JP2002199888A - 好熱性プロリルエンドペプチダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 タンパク質の構造解析などに有用な好熱性プ
ロリルエンドペプチダーゼを提供すること。 【解決手段】 好熱性プロリルエンドペプチダーゼ活性
を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
含有する単離されたＤＮＡ、このＤＮＡを含む組換えＤ
ＮＡおよび発現ベクター、この発現ベクターにより形質
転換された形質転換体ならびにこの形質転換体を用いて
前記ポリペプチドを製造する方法を見出した。生成され
たプロリルエンドペプチダーゼは、高温で一定時間加熱
処理することにより、本来の蛋白の構造をとり、高活性
を実現できる。この好熱性プロリルエンドペプチダーゼ
は、古細菌Pyrococcus horikoshiiから得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規好熱性プロリ
ルエンドペプチダーゼ、好熱性プロリルエンドペプチダ
ーゼをコードするＤＮＡ、好熱性プロリルエンドペプチ
ダーゼをコードするＤＮＡにより形質転換された形質転
換体、および形質転換体を用いる好熱性プロリルエンド
ペプチダーゼの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】プロリルエンドペプチダーゼは、生理的
条件下で、ペプチド中に存在するプロリン残基のＣ末端
側での選択的な加水分解開裂を触媒する。この酵素は、
反応条件と基質によって、縮合またはペプチド転移によ
るペプチド断片のカップリングも触媒することができ
る。従って、プロリルエンドペプチダーゼは、活性なペ
プチドを遊離させるための前駆体ペプチドの選択的開裂
やペプチドのカップリングの触媒用に使用できる。

【０００３】前駆体ペプチドの選択的開裂は、インビト
ロにおいては、例えば前駆体タンパク質あるいは融合タ
ンパク質として発現させる遺伝子工学的手法により得ら
れる組換え体ペプチドのインビトロでのプロセシング等
に重要である。プロリルエンドペプチダーゼ特有の特異
性の為に、非特異的ペプチダーゼにおいて見られる副反
応を伴うことなく目的のペプチドを得られる利点から、
この酵素の必要性は大きい。

【０００４】プロリルエンドペプチダーゼは、ヒトの子
宮において発見され、哺乳類の各臓器にも広く分布して
いる。生体内において、この酵素は、生理活性ペプチド
の代謝制御に関与し、重要な作用を有している。

【０００５】哺乳類のプロリルエンドペプチダーゼと同
じ基質特異性を示すエンドペプチダーゼが細菌のフラボ
バクテリウム・メニンゴセプチカム（Flavobacterium m
eningosepticum）中にも発見された。しかしながら、
Ｆ．メニンゴセプチカムからのプロリルエンドペプチダ
ーゼの調製は、この細菌が病原性であること、およびこ
の細菌が、プロリルエンドペプチダーゼだけでなく相当
量の他の特異的または非特異的ペプチダーゼも生産する
ことから、不都合が伴っていた。

【０００６】さらに、一般的にプロリルエンドペプチダ
ーゼはペプチダーゼ触媒反応に通常使われる条件によっ
て阻害または失活を非常に受けやすい。すなわち、前駆
体ペプチドの開裂に使われる緩衝液中の変性剤あるいは
可溶化剤に敏感である。また、カップリング生成物の形
成を行うために通常用いられる条件、例えば高濃度の有
機溶剤、極端なｐＨおよび／または高温にも敏感であ
る。

【０００７】プロリルエンドペプチダーゼをペプチドの
工業生産用の触媒として多目的に利用できるようにする
ためにプロリルエンドペプチダーゼの安定性を改善する
ことを目指して、熱安定性であるプロリルエンドペプチ
ダーゼが見出された（特表平１０-５０１９８１）。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これま
で見出されているいずれのプロリルエンドペプチダーゼ
も、至適温度は、３５℃から６０℃付近である。反応効
率の観点から言えばさらにより高温で反応を行う方が望
ましい。また、遺伝子工学的手法で本酵素を得る場合お
よび得られた酵素を使用してペプチダーゼ反応を行わせ
る場合等に混入物を除去しあるいは混入物の反応への影
響を除く為に、１００℃近い高温でもなお、安定かつ触
媒活性を保持し得るプロリルエンドペプチダーゼ（以
下、「好熱性プロリルエンドペプチダーゼ」という）が
渇望されている。本発明の目的は、新規な好熱性プロリ
ルエンドペプチダーゼ、そのアミノ酸配列、それをコー
ドするヌクレオチド配列を含むＤＮＡを提供することに
ある。さらに、該ＤＮＡを含む発現ベクター、それを含
む形質転換体、およびこのような好熱性プロリルエンド
ペプチダーゼの製造方法を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するため、鋭意検討した結果、９０-１００℃
で生育する超好熱性細菌に着目し、高温（100℃以上）
で生育する好熱菌であるパイロコッカス・ホリコシ（JC
M９９７４）から新規好熱性プロリルエンドペプチダー
ゼを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明によ
れば、以下の特性を有する新規なプロリルエンドペプチ
ダーゼが提供される： a．分子量約７０，０００; b．至適温度９５℃以上１００℃以下； c. 至適ｐＨ５．４； d．安定性 約９５℃で２４時間安定。

【００１０】１つの実施態様において、前記好熱性プロ
リルエンドペプチダーゼは、パイロコッカス（Pyrocuco
us）属に由来する。

【００１１】さらに、１つの実施態様において、前記好
熱性プロリルエンドペプチダーゼは、配列表の配列番号
１に記載のアミノ酸配列を有する。

【００１２】別の実施態様において、前記好熱性プロリ
ルエンドペプチダーゼは、配列表の配列番号１に記載の
アミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が
欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む。

