JP5431339B2 - 酵素学的方法および酵素 - Google Patents
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Description
特に腋の悪臭を含む体の悪臭は、スルファニルアルコール、不飽和またはヒドロキシル化した酸、およびステロイドの3つの主要なクラスの化合物が原因である。本明細書に記載する方法は、スルファニルアルコールの形成を防止するインヒビターの同定に有用である。
スルファニルアルコールの放出に関して、本出願人はCorynebacterium sp. Ax20由来のシスタチオニンβ−リアーゼおよび前駆体化合物を同定した(A. Natsch et al., Chemistry & Biodiversity 2004, 1058)。
配列番号3および配列番号4の配列は、その仮想的な遺伝子産物として以前に配列データベースで公表されたが、そのタンパク質の機能、触媒活性および悪臭発生におけるその関与は知られていない。
新規のタイプのペプチダーゼおよび以前に本出願人らによって記載されたβ−リアーゼのいずれも、Corynebacteriaで発生する。理論にとらわれることを望むわけではないが、非常に不快な悪臭は主にCorynebacteriaによって新しい汗から放出されることが一般的に受け入れられている。
前駆体I(生理学的に関連性のある基質)は、一般式FII
R2およびR3は、独立してHおよびメチルからなる群から選択される
を有する。
R2およびR3はHおよびメチルからなる群から独立的に選択される
を有する。
ペプチダーゼは、本明細書の以下の「ペプチダーゼの基質」の項で詳述する式FIの非生理学的な基質にも反応し、これらはスクリーニングの目的に有用である。
(1)体の悪臭形成のモジュレーターを同定する方法であって、
(i)ペプチダーゼをペプチダーゼの基質および少なくとも1種の被検物質と接触させる工程、および
(ii)ペプチダーゼ媒介反応速度への前記少なくとも1種の被検物質の効果を決定する工程
を含み、
前記ペプチダーゼは、配列番号2および配列番号4からなる群から選択されるポリペプチド配列に少なくとも40%の配列同一性で相同であり、
前記ペプチダーゼは、以下の保存された部分配列:
105番目と150番目のアミノ酸の間にERDGRWYGRGXADCKG、
150番目と180番目のアミノ酸の間にEGSEEXG、
205番目と255番目のアミノ酸の間にHSGXXGGXAPDA、
385番目と425番目のアミノ酸の間にGGSIPL
を含み、
ここで、アミノ酸は天然に存在する形態の実質的に相同なペプチダーゼのN末端から始まって番号付けされており、アルファベットはアミノ酸一文字表記を示し、Xは20の標準アミノ酸のいずれか1つである、前記方法。
で表される化合物である、項目(1)の方法。
項目(2)の代替的な態様において、XはSである。
項目(3)の代替的な態様において、基質はS−ベンジル−Cys−Gly、O−ベンジル−Ser−Gly、(1−(2−ヒドロキシエチル)−1−メチルブチル)−L−システイニル−グリシン、S−ベンジル−Cys−Ala、およびO−ベンジル−Ser−Alaからなる群から選択される化合物である。
項目(3)の代替的な態様において、基質はPro−Gly、Ala−Gly、Ala−Ala、Pro−Alaからなる群から選択される化合物である。
(i)本明細書に記載の、特に項目(1)に定義されたペプチダーゼ、および
(ii)前記ペプチダーゼによって切断される基質化合物
を含む、被検物質を前記ペプチダーゼおよび悪臭形成のモジュレーターとして同定するためのキット。
で表される化合物である。
項目(5)のさらに別の態様では、式FIで表される前記基質化合物は、Pro−Gly、Ala−Gly、Ala−Ala、およびPro−Alaから選択される。
(7)ペプチダーゼのインヒビターを体の表面に適用し、前記ペプチダーゼは、本明細書に記載した、特に、限定することなく、項目(1)に記載したペプチダーゼである、体の悪臭形成を防止または減少させるための項目(6)の方法。
(8)インヒビターを、少なくとも1種の賦形剤を含む皮膚科学的に許容し得る組成物の形態で適用する、項目(7)の方法。
(10)ペプチダーゼ基質と、単離したペプチダーゼとを含む組成物であって、
前記ペプチダーゼは、本明細書に記載した、特に、限定することなく、項目(1)に記載のペプチダーゼであり、
前記ペプチダーゼ基質は、本明細書に記載した、特に項目(2)または(3)のいずれか1つ、またはその具体的な態様のいずれか1つに記載したペプチダーゼ基質である、
前記組成物。
(12)単離されたペプチダーゼであって、該ペプチダーゼは、本明細書に記載した、特に、限定することなく、項目(1)に記載したペプチダーゼであり、
前記ペプチダーゼは、配列番号2および配列番号4から選択される配列に少なくとも40%の配列同一性で相同である、前記単離されたペプチダーゼ。
他の態様では、配列同一性は少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%である。
配列同一性によって決定される、配列番号1のヌクレオチド配列と実質的に相同なヌクレオチド、
対応するタンパク質へ翻訳されるときにアミノ酸変化を生じない、配列番号1の保存的に改変された変異体であるヌクレオチド、
ハイブリダイゼーションによって決定される、配列番号1に実質的に相同なヌクレオチド
からなる群から選択され、
配列同一性によって決定される実質的に相同なヌクレオチドは少なくとも80%の配列同一性を有する、前記ヌクレオチド。
他の態様では、配列同一性は少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%である。
(16)発現ベクターが、該発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞の一部を形成する、項目(15)の単離されたヌクレオチド。
以下の節は、ペプチダーゼおよびその変異体、その基質、その反応産物、多様なスクリーニングアッセイおよびそれらを実行する方法を含む、体の悪臭のモジュレーターおよびインヒビターの同定におけるその利用を詳細に記載するものであり、これは、利用してもよい細胞、精製ペプチダーゼを利用するアッセイ、ペプチダーゼ転写アッセイ、ペプチダーゼ用発現系、ペプチダーゼの過剰発現、ペプチダーゼコンストラクトの細胞へのトランスフェクション、ペプチダーゼタンパク質回収、ペプチダーゼのモジュレーター、ペプチダーゼ基質の同定、結合アッセイ、モジュレーターを同定するキット、同定したモジュレーターの確認、大規模スクリーニングアッセイ、被検物質のライブラリー、被検物質のタイプ、パーソナルケア製品およびペプチダーゼ配列を含む。
