CN101855361A - 酶促方法和酶 - Google Patents

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Abstract

提供的是采用肽酶鉴定身体恶臭形成的调节剂且特别是抑制剂的方法、肽酶和相对应核苷酸序列、表达载体、转染宿主细胞、形成肽酶的方法和阻止身体恶臭的方法。

Description

酶促方法和酶
技术领域
提供的是采用编码肽酶的核苷酸、用于肽酶表达的构建体和包含此种构建体的细胞、以及所得到的肽酶来鉴定身体恶臭形成的调节剂的方法。
核苷酸编码其为肽酶的蛋白质。肽酶涉及恶臭形成，并且可以在鉴定身体恶臭形成的调节剂特别是抑制剂的方法中采用。这些抑制剂具有阻止或减少身体特别是人体上的恶臭形成的能力。
背景
自20世纪50年代以后，已知由顶泌腺分泌的汗液是没有气味的，并且不希望有的汗味仅通过细菌作用而产生。因此，得出结论汗液包含恶臭前体，并且恶臭物通过细菌对所述前体的酶促作用而释放。
身体恶臭特别包括腋臭是由于3类主要化合物：硫烷基醇、不饱和酸或羟化酸和类固醇。本文描述的方法用于鉴定阻止硫烷基醇形成的抑制剂。
申请人先前鉴定了关于不饱和或羟化酸的恶臭前体，和形成其的氨基酰化酶(“AMRE”)(EP 1258531)。AMRE酶可以用于筛选恶臭形成酶的抑制剂，并且从而鉴定阻止或减少身体恶臭的化合物。
对于硫烷基醇的释放，申请人鉴定了源自棒状杆菌属物种(Corynebacteriumsp.)Ax20的胱硫醚-β-裂合酶和前体化合物(A.Natsch等人，Chemistry & Biodiversity 2004，1058)。
Starkenmann等人假定源自溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)的不同β-裂合酶从不同前体即式FIII的前体中释放硫烷基醇(WO2006079934)。
Figure GPA00001091833400021
虽然一般认为葡萄球菌属细菌不涉及恶臭形成至主要程度，但FIII的化合物(在实施例中：“cys-gly-缀合物”)看起来促成身体恶臭。
序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4作为其假定基因产物，被先前在序列数据库中公开，但蛋白质功能、催化活性及其在恶臭产生中的牵涉是未知的。
申请人目前已令人惊讶地鉴定了第三种类型的酶(肽酶包括但不限于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4)，其从前体I(例如，但不限于FIII的化合物)，或备选地，从在下文中描述的各种其他底物中释放前体II，并且连同先前鉴定的胱硫醚-β-裂合酶的作用最终形成硫烷基醇恶臭物(比较图1)。
新类型的肽酶和先前由申请人描述的β-裂合酶都存在于棒状杆菌中。不希望受理论束缚，一般公认高度不愉快的恶臭主要通过棒状杆菌从新鲜汗液中释放。
申请人显示不存在能从前体I特别是但不限于化合物FIII中释放恶臭物的棒状杆菌属物种Ax20提取物的单一级份。这证实棒状杆菌属物种提取物中不存在可以切割前体I的单一酶(比较下文显示的实施例，特别是实施例11)。进一步地，申请人显示2种酶介导前体I特别是但不限于FIII的化合物的切割：首先肽酶(例如但不限于，SEQ IDNO：2或NO：4)切割在gly和cys残基之间的二肽，并且随后β-裂合酶从由肽酶形成的cys-缀合物(FIV)中释放恶臭物(比较下文显示的实施例，特别是实施例12)。
Figure GPA00001091833400031
图1前体I和II反应生成硫烷基醇恶臭物；从前体I到前体II的反应由新近鉴定的肽酶执行。
经鉴定的类型的酶用作备选筛选靶，以鉴定由硫烷基醇恶臭物的恶臭形成的抑制剂。
前体I(生理学相关底物)具有通式FII
Figure GPA00001091833400032
其中R1选自由甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基组成的烷烃残基组
并且其中R2和R3独立地选自H和甲基。
因此，硫烷基醇恶臭物具有通式FV
Figure GPA00001091833400033
其中R1选自由甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基组成的烷烃残基组