【００１３】本発明においてはまた、配列表の配列番号
１に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
を含む単離されたＤＮＡ分子が提供される。

【００１４】別の実施態様では、配列表の配列番号１に
記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸
残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列をコ
ードするヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子
が提供される。

【００１５】さらに別の実施態様では、配列表の配列番
号２に記載のポリヌクレオチド配列を含む単離されたＤ
ＮＡ分子が提供される。

【００１６】さらに別の実施態様では、配列表の配列番
号２に記載のポリヌクレオチド配列とストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし得、かつ好熱性プロリルエ
ンドペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードす
る、単離されたＤＮＡ分子が提供される。

【００１７】本発明においてはまた、好熱性プロリルエ
ンドペプチダーゼをコードするヌクレオチド配列を有す
るＤＮＡ分子を含む発現ベクター、このような発現ベク
ターにより形質転換された形質転換体、および形質転換
体を用いた好熱性プロリルエンドペプチダーゼの製造方
法が提供される。

【００１８】

【発明の実施の形態】以下、本発明を具体的に説明す
る。本明細書中で使用するペプチドという用語は、短鎖
ペプチドのみを意味するとは限らず、ペプチド結合によ
って結合したアミノ酸から構成されるすべての分子を示
す。すなわち、本明細書において、ペプチドとは、短鎖
ペプチド、オリゴペプチドのような短鎖ペプチドからた
んぱく質を構成するようなポリペプチドまでを含む。

【００１９】本明細書の用語「プロリルエンドペプチダ
ーゼ」は、任意のプロリルエンドペプチダーゼ、即ちプ
ロリン残基のカルボキシル末端で特異的にペプチドの加
水分解的開裂を触媒する任意のプロテアーゼを意図す
る。そのようなプロリルエンドペプチダーゼのＥＣ番号
は3.4.21.26である。

【００２０】本発明の「好熱性プロリルエンドペプチダ
ーゼ」は、９０℃から１００℃付近の高温下で安定でか
つその温度領域を至適温度とするプロリルエンドペプチ
ダーゼである。好ましくは、さらに以下の特性を有す
る： a．分子量約７０，０００; b．至適温度９５℃以上１００℃以下； c. 至適ｐＨ５．４； d．安定性 約９５℃で２４時間安定。

【００２１】本発明の「好熱性プロリルエンドペプチダ
ーゼ」には、熱により活性が高められたプロリルエンド
ペプチダーゼも含まれる。熱活性の条件は特に限定され
ないが、好熱性プロリルエンドペプチダーゼ産生菌等か
ら得られた酵素を、好ましくは、６０℃から１００℃、
より好ましくは８０℃から１００℃、最も好ましくは９
５℃の温度条件下、３０分から２００分、好ましくは６
０分から２００分の間、処理することができる。

【００２２】本発明の好熱性プロリルエンドペプチダー
ゼは、原核生物、好ましくは、古細菌パイロコッカス
（Pyrococcus）属、より好ましくは、超好熱性細菌で最
適成長温度が９８℃である硫黄代謝好熱菌 パイロコッ
カス・ホリコシ（Pyrococcus horikoshii, 登録番号JCM
９９７４JCM微生物株カタログ第７版，１９９９年１月
発行）から得られ得る。

【００２３】本発明の好熱性プロリルエンドペプチダー
ゼは、例えば配列表の配列番号１に記載の天然型のアミ
ノ酸配列を有する。あるいは、配列表の配列番号１に記
載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残
基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含
み、かつ天然型の好熱性プロリルエンドペプチダーゼと
実質的に同等の活性を有するポリペプチドも、本発明の
好熱性プロリルエンドペプチダーゼに含まれる。

【００２４】人為的に作製される機能的に同等の活性を
有するポリペプチドには、多様な変異が導入され得る。
このようなポリペプチドは、当業者に周知の遺伝子組換
え技術を用いて、目的のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを改変し、改変したＤＮＡを発現させることにより得
られ得る。得られたポリペプチドが天然型のポリペプチ
ドと同等の活性を有するか否かは、その活性を測定する
ことにより容易に決定され得る。

【００２５】本発明の好熱性プロリルエンドペプチダー
ゼは、融合タンパクとして調製することもできる。融合
タンパクは、ペプチド結合により融合した第一のペプチ
ドと第二のペプチドを含む。第一のペプチドは、本発明
で定義される好熱性プロリルエンドペプチダーゼであ
る。第二のペプチドは、特定のタンパク質またはその断
片であり得る。そのような第二のペプチドになり得る特
定のたんぱく質には、ベータガラクトシダーゼ、グルタ
チオンＳトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、ホース
ラディッシュペルオキシダーゼ等がある。

【００２６】本発明の好熱性プロリルエンドペプチダー
ゼをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号
１に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
を含み得る。あるいは、配列表の配列番号１に記載のア
ミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が欠
失、置換、または付加されたアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列を含み得る。好ましくは、このヌクレ
オチド配列は、配列表の配列番号２に記載のポリヌクレ
オチド配列である。あるいは、配列表の配列番号２に記
載のポリヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下
でハイブリダイズし得、かつ好熱性プロリルエンドペプ
チダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列であり得る。