本明細書に記載の方法で有用なペプチダーゼ(またはそれをコードするヌクレオチド)は、配列番号2(またはそれをコードするヌクレオチドについては配列番号1)のペプチダーゼ、配列番号4(またはそれをコードするヌクレオチドについては配列番号3)のペプチダーゼ、および配列番号2および/または配列番号4(またはそれをコードするヌクレオチドについては配列番号1および/または配列番号3)と実質的に相同であり、かつ依然として機能的である、すなわち、ペプチダーゼが、本明細書に記載する基質/悪臭物質前駆体と結合し、および/または該基質/悪臭物質前駆体と反応/該基質/悪臭物質前駆体を切断するペプチダーゼからなる群から選択されてもよい(またはヌクレオチドの場合、これらがかかるペプチダーゼをコードするならば、これらは機能的とみなされる)。例えば、限定することなく、ヒトの腋に天然に存在する、またはそこから単離可能なcorynebacteriaから誘導し得るペプチダーゼまたはペプチダーゼをコードするヌクレオチドである。
105番目と150番目とのアミノ酸の間にERDGRWYGRGXADCKG、
150番目と180番目とのアミノ酸の間にEGSEEXG、
205番目と255番目とのアミノ酸の間にHSGXXGGXAPDA、
385番目と425番目とのアミノ酸の間にGGSIPL。
Corynebacterium jeikeiumは、特に免疫不全患者での日和見感染について知られている。K411はヒトの腋から単離された。それは院内病原菌として認知されている皮膚微生物叢の、脂質要求性および多剤耐性の細 菌種である。
本明細書で用いる用語ペプチダーゼは、Ax20ペプチダーゼ(配列番号2)、K411ペプチダーゼ(配列番号4)、または本明細書に記載した、これらに実質的に相同なペプチダーゼを指してもよい。
配列番号1および2の配列(Ax20由来)は以前に記載されておらず、単離された配列番号4のペプチダーゼは以前に記載されていない。
上記全てのcorynebacteriaはヒトの腋から単離され、またはヒトの腋に存在し、悪臭形成酵素を発現して、悪臭を生成することができる。
ペプチダーゼはインタクトな細胞の形態、または、単離された形態、例えば粗抽出物などとして、または精製された形態で使用してもよい。例えば、粗抽出物は細胞の機械的な破壊によって生成することができる。任意に、ペプチダーゼは精製されていてもよい。代替的に、ペプチダーゼは本明細書に記載するように組み換え的に生成してもよい。
さらに、実質的に相同なペプチダーゼヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、保存的な変異および/または点変異によって生成してもよく、以下に詳細に示す保存的に改変された変異体を含む。
ヌクレオチド配列に関して、保存的に改変された変異体は、同一の、または本質的に同一のアミノ酸配列(保存的に置換されたアミノ酸、すなわち、アルギニンに置き換わったリジンおよび本明細書の以下に説明するさらなる例)をコードするヌクレオチドを意味する。
別の代替ガイドラインは、正であっても負であっても、全荷電アミノ酸を互いにとっての保存的置換として許容することである。
さらに、単一アミノ酸またはコードされた配列中の少ない割合のアミノ酸(例えば、26%まで、または20%まで、または10%まで)を変化、付加、または欠失させる個々の置換、欠失、または付加もまた、保存的に改変されたバリエーションとみなされる。
%配列同一性
実質的に相同なヌクレオチド配列は、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%の%配列同一性を有する。
実質的に相同なポリペプチド配列は、少なくとも40%、少なくとも42%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%の%配列同一性を有する。
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)は、http://www.ncbi.nlm.nih.govで利用可能なプログラムblastnによって利用されるヒューリスティック探索アルゴリズムである。ヌクレオチド問い合わせ配列の別のヌクレオチド配列に対する%同一性を決定するため、10のEXPECT(statistical significance threshold for reporting matches against database sequences)およびDUSTフィルタリングを含むBLASTバージョン2.2.1.3のデフォルトパラメータを用いて、Blastnを使用する。ポリペプチド問い合わせ配列の別のポリペプチド配列に対する%相同性を決定するため、10のEXPECTおよびDUSTフィルタリングを含むBLASTバージョン2.2.1.3のデフォルトパラメータを用いて、Blastpを使用する。
例えばスクリーニングされるゲノムDNAライブラリー中に存在する他のヌクレオチド配列のために、バックグラウンドハイブリダイゼーションが生じることがある。
「精製された形態」は、他のタンパク質および/または核酸混入物に対して80%以上、例えば、限定することなく、90%以上、95%以上、98%以上、99%以上、またはそれ以上(w/w)であることを意味する。
本ペプチダーゼの基質(例えば、限定することなく前駆体I)は、ジペプチド誘導体として一般的に記載してもよい。基質の例は、限定することなく、ala−alaおよびala−glyなどの単純なジペプチドを含む。本ペプチダーゼに対して最も高い親和性を有する基質は、cys−glyおよびcys−ala誘導体、特に本明細書に記載するcys−glyまたはcys−ala残基のS原子がアルキル化したL−cys−L−glyおよびL−cys−L−ala誘導体である。
cys−gly誘導体は、天然に存在するもの、例えば、限定することなく前駆体I、または、S−ベンジル−Cys−Glyを含むが、これに限定されない合成類似体であってもよい。
で表されるものであってもよい。
R2残基に関して、「C1〜C10アルキル」は、限定することなく、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、およびデシルを含み、「C1〜C10アルカノール」は、限定することなく、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、および任意に、アルキルまたはアルカノールの任意の分枝した形態を含む。
