JP2006197802A - メタロエンドペプチダーゼ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ストレプトマイセス セプタタス TH−2(FERM P−17329)を培養して培養上清として得られる、メタロエンドペプチダーゼ活性を示す培養物およびメタロエンドペプチダーゼの製造方法;メタロエンドペプチダーゼをコードする核酸;組換えメタロエンドペプチダーゼ;該核酸を含有したメタロエンドペプチダーゼの発現用担体、該核酸を保持した形質転換細胞並びに該形質転換細胞を培養し、メタロエンドペプチダーゼを回収する組換えメタロエンドペプチダーゼの製造方法。
【選択図】なし
Description
〔1〕 80〜160mM グルコースと、10〜50mM K2HPO4との存在下に、ストレプトマイセス セプタタス TH−2(FERM P−17329)を培養して培養上清として得られる、メタロエンドペプチダーゼ活性を示す培養物、
〔2〕 80〜160mM グルコースと、10〜50mM K2HPO4との存在下に、ストレプトマイセス セプタタス TH−2(FERM P−17329)を培養して培養上清を得ることを特徴とする、メタロエンドペプチダーゼの製造方法、
〔3〕 該メタロエンドペプチダーゼが、
(A)配列番号:2に示されるアミノ酸配列、
(B)配列番号:2において、少なくとも1個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び
(C)配列番号:2に示される配列に対し、FASTAアルゴリズムで、KTUP 2、expect value 10.0、Cost to open gap 11、Cost to extend gap 1の条件で算出された配列同一性が、少なくとも75%であるアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有し、かつ下記式:
に示される配列(配列番号:3)を認識し、該配列番号:3のアミノ酸番号:4のアミノ酸残基とアミノ酸番号:5のアミノ酸残基との間のペプチド結合に作用するポリペプチドである、前記〔2〕載の製造方法、
〔4〕 該メタロエンドペプチダーゼが、配列番号:2において、少なくとも1個のアミノ酸残基が、他のアミノ酸と保存的置換されたアミノ酸配列を有し、該保存的置換が、下記アミノ酸群(1)〜(6):
(1)グリシン及びアラニン、
(2)バリン、イソロイシン及びロイシン、
(3)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン及びグルタミン、
(4)セリン及びスレオニン、
(5)リジン及びアルギニン、
(6)フェニルアラニン及びチロシン
からなる群より選ばれたアミノ酸群に属するアミノ酸残基内で行なわれるものであり、下記式:
に示される配列(配列番号:3)を認識し、該配列番号:3のアミノ酸番号:4のアミノ酸残基とアミノ酸番号:5のアミノ酸残基との間のペプチド結合に作用するポリペプチドである、前記〔3〕載の製造方法、
〔5〕 (A)配列番号:2に示されるアミノ酸配列、
(B)配列番号:2において、少なくとも1個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び
(C)配列番号:2に示される配列に対し、FASTAアルゴリズムで、KTUP 2、expect value 10.0、Cost to open gap 11、Cost to extend gap 1の条件で算出された配列同一性が、少なくとも75%であるアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有し、かつ下記式:
に示される配列(配列番号:3)を認識し、該配列番号:3のアミノ酸番号:4のアミノ酸残基とアミノ酸番号:5のアミノ酸残基との間のペプチド結合に作用する、メタロエンドペプチダーゼ、
〔6〕 前記〔2〕〜〔4〕いずれか1項に記載の製造方法により得られる、前記〔5記載のメタロエンドペプチダーゼ、
〔7〕 (a)配列番号:2に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(b)配列番号:2において、少なくとも1個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(c)配列番号:2に示される配列に対し、FASTAアルゴリズムで、KTUP 2、expect value 10.0、Cost to open gap 11、Cost to extend gap 1の条件で算出された配列同一性が、少なくとも75%であるアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び
(d)配列番号:2に示されるアミノ酸配列をコードする核酸のアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列、
