BRPI0818162B1 - Método para identificar modulador da formação de mau cheiro no corpo, kit, método para inibir peptidase em sua capacidade de clivar seu substrato e método para formar peptidase - Google Patents

Abstract

métodos enzimáticos e enzimas. a presente invenção refere-se a métodos para identificar moduladores e em particular inibidores de formação de mau cheiro no corpo, empregando enzimas peptidase, as enzimas peptidase e as sequências de nucleotídeos correspondentes, vetores de expressão, células hospedeiras transfectadas, métodos para formar as enzimas peptidase e métodos para prevenir mau cheiro no corpo.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção refere-se a métodos para identificar moduladores da formação de mau cheiro corporal empregando nucleotídeos que codificam peptidases, constructos para a expressão de peptidases e células contendo tais constructos, e as peptidases resultantes.

[002] Os nucleotídeos codificam proteínas que são enzimas de peptidase. As peptidases estão envolvidas na formação de mau cheiro e podem ser empregadas em métodos para identificar moduladores, em particular inibidores da formação de mau cheiro no corpo. Esses inibidores possuem a capacidade de prevenir ou reduzir a formação de mau cheiro no corpo, em particular, no corpo humano.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Desde 1950 sabe-se que o suor secretado pelas glândulas apócrinas é inodoro e o cheiro indesejável do suor somente se desenvolve pela ação de bactérias. Assim, concluiu-se que o suor contém precursores do mau cheiro e cheiros ruins são liberados através da ação enzimática de bactérias sobre esses precursores.

[004] O mau cheiro corporal, em particular o mau cheiro na axila, deve-se a três classes principais de compostos: sulfanilalcoóis, ácidos insaturados ou hidroxilados e esteroides. Os métodos descritos aqui são úteis para a identificação de inibidores que previnem a formação de sulfanilalcoóis.

[005] O inventor identificou previamente o precursor de mau cheiro para os ácidos insaturados ou hidroxilados, e a enzima aminoacilase ("AMRE") que os formam (EP 1258531). A enzima AMRE pode ser usada para rastrear inibidores das enzimas que formam o mau cheiro e, assim, identificar compostos para prevenir ou reduzir o mau cheiro corporal.

[006] Para a liberação de os sulfanilalcoóis, o inventor identificou uma cistationina-β-liase de Corynebacterium sp. Ax20 e um composto precursor (A. Natsch e outros, Chemistry & Biodiversity 2004, 1058).

[007] Starkenmann e outros postularam que uma β-liase diferente proveniente de Staphylococcus haemolyticus que libera sulfanilalcoóis de um precursor diferente, a saber, o precursor de fórmula FIII (WO 2006079934).

[008] Embora se acredite que as bactérias de estafilococos em geral não se envolvamm na formação do mau cheiro em um nível muito alto, o composto de FIII (nos exemplos: "conjugado de cys-gly") parece contribuir para o mau cheiro no corpo.

[009] A sequência SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 bem como seus produtos gênicos hipotéticos foram previamente publicados em um banco de dados de sequências, mas a função proteica, a atividade catalítica e seu envolvimento na geração de mau cheiro eram desconhecidos.

[0010] Surpreendentemente, o inventor identificou um terceiro tipo de enzima (peptidases que incluem, sem limitação, as SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4) que libera um precursor II a partir de um precursor I (por exemplo, sem limitação, composto de FIII) ou alternativamente, vários outros substratos descritos aqui a seguir, e que junto com a ação das cistationina-β-liases previamente identificadas formam um agente de mau cheiro de sulfanilálcool (compare Figura 1).

[0011] Ambos o novo tipo de peptidase e a β-liase previamente descritos pelos inventores ocorrem em Corinebactéria. Sem se prender à teoria, em geral se aceita que mau cheiro altamente desagradável é liberado do suor fresco principalmente por Corinebactéria.

[0012] O inventor mostrou que nenhuma parte do extrato de C. sp. Ax20 conseguiu liberar o mau cheiro a partir do precursor I, em particular e sem limitação, do composto de FIII. Isso demonstra que não há nenhuma enzima presente nos extratos de C. sp. que seja capaz de clivar o precursor I (compare exemplos abaixo, em particular exemplo 11). O inventor também mostrou que duas enzimas medeiam a clivagem do precursor I, em particular e sem limitação, o composto de FIII: primeiramente, uma peptidase (por exemplo, e sem limitação, SEQ ID NO: 2 ou NO:4) que cliva o dipeptídeo entre o resíduo de gly e cys, e a seguir uma β-liase que libera mau cheiro de um conjugado de cys (FIV) formado pela peptidase (compare exemplos abaixo, em particular o exemplo 12). Vide Figura 1.

[0013] O tipo identificado de enzima é útil como um alvo de seleção alternativo para identificar inibidores da formação do mau cheiro por agentes de mau cheiro de sulfanilálcool.

[0014] O precursor I (substratos fisiologicamente relevantes) possui a fórmula geral FII

[0015] em que R1 é selecionado de um grupo de resíduos de alcanos que consiste em metila, etila, propila, butila, pentila e hexila.

[0016] e em que R2 e R3 são independentemente selecionados do grupo que consiste em H e metila.

[0017] Assim, agente de mau cheiro de sulfanilalcanol possui a fórmula geral FV

[0018] em que R1 é selecionado a partir de um grupo de resíduos de alcanos que consiste em metila, etila, propila, butila, pentila e hexila.

[0019] e em que R2 e R3 são independentemente selecionados do grupo que consiste em H e metila.

[0020] As peptidases também irão reagir com substratos não fisiológicos de fórmula FI conforme detalhado a seguir na seção "substratos de peptidase", as quais são úteis para propósitos de seleção.

[0021] O tipo de enzima de peptidase é particularmente interessante já que, sem querer se prender à teoria, não somente ocorre nos gêneros mais relevantes de bactérias, mas também este tipo de enzimas de peptidase parece realizar a etapa de limitação de taxa das reações enzimáticas de formação de mau cheiro, e pode-se esperar que os inibidores identificados sejam particularmente eficazes.

[0022] Ademais, mais uma vez sem querer se prender à teoria, ambas as modalidades de peptidase (SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4) pertencem à mesma classe de enzimas (metalopeptidases), bem como a enzima AMRE identificada previamente que forma ácidos hidroxilados ou insaturados de mau cheiro, e a seleção com as enzimas de peptidases (incluindo, sem limitação, as enzimas SEQ ID 2 e SEQ ID 4) pode resultar na localização de inibidores que também são ativos contras as metalopeptidases envolvidas na formação de ácidos hidroxilados ou insaturados de mau cheiro e que são, assim, eficazes para reduzir a formação de agentes de mau cheiro de ambas as classes ao mesmo tempo.

SUMÁRIO

[0023] É provido o seguinte: (1) Método para identificar um modulador da formação de mau cheiro no corpo, em que o método compreende as etapas de: (i) contatar uma peptidase com um substrato de peptidase e pelo menos um agente de teste; e (ii) determinar o efeito de o pelo menos um agente de teste na taxa de reação mediada por peptidase,

[0024] em que a peptidase tem a atividade catalítica para liberar glicina do composto de substrato de fórmula FIII

[0025] em que a peptidase é homóloga a uma sequência de polipeptídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4 com uma identidade de sequência de pelo menos 40%; em que a peptidase compreende as seguintes sequências conservadas parciais:

[0026] ERDGRWYGRGXADCKG entre o aminoácido 105 e 150,

[0027] EGSEEXG entre o aminoácido 150 e 180,

[0028] HSGXXGGXAPDA entre o aminoácido 205 e 255,

[0029] GGSIPL entre o aminoácido 385 e 425;

[0030] e em que os aminoácidos são numerados a partir da terminação N de uma peptidase substancialmente homóloga em sua forma de ocorrência natural, e as letras se referem ao código de aminoácidos de caracteres únicos e X é qualquer um dos 20 aminoácidos comuns. (2) Método do item (1), em que o substrato de peptidase na etapa (i) é um composto de fórmula FI

[0031] em que X é selecionado do grupo que consiste em S e O, e em que R1 é um resíduo selecionado de H e metila, e em que R2 é um resíduo selecionado do grupo que consiste em uma C1 a C10 alquila de cadeia linear ou ramificada, um C1 a C10 alcanol de cadeia linear ou ramificada, uma fenila e uma benzila.

[0032] Em uma modalidade alternativa do item (2), X é S. (3) Método do item (1), em que o substrato é um composto selecionado do grupo que consiste em S-benzil-Cys-Gly, O-benzil-Ser- Gly, (1-(2-hidroxietil)-1-metilbutil)-L-cisteinil-glicina, S-benzil-Cys-Ala, O-benzil-Ser-Ala, Pro-Gly, Ala-Gly, Ala-Ala, e Pro-Ala.

[0033] Em uma modalidade alternativa do item (3), o substrato é um composto selecionado do grupo que consiste em S-benzil-Cys-Gly, O-benzil-Ser-Gly, (1-(2-hidroxietil)-1-metilbutil)-L-cisteinil-glicina, S- benzil-Cys-Ala e O-benzil-Ser-Ala.

[0034] Em uma modalidade alternativa do item (3), o substrato é um composto selecionado do grupo que consiste em Pro-Gly, Ala-Gly, Ala-Ala, Pro-Ala. (4) Método de qualquer um dos itens (1) a (3), em que uma enzima adicional, uma cistationina-β-liase, é incubada com o substrato e o agente de teste em paralelo ou subsequentemente, e em que na etapa (ii), o efeito do agente de teste na clivagem pelas enzimas peptidase e β-liase é determinado pela alteração da formação de pelo menos um de seus produtos de reação, opcionalmente um produto de reação selecionado de um produto de reação de tiol e um produto de reação de hidróxi. (5) Kit que compreende: (i) uma peptidase conforme descrita aqui, em particular como definida no item (1), e (ii) um composto de substrato que é clivado pela peptidase,

[0035] para uso combinado para identificar os agentes de teste como moduladores da peptidase e formação de mau cheiro.

[0036] Em uma modalidade particular do item (5), o composto de substrato é um composto de fórmula FI

[0037] em que X é selecionado do grupo que consiste em S e O, e em que R1 é um resíduo selecionado de H e metila, em que R2 é um resíduo selecionado do grupo que consiste em uma C1 a C10 alquila linear ou ramifica, um C1 a C10 alcanol linear ou ramificado, uma fenila, e uma benzila.

[0038] Em outra modalidade do item (5), tal composto de substrato de fórmula FI é selecionado do grupo que consiste em S-benzil-Cys- Gly, O-benzil-Ser-Gly, (1-(2-hidroxietil)-1-metilbutil)-L-cisteinil-glicina, S-benzil-Cys-Ala, O-benzil-Ser-Ala, Pro-Gly, Ala-Gly, Ala-Ala, e ProAla.

[0039] Ademais, em outra modalidade do item (5), tal composto de substrato de fórmula FI é selecionado do grupo que consiste em S- benzil-Cys-Gly, O-benzil-Ser-Gly, (1-(2-hidroxietil)-1-metilbutil)-L- cisteinil-glicina, S-benzil-Cys-Ala, O-benzil-Ser-Ala.