R2およびR3は、独立して、Hおよびメチルからなる群から選択される
を有する。
ペプチダーゼとの酵素反応産物は、単純なジペプチド基質については2つの遊離アミノ酸であり、またはgly誘導体については遊離グリシンおよびS置換cysまたはO置換ser誘導体であり、ala誘導体については、遊離アラニンおよびS置換cysまたはO置換ser誘導体である。
提供される新規のコンストラクトおよび産物(DNA、ベクター、組み換え細菌、タンパク質/ペプチダーゼ酵素)は、限定することなく、ペプチダーゼ反応のインヒビターをスクリーニングする場合に有用である。
インヒビターであるモジュレーターは、体の悪臭形成を防止するために製品(特に、脱臭剤を含むが、これに限定されないパーソナルケア製品)に添加する利益がある。同様に、本明細書の以下に記載するスクリーニング方法は、かかる製品中では避けるべきエンハンサーなどの他のモジュレーターの同定に使用することができる。
次いで、酵素的切断/反応速度へのモジュレーターの効果を、当該技術分野で周知の方法、例えば、限定することなく、本明細書に記載する方法によってモニターする。
酵素的切断/反応速度の変化は、遊離体切断速度または生成物形成速度(後者は二次産物を含む)によって決定する。
これらスクリーニングは、引き続き、または平行して、1つの反応ウェルで両酵素を用いて行うことができる。
適した細菌細胞は、天然にペプチダーゼを発現するすべてのcorynebacteria、例えば、限定することなく、Corynebacterium sp. 、Corynebacterium sp. Ax20、Corynebacterium striatum、Corynebacterium glaucum、Corynebacterium jeikeium、Corynebacterium jeikeium K411、Corynebacterium xerosis、Corynebacterium appendicis、Corynebacterium coyleae、Corynebacterium mucifaciens、Corynebacterium riegelii、およびCorynebacterium tuberculostearicumを含む。
細胞ベースアッセイを用いる代わりに、当該技術分野で周知の方法を用いて、本明細書で上記したペプチダーゼ発現細胞からペプチダーゼを精製し、次いで精製したペプチダーゼ、基質、および被検物質をin vitroで接触させる酵素アッセイを行い、本明細書に記載するペプチダーゼ反応速度の変化を決定することは、通常はより簡単であろう。任意に、結果を本明細書に記載するヒトの腋から得ることが可能なcorynebacteriaを用いて、in vivoで検証してもよい。
細胞ベースまたは酵素アッセイの代わりに、遺伝子転写のレベルに作用するモジュレーターを同定するアッセイを行ってもよい。被検物質をペプチダーゼを発現する野生型corynebacteriaに添加する。有限時間(例えば、30分〜8時間)後、被検物質を、細菌細胞を洗浄することによって、または遠心分離により細胞を収集することによって取り除く。その後、細菌細胞をペプチダーゼの量について分析し、その値を被検物質にさらされていないコントロール細胞と比較する。インヒビターは、細菌が生成するペプチダーゼの量を減少させ、したがって悪臭を形成する細菌の能力を低下させる。細菌細胞のペプチダーゼの量は、本明細書に記載する方法および基質を用いる活性アッセイによって、または、限定することなく配列番号2または配列番号4を含むペプチダーゼに特異的な抗体(モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれか)を産生し、その後、細菌細胞中のペプチダーゼを特異的に検出するため、好適な免疫学的検出方法、例えば、限定することなく、免疫ドットブロット、ウェスタンブロット、または酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)を用いることのいずれかによって決定することができる。
所望のタンパク質をコードするcDNAを発現させるために、典型的には、転写を誘導する強力なプロモーター、転写/翻訳ターミネーター、および翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含む発現ベクター中へ、適切なcDNAをサブクローニングする。好適な細菌プロモーターは当該技術分野で周知であり(例えば、E. coli、Bacillus sp.、およびSalmonellaなど)、かかる発現系のためのキットは市販されている。同様に、哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核生物発現系が市販されている。真核生物発現ベクターは、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、またはレトロウイルスベクターであってもよい。
タンパク質の発現に関して、当該技術分野で周知の、真核または原核細胞での発現のための従来のベクターを使用してもよい。ベクターの例は、細菌発現ベクター、例えば、pBR322ベースのプラスミド、pBADベースのプラスミド、pSKF、およびpET23Dを含むプラスミド、および融合発現系、例えば、GSTおよびLacZを含む。
さらなる発現ベクターおよび宿主株の例は、T. Maniatis et al. (Molecular Cloning, cold spring Harbor Laboratory, 1982)に記載されている。
in vitro転写および翻訳は、ペプチダーゼを発現するための別の選択肢である。
ペプチダーゼは強力な構成的プロモーター、例えばCMV初期プロモーターの制御下に置くことにより、過剰発現させてもよい。代替的に、過剰発現は誘導型プロモーター、例えば、限定することなく、ベクターpBAD-myc-his-Aのアラビノースプロモーターまたは本明細書の以下に記載するT-rex系の制御下で達成されてもよい。
標準のトランスフェクション法を、タンパク質を大量に発現する細菌細胞系、哺乳動物細胞系、酵母細胞系または昆虫細胞系を作製するのに用いることができる。
ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入する任意の既知の方法を用いてもよい。唯一必要なのは、使用する特定の遺伝子工学手順が、関連する遺伝子を対象となるタンパク質を発現することができる宿主細胞へ、成功裡に導入できることである。これら方法は、クローン化ゲノムDNA、cDNA、合成DNAまたは他の外来性遺伝物質を宿主細胞に導入することを伴ってもよく、これは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター(plasma vector)、ウイルスベクターなどの使用を含んでもよい。