【００２７】一般的に、ポリヌクレオチド配列の変異体
またはホモログの人為的調製法は、当業者に周知であ
り、そのような技術を用いて、例えば天然型の好熱性プ
ロリルエンドペプチダーゼ活性を保持する変異体または
ホモログを調製することができる。このような変異体ま
たはホモログも本発明の好熱性プロリルエンドペプチダ
ーゼに含まれる。

【００２８】ここで、ハイブリダイズの為の「ストリン
ジェントな条件」とは、例えば、６５℃における０．２
×ＳＳＣをいう。

【００２９】天然型の好熱性プロリルエンドペプチダー
ゼポリヌクレオチドは、例えば、パイロコッカス・ホリ
コシ培養後、BLAST探索法を使用して、本好熱性細菌の
遺伝子配列からPyrococcus furiosusのプロリルエンド
ペプチダーゼ配列に類似し、本酵素活性を示すと思われ
る遺伝子（配列番号２）を、PCR反応で増幅し抽出して
得られる。次に本発明に係るポリヌクレオチドを含有す
る組換えベクターを含む形質転換体を培地中で培養し、
培養物から好熱性アミノペプチダーゼを採取する。

【００３０】用いるベクターは、特に限定されるもので
はないが、宿主細胞内で自立複製可能なものでも、染色
体に１コピーもしくは複数のコピーが挿入されるもので
も良く、上記ＤＮＡすなわち好熱性プロリルエンドペプ
チダーゼ遺伝子を組み込むことができる挿入部位を持
ち、更にこの組み込んだＤＮＡを宿主細胞内で発現させ
得る領域が必要である。

【００３１】なお、ベクターに組み込む好熱性プロリル
エンドペプチダーゼ遺伝子としては、ｃＤＮＡだけでな
く、ｃＤＮＡから予想されるアミノ酸配列をコードする
ように設計して合成されたＤＮＡでも良い。このような
アミノ酸配列を基にした遺伝子の合成は、ＤＮＡ自動合
成機を利用して合成したオリゴヌクレオチドをアニール
後に連結することなどにより、容易に行うことができ
る。

【００３２】好熱性プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子
を発現させるプロモーターとしては、通常異種タンパク
質の発現に用いられる強力なプロモーターを用いること
ができる。また、好熱性プロリルエンドペプチダーゼ遺
伝子の下流にはターミネーターを挿入することもでき
る。例えば、trp、tac、lac、trc、λPL、T7等のプロモ
ーター、tpA、lpp、T4等のターミネーターが挙げられ
る。

【００３３】また、翻訳の効率化のために、ＳＤ配列の
種類、数、ＳＤ配列と開始コドンの間の領域の塩基組
成、配列、長さを好熱性プロリルエンドペプチダーゼ遺
伝子の発現に最適になるようにすることも可能である。

【００３４】好熱性プロリルエンドペプチダーゼ発現に
必要なプロモーターから翻訳開始点までの領域は、従来
公知のＰＣＲ法や化学合成法などにより調製することが
できる。

【００３５】本発明の組換えＤＮＡは、所望の発現系に
応じた公知の発現ベクターに、前記好熱性プロリルエン
ドペプチダーゼ遺伝子を含むＤＮＡを従来公知の方法に
よって挿入することにより得ることが可能である。ここ
で用いる発現ベクターは多コピーのものであることが望
ましい。

【００３６】本発明の組換えＤＮＡの調製に用いること
のできる公知のベクターとしてはpUC18、pHSG299、Pet-
11a等が挙げられる。

【００３７】次に、前記組換えＤＮＡ、発現ベクターが
挿入されて得られる種々の形質転換体について説明す
る。

【００３８】該形質転換体となりうる細胞としては、E.
coli等の細菌が挙げられる。E.coliの一具体例として
は、JM109株（recA、endA1、gyrA96、thi、hsdR17、sup
E44、relA1、Δ(lac-proAB)/F'[traD36、proAB+、lacI
q、lacZΔM15])がある。

【００３９】この他の形質転換体となりうる宿主細胞に
は、枯草菌、酵母、麹菌等があり、これらのタンパク質
分泌能を利用して、本発明の好熱性プロリルエンドペプ
チダーゼを培地中に生産させる方法も考えられる。さら
には、動物細胞、植物細胞、および昆虫細胞も含まれ
る。

【００４０】次いで、上記組換えベクターを宿主細胞内
に導入し、形質転換体を得る。組換え発現ベクターの宿
主細胞内への導入方法は、従来の慣用的に用いられてい
る方法により行うことができる。コンピテントセル法、
プロトプラスト法、リン酸カルシウム共沈法、エレクト
ロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポ
ソーム融合法等、種々のものが挙げられる。

【００４１】このような形質転換体の内部で調製された
タンパク質または分泌されて得られるタンパク質を公知
の方法で単離し、精製することにより、目的とする酵素
が得られる。

【００４２】E.coliを宿主とした場合には、不活性な会
合体、すなわちタンパク質封入体として好熱性プロリル
エンドペプチダーゼ遺伝子産物を得た後、これを適当な
方法で活性化することも可能であり、活性再生後、活性
型タンパク質を公知の方法で分離精製することにより、
目的の酵素を得てもよい。

【００４３】形質転換体を培養する為の培地は公知であ
り、例えば、E.coliではLB培地などの栄養培地や、M9培
地などの最小培地に炭素源、窒素源、ビタミン源等を添
加して用いることができる。形質転換体の培養は、宿主
に応じて、通常16−42℃、好ましくは25−37℃で5−168
時間、好ましくは8−72時間行う。振盪培養と静置培養
のいずれも可能であるが、必要に応じて攪拌、通気を行
ってもよい。