[0040] Em outra modalidade do item (5), tal composto de substrato de fórmula FI é selecionado do grupo que consiste em Pro-Gly, Ala- Gly, Ala-Ala e Pro-Ala. (6) Método para inibir uma peptidase conforme definida aqui, em particular no item (1), em sua capacidade de clivar seu substrato, em que a peptidase é contatada com um inibidor de peptidase. (7) Método de acordo com o item (6) para prevenir ou reduzir a formação de mau cheiro no corpo, em que um inibidor de peptidase é aplicado a uma superfície do corpo, e em que a peptidase é uma peptidase como descrita aqui, particularmente e sem limitação, como no item (1). (8) Método de acordo com o item (7), em que o composto é aplicado na forma de uma composição dermatologicamente aceitável, que compreende pelo menos um excipiente. (9) Método para preparar um produto de cuidado pessoal que tem efeito contra a formação de mau cheiro no corpo, em que um inibidor de peptidase é adicionado a uma formulação de produto de cuidado pessoal; e em que a peptidase é uma peptidase como a descrita aqui, particularmente e sem limitação, como no item (1). (10) Composição que compreende um substrato de peptidase e uma peptidase isolada, e em que a peptidase é uma peptidase como descrita aqui, particularmente e sem limitação, como no item (1);

[0041] em que a peptidase é uma peptidase como descrita aqui, particularmente e sem limitação, como no item (2) ou (3), ou quaisquer de suas modalidades particulares. (11) Composição de acordo com o item (10), em que a peptidase está em uma forma selecionada do grupo que consiste em uma forma isolada, em uma forma de uma preparação contendo peptidase funcional, em uma forma de expressão heteróloga em uma célula hospedeira adequada, em uma forma de Corynebacterium jeikeium que expressa a peptidase, e em uma forma de Corynebacterium jeikeium K411 que expressa a peptidase. (12) Peptidase isolada, em que a peptidase é uma peptidase como descrita aqui, particularmente e sem limitação, como no item (1),

[0042] e em que a peptidase é homóloga a uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4 com uma identidade de sequência de pelo menos 40%. (13) Peptidase isolada de acordo com o item (12), em que a peptidase é homóloga a uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4 com uma identidade de sequência de pelo menos 80%. Em outras modalidades, a identidade de sequência é de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou de pelo menos 98%. (14) Nucleotídeo que codifica uma peptidase, em que a peptidase é uma peptidase como descrita aqui, particularmente e sem limitação, como no item (1), o qual é selecionado do grupo que consiste em

[0043] um nucleotídeo substancialmente homólogo a uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 conforme determinado por identidade de sequência;

[0044] um nucleotídeo que é uma variante modificada conservativamente de SEQ ID NO: 1, que não causa alterações nos aminoácidos quando traduzidas para a proteína correspondente;

[0045] um nucleotídeo substancialmente homólogo à SEQ ID NO: 1 conforme determinado por hibridização;

[0046] em que o nucleotídeo substancialmente homólogo conforme determinado por identidade de sequência tem uma identidade de sequência de pelo menos 80%.

[0047] Em outras modalidades, a identidade de sequência é de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou de pelo menos 98%. (15) Nucleotídeo isolado de acordo com o item (16), em que o dito nucleotídeo isolado forma parte de um vetor de expressão. (16) Nucleotídeo isolado de acordo com o item (16), em que o vetor de expressão forma parte de pelo menos uma célula hospedeira transfectada com o vetor de expressão. (17) Método para formar uma peptidase, que compreende a etapa de cultivar células hospedeiras compreendendo um vetor de expressão que codifica a peptidase sob condições suficientes para expressão, formando, assim, a peptidase e, opcionalmente, recuperando esta das células, em que a peptidase é uma peptidase como descrita aqui, particularmente e sem limitação, como no item (1).

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0048] A Figura 1 mostra reações dos precursores I e II a um agente de mau cheiro de sulfanilalcanol; a reação do precursor I para o precursor II é realizada pela peptidase recém-identificada.

[0049] A Figura 2 mostra o alinhamento de sequência de SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4 mostrando os blocos de sequência conservados.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0050] As seguintes passagens descrevem em detalhes a peptidase e suas variantes, substratos, produtos de reação, seu uso na identificação de moduladores e inibidores do mau cheiro corporal, incluindo diversos ensaios de seleção e como realizá-los, incluindo as células que podem ser usadas, ensaios usando peptidase purificada, ensaios de transcrição de peptidase, sistemas de expressão para peptidases, superexpressão de peptidases, transfecção de construções de peptidase em células, recuperação de proteínas de peptidase, moduladores de peptidase, a identificação de substratos de peptidases, ensaios de ligação, um kit para identificar um modulador, confirmação dos moduladores identificados, ensaios de seleção em larga escala, biblioteca de agentes de teste, tipos de agente de teste, produtos de higiene pessoal e sequências de peptidases.

Peptidases e sequências substancialmente homólogas:

[0051] As peptidases (ou nucleotídeos que as codificam) úteis nos métodos descritos aqui podem ser selecionadas do grupo que consiste na peptidase de SEQ ID NO: 2 (ou SEQ ID NO: 1 para o nucleotídeo que a codifica), a peptidase de SEQ ID NO: 4 (ou SEQ ID NO: 3 para o nucleotídeo que a codifica), e peptidases que são substancialmente homólogas à SEQ ID NO: 2 e/ou à SEQ ID NO: 4 (ou SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO: 3 para os nucleotídeos que as codificam) e permanecem funcionais, isto é, a peptidase se liga a um substrato/precursor de agente de mau cheiro conforme descrito aqui e/ou reage/cliva tal substrato/precursor de agente de mau cheiro (ou, no caso de nucleotídeos, eles são considerados funcionais se codificam tal peptidase). Por exemplo, e sem limitação, uma peptidase ou nucleotídeo que codifica uma peptidase que é derivável de corinebactéria de ocorrência natural na axila humana ou é isolável a partir desta.

[0052] Uma peptidase substancialmente homóloga compreende os seguintes blocos de sequências conservadas parciais (as letras se referem ao código de aminoácido de caracteres únicos e X é qualquer um dos 20 aminoácidos comuns, e tais aminoácidos são numerados a partir da terminação N da peptidase substancialmente homóloga em sua forma de ocorrência natural:

[0053] ERDGRWYGRGXADCKG entre o aminoácido 105 e 150,

[0054] EGSEEXG entre o aminoácido 150 e 180,

[0055] HSGXXGGXAPDA entre o aminoácido 205 e 255,

[0056] GGSIPL entre o aminoácido 385 e 425;

[0057] Para numeração, ou a sequência de ocorrência natural da peptidase substancialmente homóloga é usada, ou, antes da numeração, como ficará aparente para os versados no assunto, qualquer marcador adicionado, ou sequências fundidas ou similares são corrigidos e não são considerados na numeração da sequência, de modo a numerá-la de maneira consistente com a sequência em sua forma de ocorrência natural, isto é, sem essas mudanças ou similares que afetarão a numeração.

[0058] Os blocos de sequência conservados também são mostrados na figura 2

[0059] As enzimas de peptidase identificadas SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4 foram isoladas de Corynebacterium sp. Ax20 (SEQ ID NO: 2) e Corynebacterium jeikeium (SEQ ID NO: 4), mais particularmente de Corynebacterium sp. Ax20, DSM 14267, relacionada mais proximamente a Corynebacterium striatum ou glaucum, a qual foi enviada em 26 de abril de 2001 para a Autoridade de Depósito Internacional DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, D-38124 Braunschweig (número de acesso DSM 14267) e Corynebacterium jeikeium K411 (Tauch e outros 2005, J Bacteriol. 187 (13): 4671-82).

[0060] Ax20 (DSM 14267) foi isolada da axila humana e se relaciona mais proximamente ao Corynebacterium striatum de acordo com testes bioquímicos (kit de teste de Coryne API, BioMerieux, França), baseado na análise da sequência do gene de rRNA 16S inteiro, relaciona-se mais proximamente a cepas do tipo de espécies de Corynebacterium glaucum.

[0061] Corynebacterium jeikeium é conhecida por infecções oportunistas, especialmente em pacientes imunocomprometidos. K411 foi isolada da axila humana. É uma espécie de bactéria da flora da pele humana que exige lipídios e é resistente a diversos fármacos e que foi reconhecida como um patógeno nosocomial.

[0062] Os termos peptidase ou peptidases conforme usados aqui podem ser referir à peptidase de Ax20 (SEQ ID NO: 2), à peptidase de K411 (SEQ ID NO: 4), ou a peptidases substancialmente homólogas a essas conforme descritas aqui.

[0063] As peptidases foram classificadas como metalopeptidases já que requerem a presença de íons de Zn como um cofator. Elas são funcionalmente relacionadas às metalopeptidases (AMRE) previamente identificadas que liberam agentes de ácidos hidroxilados ou insaturados, e também dependem de zinco. As sequências de nucleotídeos que codificam as peptidases foram isoladas e sequenciadas (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3). Cada sequência de gene de peptidase pode ser introduzida em um vetor de expressão adequado e usada para produzir a peptidase por expressão heteróloga nas células ou micro-organismos desejados. As sequências SEQ ID NO: 1 e 2 (de Ax20) não foram anteriormente descritas, e a peptidase isolada de SEQ ID NO: 4 não foi anteriormente descrita.

[0064] In vivo, as peptidases ocorrem de maneira intracelular e podem ser liberadas das células por rompimento mecânico do envelope celular. Assim, a peptidase pode ser isolada de extratos celulares, em particular extratos celulares obtidos de células derivadas dos organismos selecionados do grupo que consiste em cepas de Corinebactéria do tipo selvagem. As Corinebactérias incluem, por exemplo e sem limitação, Corynebacterium striatum, Corynebacterium glaucum, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium sp. Corynebacterium Corynebacterium Corynebacterium Corynebacterium tuberculostearicum.

[0065] Uma boa fonte de cepas de Corinebactérias do tipo selvagem é a axila humana, a partir da qual cepas bacterianas podem ser cultivadas e isoladas, como é conhecido na técnica. Todas as corinebactérias acima foram isoladas da axila humana ou ocorrem na mesma, e expressam enzimas formadoras de mau cheiro, sendo capazes de formar mau cheiro.

[0066] As peptidases podem ser usadas na forma de células intactas, ou na forma isolada, por exemplo, como um extrato bruto, ou em uma forma purificada. Por exemplo, um extrato bruto pode ser formado por rompimento mecânico das células. Opcionalmente, as peptidases podem ser purificadas. Alternativamente, as peptidases podem ser formadas de maneira recombinante, conforme é descrito aqui.

[0067] Uma proteína de peptidase substancialmente homóloga inclui tais proteínas em que a parte catalisadora e/ou de ligação ao substrato é substituída com a parte relevante de uma variante alélica de uma espécie diferente, por exemplo, outra bactéria derivada da axila humana incluindo, sem limitação, as bactérias do gênero Corinebactéria.

[0068] Ademais, sequências de nucleotídeos de peptidases ou de polipeptídeos substancialmente homólogas podem ser formadas por mutações conservadoras e/ou mutações pontuais e incluem quaisquer variantes modificadas de modo conservador, conforme detalhado a seguir.

[0069] Com relação às sequências de nucleotídeos, variantes modificadas conservativamente significam nucleotídeos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas (aminoácidos substituídos conservativamente, isto é, lisina trocada por arginina e exemplos adicionais, conforme explicado a seguir).

[0070] Devido à degeneração do código genético, uma ampla quantidade de nucleotídeos diferentes em sequência, mas funcionalmente idênticos, codificam qualquer dado polipeptídeo/proteína. Tais variações de nucleotídeos são "variações silenciosas", as quais são uma espécie de variações modificadas conservativamente. Cada sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo também descreve cada variação silenciosa possível do nucleotídeo. Assim, cada códon em um nucleotídeo (exceto AUG, o qual é normalmente o único códon para a metionina, e TGG, o qual é normalmente o único códon para triptofano) pode ser modificado para que renda uma sequência de nucleotídeos funcionalmente idêntica e que produzirá um polipeptídeo idêntico. Assim, cada variação silenciosa de um nucleotídeo que produz um polipeptídeo está implícita em cada sequência de nucleotídeos dada.

[0071] Com relação às sequências de aminoácidos, substituições de aminoácidos podem ser introduzidas usando-se protocolos conhecidos de tecnologia de genes recombinantes incluindo PCR, clonagem gênica, mutagênese direcionada a sítios de cDNA, transfecção de células hospedeiras e transcrição in vitro, as quais podem ser usadas para introduzir tais mudanças na sequência de peptidases. As variantes podem ser então selecionadas quanto às suas atividades de peptidase. Tabelas de substituições conservativas que fornecem aminoácidos funcionalmente similares são conhecidas da técnica. Por exemplo, um guia exemplar para selecionar substituições conservativas inclui (resíduo original seguido pela substituição exemplar): ala/gly ou ser, arg/lys, asn/gln ou his, asp/glu, cys/ser, gln/asn, gly/asp, gly/ala ou pro, his/asn ou gln, ile/leu ou val, leu/ile ou val, lys/arg ou gin ou glu, met/leu ou tyr ou ile, phe/met ou leu ou tyr, ser/thr, thr/ser, trp/tyr, tyr/trp ou phe, val/ile ou leu.