トランスフェクション後、トランスフェクトした細胞は当該技術分野で周知の標準的な培養条件で培養してもよい。異なる細胞が、適切な温度および細胞培養培地を含む、異なる培養条件を要求することは、当業者には明白である。
必要に応じて、タンパク質を、標準的手法を用いて、細胞から回収してもよい。例えば、細胞を、機械的に、または浸透圧ショックによって、破裂開放してもよい。結果として生じる粗酵素はそのままで使用してもよく、または、例えば、イオン交換、疎水性相互作用、逆相、およびサイズ排除クロマトグラフィー工程を含むが、これらに限定されない沈殿およびクロマトグラフィー工程に供して、1または2以上の細胞残屑、細胞タンパク質、細胞核酸、および細胞混入物から分離してもよい。各工程後、溶出したタンパク質は、濾過および限外濾過を含むが、これらに限定されない手法によって、さらに精製および/または濃縮してもよい。代替的に、組み換えタンパク質は、組み換え細胞を培養した培養培地から回収してもよい(ペプチダーゼが培養培地への搬出をもたらす配列とともに発現される場合)。
ペプチダーゼ活性のモジュレーターおよび特にインヒビターは、本明細書の以下に記載のとおりに同定することができる。
本明細書に記載の方法で同定される物質の定義が以下に続く。
モジュレーターは、以下の1または2以上の増加または減少をもたらす物質である:基質のペプチダーゼへの結合、基質(例えば、限定することなく、悪臭物質前駆体)の悪臭物質または第二の悪臭物質前駆体への反応。モジュレーターは、それ自身がペプチダーゼに、基質結合部位または他の部位いずれかで結合することができ、異なる速度で切断または反応を受けるか、または全く受けないかのいずれかであってもよく、または基質に結合して、それによって反応/切断速度に影響を与えることができる。
基質はペプチダーゼに結合し、それによって切断または反応を受ける物質である。
エンハンサーは、基質のペプチダーゼへの結合を、エンハンサー非存在下における基質の結合と比較して増加させる、および/または基質の反応/切断速度を増加させる、および/または全体的なペプチダーゼ活性を増加させるモジュレーターである。
基質と結合して、それを反応/切断し、第二の前駆体および最終的に悪臭物質を形成するペプチダーゼの活性または活性の変化は、本明細書の以下に記載する方法によって決定することができる。
基質を同定するため、被検物質をペプチダーゼとともにインキュベートし、反応物質の形成または潜在的基質の消失を、本明細書に記載する分析方法により追跡する。ペプチダーゼと反応するあらゆる化合物を基質として定義する。ある基質の親和性を、他の既知の基質に対して評価するため、基質の希釈系列を一定濃度のペプチダーゼとインキュベートし、一定時間後の各基質濃度での切断速度を決定する。得られた曲線に基づいて、生化学的パラメーターVmax(ペプチダーゼ1分子によって毎秒切断される基質分子で表した最大反応速度)およびKm(酵素が最大反応速度の50%の活性を有する基質濃度を与えるMichaelis定数)を決定する。低いKmはペプチダーゼの基質への高い親和性を示し、したがって低いKmおよび高いVmaxを有する基質は、酵素にとって特によい基質である。しかしながら、スクリーニングアッセイにおいては、高いKmおよび低いVmaxを有する基質もまた使用してもよい。
単離されたペプチダーゼ(野生型または組み換え細胞由来)、または前記ペプチダーゼもしくはこれと実質的に相同な配列を発現する組み換え細胞を含み、および、前記ペプチダーゼの基質、例えば限定することなく、S−ベンジル−Cys−Gly、O−ベンジル−Ser−Gly、(1−(2−ヒドロキシエチル)−1−メチルブチル)−L−システイニル−グリシン、S−ベンジル−Cys−Ala、O−ベンジル−Ser−Ala、Pro−Gly、Ala−Gly、Ala−Ala、Pro−Alaを含むキット、例えば、スクリーニングキットまたはハイスループットスクリーニングキットである。
キットの任意構成要素は、提供される組み換え細胞を培養するための適した培地、および、細胞をそこで生育させる培養デバイス、例えばマイクロタイタープレートを含んでもよく、当業者は、これら任意構成要素を容易に入手することができる。
(i)ペプチダーゼを発現する組み換え細胞を生育させること、または代替的に、単離されたペプチダーゼを提供すること、
(ii)適した濃度のペプチダーゼ基質の存在下で少なくとも1種の被検物質を加えること、および
(iii)ペプチダーゼによる基質/その1種または2種以上の産物の切断/反応速度の変化、または基質のペプチダーゼへの結合の変化を、被検物質の存在下および非存在下での応答を比較することにより決定し、それによって被検物質をモジュレーターとして同定すること。
(i)被検物質を、任意に約1ナノモル〜約5ミリモルの濃度で、ペプチダーゼを含むアッセイ緩衝液に加え、
(ii)被検物質のペプチダーゼへの結合を可能にする所定のプレインキュベーション期間(任意に0〜15分)の後、選択した基質を適した濃度で加え、
(iii)ペプチダーゼによる基質またはその1種もしくは2種以上の産物の切断/反応速度の変化、またはペプチダーゼへの基質結合の変化を、被検物質の存在および非存在下での応答を比較することにより決定し、それによって被検物質をモジュレーターとして同定する。
(i)ペプチダーゼタンパク質を発現する組み換え細胞を培養で生育させ、
(ii)任意に約1ナノモル〜約5ミリモルの濃度の被検物質を、適した濃度の基質存在下で、培養培地に加え、
(iii)ペプチダーゼによる基質またはその1種もしくは2種以上の産物の切断/反応速度の変化、またはペプチダーゼへの基質結合の変化を、被検物質の存在下および非存在下での応答を比較することにより決定し、それによって被検物質をモジュレーターとして同定する。
本明細書の上述の方法により同定したモジュレーターは、以下に詳細に示す、サンプルの臭いを嗅ぐ試験者のパネルによる簡単な官能実験によって、容易に確認することができる。サンプルはペプチダーゼおよびβ−リアーゼにさらされ、基質として以下の式FI
で表される化合物、および生成した任意の酵素反応産物を含む。
本明細書の上述のアッセイは、ライブラリーを、ペプチダーゼ活性を調節する物質についてスクリーニングするのによく適している。