并且其中R2和R3独立地选自H和甲基。
如下文在节段“肽酶底物”中详述的，肽酶还将使式FI的非生理学底物反应，这对于筛选目的有用。
该类型的肽酶是特别有利的，因为，不希望受理论束缚，它不仅存在于最相关属的细菌中，这种类型的肽酶看起来还在恶臭形成酶促反应中执行限速步骤，并且经鉴定的抑制剂因此可以预期是特别有效的。
再进一步地，再次不希望受理论束缚，肽酶(SEQ ID NO：2和SEQID NO：4)的2个实施方案都属于与先前鉴定的AMRE酶相同的酶类别(金属肽酶)，所述AMRE酶形成恶臭的不饱和或羟化酸，并且用肽酶筛选(包括但不限于，SEQ ID 2和SEQ ID 4的酶)可能导致发现还针对涉及形成恶臭的不饱和酸或羟化酸的金属肽酶活性的抑制剂，并且因此同时有效减少2个类别的恶臭物形成。
概述
提供的是下述：
(1)鉴定身体恶臭形成的调节剂的方法，该方法包括步骤：
(i)使肽酶与肽酶底物和至少一种测试试剂接触；和
(ii)测定至少一种测试试剂对肽酶介导的反应速率的影响，
其中肽酶具有从式FIII的底物化合物中释放甘氨酸的催化活性
其中肽酶与选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的多肽序列同源，具有至少40％的序列同一性；
其中肽酶包含下述保守的部分序列：
氨基酸105和150之间的ERDGRWYGRGXADCKG，
氨基酸150和180之间的EGSEEXG，
氨基酸205和255之间的HSGXXGGXAPDA，
氨基酸385和425之间的GGSIPL；
并且其中氨基酸从以其天然存在形式的实质性同源的肽酶的N末端开始编号，并且字母指单字符氨基酸编码，并且X是20种普通氨基酸中的任何一种。
(2)条款(1)的方法，其中步骤(i)中的肽酶底物是式FI的化合物
其中X选自S和O，并且其中R1是选自H和甲基的残基，并且其中R2是选自直链或分支C1至C10烷基、直链或分支C1至C10烷醇、苯基和苄基的残基。
在条款(2)的备选实施方案中，X是S。
(3)条款(1)的方法，其中底物是选自S-苄基-Cys-Gly、O-苄基-Ser-Gly、(1-(2-羟乙基)-1-甲基丁基)-L-半胱氨酰基-甘氨酸、S-苄基-Cys-Ala、O-苄基-Ser-Ala、Pro-Gly、Ala-Gly、Ala-Ala和Pro-Ala的化合物。
在条款(3)的备选实施方案中，底物是选自S-苄基-Cys-Gly、O-苄基-Ser-Gly、(1-(2-羟乙基)-1-甲基丁基)-L-半胱氨酰基-甘氨酸、S-苄基-Cys-Ala和O-苄基-Ser-Ala的化合物。
在条款(3)的备选实施方案中，底物是选自Pro-Gly、Ala-Gly、Ala-Ala、Pro-Ala的化合物。
(4)条款(1)至(3)中任一项的方法，其中使另外的酶胱硫醚-β-裂合酶与底物和测试试剂并行或顺次温育，并且其中在步骤(ii)中，测试试剂对通过肽酶和β-裂合酶的切割的影响通过在其反应产物的至少一种的形成中的改变进行测定，所述反应产物的至少一种任选地选自硫醇反应产物和羟基反应产物。
(5)试剂盒包括：
(i)如本文所描述的特别是如在条款(1)下限定的肽酶，和
(ii)由该肽酶切割的底物化合物，
用于组合使用以鉴定作为所述肽酶和恶臭形成的调节剂的测试试剂。
在条款(5)的一个具体实施方案中，底物化合物是式FI的化合物
Figure GPA00001091833400061
其中X选自S和O，并且其中R1是选自H和甲基的残基，并且其中R2是选自直链或分支C1至C10烷基、直链或分支C1至C10烷醇、苯基和苄基的残基。
在条款(5)的另一个实施方案中，式FI的所述底物化合物选自S-苄基-Cys-Gly、O-苄基-Ser-Gly、(1-(2-羟乙基)-1-甲基丁基)-L-半胱氨酰基-甘氨酸、S-苄基-Cys-Ala、O-苄基-Ser-Ala、Pro-Gly、Ala-Gly、Ala-Ala和Pro-Ala。
在条款(5)的另外一个实施方案中，式FI的所述底物化合物选自S-苄基-Cys-Gly、O-苄基-Ser-Gly、(1-(2-羟乙基)-1-甲基丁基)-L-半胱氨酰基-甘氨酸、S-苄基-Cys-Ala、O-苄基-Ser-Ala。
在条款(5)的另外一个实施方案中，式FI的所述底物化合物选自Pro-Gly、Ala-Gly、Ala-Ala和Pro-Ala。