[0072] Um guia exemplar alternativo usa os seis seguintes grupos, cada um contendo aminoácidos que são substituições conservativas um do outro: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (1); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); e 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y) e Triptofano (W).

[0073] Outra diretriz alternativa é permitir que todos os aminoácidos carregados sejam substituições conservativas uns dos outros, sejam eles positivos ou negativos. Ademais, adições, deleções ou substituições individuais que adicionem, deletem ou alterem um único aminoácido ou um pequeno percentual (por exemplo até 26%, até 20% ou até 10%) dos aminoácidos em uma sequência codificada também são consideradas variações modificadas conservativamente.

[0074] Sequências de polipeptídeos ou de nucleotídeos substancialmente homólogas possuem o nível de identidade de sequência indicada abaixo enquanto mantêm a atividade catalisadora do polipeptídeo nos substratos conforme definido aqui.

% de identidade de sequência:

[0075] Uma sequência de nucleotídeos substancialmente homóloga possui um percentual de identidade de sequência de pelo menos 40%, pelo menos 42%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%.

[0076] Uma sequência de polipeptídeos substancialmente homóloga possui um percentual de identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%.

[0077] Notavelmente, quando ao se comparar a peptidase Ax20 (SEQ ID NO: 1 e NO:2) com a peptidase K411 (SEQ ID NO: 3 e NO:4), cujas atividades catalisadoras são as mesmas no mesmo substrato fisiológico, baseado em suas sequências de aminoácidos, a identidade delas é de 42%, e baseado em suas sequências de nucleotídeos, a identidade delas é de 55%.

[0078] O cálculo do % de identidade de sequência é determinado do modo a seguir:

[0079] BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) é o algoritmo de busca heurística usado pelos programas blastn que estão disponíveis em http://www.ncbi.nlm.nhi.gov . Para determinar o percentual de identidade de uma sequência de busca de nucleotídeos com reação a outra sequência de nucleotídeos, Blastn é usado, empregando-se parâmetros padrões da versão BLAST 2.2.1.3, incluindo um EXPECT (limiar de significado estatístico para o relatório de pareamentos em relação a sequências de bancos de dados) de 10, e filtragem DUST. Para determinar o percentual de identidade de uma sequência de busca de polipeptídeos versus outra sequência de polipeptídeos, Blastp é usado, empregando parâmetros padrões da versão BLAST 2.2.1.3, incluindo um EXPECT de 10, e filtragem DUST.

[0080] Sequências de nucleotídeos substancialmente homólogas incluem, sem limitação, sequências que se hibridizam seletivamente a uma ou mais das sequências de nucleotídeos de peptidases descritas aqui, ou aos seus complementos, sob condições de hibridização estringentes detalhadas abaixo. As condições estrigentes são uma temperatura de 42oC em uma solução que consiste em 50% de formamida, 5xSSC, 1% de SDS e lavagem a 65oC em uma solução que consiste em 0,2xSSC e 0,1% de SDS (1xSSC=0,15 M de NaCl, 0,015 M de citrato de Na3 em pH 7,0). Hibridização pode ocorrer devido às outras sequências de nucleotídeos presentes, por exemplo, na biblioteca de DNA genômico que está sendo selecionada.

[0081] Um sinal que é duas vezes menos intenso ou, opcionalmente, 10 vezes menos intenso que a interação específica observada com o DNA alvo, é considerado um sinal de fundo. A intensidade da interação pode ser medida, por exemplo, marcando-se radioativamente a sonda com, por exemplo, 32P. O termo "isolado", conforme usado aqui, significa retirado do ambiente do qual algo se originou e transferido para um ambiente diferente, incluindo o ambiente de uma célula intacta e transferindo-se o mesmo para um lisado de célula. Por "forma purificada" entende-se mais que 80%, por exemplo, e sem limitação, mais que 90%, mais que 95%, mais que 98%, mais que 99% ou mais em relação a outras proteínas e/ou contaminantes de ácidos nucleicos.

Substratos de peptidase

[0082] Os substratos de peptidases (por exemplo, e sem limitação, o precursor I) podem ser descritos, em geral, como derivados de dipeptídeos. Exemplos de substratos incluem, sem limitação, dipeptídeos simples como ala-ala e ala-gly. Os substratos com a maior afinidade para com a peptidase são os derivados de cys-gly e cys-ala, em particular derivados de L-cys-L-gly e L-cys-L-ala, em que o átomo de S do resíduo de cys-gly ou cys-ala é alquilado conforme descrito aqui. Os derivados de cys-gly podem ser de ocorrência natural, por exemplo, e sem limitação, o precursor I, ou análogos sintéticos incluindo, sem limitação, S-benzil-Cys-Gly.

[0083] Pode-se determinar facilmente se um dado derivado de dipeptídeo é um substrato de peptidase pela incubação do mesmo com a peptidase de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e pela determinação de se o substrato reage enzimaticamente com a peptidase descrita aqui.

[0084] Os substratos incluem, sem limitação, substratos com alta afinidade à enzima que pode ter a fórmula FI mostrada a seguir:

[0085] e em que X é selecionado do grupo que consiste em S e O, e em que R1 é um resíduo selecionado do grupo que consiste em H e metila, e em que R2 é um resíduo selecionado do grupo que consiste em uma C1 a C10 alquila de cadeia linear ou ramificada, um C1 a C10 alcanol de cadeia linear ou ramificada, uma fenila e uma benzila.

[0086] Um grupo particularmente útil de substratos é o de substratos de fórmula FI, em que X é S, R1 é metila, e em que R2 é um resíduo selecionado do grupo que consiste em uma C1 a C10 alquila de cadeia linear ou ramificada, um C1 a C10 alcanol de cadeia linear ou ramificada, uma fenila e uma benzila.

[0087] Em relação aos resíduos de R2, "C1 a C10 alquilas" incluem, sem limitação, metila, etila, propila, butila, pentila, hexila, heptila, octila, nonila e decila; e "C1 a C10 alcanóis" incluem, sem limitação, metanol, etanol, propanol, butanol, pentanol, hexanol, heptanol, octanol, nonanol, decanol e, opcionalmente, qualquer forma ramificada de alquilas ou de alcanóis.

[0088] Substratos fisiologicamente relevantes são aqueles supracitados como "precursores I" e possuem a fórmula geral FII:

[0089] em que R1 é um resíduo alquila selecionado do grupo que consiste em metila, etila, propila, butila, pentila e hexila,

[0090] e em que R2 e R3 são, independentemente, selecionados do grupo que consiste em H e metila.

[0091] Exemplos particulares de substratos de peptidase incluem, sem limitação, S-benzil-Cys-Gly, O-benzil-Ser-Gly, (1-(2-hidroxietil)-1- metilbutil)-L-cisteinil-glicina, S-benzil-Cys-Ala, O-benzil-Ser-Ala, Pro- Gly, Ala-Gly, Ala-Ala, e Pro-Ala. Suas estruturas químicas são mostradas na tabela a seguir.

Produtos de reação de peptidase:

[0092] Os produtos de uma reação enzimática com peptidase são dois aminoácidos livres para substratos de dipeptídeos simples ou para derivados de gly, uma glicina livre e um derivado de cys substituído em S ou de ser substituído em O, ou para derivados de ala, uma alanina livre e um derivado de cys substituído em S ou de ser substituído em O.

[0093] O produto de agente de mau cheiro final é formado somente quando o produto de reação enzimática resultante da peptidase (por exemplo, o precursor II) é exposto a uma β-liase através da qual é clivado para que libere um sulfanilálcool.

[0094] Os produtos e construções novos que são fornecidos (DNA, vetores, bactérias recombinantes, proteína/enzima de peptidase) são úteis quando da seleção, sem limitação, de inibidores da reação da peptidase.

Identificação de moduladores e inibidores:

[0095] Moduladores que são inibidores são de interesse para serem adicionados a produtos (em particular, a produtos de higiene pessoal incluindo, sem limitação, desodorantes) para prevenir a formação de mau cheiro corporal. De modo similar, os métodos de seleção descritos a seguir poderiam ser usados para identificar outros moduladores como intensificadores, os quais devem ser evitados em tais produtos.

[0096] Para identificar um modulador, a peptidase e seu substrato são expostos a pelo menos um agente de teste (modulador potencial) em uma concentração adequada, por exemplo, e sem limitação, de 1nm a 1mM, ou de 10nm a 10microM.

[0097] Então, o efeito do modulador na taxa de clivagem/reação enzimática é monitorado por métodos bem conhecidos da técnica, por exemplo, e sem limitação, pelos métodos descritos aqui.

[0098] Uma mudança na taxa de clivagem/reação enzimática é determinada pela taxa de clivagem de produto ou pela taxa de formação de produto (a última inclui produtos secundários).

[0099] Por exemplo, a taxa de clivagem/reação é determinada pela monitoração da taxa na qual o substrato desaparece, ou pela taxa na qual os produtos da clivagem do substrato aparecem (por exemplo, a taxa em que os produtos de reação de aminoácidos livres aparecem, incluindo, sem limitação, gly ou ala).

[00100] Em uma modalidade de seleção de alto rendimento de moduladores potenciais, a liberação de L-ala ou L-gly livre é medida pela derivação do grupo Na livre com um agente de derivação de grupo amina, o qual quando sob reação com o grupo amina forma uma molécula fluorescente ou cromófora. Nesse aspecto, pode ser útil usar fluorescamina (Fluka, Buchs, Suíça) para formar uma molécula fluorescente quando da reação com L-gly ou L-ala. Finalmente, a clivagem do substrato L-gly pode ser comparada a reações de controle, e o potencial dos compostos de teste para influenciar, em particular, inibir a reação pode ser assim quantificado.

[00101] Se a β-liase ou outra enzima que age no produto de reação de peptidases é também adicionada à reação, então, alternativa ou adicionalmente, a taxa na qual o agente de mau cheiro (sulfanilálcool) ou outras moléculas de enxofre liberadas aparecem pode ser monitorada. Uma mudança na taxa monitorada indica o efeito de um agente de teste e modulador potencial sobre a enzima. Um inibidor é identificado por uma taxa mais baixa de formação de moléculas de enxofre se comparado à reação na ausência do agente de teste inibidor ou uma taxa padrão predeterminada.

[00102] As taxas de clivagem/reação podem ser monitoradas, por exemplo, e sem limitação, pelos seguintes métodos: análise do substrato ou dos aminoácidos livres formados ou outros produtos da clivagem através de cromatografia líquida de alta performance (HPLC) ou cromatografia de camada fina (TLC) ou eletroforese capilar; espectrofotometria por fluorescência após a reação do aminoácido livre com uma sonda fluorescente (por exemplo e sem limitação, a fluorescamina); espectrofotometria por fluorescência após a reação da molécula de enxofre livre com uma sonda fluorescente (por exemplo, e sem limitação, monobromobimana); cromatografia gasosa das moléculas de enxofre liberadas ou pela detecção de produtos de reação através de testes bioquímicos.

[00103] Peptidases úteis incluem, sem limitação, a peptidase de SEQ ID NO: 2 e a peptidase de SEQ ID NO: 4. A peptidase de SEQ ID NO: 4 possui uma atividade mais baixa que a peptidase de SEQ ID NO: 2, mas ainda é muito útil como alvo de seleção ou para verificar acertos na seleção e/ou para selecionar uma ampla faixa de atividade de inibidores em diferentes espécies de bactérias.

[00104] Essas seleções podem ser realizadas subsequentemente ou em paralelo, usando ambas as enzimas em uma placa de reação.

[00105] Em paralelo ou subsequentemente aos métodos de seleção que empregam peptidases conforme descritas aqui, enzimas adicionais que formam mau cheiro podem ser usadas como, por exemplo, e sem limitação, uma ou mais β-liase e AMRE. Para este fim, a β-liase e/ou AMRE podem ser incubadas com a peptidase e seu substrato e o agente de teste em paralelo ou subsequentemente, e o efeito do agente de teste na taxa de clivagem/reação das enzimas é determinado pela mudança na formação de um sulfanilalcanol (liberado pela peptidase e pela β-liase) e/ou ácidos carboxílicos ou glutamina (liberados pela AMRE). Alternativamente, a mudança na taxa de reação dos produtos da reação pode ser determinada.