からなる群より選ばれた塩基配列を含有してなり、コードされるポリペプチドが、下記式:
に示される配列(配列番号:3)を認識し、該配列番号:3のアミノ酸番号:4のアミノ酸残基とアミノ酸番号:5のアミノ酸残基との間のペプチド結合に作用する活性を有する、メタロエンドペプチダーゼをコードする核酸、
〔8〕 前記〔7〕記載の核酸によりコードされる、組換えメタロエンドペプチダーゼ、
〔9〕 前記〔7〕記載の核酸を含有してなる、メタロエンドペプチダーゼの発現用担体、
〔10〕 前記〔7〕記載の核酸を保持してなる形質転換細胞、
〔11〕 前記〔10〕記載の形質転換細胞を培養し、得られた培養物からメタロエンドペプチダーゼを回収することを特徴とする組換えメタロエンドペプチダーゼの製造方法、
I) 80〜160mM グルコースと、10〜50mM K2HPO4との存在下に、S.septatus TH−2を培養して培養上清を得る工程、
II)前記工程II)で得られた培養上清を、例えば、25mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)に対して透析し、得られた産物を、前記緩衝液で平衡化された適切なイオン交換クロマトグラフィー、例えば、25mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)で平衡化された商品名:Vivapure−Qスピンカラム(Vivascience社製、プロダクト番号:VS−IX20QHGP)に供し、例えば、0.5M NaClを含有した25mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)で溶出する工程、
III)前記工程II)で得られた画分を、10mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に対して透析し、得られた産物を、ハイドロキシアパタイトカラムに供して、10〜400mM リン酸カリウムのリニアグラジェントで、200mM リン酸カリウムの溶出画分として、メタロエンドペプチダーゼを含む画分を得る工程、及び
IV)前記工程III)で得られた画分を20mM Tris−HCl緩衝液に対して透析し、前記緩衝液で平衡化された適切なイオン交換クロマトグラフィー、例えば、25mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)で平衡化された商品名:Mono Q HR5/5カラム〔アマシャム バイオテック社製〕に供して、0〜0.5M NaClのリニアグラジェントで溶出し、115mMの溶出画分として、メタロエンドペプチダーゼを含む画分を得る工程、
を含む方法等が挙げられる。なお、前記各工程において、メタロエンドペプチダーゼの活性測定は、前記と同様の手法により行なわれうる。また、各工程の間に必要に応じて、透析後の画分について、4000×gで10分間の遠心分離に供してもよい。
本発明のメタロエンドペプチダーゼは、12.5重量% SDS−PAGEにより算出された分子量が、約35kDで、リン酸緩衝化生理的食塩水で平衡化された商品名:Superdex 200 10/300 GLカラム〔アマシャム バイオテック社製〕を用いたゲル濾過法(流速0.5ml/分、カラムサイズ:1cm(内径)×30cm)により算出された分子量が、約40kDであり、単量体である。
本発明のメタロエンドペプチダーゼ1分子あたり、0.9亜鉛分子を有する。
EDTA及びホスホルアミドンにより阻害される。
pH5〜8、好ましくは、pH5.5〜7であり、特にpH6.0付近で活性が最大になる
1) 2mM カルシウム存在下で、至適反応温度の範囲の上限が約10℃上昇し、カルシウム非存在下かつ15℃でインキュベーションした場合の活性に対して、約100%の相対活性の熱安定性を示す範囲の上限が約10℃上昇する。
2) 2mM MgCl2、2mM CoCl2、2mM NiSO4、2mM FeSO4及び2mM ZnSO4の存在下では、活性が増加せず、特に、2mM NiSO4、2mM FeSO4及び2mM ZnSO4の添加により、最大活性の20%未満まで活性が減少する。
1) 前記メタロペプチダーゼ活性の測定法の条件下において、前記配列番号:3に示される基質について、P1位において、Phe残基、Leu残基、Tyr残基、Met残基、Thr残基及びAla残基の順で選択性があり、P2位における疎水性又は塩基性の残基及びP3位における塩基性又は小さい残基に選択的であり、P2及びP3位における酸性残基に選択的でない。具体的には、P2位において、Ala残基、Arg残基、Val残基、Phe残基及びLys残基に対する選択性、P3位において、Arg残基、Val残基及びAla残基に対する選択性を示す。
2) 前記FRETS−GRYFAに対し、Km値:5.0±1.6μM、kcat値:5.0±1.0(1/秒)、kcat/Km:1.0±0.30(1/秒・1/μM)。
(A)配列番号:2に示されるアミノ酸配列、
(B)配列番号:2において、少なくとも1個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び