【００４４】好熱性プロリルエンドペプチダーゼの単
離、精製方法としては、形質転換体の抽出物より、公知
の塩析、等電点沈殿法もしくは溶媒沈殿法等の沈殿法、
透析、限外濾過もしくはゲル濾過等の分子量差を利用す
る方法、イオン交換クロマトグラフィー等の特異的親和
性を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロ
マトグラフィー等の疎水度の差を利用する方法やその他
アフィニティークロマトグラフィー、ＳＤＳポリアクリ
ルアミド電気泳動法、等電点電気泳動法などが挙げら
れ、これらを組み合わせることにより精製が可能であ
る。

【００４５】あるいは、生産された酵素は、加熱処理に
て簡単に単離精製できる。熱遺伝子組換えによる製造方
法については、以下の実施例で詳細に説明するが、当業
者にとっては、当分野における通常の技術を使用して本
発明の記載に種々の変更等を加えることが可能であり、
かかる変更等も本発明に含まれる。

【００４６】

【実施例】以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、
本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。 (実施例１)パイロコッカス・ホリコシの培養 パイロコッカス・ホリコシは公知の好熱菌であり、その
培養条件なども知られているが、ここではその一例を挙
げる。

【００４７】13.5ｇのNaCl、4gのNa₂SO₄、0.7 gのKCl、
0.2gのNaHCO₃、0.1gのKBr、30 mgのH₃BO₃、10gのMgCl₂
・6H₂O、1.5gのCaCl₂、25mgのSrCl₂、1.0mlのレザスリ
ン溶液（0.2g/L）、1.0gの酵母エキス、5gのバクトペプ
トンを蒸留水1Lに溶かし、pHを6.8に調整した後、加圧
殺菌した。ついで、乾熱滅菌した元素硫黄を0.2％とな
るように加え、この培地をアルゴンガスで飽和して嫌気
性とした後、パイロコッカス・ホリコシOT３を植菌し
た。培地が嫌気性となったか否かはNa₂S溶液を加えて、
培養液中でNa₂Sによるレザスリン溶液のピンク色が着色
しないことにより確認した。この培養液を95℃で２−4
日培養した。

【００４８】(実施例２)染色体ＤＮＡの調製 培養後、5000rpm、10分間の遠心分離により菌体を集菌
した。菌体を10mM Tris(pH 7.5)-1mM EDTA溶液で２回洗
浄後、InCert Agarose（FMC社製）ブロック中に封入し
た。このブロックを１％N-ラウロイルサルコシン-1mg/m
lプロテアーゼK溶液中で処理することにより、染色体DN
AをAgaroseブロック中に分離調製した。

【００４９】（実施例3）染色体ＤＮＡを含むライブラ
リークローンの作製 実施例2で得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Hind III に
より部分分解後アガロースゲル電気泳動により約40kb長
の断片を調整した。このＤＮＡ断片を、制限酵素Hind I
II によって完全分解したBacベクターpBAC108LまたはpF
OS１に、T4リガーゼを用いて結合させた。前者のベクタ
ーを用いた場合には結合終了後のDNAをただちに大腸菌
内へ電気孔窄法により導入した。後者のベクターpFOS1
を用いた場合には、結合終了後のDNAをGIGA Pack Gold
（ストラタジーン社製）により試験管内でλファージ粒
子内に詰め込み、この粒子を大腸菌に感染させることに
よりDNAを大腸菌内に導入した。これらの方法により得
られた抗生物質クロラムフェニコール耐性の大腸菌集団
をBACライブラリーまたはFosmidライブラリーとした。
ライブラリーからJCM９９７４の染色体をカバーするの
に適したクローンを選択して、クローンの整列化を行っ
た。

【００５０】（実施例4）各BACクローンまたはFosmid
クローンの塩基配列決定 整列化されたBAC或いはFosmid クローンについて順次以
下の方法で塩基配列を決定していった。大腸菌より回収
した各BAC或いはFosmidクローンのDNAを超音波処理する
ことにより断片化し、アガロースゲル電気泳動により1k
b及び2kb長のＤＮＡ断片を回収した。この断片をプラス
ミドベクターpＵＣ118のＨinc II 制限酵素部位に挿入
したショットガンクローンを各BAC或いはFosmidクロー
ン当たり500クローン作製した。各ショットガンクロー
ンの塩基配列をパーキンエルマー、ABI社製自動塩基配
列読み取り装置373または377を用いて決定していった。
各ショットガンクローンから得られた塩基配列を塩基配
列自動連結ソフトSequencherを用いて連結編集し、各BA
C或いはFosmidクローンの全塩基配列を決定していっ
た。

【００５１】（実施例5）プロリルエンドペプチダーゼ
遺伝子の同定 上記で決定された各BAC或いはFosmidクローンの塩基配
列の大型計算機による解析を行い、古細菌JCM9974のゲ
ノム解析データと照合して、プロリルエンドペプチダー
ゼをコードする遺伝子（配列表の配列番号２）を確認し
た。この遺伝子は、開始コドンから終止コドンまでで１
８５４塩基対からなり、そのコードするアミノ酸（ ６
１７アミノ酸）配列（配列番号１）は、パイロコッカス
フリオシス（Pyrococcus furiosus） のプロリルエ
ンドペプチダーゼと８６％の相同性を有していた。