(6)在其切割其底物的能力方面抑制如本文所限定的特别是在条款(1)下的肽酶的方法，其中使肽酶与肽酶抑制剂接触。
(7)用于阻止或减少身体恶臭形成的条款(6)的方法，其中将肽酶抑制剂应用于身体表面，并且其中肽酶是如本文所描述的特别是但不限于在条款(1)下的肽酶。
(8)条款(7)的方法，其中化合物以包含至少一种赋形剂的皮肤病学可接受的组合物形式应用。
(9)用于制备具有针对身体恶臭形成的效应的个人护理产品的方法，其中将肽酶抑制剂加入个人护理产品制剂中，并且其中肽酶是如本文所描述的特别是但不限于在条款(1)下的肽酶。
(10)包含肽酶底物和分离的肽酶的组合物，
其中肽酶是如本文所描述的特别是但不限于在条款(1)下的肽酶；
其中肽酶底物是如本文所描述的特别是但不限于在条款(2)或(3)中任一项或其具体实施方案任何一个中的肽酶底物。
(11)条款(10)的组合物，其中肽酶是选自分离形式、包含功能肽酶的制剂形式、在合适宿主细胞中的异源表达形式、表达肽酶的杰氏棒状杆菌(Corynebacterium jeikeium)形式、和表达肽酶的杰氏棒状杆菌K411形式的形式。
(12)分离的肽酶，其中肽酶是如本文所描述的特别是但不限于在条款(1)下的肽酶，
并且其中肽酶与选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的序列同源，具有至少40％的序列同一性。
(13)条款(12)的分离的肽酶，其中肽酶与选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的序列同源，具有至少80％的序列同一性。
在其他实施方案中，序列同一性是至少85％、至少90％、至少95％或至少98％。
(14)编码肽酶的核苷酸，其中肽酶是如本文所描述的特别是但不限于在条款(1)下的肽酶，其选自
通过序列同一性测定的与SEQ ID NO：1的核苷酸序列实质性同源的核苷酸，
当翻译成相对应蛋白质时，不引起氨基酸改变的SEQ ID NO：1的保守修饰变体的核苷酸，
通过杂交测定的与SEQ ID NO：1实质性同源的核苷酸，
其中通过序列同一性测定的实质性同源的核苷酸具有至少80％的序列同一性。
在其他实施方案中，序列同一性是至少85％、至少90％、至少95％或至少98％。
(15)条款(16)的分离的核苷酸，其中所述分离的核苷酸构成表达载体的部分。
(16)条款(16)的分离的核苷酸，其中表达载体构成用表达载体转染的宿主细胞的部分。
(17)形成肽酶的方法，其包括下述步骤：在足以表达的条件下培养包括编码肽酶的表达载体的宿主细胞，从而形成肽酶，并且任选地从细胞中将其回收，其中肽酶是如本文所描述的特别是但不限于如在条款(1)下的肽酶。
详述
下述段落详细描述了肽酶及其变体，其底物，其反应产物，其在鉴定身体恶臭的调节剂和抑制剂中的用途，包括各种筛选测定法和如何执行它们，包括可以使用的细胞，使用纯化肽酶的测定法，肽酶转录测定法，关于肽酶的表达系统，肽酶的超表达，肽酶构建体转染到细胞内，肽酶蛋白质回收，肽酶调节剂，肽酶底物鉴定，结合测定法，鉴定调节剂的试剂盒，经鉴定的调节剂的证实，大规模筛选测定法，测试试剂文库，测试试剂类型，个人护理产品和肽酶序列。
肽酶和实质性同源的序列：
在本文描述的方法中有用的肽酶(或编码其的核苷酸)可以选自SEQ ID NO：2的肽酶(或关于编码其的核苷酸SEQ ID NO：1)，SEQ IDNO：4的肽酶(或关于编码其的核苷酸SEQ ID NO：3)，和与SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：4实质性同源的肽酶(或关于编码其的核苷酸SEQ IDNO：1和/或SEQ ID NO：3)，并且保留功能，即肽酶结合如本文描述的底物/恶臭物前体和/或反应/切割所述底物/恶臭物前体(或在核苷酸的情况下，如果它们编码此种肽酶，那么它们视为功能的)。例如，但不限于，肽酶或编码肽酶的核苷酸可衍生自天然存在的棒状杆菌或可从人腋窝中分离。
实质性同源的肽酶包含下述保守的部分序列块(字母指单字符氨基酸编码，并且X是20种普通氨基酸中的任何一种，并且所述氨基酸从以其天然存在形式的实质性同源的肽酶的N末端开始编号：
氨基酸105和150之间的ERDGRWYGRGXADCKG，