アッセイは、アッセイの工程の自動化、および(例えば、ロボットアッセイでのマイクロタイタープレート上でのマイクロタイター型式で)典型的には平行して実行される、アッセイへの、好都合な供給源由来の化合物の提供により、大規模な化学ライブラリーをスクリーニングするために設計してもよい。
合成化合物ライブラリーは、Maybridge Chemical Co.(Trevillet, Cornwall, UK)、Comgenex(Princeton, N.J.)、Brandon Associates(Merrimack, N.H.)、およびMicrosource(New Milford, Conn.)を含む複数の会社から市販されている。
遊離体および直接的または間接的な産物(例えば、限定することなく、基質/前駆体I、前駆体II、悪臭物質)の増加または減少を測定することにより切断/反応速度を測定する本明細書の上述の機能的な方法の代わりに、基質のペプチダーゼへの結合を測定する当該技術分野で周知の結合アッセイによって、基質結合を決定してもよい。モジュレーターのペプチダーゼポリペプチドへの結合は、例えば、限定することなく、分光学的な特性(例えば蛍光、吸光度または屈折率)の変化の測定、(例えば形状(shape)を利用する)水力学的な方法、クロマトグラフィー、ペプチダーゼポリペプチドの溶解特性の測定によって決定することができる。
コンビナトリアル化学ライブラリーは、複数の化学的「ビルディングブロック」、例えば試薬などを組み合わせることにより、化学合成または生物学的合成のいずれかによって産生した多様な化学物質の収集物である。例えば、線形コンビナトリアル化学ライブラリー、例えばポリペプチドライブラリーなどは、1組の化学的ビルディングブロック(アミノ酸)を、所与の化合物の長さ(すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸数)に対して、全ての可能な方法で組み合わせることによって形成される。数百万の化学物質を、かかる化学的ビルディングブロックのコンビナトリアルな混合を介して合成することができる。
希少な化学ライブラリーは、Aldrich(Milwaukee, Wis.)から入手可能である。
被検物質は、低分子化学物質、化学的ポリマー、生物学的ポリマー、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、核酸および脂質を含む任意の物質であってもよい。物質は、合成化合物、化合物の混合物、天然物または天然のサンプル、例えば植物抽出物、培養上清、または組織サンプルであってもよい。
同定された酵素インヒビター/悪臭中和物質(malodour counteractants)は、体の悪臭を防止するために多様な製品に添加してもよい。例えば、パーソナルケア製品は、限定することなく、脱臭剤、制汗剤、ローション、クリーム、膏(salve)、パウダー、ボディローション、軟膏、石鹸、シャンプー、ファインフレグランス、オーデコロン、オーデトワレを含む。パーソナルケア製品は香料入りであっても、または香料を含まなくてもよい。かかる製品は、通常は当該技術分野で周知の複数の賦形剤を含有する。パーソナルケア製品の悪臭中和効果は、ペプチダーゼのエンハンサーとして同定されたすべての成分を除外することによって、さらに改良することができる。
同定されたモジュレーター/インヒビターは、水溶液、エマルジョン、アルコール性溶液、シリコン溶液、油、またはワックスに添加してもよい。
本明細書に記載のコンストラクトおよび方法に利用する配列は、本明細書の以下の配列表に見出すことができる。
配列番号1:Corynebacterium sp. Ax20由来のペプチダーゼのヌクレオチド配列
配列番号2:Corynebacterium sp. Ax20由来のペプチダーゼのアミノ酸配列
配列番号3:Corynebacterium jeikeium K411由来のペプチダーゼのヌクレオチド配列
配列番号4:Corynebacterium jeikeium K411由来のペプチダーゼのアミノ酸配列
配列番号5:Corynebacterium sp. Ax20由来のβ−リアーゼのヌクレオチド配列
配列番号6:Corynebacterium sp. Ax20由来のβ−リアーゼのアミノ酸配列
全ての例は、Corynebacteria、特に2001年4月26日にD-38124 Braunschweigの国際寄託機関DSMZ- German Collection of Microorganisms and Cell Culturesに提出された、Corynebacterium sp. Ax20(「Ax20」)、DSM 14267(Accession Number DSM 14267)およびCorynebacterium jeikeium K411 (「K411」)(Tauch et al. 2005, J Bacteriol. 187(13): 4671-82)由来のDNA配列を使用する。
ペプチダーゼ(配列番号2)の単離
細胞抽出物は以下のように作製した。Ax20の一晩培養物を遠心分離で収集し、少量の緩衝液A(50mM NaCl、50mM NaH2PO4/K2HPO4、pH7)に再懸濁して、10倍量のガラスビーズ(425〜600μm, Sigma, St-Louis, USA)で修正し、最大速度で30分間ボルテックスすることにより機械的に破壊した。ライセートを遠心分離し、上清を保存した。得られたCorynebacterium sp. Ax20細胞抽出物を、その後引き続き次のカラムで分画した。1.フェニルセファロース(疎水性相互作用クロマトグラフィー)、2.Mono-Q(強陰イオン交換)、3.Mono-P(弱陰イオン交換)、および4.Superdex 200(ゲル濾過)。
これら4つの精製工程の後、調製物をSDS−PAGEゲル上で分離した。活性画分に固有のゲルバンドを切除し、それによってペプチダーゼを得た。
遺伝子(配列番号1)のクローニングおよびペプチダーゼ(配列番号2)をコードする核酸配列の単離
例1で得たペプチダーゼを、トリプシン消化およびペプチド配列分析に供した。これら単離されたペプチド配列に基づき、Corynebacterium sp. Ax20のゲノムDNAをテンプレートとして使用し、ポリメラーゼ連鎖反応で遺伝子の部分配列を増幅するようにプライマーを設計した。
その後、完全な遺伝子配列を、Corynebacterium sp. Ax20の染色体ライブラリーを用いて、染色体歩行によって単離した。
それによって、配列番号1に示す、ペプチダーゼ配列の完全なオープンリーディングフレームを得た。
Ax20ペプチダーゼの異種発現、産生および精製