【００５２】（実施例6）発現プラスミドの構築 構造遺伝子領域の前後に制限酵素（Nde I とXho I ）サ
イトを構築する目的で、次の２種のDNAプライマーを合
成した。プライマー１：５'-TTTTGAATTCTTGCATATGATGTC
AATGATAGAGAAG-３'（上流用プライマー、配列表の配列
番号３）プライマー２：５'-TTTTGGTACCTTTGGATCCTTATC
CCTCCTAGAGCTCAAATGCTAA-３')（下流用プライマー、配
列表の配列番号４）。このプライマー対を用いて、PCR
でその遺伝子の前後に制限酵素サイトを導入した。PCR
反応後、制限酵素（Nde I とXho I）で完全分解（３７
℃で２時間）した後、その構造遺伝子を精製した。

【００５３】ｐET-11ａ（Novagen社製）を制限酵素Nde
I とXho I で切断・精製した後、上記の構造遺伝子とT4
リガーゼで16℃,2時間反応させ連結した。連結したDNA
の一部をE.coli-ＸＬ2−BlueＭＲＦ’（Stratagene社
製）のコンピテントセルに導入し形質転換体のコロニー
を得た。得られたコロニーから発現プラスミドをアルカ
リ法で精製した。

【００５４】（実施例7）組換遺伝子の発現 大腸菌（E.coliBL21(DE3), Stratagene社製）のコンピ
テントセルを融解して、ファルコンチューブに0.1ｍL移
した。その中に発現プラスミド溶液を0.005ｍLを加え氷
中に30分間放置した後42℃でヒートショックを30秒間行
い、ＳＯＣmedium0.9mLを加え、37℃で1時間振とう培養
する。その後アンピシリンを含む2ＹＴ寒天プレートに
適量まき、37℃で一晩培養し、形質転換体を得た。当形
質転換体をアンピシリンを含む2ＹＴ培地1Lで600ｎｍの
吸収が1に達するまで培養した後、ＩＰＴＧ（Isopropyl
-b-D-thiogaractopyranoside）100mＭ溶液を10ｍｌ加え
さらに6時間培養した。培養後遠心分離（6,000ｒｐｍ、
20ｍｉｎ）で集菌した。

【００５５】（実施例8）好熱性酵素の精製 集菌した菌体の2培量のアルミナを加え,菌体を粉砕した
後、5倍量の10mＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）を加え
懸濁液を得た。得られた懸濁液を85℃で30分加熱後遠心
分離（11,000ｒｐｍ，20分）し、上澄みをＨｉＴｒａｐ
Ｑ（ファルマシア社製）カラムに吸着させ活性画分を得
た。

【００５６】（実施例9）酵素の諸性質 （１）分子量 Phastシステム（ファルマシア社製）を用いて１０％か
ら１５％のゲル勾配上でSDS-PAGEを実施した。溶出した
画分はアミノ酸配列から計算される適当な分子量（７０
ｋ）に相当する単一のバンドを示し、これを酵素の性状
解析のために使用した。

【００５７】測定分子量は、SDS-PAGEと共に、ＴＳＫゲ
ルＧ３０００ＳＷ_ＸＬカラム（ＴＯＳＨＯ，東京）上で
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を行って決定し
た。溶出は０．３M NaClを含む５０ｍM リン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐH６．８）で、流速0.8ｍｌ／分、室温で行
った。溶出したタンパク質を280nmにおけるUV吸収で検
出した。精製した酵素はSDS-PAGEでも、ゲルろ過の溶出
液からも共に７０キロダルトンであることが解った。

【００５８】（２）至適ｐＨ 酵素活性の至適ｐＨの測定は、５０ｍＭ酢酸ナトリウム
緩衝液，５０ｍＭリン酸緩衝液及び５０ｍＭ酢酸ナトリ
ウム緩衝液でｐＨ4〜9までの基質(Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro
-Ile-Val)3mM溶液を調整し、８５℃で酵素の加水分解活
性の初速度を測定することにより求めた。ｐＨ5.4最大
速度が得られたため、最適ｐＨは5.4と結論した。

【００５９】（３）至適温度 基質としてSer-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Valを使用し、50
ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．４）中に一定量の
酵素を加えて１０分反応させ、相対活性を調べた。最大
活性（至適温度）は95℃であった。

【００６０】（４）耐熱性（安定性） 当該酵素溶液（0.1mg/mL）を50ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ5.4）中、95℃で24時間加熱後、温度を85℃に
低下させ残存活性を調べたが、活性の低下は見られなか
った。

【００６１】（５）基質特異性 基質特異性は、基質として、i) Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-I
le-Val、ii) Cbz（カルボベンゾキシル）-Ala-Pro-Leu-
Gly-Pro、iii) Cbz-Ala-Pro-pNA(パラニトロアニリド)
iv) Cbz（カルボベンゾキシル）-Ala-Ala-pNA を用い
て測定した。さらに、v) Ala-Pro-pNA, vi) Gly-Pro-pN
Aも基質として使用した。すなわち、酵素溶液（0.1mg/m
L）を各種の基質（２mM)を含む50ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ5.4）中、８５℃で １時間インキュベートし
た後、触媒活性を調べた。

【００６２】活性は、加水分解後に生じるα-アミノ酸
をカドミウムニンヒドリンあるいは、p-ニトロアニリド
の吸収から検出した。その結果、基質i) Ser-Gln-Asn-T
yr-Pro-Ile-Val、基質 ii) Cbz-Ala-Pro-Leu-Gly-Pro、
基質iii) Cbz-Ala-Pro-pNAでは、プロリンのＣ末端側の
開裂が確認された。基質 iv) Ala-Pro-pNAおよびv) Gly
-Pro-pNAでは、加水分解した基質を得ることができなか
ったが、カルボベンゾキシルを結合させた同基質では、
プロリンのＣ末端側の開裂が観察された。これらをまと
めた結果を表１に示す。