[00106] Inibidores identificados de uma ou mais de peptidase de SEQ ID NO: 2, peptidase de SEQ ID NO: 4, e homólogos substanciais são ingredientes desodorantes desejáveis, já que eles inibem a etapa limitante de taxa na liberação de químicos de enxofre a partir de suor inodoro. Particularmente interessantes são os inibidores que inibem mais de uma peptidase de Corinebactéria como, por exemplo, e sem limitação, ambas as peptidases de SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4, e assim fornecerão uma atividade de ampla banda contra diferentes espécies de corinebactéria.

[00107] Os resultados dos exemplos a seguir mostram que a β-liase cliva somente o conjugado de cys, mas não o precursor I de FIII, o que indica que a β-liase sozinha não pode ser responsável pela clivagem do substrato quantitativamente mais abundante na secreção da axila. Em contraste, o extrato contendo peptidase de C. sp. Ax20 isolado da axila de um indivíduo teste humano libera mau cheiro de sulfanilalcanol do precursor I de FIII (nos exemplos: conjugado de cys- gly) e essa reação é interrompida pelo inibidor de metalopeptidase o- fenantrolina. Isso é surpreendente, já que WO 2006079934 postula uma β-liase que cliva o precursor I de FIII. Segue-se disto que os extratos celulares contêm outra enzima que não uma β-liase envolvida na clivagem do precursor I de FIII. Mas como nenhuma fração do extrato celular de Ax20 pode liberar o enxofre do agente de mal cheiro volátil do precursor I de FIII, conforme mostrado aqui nos exemplos, e já que uma única fração de β-liase pode liberar enxofre de agente de mau cheiro volátil do precursor I de FIII, de novo, como é mostrado nos exemplos, segue-se que duas enzimas liberam sequencialmente o agente de mau cheiro do precursor I de FIII, a saber, uma peptidase que libera gly, formando, assim, o substrato para a β-liase que, por sua vez, libera a molécula de enxofre.

Células usadas nos ensaios:

[00108] Células bacterianas adequadas incluem todas as corinebactérias que expressam naturalmente a peptidase, por exemplo, e sem limitação, Corynebacterium sp.., Corynebacterium sp. Ax20, Corynebacterium striatum, Corynebacterium glaucum, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium jeikeium K411, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium appendicis, Corynebacterium coyleae, Corynebacterium mucifaciens, Corynebacterium riegelii, e Corynebacterium tuberculostearicum.

[00109] Alternativamente, a peptidase pode ser heterologamente expressa em uma cepa hospedeira, por exemplo, sem limitação, uma cepa bacteriana (incluindo, sem limitação, uma cepa de E. coli), uma cepa de levedura, ou uma linhagem de célula eucariótica (incluindo, sem limitação, células de insetos, células de mamíferos, células de anfíbios e células de vermes). Essas cepas hospedeiras são transformadas com um vetor adequado contendo a sequência de nucleotídeos que codifica a peptidase e os elementos de controle relevantes para o hospedeiro, como bem conhecidos na técnica.

[00110] Os constructos de vetor para expressar a peptidase podem ser produzidas de um modo conhecido por si mesmo usando-se a reação em cadeia de polimerase (PCR) para amplificar a região de codificação proveniente do DNA cromossômico de uma corinebactéria e, depois da verificação da sequência, a sequência de codificação é subclonada em um vetor adequado. Vetores adequados estão comercialmente disponíveis, por exemplo, vetores da Invitrogen (Groningen, Holanda). Um vetor útil é o vetor pET-3a (Studier e Moffatt, 1986). Os plasmídeos resultantes são transformados em uma cepa hospedeira de E. coli. A adequabilidade de uma combinação de vetor-cepa hospedeira depende da cepa hospedeira escolhida com a qual o vetor é compatível ou com a qual é otimizado (por exemplo, o vetor pET-3a é transformado na cepa hospedeira BL21(DE3)).

[00111] Alternativamente, uma variedade de sistemas de vetor de expressão/hospedeiro pode ser usada para conterem e expressarem sequências que codificam a peptidase. Esses incluem, por exemplo, micro-organismos diferentes que incluem bactérias transformadas com bacteriófago recombinante, plasmídeo, ou vetores de expressão de DNA de cosmídeo; levedura transformada com vetores de expressão de levedura; sistemas de células de insetos infectados com vetores de expressão virais (por exemplo, baculovírus), ou com vetores de expressão bacteriana (por exemplo, plasmídeos pBR322).

[00112] Sistemas de expressão de levedura podem ser usados para a produção de peptidase. Vários vetores que contêm promotores constitutivos ou induzíveis, tais como, fator alfa, álcool oxidase e promotores de PGH, podem ser usados na levedura Saccharomyces cerevisae ou Pichia pastoris. Além disso, tais vetores direcionam a secreção ou retenção intracelular de proteínas expressas e permitem a integração de sequências estranhas no genoma do hospedeiro para propagação estável.

[00113] Para a expressão de proteínas heterólogas em linhagens de células intactas podem ser usados, por exemplo, derivados de Lepidopteran baculovirus, nucleovírus multicapsídeo de Autographa californica (AcMNPV). Nesse sistema, a expressão de gene estranho é direcionada por um promotor viral tardio muito forte, ou os promotores de poliedrina ou p10, e um amplo arranjo de vetores está disponível o qual otimiza a expressão de proteínas recombinantes. Esses vetores possibilitam a expressão de ambas as proteínas ligadas à membrana ou secretadas. Vários vetores estão comercialmente disponíveis, por exemplo, o Sistema InsectSelect®da Invitrogen.

Ensaios usando-se peptidase purificada:

[00114] Alternativamente ao uso de um ensaio com base em células, será usualmente mais simples purificar a peptidase das células que expressam peptidases descritas acima usando métodos bem conhecidos da técnica e efetuar, subsequentemente, um ensaio enzimático contatando a peptidase purificada, seu substrato e um agente de teste in vitro e determinar uma alteração na taxa de reação de peptidase conforme descrição aqui. Opcionalmente, os resultados podem ser validados in vivo usando-se corinebactérias deriváveis da axila humana conforme descrição aqui.

Ensaios de transcrição de peptidase:

[00115] Alternativamente aos ensaios com base em células ou enzimáticos, um ensaio para identificar moduladores que agem sobre o nível de transcrição de gene pode ser realizado. Os agentes de teste são adicionados às corinebactérias to tipo selvagem que expressam a peptidase. Depois de um tempo finito (por exemplo, 30 minutos a 8 horas), os agentes de teste são removidos por lavagem das células bacterianas ou por colheita das células por centrifugação. As células bacterianas são então analisadas quanto à quantidade da peptidase, e esse valor é comparado às células de controle não expostas ao agente de teste. Os inibidores reduzem a quantidade de peptidase formada pelas bactérias e, portanto, seu potencial para formar mau cheiro. A quantidade de peptidase das células bacterianas pode ser determinada ou por ensaio de atividade usando-se os métodos e substratos conforme descritos aqui ou por construir um anticorpo específico (ou um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal) para uma peptidase que inclui, sem limitação, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e então usar um método de detecção imunológico, por exemplo, sem limitação, immuno dot-blot, western-blot, ou ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), para detectar especificamente a peptidase nas células bacterianas.

Sistemas de expressão para peptidase:

[00116] Para expressar cDNAs que codificam as proteínas desejadas, deve-se subclonar o cDNA apropriado em um vetor de expressão que contém um promotor forte para direcionar a transcrição, o terminador de transcrição/tradução, e um sítio de ligação a ribossomo para iniciação traducional. Promotores bacterianos adequados são bem conhecidos da técnica, por exemplo, E. coli, Bacillus sp. e Salmonella, e kits para tais sistemas de expressão estão comercialmente disponíveis. Similarmente, sistemas de expressão eucariótica para células de mamíferos, levedura, e células de insetos estão comercialmente disponíveis. O vetor de expressão eucariótica pode ser, por exemplo, um vetor adenoviral, um vetor adeno- associado, ou um vetor retroviral.

[00117] Um cassete de expressão deve conter também uma região de terminação de transcrição a jusante do gene estrutural para proporcionar terminação eficaz. A região de terminação pode ser obtida do mesmo gene que a sequência de promotor ou pode ser obtida de genes diferentes.

[00118] Para expressão das proteínas, os vetores convencionais para expressão em células eucarióticas ou procarióticas bem conhecidas da técnica podem ser usados. Exemplos de vetores incluem vetores de expressão bacteriana, por exemplo, plasmídeos que incluem plasmídeos com base em pBR322, plasmídeo com base em pBAD, pSKF, e pET23D, sistemas de expressão de fusão, por exemplo, GST e LacZ.

[00119] Vetores de expressão que contêm elementos reguladores provenientes de vírus eucarióticos são usados, tipicamente, em vetores de expressão eucariótica, por exemplo, vetores de SV40, vetores de citomegalovírus, vetores do papilomavírus, e vetores derivados de vírus Epstein-Barr. Outros vetores eucarióticos exemplares incluem pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, baculovírus pDSVE, pcDNA3.1, pIRES e qualquer outro vetor que possibilite a expressão de proteínas sob a direção de promotor precoce de SV40, promotor tardio de SV40, promotor de metalotioneína, promotor do vírus de tumor mamário de murino, promotor do vírus de sarcoma de Rous, promotor de poliedrina, ou outros promotores que mostraram ser eficazes para a expressão em células eucarióticas.

[00120] Alguns sistemas de expressão têm marcadores que proporcionam amplificação de genes tais como timidina, cinase, higromicina B fosfotransferase, di-hidrofolato redutase e similares. Os elementos que estão tipicamente incluídos em vetores de expressão podem incluir também um replicon que funciona em E. coli, um gene que codifica resistência aos fármacos para permitir seleção de bactérias que abrigam plasmídeos recombinantes, e sítios de restrição única em regiões não essenciais do plasmídeo para permitir a inserção de sequências eucarióticas. O gene de resistência ao fármaco particular escolhido não é crítico, qualquer um dos muitos genes de resistência a fármacos conhecidos da técnica são adequados. As sequências procarióticas são opcionalmente escolhidas de modo que elas não interferem na replicação do DNA em células eucarióticas, se necessário.

[00121] Em sistemas bacterianos, o fragmento de cDNA de peptidase pode ser expresso sozinho como uma proteína de fusão em que a peptidase, proteína de interesse, é fundida à proteína de ligação de maltose (MPB) periplasmática de E. coli em que a MBP, incluindo seu peptídeo de sinal, é ligada à terminação amino da peptidase. O cDNA de peptidase do tipo selvagem ou a MBP: cDNA de fusão de peptidase é subclonada em um plasmídeo adequado, por exemplo, pBR322, em que E. coli, a expressão de peptidase é acionada pelo promotor do tipo selvagem lac.

[00122] Exemplos particulares de combinações de vetor-cepa hospedeira são o vetor pPROTet.E133, E. coli DH5aPRO (Clontech, Palo Alto, CA, US) ou o vetor pBAD-myc-his-A na cepa de E. coli TOP 10 (Invitrogen, Groningen, Holanda).

[00123] Outros exemplos de vetores de expressão e cepas hospedeiras são descritos por T. Maniatis e outros (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).

[00124] Transcrição e tradução in vitro são alternativas para expressão de peptidase.

Superexpressão de peptidase

[00125] A peptidase pode ser superexpressa colocando-se a mesma sob o controle de um promotor constitutivo forte, por exemplo, o promotor precoce de CMV. Alternativamente, a superexpressão pode ser obtida sob controle de um promotor induzível, por exemplo, sem limitação, o promotor de arabinose no vetor pBAD-myc-his-A ou no sistema T-rex descrito abaixo.