ペプチダーゼ(配列番号1)のオープンリーディングフレーム(ORF)を、Corynebacterium sp. Ax20の染色体DNAから、特異的なプライマーを使用してPCRによって増幅した。ORFを、6×ヒスチジンタグをコードする配列にライゲーションし、発現ベクター(pET-3a, Studier and Moffatt, 1986)にクローニングした。得られたプラスミドを、E. coli株(BL21(DE3))に形質転換した。
代替的に、6×ヒスチジンタグ無しのORFを、同じベクターにクローニングした。
酵素を精製するために、透明な細胞ライセートをNi−NTAアフィニティーカラム(Qiagen, Hilden, Germany)にロードした。カラムを20mMのイミダゾールを含有する緩衝液で洗浄し、最終的に、100〜250mMの増加する濃度のイミダゾールを有する緩衝液で溶出した。得られた溶出液は、SDS−PAGEで示すように、純度>95%の組み換え酵素を含有していた。
K411ペプチダーゼ(配列番号4)の異種発現および産生
Corynebacterium K411由来の配列番号4のペプチダーゼを、配列番号2について上記したように発現させ、産生し、および精製した。
Ax20およびK411ペプチダーゼの活性
例3および4に記載したとおりに作製した50mlの組み換えE. coli培養物を収集して、最終容量3mlのリン酸緩衝液に再懸濁し、その後超音波処理によって破壊した。可溶抽出物を遠心分離によって透明にした。得られた抽出物の様々な希釈溶液を、cys−gly複合体(1mM)とともに、過剰量のβ−リアーゼ存在下においてだけでなく非存在下においてもインキュベートした。ネガティブコントロールとして、空ベクターで形質転換したE.coli由来の透明な細胞ライセートおよびcys−gly複合体を有するがβ−リアーゼを有しない細胞ライセートを使用した。
以下の表に示すように(列2〜7を参照)、悪臭物質(3−スルファニル−3−メチル−ヘキサノール)は、(配列番号2/Ax20または配列番号4/K411のペプチダーゼを発現する)配列番号1または配列番号3を含有するプラスミドで形質転換した組み換えE.coli株によってのみ、およびβ−リアーゼ存在下においてのみ、cys−gly複合体から放出された。K411ペプチダーゼは、Ax20ペプチダーゼより低い効率でcys−gly複合体を切断する(列7参照)。
示したとおり、ヒスチジンタグはペプチダーゼ活性への顕著な効果を何ら有しない。
ペプチダーゼの基質特異性
例3で記載したとおりに作製した組み換えAx20ペプチダーゼ(アフィニティーカラム精製のタグ付酵素)を、基質特異性を特徴付けるため、およびスクリーニングアッセイ(例えば、インヒビターを含むモジュレーターのスクリーニングのための)に有用な基質の同定のため、様々な化合物、特に潜在的な候補ジペプチド基質とともにインキュベートした。
切断は薄層クロマトグラフィーで決定した。
量は定性的であり、(++)は1時間のインキュベーション中の0.1μg/mlのペプチダーゼによる1mM溶液の>80%の切断を示し、(+++)は1時間のインキュベーション中の1μg/mlのペプチダーゼによる1mM溶液の完全な切断を示し、(+)は1時間のインキュベーション中の1μg/mlのペプチダーゼによる1mM溶液の部分的な切断(20〜80%)示し、(−)は何らの切断もないことを示す。
ペプチダーゼのモジュレーター/インヒビターの同定方法
組み換えAx20ペプチダーゼ(配列番号2)の添加によるペプチド基質Pro−Glyの切断は、フルオレサミン(FluramTM, Fluka, Buchs, Switzerland)によって誘導体化が可能な固有の遊離NH2基を放出した。
リン酸緩衝液に溶解したAx20ペプチダーゼをマイクロタイタープレート個々のウェルに加え(1μg/mlのペプチダーゼ)、平衡化、およびインヒビターがある場合にはインヒビターのペプチダーゼへの結合を可能にするため、5分間インキュベートする。
リン酸緩衝液に溶解した基質Pro−Glyは、1mMの最終濃度となるように各ウェルの被検化合物/ペプチダーゼ混合物に加える。
インヒビターは、通常、例えば1mM、100μM、10μM、1μM、またはそれ未満の濃度での、少なくとも50%の阻害率の阻害で同定される。
多様なペプチダーゼ酵素を用いたペプチダーゼモジュレーター/インヒビターの同定方法
例7を、ペプチダーゼ酵素を置換し、配列番号4(K411ペプチダーゼ)、または配列番号4もしくは配列番号2(Ax20ペプチダーゼ)のホモログの1または2以上を使用することを除き、記載したとおりに行ってもよい。
広い阻害スペクトルを有するペプチダーゼのモジュレーター/インヒビターの同定方法
例7を、配列番号2、配列番号4、または配列番号4もしくは配列番号2のホモログから選択される2または3以上のペプチダーゼ酵素を、引き続きまたは平行して使用することを除き、記載したとおりに行ってもよい。平行して行う場合、酵素反応は適合する緩衝液を使用して、同じウェルの中で行ってもよい。
これは、両ペプチダーゼに作用する化合物を同定し、多様な細菌株に対して広い阻害活性を有する阻害性化合物を同定する利点がある。
ペプチダーゼおよび/またはβ−リアーゼに対して活性を有するペプチダーゼのモジュレーター/インヒビターの同定方法
本例は、例7に記載したスクリーニングアッセイの代わりとして、以下の改変とともに行った。
基質として、cys−gly複合体または本明細書で上記した基質構造の化合物を使用する。
これらは、(S−ベンジル)−cys−gly、(S−ベンジル)−cys−ala、または任意のS置換cys−glyまたは置換cys−ala複合体、例えば、S−エチル−、S−プロピル−、S−ブチル−、S−ペンチル−、S−ヘキシル−、S−フェニル−cys−glyまたは−cys−alaを含む。
代替的に、セリンのOH基で置換された、置換ser−alaまたは置換ser−gly誘導体を使用する。同様の多種類のセリンでの置換基が、システインと同じように可能である。
以下に示す結果に関しては、(S−ベンジル)−cys−glyを使用した。
代替的に、N−(9−アクリジニル)マレイミドおよび359/440nmでの蛍光検出を含む、他のチオール誘導体化物質を使用した。
1種または2種以上のペプチダーゼ(配列番号2および/または配列番号4)およびAMREに対して活性を有する広域モジュレーター/インヒビターの同定方法
例7または8への追加の工程において、同定したペプチダーゼインヒビターをAMRE酵素(EP1258531にNatschによって記載されたNα−アシル−グルタミン−アミノアシラーゼ)に対するモジュレーション効果について試験し、それによって悪臭放出に関与する両メタロペプチダーゼ酵素のデュアルインヒビターを同定した。