【００６３】

【表１】

【００６４】従って、本発明の好熱性プロリルエンドペ
プチダーゼは、95℃の高温において、プロリンのＣ末端
側の選択的な加水分解開裂を触媒することが確認され
た。

【００６５】一方、遺伝子レベルでは、パイロコッカス
ホリコシ由来の好熱性プロリルエンドペプチダーゼと高
い相同性を有するパイロコッカスフリオシス由来のプロ
リルエンドペプチダーゼは、６５℃で不安定となり、自
己分解を起こすことがわかっている。

【００６６】（実施例１０）熱活性化機構 実施例７で得られた集菌した菌体の2培量のアルミナを
加え,菌体を粉砕した後、5倍量の10mＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ8.0）を加え懸濁液を得た。得られた懸濁液を
遠心分離（11,000ｒｐｍ，20分）し、上澄みをＨｉＴｒ
ａｐＱ（ファルマシア社製）カラムに吸着させ活性画分
を得た。

【００６７】得られた好熱性プロリルエンドペプチダー
ゼを、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．４）
中で、０．６０ｍｇ／ｍｌとし、インキュベーションし
た。各時間ごとに、酵素をサンプリングし、Ac−Leu−P
naを基質として、同バッファ中で８５℃にて活性を測定
した。それぞれの活性を図１に示す。温度はそれぞれ６
５℃（黒三角）、７５℃（白三角）、８５℃（黒丸）お
よび９５℃（白丸）である。図に示されているように、
９５℃での１８０分のインキュベーションにより、イン
キュベーションしなかった場合の約４倍もの比活性が得
られた。９５℃にて１８０分間処理した熱活性化したプ
ロリルエンドペプチダーゼ（HPEPh）は、９５℃での２
４時間処理でも安定であった。さらに、HPEPhを４−２
５℃に戻して同じ酵素反応を行っても、活性が落ちず、
HPEPhが、不可逆的に活性化されていることがわかっ
た。

【００６８】それぞれの熱処理の温度における、酵素の
比活性と時間との関係は、一次反応式に従う。速度定数
（k_act）は、図２に示すように、データを対数グラフに
プロットすることで得られる。それぞれのプロットは、
図１と同じ意味を表す。このグラフから、HPEPhは、熱
処理をしていないプロリルエンドペプチダーゼ（PEPh）
と比較して、酵素のモノマー分子のコンフォメーション
が変化し、分子同士の凝集や解離を伴わずに、酵素活性
が上昇していることがわかった。

【００６９】次に、基質としてSer-Gln-Asn-Tyr-Pro-Il
e-Valを使用し、50ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
５．４）中に一定量の酵素を加えて、各温度で１０分ず
つ反応させ、HPEPhと熱処理していない好熱性プロリル
エンドペプチダーゼ（PEPh）との相対活性を調べた。最
大活性（至適温度）はいずれも95℃付近であったが、温
度が上昇するにつれ、HPEPhが非常に高い活性を示し、
その差が大きくなるがわかった。図３に各温度におけ
る、両酵素の比活性を表すグラフを示す。グラフの黒丸
は、HPEPhを示し、白丸はPEPhを示す。