[00126] Transfecção de constructos de vetores de expressão de peptidase em células

[00127] Métodos de transfecção padrão podem ser usados para produzir linhagens de células bacterianas, de mamíferos, de levedura ou de insetos que expressam grandes quantidades da proteína.

[00128] Qualquer método conhecido para introduzir sequências de nucleotídeos em células hospedeiras pode ser usado. É somente necessário que o procedimento de engenharia genética, particular, usado seja capaz de introduzir, com sucesso, os genes relevantes na célula hospedeira capaz de expressar as proteínas de interesse. Esses métodos podem envolver introduzir DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou outro material genético estranho em uma célula hospedeira e incluem o uso de transfecção de fosfato, polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, lipossomos, microinjeção, vetores de plasma, vetores virais e similares.

[00129] Por exemplo, sem limitação, o sistema de expressão T- Rex® (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) pode ser usado. O Sistema T- Rex® é um sistema de expressão mamífera regulado por tetraciclina que usa elementos reguladores do opéron de resistência de tetraciclina codificado por E. coli Tn10 (Tet). Regulação de tetraciclina no Sistema T-Rex® é baseada na ligação de tetraciclina ao repressor Tet e desrepressão da expressão de controle de promotor do gene de interesse.

[00130] Depois da transfecção, as células transfectadas podem ser cultivadas usando-se condições de cultura padrão bem conhecidas da técnica. Tornar-se-ão aparentes para aqueles versados na técnica que células diferentes requerem condições de cultura diferentes, incluindo temperatura apropriada e meios de cultura de células.

Recuperação de proteína de peptidase:

[00131] Se desejado, a proteína pode ser recuperada das células usando-se técnicas padrão. Por exemplo, as células podem se abrir por explosão seja mecanicamente ou por choque osmótico. A enzima bruta resultante pode ser usada como tal ou pode ser separada de um ou mais fragmentos de células, proteínas de célula, ácidos nucleicos de células, e contaminantes de células, por exemplo, ao serem submetidas à precipitação e às etapas de cromatografia, incluindo, mas sem limitação, troca iônica, interação hidrofóbica, etapas de cromatografia de fase reversa e de exclusão de tamanho. Depois de cada etapa, a proteína eluída pode ser ainda purificada e/ou concentrada por métodos que incluem, mas sem limitação, filtração e ultrafiltração. Alternativamente, a proteína recombinante pode ser recuperada do meio de cultura no qual as células recombinantes foram cultivadas (desde que a peptidase tenha sido expressa juntamente com uma sequência que possibilite exportar para o meio de cultura).

[00132] Moduladores que podem ser identificados pelos ensaios:

[00133] Moduladores e, em particular, inibidores de atividade de peptidase podem ser identificados conforme descrição abaixo.

[00134] A seguir está uma definição dos agentes a serem identificados nos métodos descritos aqui.

[00135] Um modulador é um agente que efetua aumento ou redução de um ou mais dos seguintes: a ligação de um substrato à peptidase, a reação do substrato (por exemplo, sem limitação, um precursor de agente de mau cheiro) com o agente de mau cheiro ou um segundo precursor de agente de mau cheiro. O modulador pode ele mesmo se ligar à peptidase, ou no sítio de ligação de substrato ou em outro lugar, e pode ser tanto clivado como reagido em taxa diferente ou nenhuma, ou pode se ligar ao substrato e assim afetar sua taxa de reação/clivagem.

[00136] Moduladores incluem vários tipos de compostos, incluindo moléculas pequenas, peptídeos, proteínas, nucleotídeos, anticorpos ou fragmentos destes. Esses podem ser derivados de várias fontes, inclusive sintéticas ou naturais, extratos de material natural, por exemplo, provenientes de animal, material de células de mamífero, de inseto, de vegetal, bacterianas ou fúngicas ou células cultivadas ou meio condicionado de tais células.

[00137] Um substrato é um agente que se liga à peptidase e é clivado ou reagido por ela.

[00138] Um inibidor é um modulador que diminui a ligação de um substrato à peptidase em comparação com a ligação do substrato na ausência de inibidor, e/ou diminui a taxa de reação/clivagem do substrato, e/ou reduz a atividade total da peptidase.

[00139] Um intensificador aumenta a ligação de um substrato à peptidase em comparação com a ligação do substrato na ausência do intensificador, e/ou aumenta a taxa de reação/clivagem do substrato, e/ou aumenta a atividade total da peptidase.

[00140] A atividade ou alterações da atividade de uma ligação a um substrato e reação/clivagem deste para formar um segundo precursor e finalmente o agente de mau cheiro pode ser determinado pelos métodos descritos abaixo.

Identificação de substratos:

[00141] Para identificar um substrato, um agente de teste é incubado com peptidase e a formação dos produtos de reação ou o desaparecimento do substrato potencial é acompanhado por métodos analíticos conforme descritos aqui. Qualquer composto que é reagido pela peptidase é definido como um substrato. Para classificar a afinidade de um substrato versus outros substratos conhecidos, séries de diluição do substrato são incubadas com uma concentração fixa de peptidase, e a taxa de clivagem em cada concentração de substrato, depois de certo tempo, é determinada. Com base na curva resultante, os parâmetros bioquímicos vmax (taxa de reação máxima em moléculas de substratos clivadas, por segundo, por uma molécula de peptidase) e Km (constante de Michaelis que dá a concentração de substrato na qual a enzima é ativa com 50% de taxa de reação máxima) são determinados. Km baixa indica uma afinidade alta da peptidase por seu substrato e assim um substrato com uma Km baixa e uma vmax alta é particularmente um substrato particularmente bom para a enzima. Contudo, para selecionar ensaios, os substratos com Km alta e uma vmax baixa podem ser usados também.

Kit para identificar um modulador:

[00142] Um kit, por exemplo, um kit para seleção ou um kit para selecionar alta produtividade, que compreende peptidase isolada (proveniente de células to tipo selvagem ou recombinante) ou células recombinantes que expressam peptidase, ou uma sequência substancialmente homóloga à mesma; e que compreende um substrato da peptidase, por exemplo, sem limitação, S-benzil-Cys-Gly, O-benzil-Ser-Gly, (1-(2-hidroxietil)-1-metilbutil)-L-cisteinil-glicina, S- benzil-Cys-Ala, O-benzil-Ser-Ala, Pro-Gly, Ala-Gly, Ala-Ala, e Pro-Ala.

[00143] O substrato é proporcionado em concentrações adequadas, por exemplo, 1microM a 10mM, ou 10microM a 1mM, por exemplo, 50microM a 1mM, ou 50microM a 500microM.

[00144] Componentes opcionais do kit podem incluir um meio adequado para cultivar as células recombinantes fornecidas, e um dispositivo de cultura para crescer as células em, por exemplo, uma placa de microtítulo, esses componentes opcionais estarão prontamente disponíveis para aquele versado na técnica.

[00145] O kit pode ser usado como a seguir: (i) crescer células recombinantes que expressam a peptidase, ou alternativamente, proporcionar uma peptidase isolada, (ii) adicionar pelo menos um agente de teste em presença de um substrato de peptidase em uma concentração adequada, e (iii) determinar uma alteração na taxa de clivagem/reação de o substrato/seu(s) produto(s) de reação pela peptidase ou uma alteração na ligação de substrato à peptidase por comparação da resposta em presença e ausência do agente de teste, e o agente de teste é, assim, identificado como um modulador.

[00146] Em particular, para o kit que usa peptidase isolada: (i) agentes de teste, opcionalmente em concentrações de cerca de 1 nanomolar a cerca de 5 milimolar, são adicionados a um tampão de ensaio contendo peptidase, (ii) depois de um período de pré-incubação definido que permite que o agente de teste se ligue à peptidase (opcionalmente, 0 a 15 minutos), o substrato selecionado é adicionado em uma concentração adequada, (iii) uma alteração na taxa de clivagem/reação do substrato ou de seu(s) produto(s) pela peptidase ou uma alteração da ligação do substrato à peptidase é determinada comparando-se a resposta em presença ou ausência do agente de teste, e o agente de teste é assim identificado como um modulador.

[00147] Um ensaio similar pode ser realizado em que a peptidase não está em uma forma isolada, mas na forma de um extrato celular ou é proporcionado na forma de células procarióticas ou eucarióticas intactas: (i) células recombinantes que expressam a proteína peptidase são crescidas em cultura, (ii) agentes de teste, opcionalmente em concentrações de cerca de 1 nanomolar a 5 milimolares, são adicionados ao meio de cultura em presença do substrato em uma concentração adequada, (iii) uma alteração em uma taxa de reação de clivagem do substrato ou seu(s) produto(s) pela peptidase ou uma alteração na ligação de substrato à peptidase é determinada por comparar a resposta em presença ou ausência do agente de teste, e o agente de teste é assim identificado como um modulador.

[00148] Por exemplo, sem limitação, a etapa (iii) pode ser realizada de acordo com qualquer um dos métodos descritos aqui acima. Isso pode requerer células recombinantes especificamente escolhidas ou adaptadas, que são descritas aqui, acima.

Confirmação de moduladores identificados:

[00149] Um modulador identificado por um método descrito aqui acima pode ser facilmente confirmado por experimentos sensoriais simples usando-se um painel de pessoas de teste para cheirar amostras conforme detalhamento abaixo. As amostras foram expostas a uma peptidase e uma β-liase e contêm como um substrato um composto de fórmula FI abaixo e quaisquer produtos de reação enzimática.

[00150] em que X é selecionado de S e em que R1 é um resíduo selecionado do grupo que consiste em H e metila e em que R2 é um resíduo selecionado do grupo que consiste em uma C1 a C10 alquila, C1 a C10 alcanol, uma fenila e uma benzila.

[00151] As amostras são cheiradas pelo painel em comparação com um controle negativo sem modulador para confirmar um modulador que modula, por exemplo, inibe a formação de mau cheiro.

Ensaios de seleção em larga escala:

[00152] Os ensaios descritos aqui, acima, são bem adequados para selecionar bibliotecas para agentes que modulam a atividade da peptidase.

[00153] Os ensaios podem ser desenhados para selecionar bibliotecas químicas em larga escala por automatização das etapas dos ensaios e fornecimento de compostos provenientes de qualquer fonte para os ensaios, que são tipicamente corridos em paralelo (por exemplo, formatos de microtítulo em placas de microtítulo em ensaios robóticos).

[00154] Os ensaios podem ser corridos em métodos de seleção de alto rendimento, os quais envolvem proporcionar uma biblioteca combinatória química ou peptídica contendo um grande número de moduladores potenciais. Tais bibliotecas são então selecionadas em um ou mais ensaios descritos aqui, acima, para identificar os agentes de biblioteca (espécies ou subclasses químicas particulares) que exibem a atividade descrita acima. Os moduladores assim identificados podem ser usados diretamente ou podem servir como guias para identificação de outros moduladores por preparação e teste de derivados.

[00155] Bibliotecas de compostos sintéticos estão comercialmente disponíveis em várias companhias incluindo Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princenton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH) e Microsource (New Milford, Conn.).

Ensaios de ligação:

[00156] Alternativamente aos métodos funcionais descritos aqui, acima, que medem alteração na taxa de clivagem/reação por mediação de aumento ou decréscimo de edutos e produtos diretos ou indiretos (por exemplo, sem limitação, substrato/precursor I, precursor II, agente de mau cheiro), a ligação do substrato pode ser determinada por ensaios de ligação que medem a ligação de um substrato à peptidase, que são bem conhecidos da técnica. A ligação de um modulador de polipeptídeo peptidase pode ser determinada, por exemplo, sem limitação, por medição de alterações nas características espectroscópicas (por exemplo, fluorescência, absorbância, ou índice refrativo), métodos hidrodinâmicos (empregando-se, por exemplo, conformação), cromatografia, medição de propriedade de solubilidade de uma polipeptídeo peptidase.

Bibliotecas de agentes de teste:

[00157] Uma biblioteca química combinatória é uma coleção de diversos compostos químicos gerados ou por síntese química ou por síntese biológica, combinando-se um número de "blocos construtores" químicos tais como reagentes. Por exemplo, uma biblioteca química combinatória linear tal como uma biblioteca de polipeptídeos é formada combinando-se um conjunto de blocos construtores químicos (aminoácidos) em cada modo possível para um dado comprimento do composto (isto é o número de aminoácidos em um composto de polipeptídeo). Milhões de compostos químicos podem ser sintetizados através de tal mistura combinatória de blocos construtores químicos.