代替的に、工程を酵素の存在下で同時に平行して行うことができる。
AMREはEP1258531の例6に記載されたとおりに作製する。
結果を以下の表に収載する。
Ax20細胞ライセートまたはβ−リアーゼで切断した場合のcys−gly複合体切断における差異
被検化合物(Cys複合体(1mM)またはCys−Gly複合体(1mM))を、β−リアーゼとともにインキュベートした。
また、被検化合物(cys複合体(1mM)またはcys−gly複合体(1mM))を、配列番号2のペプチダーゼを天然に含有する野生型株Corynebacterium sp. Ax20の抽出物とともにインキュベートした。Corynebacterium sp. Ax20の細胞抽出物は、例1に記載したとおりに調製した。得られた抽出物を、光学密度OD 4となるように調整したときに最初の培養液が有したのと同じ容量になるまで希釈した。基質は24時間抽出物とともにインキュベートした。
しかしながら、ヒト被検対象の腋から単離したC. sp. Ax20由来の抽出物は、両複合体から3−スルファニル−3−メチル−ヘキサノールを放出する。(上記表の3行目参照)。
C. sp. Ax20由来の別々の抽出物画分は悪臭物質を放出できない
例1に記載したとおりにC. sp. Ax20から得た細胞抽出物を、Mono-Q陰イオン交換カラムを用いて分画した。得られた画分を、cys−gly複合体とともに別々にインキュベートし、3−スルファニル−3−メチル−ヘキサノール(悪臭物質)の放出を例1に記載したとおりに測定した。
結果は、C. sp. Ax20抽出物のいずれの単一画分も、cys−gly複合体から3−スルファニル−3−メチル−ヘキサノールを放出できなかったことを示した。このことは、C. sp.抽出物中には、cys−gly複合体から悪臭物質を放出することのできる単一の酵素が存在しないことを実証する。
β−リアーゼと併用した場合にC. sp.抽出物画分は悪臭物質を放出する
C. sp. Ax20細胞抽出物の画分を、例11に記載したとおりに作製した。
各画分をβ−リアーゼとともに、およびcys−gly複合体とともにインキュベートした。3−スルファニル−3−メチル−ヘキサノール(悪臭物質)の放出を、上記例1に記載したとおりに測定した。
例11の結果とともに、このことは、2種類の酵素がcys−gly複合体の切断を媒介していることを実証する。まずペプチダーゼがglyおよびcys残基の間でジペプチドを切断し、次いでβ−リアーゼがその後、ペプチダーゼによって形成されたcys複合体から悪臭物質を放出する。
Corynebacteria抽出物による悪臭放出はペプチダーゼインヒビターによって阻害される
C. sp. Ax20およびC. jeikeium K411由来の抽出物を、例1に記載したとおりに作製した。
o−フェナントロリン(0.5mM)、メタロペプチダーゼインヒビターまたは、メタロペプチダーゼインヒビターを含まないが、特異性の広いセリンおよびアスパラギン酸ペプチダーゼのインヒビターを含有するプロテアーゼインヒビター混合物であるCompleteTM(EDTA不含)(Roche biochemicals, Switzerland、製造者によって指示された使用濃度)を抽出物のバッチに加え、10分間インキュベートした。
Corynebacteria細胞ライセートにおける酵素活性を示す悪臭物質3−スルファニル−3−メチル−ヘキサノールの放出を、例12および13に記載したとおりに測定した。
メタロペプチダーゼインヒビターo−フェナントロリンの添加は、C. sp.由来の抽出物を使用した場合、Cys複合体の切断は阻害しないが(0%阻害率)、cys−gly複合体の切断を阻害する(100%阻害率)。同様に、C. jeikeiumの抽出物に関しては、cys複合体に対する顕著な阻害はないが、cys−gly複合体の高い阻害がある(93%)。
このことはまた、β−リアーゼ反応(Cys複合体の切断)がo−フェナントロリンによっては阻止されないが、cys−gly結合の切断のみが阻害されることを示し、Corynebacteria由来の抽出物中のメタロペプチダーゼが専らこの反応を触媒することを示す。
様々なセリンおよびアスパラギン酸ペプチダーゼに対して広い特異性を有するプロテアーゼインヒビターの混合物(CompleteTM)は、いずれの複合体の切断も顕著に阻止しなかったが、これはセリン/アスパラギン酸ペプチダーゼが悪臭物質の放出に関与していないことを示す。
Claims (13)
- 体の悪臭形成のモジュレーターを同定する方法であって、
(i)ペプチダーゼをペプチダーゼ基質および少なくとも1種の被検物質と接触させる工程、および
(ii)前記少なくとも1種の被検物質のペプチダーゼ媒介反応速度への効果を決定する工程
を含み、前記ペプチダーゼは、式FIII
前記ペプチダーゼは、配列番号2および配列番号4からなる群から選択されるポリペプチド配列に少なくとも90%の配列同一性で相同であり、
前記ペプチダーゼは、以下の保存された部分配列:
105番目と150番目のアミノ酸の間にERDGRWYGRGXADCKG、
150番目と180番目のアミノ酸の間にEGSEEXG、
205番目と255番目のアミノ酸の間にHSGXXGGXAPDA、
385番目と425番目のアミノ酸の間にGGSIPL
を含み、
ここでアミノ酸は配列番号2または配列番号4のポリペプチド配列のN末端から始まって番号付けされており、アルファベットはアミノ酸一文字表記を示し、Xは20の標準アミノ酸のいずれか1つである、前記方法。 - 基質が、S−ベンジル−Cys−Gly、O−ベンジル−Ser−Gly、(1−(2−ヒドロキシエチル)−1−メチルブチル)−L−システイニル−グリシン、S−ベンジル−Cys−Ala、O−ベンジル−Ser−Ala、Pro−Gly、Ala−Gly、Ala−Ala、およびPro−Alaからなる群から選択される化合物である、請求項1に記載の方法。
- 追加の酵素であるシスタチオニン−β−リアーゼを、基質および被検物質とともに、平行してまたは引き続きインキュベートし、工程(ii)において、ペプチダーゼとβ−リアーゼ酵素とによる切断への被検物質の効果を、チオール反応産物およびヒドロキシ反応産物から選択される少なくとも1種の反応産物の形成の変化によって決定する、請求項1または2に記載の方法。
- 組み合わせて用いるための
(i)ペプチダーゼ、および
(ii)ペプチダーゼによって切断される基質化合物
を含む、被検物質を前記ペプチダーゼおよび悪臭形成のモジュレーターとして同定するためのキットであって、