【００７０】

【発明の効果】本発明により、反応の至適温度が95℃で
あり、プロリン残基のＣ末端側での選択的な加水分解開
裂を触媒する新規な好熱性プロリルエンドペプチダーゼ
が提供できる。さらに、酵素分子が安定であるという事
から耐有機溶媒性の向上も期待できる。本発明の酵素に
より、高温下での、ポリペプチドのアミノ末端分析等が
可能になる。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Secretary of Agency of Industrial Science and Technology， Rakuto Kasei Industrial Co., Ltd. <120> Thermophilic Proryl Endopeptidase <130> P00X125ATA <160> 4 <210> 1 <211> 617 <212> PRT <213> Pyrococcus horikoshii <400> 1 フォームの始まり Met Val Glu Asp Pro Tyr Ile Trp Met Glu Asn Leu Gln Asp Asn Arg 1 5 10 15 Val Arg Glu Ile Ile Glu Arg Glu Asn Lys Lys Phe Arg Glu Phe Ile 20 25 30 Gly Glu Leu Ser Asp Lys Leu Phe Pro Glu Val Trp Glu Tyr Phe Ser 35 40 45 Ile Pro Thr Val Thr Met Ala Lys Ile Thr Lys Arg Gly Ile Ile Val 50 55 60 Ser Tyr Asn Glu Lys Asp Arg Ser Ile Ile Arg Trp Leu Asp Gly Asp 65 70 75 80 Val Ile Val Asp Ser Lys Glu Ile Glu Arg Glu Val Gly Asp Glu Val 85 90 95 Leu Leu Gln Gly Phe Thr Ala Asp Asp Glu Gly Glu Lys Leu Ala Tyr 100 105 110 Ser Phe Ser Ile Gly Gly Ala Asp Glu Gly Ile Thr Arg Ile Ile Asp 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Glu Val Ile Glu Glu Ile Lys Pro Ser Ile Trp Asn 130 135 140 Ile Leu Phe Leu Lys Asp Gly Tyr Tyr Phe Ala Arg Phe Tyr Arg Lys 145 150 155 160 Glu Lys Thr Pro Asp Gly Val Asp Pro Pro Ala Glu Arg Val Phe Trp 165 170 175 Lys Asp Lys Glu Gly Glu Lys Met Val Phe Gly Glu Gly Leu Thr Ser 180 185 190 Gly Tyr Phe Met Thr Leu Arg Lys Ser Ser Asp Asp Lys Phe Ala Met 195 200 205 Leu Thr Leu Asn Tyr Gly Trp Asn Gln Gly Glu Ile Tyr Val Gly Pro 210 215 220 Ile Asp Lys Pro Gln Glu Trp Arg Lys Val Tyr Ser Ala Thr Val Pro 225 230 235 240 Val Glu Pro Val Asp Ile Val Asn Gly Lys Leu Tyr Ile Leu Thr Arg 245 250 255 Glu Gly Arg Gly Met Gly Lys Val Ile Ala Val Lys Asp Gly Glu Ile 260 265 270 Glu Glu Val Ile Pro Glu Gly Glu Phe Pro Leu Glu Trp Ala Val Ile 275 280 285 Val Asp Asp Lys Ile Val Ala Gly Arg Leu Val His Ala Ser His Arg 290 295 300 Leu Glu Val Tyr Thr Leu Lys Gly Glu Lys Ile Glu Glu Val Thr Phe 305 310 315 320 Asp Ile Pro Gly Ala Leu His Pro Leu Asp Lys Asn Asn Lys Glu Val 325 330 335 Leu Leu Arg Tyr Ile Ser Phe Thr Ile Pro Tyr Arg Leu Tyr Glu Phe 340 345 350 Lys Asp Lys Leu Arg Ile Ile Glu Glu Arg Lys Val Glu Gly Lys Phe 355 360 365 Lys Val Glu Glu Asp Phe Val Val Ser Lys Asp Gly Thr Arg Ile His 370 375 380 Tyr Phe Ile Ile Lys Gly Glu Lys Asp Glu Lys Lys Ala Trp Val Phe 385 390 395 400 Gly Tyr Gly Gly Phe Asn Ile Ala Leu Thr Pro Arg Phe Phe Pro Gln 405 410 415 Val Ile Pro Phe Leu Lys Arg Gly Gly Thr Phe Val Met Ala Asn Leu 420 425 430 Arg Gly Gly Ser Glu Tyr Gly Glu Glu Trp His Arg Ala Gly Met Arg 435 440 445 Glu Asn Lys Gln Asn Val Phe Asp Asp Phe Ile Ala Val Leu Glu Lys 450 455 460 Leu Lys Lys Glu Gly Tyr Lys Val Ala Ala Trp Gly Arg Ser Asn Gly 465 470 475 480 Gly Leu Leu Val Ser Ala Thr Leu Thr Gln Arg Pro Asp Ile Met Asp 485 490 495 Ala Ala Leu Ile Gly Tyr Pro Val Ile Asp Met Leu Arg Phe His Lys 500 505 510 Leu Tyr Ile Gly Ser Val Trp Ile Pro Glu Tyr Gly Asn Pro Asp Asp 515 520 525 Pro Lys Asp Arg Glu Phe Leu Leu Lys Tyr Ser Pro Tyr His Asn Val 530 535 540 Asp Pro Asn Lys Lys Tyr Pro Leu Thr Leu Ile Tyr Thr Gly Leu His 545 550 555 560 Asp Asp Arg Val His Pro Ala His Ala Leu Lys Phe Phe Met Lys Leu 565 570 575 Lys Glu Val Gly Ala Pro Val Tyr Leu Arg Val Glu Thr Lys Ser Gly 580 585 590 His Met Gly Ala Ser Pro Glu Thr Arg Ala Arg Glu Leu Thr Asp Leu 595 600 605 Leu Ala Phe Val Leu Lys Ser Leu Ser *** 610 615 <210> 2 <211> 1851 <212> DNA <213> Pyrococcus horikoshii <400> 2 atggttgagg atccctacat ctggatggag aacctccaag ataatagggt tagagagata 60 attgaaaggg aaaataagaa gttcagagaa ttcattggag agcttagcga caaattattt 120 cccgaagttt gggaatactt ttcaatcccc acagtaacca tggccaagat aacgaagagg 180 ggaattatag tttcatataa cgagaaagat aggagcatta taaggtggct tgatggtgat 240 gttatagtcg attcaaagga aatagagagg gaagttggag atgaagtctt actccaggga 300 ttcacagcag acgacgaagg tgaaaagctg gcttacagct tttcaattgg aggtgctgac 360 gagggaataa cgaggataat cgacctcaag agtggagaag ttatagagga gataaagccc 420 tccatttgga acatattatt cttaaaggat ggctattact ttgcaaggtt ctataggaag 480 gagaaaactc ctgatggagt tgatcctccg gctgaaaggg tattctggaa ggataaagaa 540 ggagagaaga tggtgtttgg agaggggcta acatccggat acttcatgac tctcagaaag 600 agctcagatg ataagtttgc aatgctaacc ttgaactatg gatggaatca gggagaaata 660 tacgttggcc ccattgacaa gccccaggag tggaggaagg tttactctgc tactgttcct 720 gtggaacccg tagatatagt taacggaaaa ctctatatcc ttaccaggga aggaagagga 780 atggggaagg taatagcagt aaaggatggc gagattgagg aagtgattcc agagggggag 840 tttccattag agtgggccgt aatagttgat gataaaatag tagcgggaag gctcgttcac 900 gcaagccaca ggttggaggt ttatacatta aagggggaga aaattgaaga agtcactttt 960 gacattccag gggcactgca tccattagat aaaaacaaca aagaagttct cctcaggtac 1020 atcagcttca cgatccctta cagactctat gagttcaaag ataagctaag aattatagag 1080 gaaagaaagg ttgaagggaa atttaaggtt gaggaggact ttgtcgtaag caaagatgga 1140 acgaggattc attacttcat cattaaaggg gagaaggatg agaagaaggc gtgggtcttt 1200 ggatacggag gctttaacat agccttaacc cccaggttct tcccccaggt tataccattc 1260 ctcaaaaggg gaggaacatt cgttatggcc aacttaagag gaggaagcga atatggcgag 1320 gaatggcata gggccggaat gagggaaaac aaacagaatg tatttgatga cttcatagca 1380 gttcttgaga agcttaagaa agagggttac aaggttgcgg cctgggggag gagtaatggt 1440 gggcttttag tttctgcaac tttaacccag aggccagata ttatggatgc tgcattgatc 1500 ggttatccag tgatagatat gttgaggttc cataaacttt acataggaag cgtttggatt 1560 ccagaatatg ggaatccaga cgatcctaag gatagggagt tcctactgaa gtattctccc 1620 tatcacaatg tcgaccccaa caagaaatat cccctgacgc tcatctatac aggtttgcac 1680 gatgacaggg ttcatccagc acatgcacta aaattcttca tgaagcttaa ggaggttggt 1740 gctccagttt acctaagggt ggaaactaag agcgggcaca tgggagcttc accagaaact 1800 agggctaggg agcttacaga tcttttagct ttcgttttaa agtccctctc ttga 1854 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer to introduce a rest riction site <400> 3 ttttgaattc ttgcatatga tgtcaatgat agagaag 37 <210> 4 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer to introduce a rest riction site <400> 4 ttttggtacc tttggatcct tatccctcct agagctcaaa tgctaa 46