(C)配列番号:2に示される配列に対し、FASTAアルゴリズムで、KTUP 2、expect value 10.0、Cost to open gap 11、Cost to extend gap 1の条件で算出された配列同一性が、少なくとも75%であるアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有し、かつ下記式:
に示される配列(配列番号:3)を認識し、該配列番号:3のアミノ酸番号:4のアミノ酸残基とアミノ酸番号:5のアミノ酸残基との間のペプチド結合に作用するポリペプチド等が挙げられる。
るアミノ酸配列のバリアントとしては、前記(B)又は(C)のアミノ酸配列が挙げられる。また、後述の核酸によりコードされるポリペプチドであって、前記メタロエンドペプチダーゼ活性の測定法の条件下に、前記認識配列を認識し、切断する活性を示すものであれば、本発明のメタロエンドペプチダーゼに含まれる。
(1)グリシン及びアラニン、
(2)バリン、イソロイシン及びロイシン、
(3)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン及びグルタミン、
(4)セリン及びスレオニン、
(5)リジン及びアルギニン、
(6)フェニルアラニン及びチロシン
からなる群より選ばれたアミノ酸群に属するアミノ酸残基内で行なわれたものであるアミノ酸配列が挙げられる。
(b)配列番号:2において、少なくとも1個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(c)配列番号:2に示される配列に対し、FASTAアルゴリズムで、KTUP 2、expect value 10.0、Cost to open gap 11、Cost to extend gap 1の条件で算出された配列同一性が、少なくとも75%であるアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び
(d)配列番号:2に示されるアミノ酸配列をコードする核酸のアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列、
からなる群より選ばれた塩基配列を含有してなり、コードされるポリペプチドが、前記配列番号:3を認識し、該配列番号:3のアミノ酸番号:4のアミノ酸残基とアミノ酸番号:5のアミノ酸残基との間のペプチド結合に作用する活性を有する、メタロエンドペプチダーゼをコードする核酸に関する。
前記実施例2で得られた酵素を、24μg/mLのタンパク質濃度に調整し、酵素溶液を得た。得られた酵素溶液 20μLと、インヒビター溶液[プロテアーゼインヒビターセット〔ロシュ モレキュラーバイオケミカルズ(Roche Molecular Biochemicals)〕] 5μLと、8mM CaCl2を含む0.2M 酢酸緩衝液(pH6.1) 12.5μLとを混合し、37℃で10分間インキュベーションした。ついで、得られた混合物に、ユニバーサル基質溶液(H2O中、4mg/mL) 12.5μLを添加し、得られた混合物を37℃で10分間インキュベーションした。その後、得られた産物を、3000×gで5分間、遠心分離し、上清を得た。得られた上清 100μLと0.5M Tris−HCl緩衝液(pH8.8) 150μLとを、96ウェルマイクロプレートのウェルに添加し、混合した。
原子吸光分析法による、SSMPに存在する亜鉛の解析を行なった。その結果、1酵素分子あたり、0.9亜鉛分子が測定された。
前記実施例1におけるタンパク質分解活性の測定において、インキュベーション緩衝液に用いる緩衝液として、pH5.3、pH5.5、pH5.8、pH6.1及びpH6.5それぞれの酢酸緩衝液、pH6.0、pH6.3、pH6.8、pH7.1及びpH7.4それぞれのリン酸カリウム緩衝液並びにpH7.0、pH7.2、pH7.6、pH7.9及びpH8.2それぞれのTris−HCl緩衝液を用いて、SSMPのタンパク質分解活性を測定した。結果を、図3に示す。なお、図3中、相対活性は、最も高い活性を示したpHにおける活性を100として算出した値により示した。
SSMP活性及び安定性へのカルシウムイオンの影響を調べた。
FRETS−25Xaaライブラリー〔ペプチド研究所製〕は、図5に示される構造を有し、アミノ末端D−2,3−ジアミノプロピオン酸(D−A2pr)残基の側鎖に結合した高い蛍光2−(N−メチルアミノ)ベンゾイル(Nma)基を含み、Lysのε−アミノ基に連結した2,4−ジニトロフェニル(Dnp)基により効率よく消光するという性質を有する基質のライブラリーである。
前記(1)の結果に基づき、コンセンサス基質:
D-A2pr(Nma)-Gly-Arg-Tyr-Phe-Ala-Phe-Pro-Lys(Dnp)-D-Arg-D-Arg