前記基質化合物は、S−ベンジル−Cys−Gly、O−ベンジル−Ser−Gly、(1−(2−ヒドロキシエチル)−1−メチルブチル)−L−システイニル−グリシン、S−ベンジル−Cys−Ala、O−ベンジル−Ser−Ala、Pro−Gly、Ala−Gly、Ala−Ala、およびPro−Alaからなる群から選択され、
前記ペプチダーゼは、式FIII
前記ペプチダーゼは、配列番号2および配列番号4からなる群から選択されるポリペプチド配列に少なくとも90%の配列同一性で相同であり、
前記ペプチダーゼは、以下の保存された部分配列:
105番目と150番目のアミノ酸の間にERDGRWYGRGXADCKG、
150番目と180番目のアミノ酸の間にEGSEEXG、
205番目と255番目のアミノ酸の間にHSGXXGGXAPDA、
385番目と425番目のアミノ酸の間にGGSIPL
を含み、
ここでアミノ酸は配列番号2または配列番号4のポリペプチド配列のN末端から始まって番号付けされており、アルファベットはアミノ酸一文字表記を示し、Xは20の標準アミノ酸のいずれか1つである、前記キット。 - ペプチダーゼを、その基質を切断するその能力において阻害する方法であって、前記ペプチダーゼをペプチダーゼインヒビターと接触させ、該ペプチダーゼは、式FIII
前記ペプチダーゼは、配列番号2および配列番号4からなる群から選択されるポリペプチド配列に少なくとも90%の配列同一性で相同であり、
前記ペプチダーゼは、以下の保存された部分配列:
105番目と150番目のアミノ酸の間にERDGRWYGRGXADCKG、
150番目と180番目のアミノ酸の間にEGSEEXG、
205番目と255番目のアミノ酸の間にHSGXXGGXAPDA、
385番目と425番目のアミノ酸の間にGGSIPL
を含み、
ここでアミノ酸は配列番号2または配列番号4のポリペプチド配列のN末端から始まって番号付けされており、アルファベットはアミノ酸一文字表記を示し、Xは20の標準アミノ酸のいずれか1つである、前記方法。 - ペプチダーゼ基質と、単離されたペプチダーゼとを含む組成物であって、該ペプチダーゼ基質は、S−ベンジル−Cys−Gly、O−ベンジル−Ser−Gly、(1−(2−ヒドロキシエチル)−1−メチルブチル)−L−システイニル−グリシン、S−ベンジル−Cys−Ala、O−ベンジル−Ser−Ala、Pro−Gly、Ala−Gly、Ala−Ala、およびPro−Alaからなる群から選択され、
前記ペプチダーゼは、式FIII
前記ペプチダーゼは、配列番号2および配列番号4からなる群から選択されるポリペプチド配列に少なくとも90%の配列同一性で相同であり、
前記ペプチダーゼは、以下の保存された部分配列:
105番目と150番目のアミノ酸の間にERDGRWYGRGXADCKG、
150番目と180番目のアミノ酸の間にEGSEEXG、
205番目と255番目のアミノ酸の間にHSGXXGGXAPDA、
385番目と425番目のアミノ酸の間にGGSIPL
を含み、
ここで配列番号2または配列番号4のポリペプチド配列のN末端から始まって番号付けされており、アルファベットはアミノ酸一文字表記を示し、Xは20の標準アミノ酸のいずれか1つである、前記組成物。 - ペプチダーゼが、単離された形態、機能的なペプチダーゼを含有する調製物の形態、適した宿主細胞における異種発現の形態、ペプチダーゼを発現するCorynebacterium jeikeiumの形態、およびペプチダーゼを発現するCorynebacterium jeikeium K411の形態からなる群から選択される形態である、請求項6に記載の組成物。
- 単離されたペプチダーゼであって、
前記ペプチダーゼは、式FIII
前記ペプチダーゼは、配列番号2のポリペプチド配列に少なくとも90%の配列同一性で相同であり、
前記ペプチダーゼは、以下の保存された部分配列:
105番目と150番目のアミノ酸の間にERDGRWYGRGXADCKG、
150番目と180番目のアミノ酸の間にEGSEEXG、
205番目と255番目のアミノ酸の間にHSGXXGGXAPDA、
385番目と425番目のアミノ酸の間にGGSIPL
を含み、
ここでアミノ酸は配列番号2のポリペプチド配列のN末端から始まって番号付けされており、アルファベットはアミノ酸一文字表記を示し、Xは20の標準アミノ酸のいずれか1つである、前記ペプチダーゼ。 - ペプチダーゼをコードするヌクレオチドであって、
(i)配列同一性によって決定される、配列番号1のヌクレオチド配列と実質的に相同なヌクレオチド配列、
(ii)対応するタンパク質へ翻訳されるときにアミノ酸変化を生じない、配列番号1の保存的に改変された変異体であるヌクレオチド配列、
(iii)ストリンジェントなハイブリダイゼーションによって決定される、配列番号1に実質的に相同なヌクレオチド配列
からなる群から選択され、
配列同一性によって決定される(i)の実質的に相同なヌクレオチド配列は、少なくとも90%の配列同一性を有し、
前記ペプチダーゼは、式FIII
前記ペプチダーゼは、配列番号2のポリペプチド配列に少なくとも90%の配列同一性で相同であり、
前記ペプチダーゼは、以下の保存された部分配列:
105番目と150番目のアミノ酸の間にERDGRWYGRGXADCKG、
150番目と180番目のアミノ酸の間にEGSEEXG、
205番目と255番目のアミノ酸の間にHSGXXGGXAPDA、
385番目と425番目のアミノ酸の間にGGSIPL
を含み、
ここでアミノ酸は配列番号2のポリペプチド配列のN末端から始まって番号付けされており、アルファベットはアミノ酸一文字表記を示し、Xは20の標準アミノ酸のいずれか1つである、前記ヌクレオチド。 - 単離されたヌクレオチドが発現ベクターの一部を形成する、請求項9に記載の単離されたヌクレオチド。
- 発現ベクターが、発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞の一部を形成する、請求項10に記載の単離されたヌクレオチド。
- ペプチダーゼを形成する方法であって、該ペプチダーゼをコードする発現ベクターを含む宿主細胞を発現に十分な条件下で培養し、それによってペプチダーゼを形成する工程を含み、該ペプチダーゼは、式FIII
前記ペプチダーゼは、配列番号2のポリペプチド配列に少なくとも90%の配列同一性で相同であり、
前記ペプチダーゼは、以下の保存された部分配列:
105番目と150番目のアミノ酸の間にERDGRWYGRGXADCKG、
150番目と180番目のアミノ酸の間にEGSEEXG、
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