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の酵素を各温度でインキュベーション
した場合の比活性の変化を示した図である。

【図２】 本発明の酵素活性の比活性の変化を、対数グ
ラフで表した図である。

【図３】 熱処理した本発明の酵素と熱処理していない
本酵素の比活性を温度により比較した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/52 (Ｃ１２Ｎ 9/52 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 9/52 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｂ Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 下村 朗 滋賀県大津市関津四丁目５番１号 洛東化 成工業株式会社内 (72)発明者 安藤 進 滋賀県大津市関津四丁目５番１号 洛東化 成工業株式会社内 (72)発明者 小杉 佳次 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 石川 一彦 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 石田 紘靖 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA14 CA04 DA01 DA02 DA05 DA11 EA04 FA02 GA11 HA01 4B050 CC01 CC03 DD02 FF11E LL05 4B065 AA01Y AB01 AC02 BA02 CA33 CA60

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の特性を有する好熱性プロリルエン
   ドペプチダーゼ： a．分子量約７０，０００; b．至適温度９５℃以上１００℃以下； c. 至適ｐＨ５．４； d．安定性 約９５℃で２４時間安定。
2. 【請求項２】 原核生物に由来する、請求項１に記載の
   好熱性プロリルエンドペプチダーゼ。
3. 【請求項３】 パイロコッカス（Pyrocucous）属に由来
   する、請求項１に記載の好熱性プロリルエンドペプチダ
   ーゼ。
4. 【請求項４】 パイロコッカス ホリコシ（Pyrocucous
   horikoshii）に由来する、請求項１に記載の好熱性プ
   ロリルエンドペプチダーゼ。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列を有する、請求項１に記載の好熱性プロリルエンドペ
   プチダーゼ。
6. 【請求項６】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列において、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置
   換、または付加されたアミノ酸配列を含む、請求項１に
   記載の好熱性プロリルエンドペプチダーゼ。
7. 【請求項７】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離され
   たＤＮＡ分子。
8. 【請求項８】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列において、１またはアミノ酸残基が欠失、置換、また
   は付加されたアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオ
   チド配列を含む、単離されたＤＮＡ分子。
9. 【請求項９】 配列表の配列番号２に記載のポリヌクレ
   オチド配列を含む、請求項７に記載の単離されたＤＮＡ
   分子。
10. 【請求項１０】 配列表の配列番号２に記載のポリヌク
    レオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダ
    イズし得、かつ好熱性プロリルエンドペプチダーゼ活性
    を有するポリペプチドをコードする、単離されたＤＮＡ
    分子。
11. 【請求項１１】 請求項７から１０までのいずれかに記
    載のＤＮＡ分子を含む組換えベクター。
12. 【請求項１２】 好熱性プロリルエンドペプチダーゼの
    発現用のプロモーターの調節下に請求項７から１１まで
    のいずれかに記載のＤＮＡ分子を含んで成り、宿主細胞
    において、好熱性プロリルエンドペプチダーゼの活性を
    有するポリペプチドを発現する能力を有する、発現ベク
    ター。
13. 【請求項１３】 請求項１１または１２に記載のベクタ
    ーにより形質転換された形質転換体。
14. 【請求項１４】 微生物細胞、動物細胞、植物細胞また
    は昆虫細胞を宿主とする、請求項１３に記載の形質転換
    体。
15. 【請求項１５】 請求項１３に記載の形質転換体を培養
    する工程、得られる培養物より好熱性プロリルエンドペ
    プチダーゼを回収する工程を含む、好熱性プロリルエン
    ドペプチダーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。