氨基酸150和180之间的EGSEEXG，
氨基酸205和255之间的HSGXXGGXAPDA，
氨基酸385和425之间的GGSIPL。
对于编号，使用实质性同源的肽酶的天然存在序列，或在编号前，如对于技术人员显而易见的，在序列的编号中校正或不考虑任何加入的标记、融合序列或相似，以便使其与以其天然存在形式的序列一致，即不包含将影响编号的此种或相似的改变。
保守序列块也在下图中显示。
Figure GPA00001091833400091
图2：显示保守序列块的SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的序列比对
鉴定的肽酶SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4从棒状杆菌属物种Ax20(SEQ ID NO：2)和杰氏棒状杆菌(SEQ ID NO：4)中分离，更特别地从棒状杆菌属物种Ax20，DSM 14267和杰氏棒状杆菌K411(Tauch等人2005，J Bacteriol.187(13)：4671-82)中分离，所述DSM 14267与纹带棒状杆菌(Corynebacterium striatum)或Corynebacteriumglaucum最紧密相关，已于2001年4月26日提交给InternationalDepository Authority DSMZ-German Collection of Microorganismsand Cell Cultures，D-38124 Braunschweig(登记号DSM 14267)。
Ax20(DSM 14267)从人腋窝中分离，并且根据生物化学测试(APICoryne测试试剂盒，BioMerieux，France)与纹带棒状杆菌最紧密相关，基于全长16S rRNA基因的序列分析，它与源自物种Corynebacterium glaucum的类型菌株最紧密相关。
杰氏棒状杆菌已知用于机会性感染，特别是在免疫妥协患者中。K411从人腋窝中分离。它是人皮肤菌群的需要脂质的和多药抗性的细菌物种，其已识别为医院病原体。
如本文所使用的，术语肽酶可以指Ax20肽酶(SEQ ID NO：2)、K411肽酶(SEQ ID NO：4)、或如本文所描述的与其实质性同源的肽酶。
在它们需要Zn离子的存在作为辅因子的范围内，肽酶分类为金属肽酶。它们与先前鉴定的释放不饱和或羟化酸恶臭物并且也是锌依赖性的金属肽酶(AMRE)功能上相关。编码肽酶的核苷酸序列已得到分离且测序(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3)。可以将每种肽酶基因序列引入合适的表达载体中，并且通过在所需微生物或细胞中的异源表达用于产生肽酶。
序列SEQ ID NO：1和2(源自Ax20)没有被在先描述，且SEQ IDNO：4的经分离的肽酶没有被在先描述。
在体内，肽酶存在于细胞内，并且可以通过细胞包膜的机械破碎从细胞中释放。因此，肽酶可以从细胞提取物中分离，特别是由衍生自生物体的细胞获得的细胞提取物，所述生物体选自野生型棒状杆菌菌株。
棒状杆菌包括例如但不限于，棒状杆菌属物种、纹带棒状杆菌、Corynebacterium glaucum、杰氏棒状杆菌、棒状杆菌属物种Ax 20、杰氏棒状杆菌K411、干燥棒状杆菌(Corynebacterium xerosis)、Corynebacterium appendicis、Corynebacterium coyleae、Corynebacterium mucifaciens、Corynebacterium riegelii和Corynebacterium tuberculostearicum。
野生型棒状杆菌菌株的良好来源是人腋窝，如本领域众所周知的，从其中可以培养且分离细菌菌株。
所有上述棒状杆菌都从人腋窝中分离或存在于人腋窝中，表达恶臭形成酶并且能够形成恶臭。
肽酶可以以完整细胞形式、或以分离形式例如作为粗提取物、或以纯化形式使用。例如，粗提取物可以通过细胞的机械破碎形成。任选地，肽酶可以是纯化的。备选地，肽酶可以如本文所描述的重组形成。
实质性同源的肽酶蛋白质包括此种蛋白质，其中底物结合和/或催化部分由源自不同物种的等位基因变体的相关部分替换，例如另一种人腋窝衍生的细菌，包括但不限于棒状杆菌属的细菌。
