261位までのアミノ酸配列に対し、配列同一性が、少なくとも85%であるアミノ酸配列をコードする塩基配列、および
(d)配列表の配列番号2の1位から261位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列のアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする塩基配列、
からなる群より選択される塩基配列を有する。
土壌より分離された放線菌ストレプトマイセス・オミヤエンシス(Streptomyces omiyaensis)84A06株を、2%グルコース、0.5%ポリペプトン、0.5%イーストエキストラクト、0.8%K2HPO4、および0.05%MgSO4・7H2Oを含む培養培地(PG培地)に接種し、そして125rpmで撹拌しながら30℃にて6日間培養した。
精製SOTを、PVDFメンブラン(Bio-Rad社)上にエレクトロブロットし、次いでプロテインシークエンサーにかけて、N末端アミノ酸配列(VVGGTRAAQGEFP:配列番号4)を同定した。また、精製SOTを、通常試薬として用いられるトリプシン(Sigma)で処理し、トリプシン処理ペプチド断片を得た。得られたトリプシン処理ペプチド断片を、LC−MSにより解析し、内部アミノ酸配列(LAETTAYNSGTF:配列番号5、GKDWALIK:配列番号6、およびLASPITSLPTL:配列番号7)を同定した。
大腸菌と放線菌との間の遺伝子間結合によって、ストレプトマイセスのメタロエンドペプチダーゼのプロモーターを含む発現ベクターpTONA5aを構築した。
SOTの生化学的研究のために、株の入手可能性の点でSGT(ストレプトマイセス・グリセウス由来のトリプシン)を比較酵素として選択した。そこで、組換え酵素を、活性形態として細胞外培地中に分泌するように、S. lividans 1326株をSOTまたはSGT発現用の宿主株として用いて、SOTおよびSGTについて、それぞれ以下のようにして発現ベクターを構築した。
上記実施例3で得られた組換えSOTおよびSGTの発現ベクターを、それぞれ大腸菌S17−1に導入して形質転換した。形質転換体の単一コロニーを、カナマイシン50μg/mLを含むLB培地中で37℃にて8時間培養した。細胞を回収し、ピペットを用いてLB培地で3回洗浄して、カナマイシンを除去した。細胞を500μLのLB培地に懸濁し、次いで放線菌S. lividans 1326株の胞子懸濁液と混合した。混合物をISP No.4寒天プレート上に塗布し、30℃にて18〜22時間培養した。カナマイシン20μg/mLおよびナリジキシン酸ナトリウム67μg/mLを含むソフトアガー栄養培地の4.5mLを、寒天プレート上に分配し、30℃にてさらに3日間インキュベートした。単一コロニーを、水道水中に2.0%大豆ミール、2.0%マンニトール、カナマイシン(20 μg/mL)およびナリジキシン酸ナトリウム(5μg/mL)を含む培地を含む寒天プレート上に画線した。得られたS. lividans 1326形質転換体を、500ml容バッフル付フラスコ中のPG培地50mLに接種し、そして180rpmで回転振とうしながら30℃にて6日間増殖させた。
トリプシンのコンセンサス基質であるBz−L−Arg−pNA・HCl(Arg−pNA)を、組換えSOTおよびSGTの生化学的研究に用いた。標準的なアッセイを以下のように行った:10μLの酵素溶液を、50mM Tris−HCl(pH8.0)中2mMのArg−pNAの90μLに添加し、そしてサーマルサイクラー(TaKaRa)を用いて37℃にて30分間インキュベートした。コントロール混合物は、酵素を含まなかった。インキュベーション後、反応混合物を98℃にて1分間加熱して、酵素反応を停止した。次いで、25μLの反応混合物を96ウェルマイクロタイタープレートのウェル中の75μLの50mM Tris−HCl(pH8.0)に添加した。加水分解アッセイを、マイクロプレートリーダーを用いてp−ニトロアニリンの放出による405nmの吸光度を測定することによって決定した。
蛍光エネルギー転移(FRETS)コンビナトリアルライブラリーにより、基質特異性の解析を行った。FRETS−25Xaaライブラリー(株式会社ペプチド研究所:配列番号3)は、図5に示される構造を有する基質のライブラリーである。これは、アミノ末端のD−2,3−ジアミノプロピオン酸(A2pr)残基の側鎖に連結された高蛍光の2−(N−メチルアミノ)ベンゾイル(Nma)基を含む。このNmaは、Lysのε−アミノ官能基に連結した2,4−ジニトロフェニル(Dnp)基によって効率的に消光されている。FRETS−25Xaaライブラリーを基質として、上記実施例4で得た精製SOTおよびSGTについて、50mMのTris−HCl緩衝液(pH8.0)を用いて37℃にて酵素反応を行った。