[00158] Uma biblioteca química rara está disponível por Aldrich (Milwaukee, Wis.).

[00159] Bibliotecas de compostos naturais na forma de extratos bacterianos, fúngicos, vegetais e animais estão comercialmente disponíveis, por exemplo, da Pan Laboratories (Bothell, Wash.) ou MycoSearch (NC), ou são facilmente produzíveis por métodos bem conhecidos da técnica. Adicionalmente, bibliotecas e compostos naturais, e produzidos sinteticamente, são prontamente modificados através de meios químicos, físicos e bioquímicos convencionais.

[00160] Outras bibliotecas incluem bibliotecas de proteína/expressão, bibliotecas de cDNA de fontes naturais, incluindo, por exemplo, alimentos, vegetais, animais, bactérias, bibliotecas que expressam variantes aleatória ou sistematicamente mutadas de um ou mais polipeptídeos, bibliotecas genômicas em vetores virais que são usados para expressarem o teor de mRNA de uma célula ou tecido.

[00161] Em um ensaio de alta produtividade, é possível selecionar até várias centenas de moduladores ou de substratos diferentes em um único dia. Em particular cada poço de uma placa de microtítulo pode ser usado para efetuar um ensaio separado contra um modulador/substrato potencial separado, ou, se os efeitos de concentração ou de tempo de incubação são para serem observados, cada 5 a 10 poços podem testar um único modulador. Assim, uma placa de microtítulo, padrão, única pode ensaiar cerca de 100 moduladores. Quando placas de 1.536 poços são usadas, então uma única placa pode facilmente ensaiar de cerca de 100 a cerca de 1.500 compostos diferentes. É possível ensaiar várias placas diferentes por dia; é possível seleções de ensaio para até cerca de 6.000 a 20.000 compostos diferentes.

Tipos de agentes de teste que podem ser testados quanto ao seu efeito modulador de peptidase nos métodos de ensaio:

[00162] Os agentes de teste podem ser qualquer agente que inclua pequenos compostos químicos, polímeros químicos, polímeros biológicos, peptídeos, proteínas, açúcares, carboidratos, ácidos nucleicos e lipídios. Um agente pode ser um composto sintético, uma mistura de compostos, um produto natural ou uma amostra natural, por exemplo, extrato vegetal, sobrenadante de cultura, ou amostra de tecido.

Produtos para cuidado pessoal:

[00163] Os inibidores de enzima/neutralizadores de mau cheiro identificados podem ser adicionados a vários produtos para prevenir o mau cheiro do corpo. Por exemplo, produtos de cuidado pessoal incluem, sem limitação, desodorante, antiperspirante, loção, creme, pomada, loção para o corpo, unguento, sabonete, xampu, fragrância fina, água de colônia, água de toalete. Os produtos de cuidado pessoal podem ser perfumados ou podem ser sem perfume. Tais produtos contêm usualmente vários excipientes que são bem conhecidos da técnica. O efeito do neutralizador de mau cheiro dos produtos de cuidado pessoal pode ser ainda aperfeiçoado ao se excluir quaisquer ingredientes identificados como intensificadores de peptidase.

[00164] O modulador/inibidor identificado pode ser adicionado a uma solução aquosa, emulsão, solução alcoólica, solução de silício, óleo ou cera.

Sequências de ácidos nucleicos e proteínas:

[00165] As sequências empregadas nas constructos e métodos descritos aqui podem ser encontradas nas sequências listadas abaixo: SEQ ID NO: 1: Sequência de nucleotídeos peptidase de Corynebacterium sp. Ax20 SEQ ID NO: 2: Sequências de aminoácidos peptidase de Corynebacterium sp. Ax20 SEQ ID NO: 3: Sequência de nucleotídeos de peptidase de Corynebacterium jeikeium K411 SEQ ID NO: 4: Sequência de aminoácidos peptidase de Corynebacterium jeikeium K411 SEQ ID NO: 5: Sequência de nucleotídeos de -liase de Corynebacterium sp. Ax20 SEQ ID NO: 6: Sequência de aminoácidos de -liase de Corynebacterium sp. Ax20

[00166] A seguir é apresentada uma série de exemplos que servem para ilustrar a matéria descrita acima. Os exemplos a seguir são meramente ilustrativos e não devem ser interpretados como limitativos da matéria descrita aqui incluindo polipeptídeos, ácidos nucleicos/nucleotídeos, vetores de expressão, células hospedeiras, kit e produtos de cuidado pessoal, de qualquer forma.

Exemplos

[00167] Todos os exemplos usam as sequências de DNA derivadas de Corinebactérias, em particular Corynebacterium sp. Ax20 ("Ax20"), DSM 14267, que foi depositada em 26 de abril de 2001 na Autoridade de Depósito Internacional DSMZ- Coleção alemã de micro-organismos e culturas celulares, D-38124 Braunschweig (Número de Acesso DSM 14267), e Corynebacterium jeikeium K411 ("K411") (Tauch e outros 2005, J Bacteriol. 187(13): 4671-82).

[00168] Nos exemplos, o conjugado de cys-gly se refere ao seguinte composto dipeptídico:

[00169] O conjugado de cys nos exemplos se refere ao seguinte composto:

[00170] "β-liase" nos exemplos se refere à enzima β-liase descrita por Natsch e outros 2004, Chemistry & Biodiversity, 1, 1058. O quadro de leitura aberta inteiro do gene de β-liase (gene metC, 1134 bp) está disponível no Genebank sob número de acesso AY646680 (gi|51556860|gb|AY646680.1|[51556860]). Ele está também incluído na sequência de listagem (SEQ ID NO: 5, sequência de nucleotídeos, e SEQ ID NO: 6, sequência de proteínas).

[00171] "AMRE" ou "enzima AMRE" é a abreviatura para "enzima liberadora de mau cheiro axilar" e designa a enzima liberadora de ácido de mau cheiro Na-acil-glutamina-aminoacilase descrita por Natsch em EP 1258531. A sequência de aminoácidos de AMRE é SEQ ID NO: 1 em EP 1258531, o quadro de leitura aberto do gene de AMRE é SEQ ID NO: 5 em EP1258531. Sua expressão heteróloga está descrita no Exemplo 6 de EP 1258531.

Exemplo 1 Isolamento da peptidase (SEQ ID NO: 2)

[00172] Um extrato celular foi formado como a seguir: uma cultura de uma noite de Ax20 foi coletada por centrifugação e ressuspensa em um volume pequeno de tampão A (NaCl 50 mM; NaH2PO4 50 mM/K2HPO4 50 mM; pH 7), modificado com um volume de dez vezes de contas de vidros (425 a 600 μm, Sigma, St-Louis, US) e mecanicamente rompido por turbilhonamento destas em velocidade máxima, por 30 minutos. Os lisados foram centrifugados e os sobrenadantes reservados. O extrato celular de Corynebacterium sp. 4x20 foi então subsequentemente fracionado nas seguintes colunas: 1. fenil-sefarose (cromatografia de interação hidrofóbica), 2. mono-Q (troca de anion forte), 3. mono-P (troca de anion fraco) e 4. Superdex 200 (filtração em gel).

[00173] Amostras de cada fração foram incubadas, ambas com β- liase e com o conjugado de cys-gly ao mesmo tempo, e a liberação de 3-sulfanil-3-metil-hexanol foi determinada por um teste de fluorescência específico para grupos SH livres; com esta finalidade, a reação enzimática foi finalizada por adição de 0,5 volume de tampão de NaCO3 (0,1M, pH 8,8) contendo monobromobimano, assim derivatizando o grupo tiol livre. A fluorescência foi então medida em uma estação Flex (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, US) com um comprimento de onda de excitação de 385 nm e um comprimento de onda de emissão de 480 nm.

[00174] Um pico único de atividade (liberação de 3-sulfanil-3-metil- hexanol) foi encontrado em cada etapa de purificação, indicando que somente uma enzima é envolvida na reação de liberação.

[00175] Depois destas quatro etapas de purificação, a preparação foi separada em SDS-Page-gel. A banda de gel única para as frações ativas foi excisada e a peptidase assim obtida.

Exemplo 2 Clonagem do gene (SEQ ID NO: 1) e o isolamento da sequência de ácidos nucleicos que codificam peptidase (SEQ ID NO: 2)

[00176] A peptidase obtida no Exemplo 1 foi submetida a um digestor tríptico e análise de sequência de peptídeos. Com base nessas sequências de peptídeos isoladas, os iniciadores foram desenhados para amplificar uma sequência parcial do gene por reação de cadeia de polimerase usando DNA genômica de Corynebacterium sp. Ax20 como modelo.

[00177] A sequência de genes completa foi então isolada pela técnica denominada de "caminhar no cromossomo" com uma biblioteca cromossômica de Corynebacterium sp. Ax20.

[00178] Assim, o quadro de leitura aberta completo da sequência de peptidase foi obtido conforme mostrado na SEQ ID NO: 1.

Exemplo 3 Expressão heteróloga, produção e purificação da Ax20 peptidase

[00179] O quadro de leitura aberta (ORF) da peptidase (SEQ ID NO: 1) foi amplificado de DNA cromossômico de Corynebacterium sp. Ax20 por PCR usando iniciadores específicos. O ORF foi ligado a uma sequência que codifica um 6x Marcador de Histidina e clonado para um vetor de expressão (pET-3a, Studier e Moffatt, 1986). Os plasmídeos resultantes foram transformados em uma cepa de E. coli (BL21(DE3)).

[00180] Alternativamente, o ORF sem os 6 x Marcador de Histidina foi clonado no mesmo vetor.

[00181] As cepas de E. coli recombinantes com ou sem 6 x Marcador de Histidina foram crescidos em meio de NZCYM (10,0 g de hidrolisado de caseína; 5,0 g de NaCl; 1,0 g de casaminoácidos (Difco); 5,0 g de extrato de levedura; MgSO4 x 2,0 de 7 H2O; 2,0g de Maltose; 1.000,0 mL de Água destilada), induzido com IPTG (isopropil- β-D-tiogalactopiranosideo) e depois de 4 horas, as células foram lisadas por três passagens através de uma prensa francesa em um tampão de fosfato (100mM, pH 7). O lisado de células foi clarificado por centrifugação em 10.000 g por 15 minutos.

[00182] Para purificar a enzima, o lisado de células clarificado foi carregado em uma coluna de afinidade Ni-NTA (Qiagen, Hilden, Alemanha). A coluna foi lavada com um tampão que continha imidazol 20mM e finalmente eluído com um tampão com uma concentração crescente de 100 a 250 mM de imidazol. O eluato resultante continha a enzima recombinante em > 95% de pureza conforme mostrado por SDS Page.

Exemplo 4 Expressão heteróloga e produção da K411 peptidase (SEQ ID NO: 4)

[00183] A peptidase SEQ ID NO: 4 de Corinebactéria K411 foi expressa, produzida e purificada conforme descrição acima para SEQ ID NO: 2.

Exemplo 5 Atividade de AX20 e K411 peptidases

[00184] Cinquenta mililitros de cultura de E. coli recombinante conforme descrição no Exemplos 3 e 4 foram colhidos, ressuspensos em um volume final de 3 mL de tampão de fosfato e então rompidos com ultrassonicação. O extrato solúvel foi clarificado por centrifugação. Soluções diferentes do extrato resultante foram incubadas com o conjugado de cys-gly (1 mM) e tanto em presença como na ausência de excesso de β-liase. Como controle negativo, o lisado de células clarificado de E. coli transformado com um vetor vazio e lisados de células com o conjugado de cys-gly, mas sem β-liase, foram usados.

[00185] A Tabela mostra a liberação do agente de mau cheiro (3- sulfanil-3-metil-hexanol) em mM como determinada por teste de fluorescência descrito no Exemplo 1.