(FRETS−GRYFA;配列番号:4)をデザインし、合成した。2mM CaCl2を含む50mM 酢酸緩衝液(pH6.1)で、前記コンセンサス基質を、1.6〜100μMとなるように希釈し、各基質溶液 490μLを得た。得られた希釈溶液 490μLを、37℃で5分間プレインキュベーションした。精製SSMP(2.5ng/μL) 10μLを前記基質溶液に添加し、ついで、得られた混合物を、37℃で1分間インキュベーションした。なお、サーマルセルホルダーに設置した前記混合物について、Hitachi分光蛍光光度計F−4500を用い、λex 340nm、λem 440nmを測定した。反応速度は、Nma溶液を用いてプロットした標準曲線から推定した。
前記実施例2で得られた精製SSMPを、12.5重量% SDS−PAGEに供した。ついで、得られたゲル中のタンパク質を、商品名:トランスブロットSDセル〔バイオラッド(BioRad)社製〕を用い、製造者の説明書に準じて、商品名:シーケブロットPVDF〔バイオラッド(BioRad)社製〕にエレクトロブロッティングした。ブロットされたSSMPについて、プロテインシークエンサーに供して、N末端アミノ酸配列を同定した。また、SSMPを、トリプシンで処理し、トリプシン処理ペプチド断片を得た。得られたトリプシン処理ペプチド断片を、LC−MSにより解析し、内部アミノ酸配列を同定した。なお、アミノ酸配列の解析において、Ile及びLeuは、同じ分子量のため、互いに区別できなかった。Gln及びLysは、分子量がほぼ等しいため、互いに区別化できなかった。
ゲノムDNAを、ホップウッド(D.A Hopwood)らの方法〔A Laboratory Manual,The John Ines Foundation,Norwich,1985年、第70頁−第84頁〕に準じて、S.septatus TH−2から調製した。
5’-GG(GC)AACGT(GC)CC(GC)CT(GC)AC(GC)AC-3’(配列番号:10)、及び
5’-TCGTA(GC)GT(GC)GG(GC)(GC)(AT)GTTGTA-3’(配列番号:11)
と、GC−RICH PCRシステム〔ロシュ モレキュラーバイオケミカル(Roche Molecular Biochemicals)社製〕と、0.5M GC−RICHリゾルーションソルーション(商品名)とを用い、前記S.septatus TH−2のゲノムDNAを鋳型として、PCRを行ない、ssmp遺伝子の一部からなるDNA断片を増幅した。前記PCRのサーマルプロファイルは、95℃で3分インキュベーションし、95℃で30秒と54℃で30秒と72℃で45秒とからなる反応を10サイクル、95℃で30秒と、54℃で30秒と72℃で45秒(ただし、1サイクル毎に5秒延長)とからなる反応を20サイクル、72℃で7分間の伸長を行なう条件とした。
5’-ACCAACTCCACCGACACCTGG-3’(配列番号:12、配列番号:1のヌクレオチド番号:2083−2103に対応)、及び
5’-CTTGTCGGTGCCGTTGTTGGC-3’(配列番号:13、配列番号:1のヌクレオチド番号:ヌクレオチド番号:2455−2475の相補鎖に対応)
と、商品名:PCR DIGプローブ合成キット〔ロシュ モレキュラーバイオケミカルズ(Roche Molecular Biochemicals)〕とを用い、95℃2分のインキュベーション後、95℃10秒と60℃30秒と72℃2分とを1サイクルとする10サイクルの反応を行ない、ついで、95℃10秒と60℃30秒と72℃2分(ただし1サイクル毎に20秒増やす)とを1サイクルとする20サイクルの反応を行ない、72℃で7分間インキュベーションすることにより、ジゴキシゲニン(DIG)標識プローブを合成した。
Van91I消化断片の増幅のために、
5'-TACCTGCTGTCCGAGGGCAGC-3'(配列番号:14、配列番号:1のヌクレオチド番号:2638-2658に対応)、及び
5'-CGCCCCGTCTTCGAGCTGGAAGCC-3'(配列番号:15、配列番号:1のヌクレオチド番号:1999-2022の相補鎖に対応);
SalI消化断片の増幅のために、
5'-TACCTGCTGTCCGAGGGCAGC-3'(配列番号:16、配列番号:1のヌクレオチド番号:2638−2658に対応)、及び
5'-GTAGAAGTCCCAGGTGACGGC-3'(配列番号:17、配列番号:1のヌクレオチド番号:2149−2169の相補鎖に対応);
ApaI消化断片の増幅のために、
5'-TGCGCTGTCGGAGGCGGTGG-3'(配列番号:18、配列番号:1のヌクレオチド番号:2989−3008に対応)、及び
5'-CGCCGAGCCGCTCTGCACTCC-3'(配列番号:19、配列番号:1のヌクレオチド番号:1369−1389の相補鎖に対応)
と、0.5M 商品名:GC−RICHリゾルーションソルーションと、GC−RICH PCRシステム〔ロシュ モレキュラーバイオケミカルズ(Roche Molecular Biochemicals)社製〕とを用いて、PCRを行なった。
Claims (11)