組換えSOTおよびSGTの天然コラーゲンに対する分解活性を、ウシアキレス腱由来の天然の不溶性I型コラーゲン(Sigma)およびヒト胎盤由来のIV型コラーゲン(Sigma)を用いて、非特許文献18に記載の手順に基づいて検討した。反応混合物は、2mgコラーゲン、10mMのCaCl2を含む0.4mLの50mM Tris−HCl(pH8.0)、および0.1mLの酵素溶液を含んでいた。37℃でのプレインキュベーション後、反応を、37℃にて振とう(1000rpm)しながら30〜60分間行った。コントロール混合物は、酵素を含まなかった。反応を、1μLの0.2M HClの添加によって停止した。遊離アミノ基の増加の初期速度を、ニンヒドリン法によって測定した。4℃にて10000gでの10分間の遠心分離後、0.1mlの上清を、0.4mLのニンヒドリン呈色試薬溶液(ナカライテスク株式会社)と混合し、そして97℃にて10分間加熱し、次いで、氷上で混合物を冷却した。次いで、2−プロパノール(1mL)を混合物に添加し、そして570nmでの上清の吸光度の上昇を測定した。参照酵素として、クロストリジウム・ヒストリカム(Clostridium histolyticum)のI型コラゲナーゼ(ColI:Sigma)を用いた。1コラーゲン切断ユニットは、カルシウムイオンの存在下、37℃にてpH7.4で5時間インキュベートしたときのI型コラゲナーゼ(ColI)によるコラーゲンからペプチドの遊離が、1.0μmolのロイシンに対するニンヒドリン呈色に相当する酵素量である。
Claims (11)
- IV型コラーゲン、I型コラーゲン、およびゼラチンに対して加水分解活性を有する、トリプシン様酵素。
- 以下の性質:
(1)至適反応pH:pH8.0〜9.0;
(2)至適反応温度:カルシウムイオン不在下で50℃、およびカルシウムイオン存在下で55℃;
(3)熱安定性:90%熱不活性化温度として、カルシウムイオン不在下で35℃、およびカルシウムイオン存在下で50℃;および
(4)フェニルメチルスルホニルフルオリドによって阻害される;
を有する、請求項1に記載のトリプシン様酵素。 - ストレプトマイセス・オミヤエンシス(Streptomyces omiyaensis)84A06(FERM P−21453)により産生される、請求項1または2に記載のトリプシン様酵素。
- (A)配列表の配列番号2の1位から261位までのアミノ酸配列、
(B)配列表の配列番号2の1位から261位までのアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列、および
(C)配列表の配列番号2の1位から261位までのアミノ酸配列に対し、配列同一性が、少なくとも85%であるアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1から3のいずれかの項に記載のトリプシン様酵素。 - 配列表の配列番号3に記載のアミノ酸配列の3位のアミノ酸残基と4位のアミノ酸残基との間のペプチド結合に対する加水分解活性を有する、請求項1から4のいずれかの項に記載のトリプシン様酵素であって、該配列表の配列番号3に記載のアミノ酸配列において、2位がArgのアミノ酸残基であり、3位がTyr、Ile、およびLysからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、そして4位がArgおよびLysからなる群より選択されるアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチドに対する基質優先性を有する、トリプシン様酵素。
- トリプシン様酵素をコードする遺伝子であって、該トリプシン様酵素が、IV型コラーゲン、I型コラーゲン、およびゼラチンに対して加水分解活性を有し、そして該遺伝子が、
(a)配列表の配列番号2の1位から261位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(b)配列表の配列番号2の1位から261位までのアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(c)配列表の配列番号2の1位から261位までのアミノ酸配列に対し、配列同一性が、少なくとも85%であるアミノ酸配列をコードする塩基配列、および
(d)配列表の配列番号2の1位から261位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列のアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする塩基配列、
からなる群より選択される塩基配列を有する、遺伝子。 - 前記メトリプシン様酵素が、配列表の配列番号3に記載のアミノ酸配列の3位のアミノ酸残基と4位のアミノ酸残基との間のペプチド結合に対する加水分解活性を有し、そして該配列表の配列番号3に記載のアミノ酸配列において、2位がArgのアミノ酸残基であり、3位がTyr、Ile、およびLysからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、そして4位がArgおよびLysからなる群より選択されるアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチドに対する基質優先性を有する、請求項6に記載の遺伝子。
- 請求項6または7に記載の遺伝子を含む、発現用担体。
- 請求項6または7に記載の遺伝子が組み込まれている、形質転換細胞。
- 請求項9に記載の形質転換細胞により産生される、組換えトリプシン様酵素。
- ストレプトマイセス・オミヤエンシス(Streptomyces omiyaensis)84A06(FERM P−21453)株。
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