[00186] Conforme mostrado na tabela abaixo, vide colunas 2 a 4, o agente de mau cheiro (3-sulfanil-3-metil-hexanol) foi somente liberado do conjugado de cys-gly pela cepa de E. coli recombinante transformada com o plasmídeo contendo SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 (expressando SEQ ID NO: 2/AX20 ou SEQ ID NO: 4/K411 peptidase) e somente em presença da β-liase. A K411 peptidase cliva o conjugado de cys-gly (vide coluna 5) com eficácia menor que a Ax20 peptidase.

[00187] Isso mostra que a sequência de nucleotídeos isolada de SEQ IN NO: 1 e SEQ ID NO: 3 codifica uma enzima peptidase com atividade enzimática relevante.

[00188] Como mostrado, o marcador de histidina não tem qualquer efeito significante sobre a atividade da peptidase.

Exemplo 6 Especificidade de substrato de Ax20 peptidase

[00189] A AX20 peptidase recombinante formada conforme descrita no Exemplo 3 (enzima marcada purificada em coluna de afinidade) foi incubada com compostos diferentes, em particular substratos de dipeptídeos, candidatos potenciais, para caracterizar a especificidade do substrato e para identificar substratos úteis para ensaios de seleção (por exemplo, para selecionar moduladores, inclusive inibidores).

[00190] A Tabela abaixo lista os compostos testados (a maioria dipeptídeos indicados por seus nomes abreviados, por exemplo, ala- gly para um dipeptídeo de alanina-glicina) e indica se eles são clivados pela peptidase. Z indica um grupo protetor bezilóxi-carbonila na terminação N do peptídeo.

[00191] A clivagem foi determinada por cromatografia de camada fina.

[00192] As quantidades são qualitativas com (+++) indicando >80% de clivagem de uma solução 1mM por 0,1 μg/mL de peptidase durante uma incubação durante 1 hora; (++) indica clivagem completa de uma solução 1mM por 1 μg/mL de peptidase durante incubação por 1 hora e (+) indica clivagem parcial (20 a 80%) de uma solução 1mM por 1 μg/mL de peptidase durante uma incubação por 1 hora e (-) indicando a ausência de qualquer clivagem.

Exemplo 7 Método para identificar moduladores/inibidores de peptidase

[00193] A clivagem do substrato de peptídeo Pro-Gly por adição da AX20 peptidase recombinante (SEQ ID NO: 2) liberou um único grupo NH2 livre que pode ser derivatizado por fluorescamina (Fluram®, Fluka, Buchs, Suíça).

[00194] Os compostos de teste (por exemplo, inibidores de enzima potenciais) são dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO), por exemplo, em poços individuais de uma placa de microtítulo.

[00195] AX20 peptidase dissolvida em tampão de fosfato é adicionada aos poços individuais da placa de microtítulo (1 μg/mL de peptidase), e incubada por 5 minutos para permitir o equilíbrio e ligação dos inibidores, se alguma, à peptidase.

[00196] O substrato Pro-Gly dissolvido em tampão de fosfato é adicionado à mistura de composto de teste/peptidase em cada poço para dar uma concentração final de 1mM.

[00197] Alternativamente, outro composto de substrato pode ser usado. Substratos úteis incluem Ala-ala, Ala-Gly, o conjugado de Cys- Gly e S-benzil-Cys-Gly. Se esses compostos são usados, a detecção da clivagem é realizada determinando-se a glicina livre formada (por cromatografia em camada fina (TLC) ou por cromatografia líquida de alta performance (HPLC), em vez de por fluormetria.

[00198] Depois de um tempo de incubação de 60 minutos a 37oC, o grupo NH2 livre da glicina liberado de Pro-Gly é derivatizado por adição de Fluram dissolvido em acetonitrila para uma concentração final de Fluram de 1mM e uma concentração final de acetonitrila de 25% v/v, e depois de 5 minutos de incubação, a fluorescência é determinada em uma estação Flex (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, US) com um comprimento de onda de excitação de 381 nm e um comprimento de onda de emissão de 470 nm. Os controles são efetuados em paralelo e submetidos ao mesmo procedimento. Um controle positivo contém DMSO sem inibidor, um controle negativo não contém substrato.

[00199] A % de adição é calculada com base em uma comparação com o controle positivo (0% de inibição/100% de atividade). Exemplos de inibidores ativos assim identificados são mostrados na tabela abaixo.

[00200] Os resultados na Tabela mostram que o composto Pro-Gly é um substrato útil para seleção de alto rendimento. Somente o grupo NH2 presente é um em Gly liberado através de clivagem pela peptidase, resultando em um razão superior de sinal para ruído.

[00201] Um inibidor é usualmente identificado por inibição de pelo menos 50% de inibição, por exemplo, em uma concentração de 1mM, 100microM, 10microM, 1microM, ou abaixo.

Exemplo 7b Método para identificar moduladores/inibidores de peptidase usando várias enzimas de peptidase

[00202] O Exemplo 7 pode ser realizado conforme descrito, exceto pelo fato de que a enzima peptidase é substituída e uma ou mais de SEQ ID NO: 4 (K411 peptidase) são usados, ou um homólogo para SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 2 (Ax20 peptidase).

Exemplo 7c Método para identificar moduladores/inibidores de peptidase com amplo espectro inibidor

[00203] O Exemplo 7 pode ser realizado conforme descrito, exceto que foram usadas duas ou mais enzimas de peptidase selecionadas de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, ou um homólogo de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 2, subsequentemente ou em paralelo. Quando realizado em paralelo, as reações enzimáticas podem ser efetuadas no mesmo poço, empregando-se um tampão compatível.

[00204] Isso tem a vantagem de identificar compostos que agem em ambas as peptidases e identificar compostos inibidores com uma ampla atividade inibidora contra várias cepas bacterianas.

Exemplo 8 Método para identificar moduladores/inibidores de peptidase que são ativos contra peptidase e/ou β-liase

[00205] O exemplo foi realizado como alternativa para o ensaio de seleção conforme descrito no Exemplo 7, com as seguintes modificações.

[00206] Como substratos, o conjugado de cys-gly ou os compostos da estrutura dos substratos descritos aqui e acima são usados.

[00207] Esses incluem (S-benzil)-cys-gly, (S-benzil)-cys-ala, ou qualquer conjugado de cys-gly ou cys-Ala substituído com S, por exemplo, S-etil-, S-propil-, S-butil-, S-pentil-, S-hexil-, S-fenil-cys-gly ou -cys-ala.

[00208] Alternativamente, derivados de ser-ala ou ser-gly substituídos são usados, os quais são substituídos no grupo OH da serina. A mesma grande variedade de substituintes em serina é possível como quando em cisteína.

[00209] Para os resultados abaixo foi usado (S-benzil)-cys-gly.

[00210] A peptidase (SEQ ID NO: 2) em uma concentração de 0,1 μg/mL foi usada em combinação com β-liase em uma concentração de 0,1 μg/mL; ambas as enzimas foram dissolvidas no mesmo tampão de fosfato, ao mesmo tempo.

[00211] Simultaneamente, selecionar inibidores de ambas a β-liase e peptidase tem a vantagem de uma seleção mais eficaz (isto é, ambos os inibidores ou de peptidase ou da β-liase ou ambos serem identificados ao mesmo tempo). Subsequentemente, cada "acerto" de seleção (modulação/inibição de liberação do agente de mau cheiro) foi ainda analisado para determinar a atividade da peptidase e/ou atividade da β-liase separadamente.

[00212] Em vez de derivatizar o grupo NH2 livre do conjugado por adição de Fluram, o grupo SH livre liberado do conjugado pela ação subsequente de ambas as enzimas foi derivatizado por adição de monobromobimano (Fluka, Buchs, Suíça) dissolvida em tampão de NaCO3 (100mM, pH 8,8) para dar uma concentração final de 0,5mM a 1mM. Depois de 5 a 15 minutos de incubação, a fluorescência foi medida em uma estação Flex (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, US) com um comprimento de onda de excitação de 385 nm e um comprimento de onda de emissão de 480 nm.

[00213] Alternativamente, outros agentes de derivatização de tiol foram usados incluindo N-(9-acridinil)maleimida e detecção fluorescente em 359/440 nm.

[00214] Inibidores de peptidase ativos assim identificados são mostrados na tabela abaixo.

Exemplo 9 Método para identificar moduladores/inibidores de banda ampla ativos contra uma ou mais peptidases (SEQ ID NO: 2 ew/ou N:4) e AMRE

[00215] Em uma etapa adicional ao Exemplo 7 ou 8, os inibidores de peptidase identificados foram testados quanto a seu efeito modulador contra a enzima AMRE (Nα-acil-glutamina-aminoacilase descrita por Natsch em EP1259531), identificando, assim, inibidores duais de ambas as enzimas de metalopeptidase envolvidas na liberação de mau cheiro.

[00216] Alternativamente, as etapas podem ser realizadas em paralelo em presença das enzimas simultaneamente.

[00217] AMRE é formada conforme descrição no Exemplo 6 de EP1258531.

[00218] Os resultados estão listados na Tabela abaixo.

[00219] Assim, os resultados demonstram que os inibidores ativos, nestes casos quelantes de metal, ativos contra mais que uma enzima formadora de mau cheiro, podem ser identificados com uma combinação dos ensaios descritos, resultando assim em um ensaio eficaz para identificar moduladores/inibidores de banda ampla.

Exemplo 10 Diferenças na clivagem do conjugado de cys-gly quando clivado com lisado de células Ax20 ou β-liase

[00220] Os compostos de teste (conjugado de Cys (1mM) ou conjugado de Cys-Gly (1mM)) foram incubados com β-liase.

[00221] Os compostos de teste (conjugado cys (1mM) ou conjugado de cys (1mM) foram também incubados com o extrato de cepa do tipo selvagem de Corynebacterium sp. Ax20 contendo peptidase de SEQ ID NO: 2. O extrato celular de Corynebacterium sp. Ax20 foi preparado conforme descrito no Exemplo 1. O extrato resultante foi diluído para o mesmo volume que o da cultura original que tinha quando ajustado para uma densidade óptica de OD 4. O substrato foi incubado com o extrato por 24 horas.

[00222] A clivagem foi medida por cromatografia de gás para determinar a liberação de 3-sulfanil-3-metil-hexanol em mM. Os resultados estão mostrados na tabela abaixo.

[00223] Os resultados mostram que somente o conjugado de cys, mas não o conjugado de cys-gly, foi clivado por β-liase recombinante, indicando que a β-liase não pode clivar o substrato principal na secreção da axila (vide fileira 2 da Tabela acima).

[00224] Contudo, o extrato de C. sp Ax20 isolado da axila de um paciente de teste humano realmente libera 3-sulfanil-3-metil-hexanol de ambos os conjugados (vide fileira 3 da Tabela acima).

Exemplo 11 Frações separadas de extrato de C. sp. Ax20 não são capazes de liberar mau cheiro

[00225] Extratos celulares obtidos de C. sp Ax20 conforme descritos no Exemplo 1 foram fracionados usando-se uma coluna de troca aniônica Mono-Q. As frações resultantes foram incubadas separadamente com o conjugado de cys-gly e a liberação de 3- sulfanil-3-metil-hexano (agente de mau cheiro) foi medida conforme descrição no Exemplo 1.

[00226] Os resultados mostraram que nenhuma única fração de extrato de C. sp. Ax20 foi capaz de liberar 3-sulfanil-3-metil-hexanol do conjugado de cys-gly. Isso demonstra que não há uma simples enzima presente nos extratos de C. sp. que possa liberar o agente de mau cheiro do conjugado de cys-gly.

Exemplo 12 Fração de extrato de C. sp. libera agente de mau cheiro quando em combinação com β-liase

[00227] Frações de extratos celulares de C. sp. Ax20 foram formados conforme descrição no Exemplo 11.

[00228] Cada fração foi incubada com β-liase e com o conjugado de cys-gly. A liberação de 3-sulfanil-3-metil-hexanol (agente de mau cheiro) foi medida conforme descrição no Exemplo 1 acima.

[00229] Os resultados mostraram que uma única fração liberou 3- sulfanil-3-metil-hexanol do conjugado de cys-glys em presença da β- liase. As outras frações ou a β-liase por elas mesmas não foram capazes de liberarem o agente de mau cheiro.