- 80〜160mM グルコースと、10〜50mM K2HPO4との存在下に、ストレプトマイセス セプタタス TH−2(FERM P−17329)を培養して培養上清として得られる、メタロエンドペプチダーゼ活性を示す培養物。
- 80〜160mM グルコースと、10〜50mM K2HPO4との存在下に、ストレプトマイセス セプタタス TH−2(FERM P−17329)を培養して培養上清を得ることを特徴とする、メタロエンドペプチダーゼの製造方法。
- 該メタロエンドペプチダーゼが、
(A)配列番号:2に示されるアミノ酸配列、
(B)配列番号:2において、少なくとも1個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び
(C)配列番号:2に示される配列に対し、FASTAアルゴリズムで、KTUP 2、expect value 10.0、Cost to open gap 11、Cost to extend gap 1の条件で算出された配列同一性が、少なくとも75%であるアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有し、かつ下記式:
に示される配列(配列番号:3)を認識し、該配列番号:3のアミノ酸番号:4のアミノ酸残基とアミノ酸番号:5のアミノ酸残基との間のペプチド結合に作用するポリペプチドである、請求項2記載の製造方法。 - 該メタロエンドペプチダーゼが、配列番号:2において、少なくとも1個のアミノ酸残基が、他のアミノ酸と保存的置換されたアミノ酸配列を有し、該保存的置換が、下記アミノ酸群(1)〜(6):
(1)グリシン及びアラニン、
(2)バリン、イソロイシン及びロイシン、
(3)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン及びグルタミン、
(4)セリン及びスレオニン、
(5)リジン及びアルギニン、
(6)フェニルアラニン及びチロシン
からなる群より選ばれたアミノ酸群に属するアミノ酸残基内で行なわれるものであり、下記式:
に示される配列(配列番号:3)を認識し、該配列番号:3のアミノ酸番号:4のアミノ酸残基とアミノ酸番号:5のアミノ酸残基との間のペプチド結合に作用するポリペプチドである、請求項3記載の製造方法。 - (A)配列番号:2に示されるアミノ酸配列、
(B)配列番号:2において、少なくとも1個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び
(C)配列番号:2に示される配列に対し、FASTAアルゴリズムで、KTUP 2、expect value 10.0、Cost to open gap 11、Cost to extend gap 1の条件で算出された配列同一性が、少なくとも75%であるアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有し、かつ下記式:
に示される配列(配列番号:3)を認識し、該配列番号:3のアミノ酸番号:4のアミノ酸残基とアミノ酸番号:5のアミノ酸残基との間のペプチド結合に作用する、メタロエンドペプチダーゼ。 - 請求項2〜4いずれか1項に記載の製造方法により得られる、請求項5記載のメタロエンドペプチダーゼ。
- (a)配列番号:2に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(b)配列番号:2において、少なくとも1個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(c)配列番号:2に示される配列に対し、FASTAアルゴリズムで、KTUP 2、expect value 10.0、Cost to open gap 11、Cost to extend gap 1の条件で算出された配列同一性が、少なくとも75%であるアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び
(d)配列番号:2に示されるアミノ酸配列をコードする核酸のアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列、
からなる群より選ばれた塩基配列を含有してなり、コードされるポリペプチドが、下記式:
に示される配列(配列番号:3)を認識し、該配列番号:3のアミノ酸番号:4のアミノ酸残基とアミノ酸番号:5のアミノ酸残基との間のペプチド結合に作用する活性を有する、メタロエンドペプチダーゼをコードする核酸。 - 請求項7記載の核酸によりコードされる、組換えメタロエンドペプチダーゼ。
- 請求項7記載の核酸を含有してなる、メタロエンドペプチダーゼの発現用担体。
- 請求項7記載の核酸を保持してなる形質転換細胞。
- 請求項10記載の形質転換細胞を培養し、得られた培養物からメタロエンドペプチダーゼを回収することを特徴とする組換えメタロエンドペプチダーゼの製造方法。
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