[00230] Juntamente com os resultados do Exemplo 11, isso demonstra que duas enzimas estão mediando a clivagem do conjugado de cys-gly: primeiramente a peptidase está clivando o dipeptídeo entre o resíduo gly e o cys, e então uma β-liase liberando subsequentemente o agente de mau cheiro do conjugado de cys formado pela peptidase.

Exemplo 13 Liberação de mau cheiro pelo extrato de Corinebactéria é inibida por inibidores de peptidase

[00231] Extratos de C. sp. Ax20 e C. jeikeium K411 foram formados conforme descrição no Exemplo 1.

[00232] O-fenantrolina (0,5mM), um inibidor de metalopeptidase, ou Complete® (isento de EDTA), uma mistura de inibidores protease (Roche Biochemicals, Suíça; uso de concentração conforme indicação do fabricante) que contém uma serina de ampla especificidade e inibidores de aspartato-peptidases, mas não de inibidores de metalopeptidase, foram adicionados às bateladas dos extratos e incubados por 10 minutos.

[00233] O conjugado de cys ou o conjugado de cys-gly (1mM), ambos precursores para o agente de mau cheiro 3-sulfanil-3-metil- hexanol, foram então adicionados aos extratos de C. sp. Ax20 ou C. jeikeium K411 contendo os inibidores diferentes.

[00234] A liberação do agente de mau cheiro 3-sulfanil-3-metil- hexanol, que indica atividade enzimática nos lisados de células de Corinebactérias, foi medida conforme descrição nos Exemplos 12 e 13.

[00235] Os resultados (em % de inibição de liberação de 3-sulfanil- 3-metil-hexanol em comparação com as reações de inibidores adicionados) são indicados na Tabela abaixo.

[00236] Conforme mostrado no Exemplo 10, incubação com extrato de C. sp. Ax20 induziu uma liberação de agente de mau cheiro significante de ambos os conjugados, e extrato de C. jeikeium K411 também clivou ambos os substratos, embora em uma razão mais baixa.

[00237] A adição do inibidor de metalopeptidase, o-fenantrolina, não inibe a clivagem do conjugado de Cys (0% de inibição), mas inibe a clivagem do conjugado de cys-gly (100% de inibição) quando extrato de C. sp. é usado. Similarmente, para o extrato de C. jeikeium, não há inibição para o conjugado de cys, mas inibição alta do conjugado de cys-gly (93%).

[00238] Isso mostra que a clivagem do conjugado de cys-gly (mas não o conjugado de cys) é mediada por uma enzima suscetível à inibição pelo inibidor de metalopeptidase, o-fenantrolina.

[00239] Isso indica também que a reação de β-liase (clivagem do conjugado de Cys) não é bloqueada por o-fenantrolina, mas somente a clivagem de ligação de cys-gly é inibida, e mostra que uma metalopeptidase em extratos de Corinebactérias catalisa, exclusivamente, esta reação.

[00240] A mistura de inibidores de protease (Complete®) com ampla especificidade para diferentes serina e aspartato-peptidases não bloquearam significantemente a clivagem de qualquer um dos conjugados, mostrando que não há serina/aspartato-peptidase envolvida na liberação do agente de mau cheiro.

[00241] Embora as peptidases, nucleotídeos, vetores de expressão, células hospedeiras, métodos e kit tenham sido descritos acima em conexão com certas modalidades ilustrativas, é para ser entendido que outras modalidades similares podem ser usadas ou modificações e adições podem ser efetuadas nas modalidades descritas para realizar a(s) mesma(s) função(ções). Ainda, todas as modalidades descritas não são necessariamente alternativas, pois várias modalidades podem ser combinadas para proporcionar as características desejadas. Variações podem ser efetuadas por aquele com conhecimento versado da técnica sem se desviar do espírito e escopo da descrição. Portanto, os nucleotídeos, polipeptídeos/peptidases, vetores de expressão, células hospedeiras, métodos e kit não devem ser limitados a qualquer modalidade única, mas sim serem interpretados na abrangência e escopo de acordo com o mencionado nas reivindicações apensas.

Claims (8)

1. Método para identificar um modulador da formação de mau cheiro no corpo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) contatar uma peptidase com um substrato de peptidase e pelo menos um agente de teste; e (ii) determinar o efeito de o, pelo menos, um agente de teste na taxa de reação mediada por peptidase, em que a peptidase tem a atividade catalítica para liberar glicina do composto de substrato de fórmula FIII em que a peptidase é uma sequência de polipeptídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4; em que a peptidase compreende as seguintes sequências conservadas parciais: ERDGRWYGRGXADCKG entre o aminoácido 105 e 150 correspondendo às posições 113-128 de SEQ ID NO:2 e posições 119-134 de SEQ ID NO:4, EGSEEXG entre o aminoácido 150 e 180 correspondendo às posições 155-161 de SEQ ID NO:2 e posições 167-173 de SEQ ID NO:4, HSGXXGGXAPDA entre o aminoácido 205 e 255 correspondendo às posições 219-230 de SEQ ID NO:2 e posições 230-241 de SEQ ID NO:4, GGSIPL entre o aminoácido 385 e 425 correspondendo às posições 397-402 de SEQ ID NO:2 e posições 406-411 de SEQ ID NO:4; e em que os aminoácidos são numerados a partir da terminação N de uma peptidase em sua forma de ocorrência natural, e as letras se referem ao código de aminoácidos de caracteres únicos e X é qualquer dos 20 aminoácidos comuns.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o substrato é um composto selecionado do grupo consistindo em S-benzil-Cys-Gly, O-benzil-Ser-Gly, (1-(2-hidroxietil)-1- metilbutil)-L-cisteinil-glicina, S-benzil-Cys-Ala, O-benzil-Ser-Ala, Pro- Gly, Ala-Gly, Ala-Ala, e Pro-Ala.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que uma enzima adicional, uma cisationina- β-liase, é incubada com o substrato e o agente de teste em paralelo ou subsequentemente, e em que na etapa (ii), o efeito do agente de teste na clivagem pelas enzimas peptidase e β-liase é determinado pela alteração da formação de pelo menos um de seus produtos de reação, opcionalmente um produto de reação selecionado de um produto de reação de tiol e um produto de reação de hidróxi.

4. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) uma peptidase, e (ii) um composto de substrato que é clivado pela peptidase, para uso combinado para identificar os agentes de teste como moduladores da peptidase e formação de mau cheiro, em que o composto de substrato é selecionado do grupo consistindo em S-benzil-Cys-Gly, O-benzil-Ser-Gly, (1-(2-hidroxietil)-1- metilbutil)-L-cisteinil-glicina, S-benzil-Cys-Ala, O-benzil-Ser-Ala, Pro- Gly, Ala-Gly, Ala-Ala, e Pro-Ala, em que a peptidase tem a atividade catalítica para liberar glicina do composto de substrato de fórmula FIII em que a peptidase é uma sequência de polipeptídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4; em que a peptidase compreende as seguintes sequências parciais conservadas: ERDGRWYGRGXADCKG entre o aminoácido 105 e 150 correspondendo às posições 113-128 de SEQ ID NO:2 e posições 119-134 de SEQ ID NO:4, EGSEEXG entre o aminoácido 150 e 180 correspondendo às posições 155-161 de SEQ ID NO:2 e posições 167-173 de SEQ ID NO:4, HSGXXGGXAPDA entre o aminoácido 205 e 255 correspondendo às posições 219-230 de SEQ ID NO:2 e posições 230-241 de SEQ ID NO:4, GGSIPL entre o aminoácido 385 e 425 correspondendo às posições 397-402 de SEQ ID NO:2 e posições 406-411 de SEQ ID NO:4; e em que os aminoácidos são numerados a partir da terminação N de uma peptidase em sua forma de ocorrência natural, e as letras se referem ao código de aminoácidos de caracteres únicos e X é qualquer dos 20 aminoácidos comuns.

5. Método para inibir uma peptidase em sua capacidade de clivar seu substrato, caracterizado pelo fato de que a peptidase é contatada com um inibidor de peptidase, em que o inibidor de peptidase é um substrato não-fisiológico de Fórmula FI em que X é selecionado dentre o grupo consistindo em S e O, e em que R1 é um resíduo selecionado dentre H e metila, e em que R2 é um resíduo selecionado dentre o grupo consistindo em C1-C10 alquila de cadeia linear ou ramificada, C1-C10 alcanol de cadeia linear ou ramificada, uma fenila e uma benzila, e em que a peptidase tem a atividade catalítica para liberar glicina do composto de substrato de fórmula FIII em que a peptidase é uma sequência de polipeptídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4; em que a peptidase compreende as seguintes sequências parciais conservadas: ERDGRWYGRGXADCKG entre o aminoácido 105 e 150 correspondendo às posições 113-128 de SEQ ID NO:2 e posições 119-134 de SEQ ID NO:4, EGSEEXG entre o aminoácido 150 e 180 correspondendo às posições 155-161 de SEQ ID NO:2 e posições 167-173 de SEQ ID NO:4, HSGXXGGXAPDA entre o aminoácido 205 e 255 correspondendo às posições 219-230 de SEQ ID NO:2 e posições 230-241 de SEQ ID NO:4, GGSIPL entre o aminoácido 385 e 425 correspondendo às posições 397-402 de SEQ ID NO:2 e posições 406-411 de SEQ ID NO:4; e em que os aminoácidos são numerados a partir da terminação N de uma peptidase em sua forma de ocorrência natural, e as letras se referem ao código de aminoácidos de caracteres únicos e X é qualquer dos 20 aminoácidos comuns.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é para prevenir ou reduzir a formação de mau cheiro no corpo, em que um inibidor de peptidase é aplicado a uma superfície do corpo, em que a peptidase tem a atividade catalítica para liberar glicina do composto de substrato de fórmula FIII em que a peptidase é uma sequência de polipeptídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4; em que a peptidase compreende as seguintes sequências parciais conservadas: ERDGRWYGRGXADCKG entre o aminoácido 105 e 150 correspondendo às posições 113-128 de SEQ ID NO:2 e posições 119-134 de SEQ ID NO:4, EGSEEXG entre o aminoácido 150 e 180 correspondendo às posições 155-161 de SEQ ID NO:2 e posições 167-173 de SEQ ID NO:4, HSGXXGGXAPDA entre o aminoácido 205 e 255 correspondendo às posições 219-230 de SEQ ID NO:2 e posições 230-241 de SEQ ID NO:4, GGSIPL entre o aminoácido 385 e 425 correspondendo às posições 397-402 de SEQ ID NO:2 e posições 406-411 de SEQ ID NO:4; e em que os aminoácidos são numerados a partir da terminação N de uma peptidase em sua forma de ocorrência natural, e as letras se referem ao código de aminoácidos de caracteres únicos e X é qualquer dos 20 aminoácidos comuns.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o composto é aplicado na forma de uma composição dermatologicamente aceitável, compreendendo pelo menos um excipiente.

8. Método para formar uma peptidase, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de cultivar células hospedeiras compreendendo um vetor de expressão que codifica a peptidase sob condições suficientes para expressão, formando, assim, a peptidase e, opcionalmente, recuperando esta das células, em que a peptidase tem atividade catalítica para liberar glicina do composto de substrato de fórmula FII em que a peptidase compreende uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO:2; em que a peptidase compreende as seguintes sequências parciais conservadas: ERDGRWYGRGXADCKG entre o aminoácido 105 e 150 correspondendo às posições 113-128 de SEQ ID NO:2, EGSEEXG entre o aminoácido 150 e 180 correspondendo às posições 155-161 de SEQ ID NO:2, HSGXXGGXAPDA entre o aminoácido 205 e 255 correspondendo às posições 219-230 de SEQ ID NO:2, GGSIPL entre o aminoácido 385 e 425 correspondendo às posições 397-402 de SEQ ID NO:2; e em que os aminoácidos são numerados a partir da terminação N de uma peptidase em sua forma de ocorrência natural, e as letras se referem ao código de aminoácidos de caracteres únicos e X é qualquer dos 20 aminoácidos comuns.