此外，实质性同源的肽酶核苷酸或多肽序列可以通过保守突变和/或点突变形成，并且包括如下文详述的任何保守修饰变体。
就核苷酸序列而言，保守修饰的变体意指编码一致或实质上一致的氨基酸序列的核苷酸(保守置换氨基酸，即赖氨酸转变成精氨酸，并且进一步的实例如在下文中所解释的)。
由于遗传密码的简并性，在序列中不同但功能上一致的大量核苷酸编码任何给定多肽/蛋白质。此种核苷酸变化是“沉默变化”，这是保守修饰变化的一个种类。编码多肽的每个核苷酸序列也描述了核苷酸的每个可能沉默变化。因此，可以修饰核苷酸中的每个密码子(除通常是关于甲硫氨酸的唯一密码子的AUG，和通常是关于色氨酸的唯一密码子的TGG外)，以产生功能上一致的核苷酸序列，其将产生一致多肽。因此，编码多肽的核苷酸的每个沉默变化隐含在每个给定核苷酸序列中。
就氨基酸序列而言，氨基酸置换可以使用重组基因技术的已知方案引入，包括PCR、基因克隆、cDNA的定点诱变、宿主细胞转染、和体外转录，其可以用于将此种改变引入肽酶序列。变体随后可以就肽酶活性进行筛选。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域众所周知的。例如，选择保守置换的一个示例性指导包括(原残基后为示例性置换)：ala/gly或ser；arg/lys；asn/gln或his；asp/glu；cys/ser；gln/asn；gly/asp；gly/ala或pro；his/asn或gln；ile/leu或val；leu/ile或val；lys/arg或gin或glu；met/leu或tyr或ile；phe/met或leu或tyr；ser/thr；thr/ser；trp/tyr；tyr/trp或phe；val/ile或leu。
备选示例性指导使用下述6个组，各自包含是关于彼此的保守置换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
另一个备选指导允许所有荷电氨基酸作为关于彼此的保守置换，无论它们是正的还是负的。
此外，改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小百分比(例如高达26％、或高达20％、或高达10％)氨基酸的个别置换、缺失或添加也视为保守修饰变化。
实质性同源的核苷酸或多肽序列具有下文指出的序列同一性程度，同时保留如本文限定的多肽对底物的催化活性。
序列同一性％：
实质性同源的核苷酸序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性％。
实质性同源的多肽序列具有至少40％、至少42％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性％。
值得注意的是，当比较肽酶Ax20(SEQ ID NO：1和NO：2)和肽酶K411(SEQ ID NO：3和NO：4)时，两者都具有对相同生理学底物的相同催化活性，基于其氨基酸序列，它们的同一性是42％，并且基于其核苷酸序列，它们的同一性是55％。
序列同一性％的计算如下测定。
BLAST(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment SearchTool))是由在http://www.ncbi.nlm.nih.gov处可获得的程序blastn采用的启发搜索算法。
为了测定核苷酸查询序列针对另一种核苷酸序列的同一性％，使用Blastn，使用BLAST版本2.2.1.3的缺省参数，包括EXPECT(用于报告针对数据库序列的匹配的统计显著性阈值)10、和DUST过滤。
为了测定多肽查询序列针对另一种多肽序列的同一性％，使用Blastp，使用BLAST版本2.2.1.3的缺省参数，包括EXPECT 10、和DUST过滤。
实质性同源的核苷酸序列包括但不限于，在下文详述的严格杂交条件下，与本文描述的一种或多种肽酶核苷酸序列或与其互补体选择性杂交的序列。
严格条件是42℃的温度下在由50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS组成的溶液中，和65℃下洗涤于由0.2×SSC和0.1％SDS(1×SSC＝0.15M NaCl、0.015 M Na3柠檬酸盐pH 7.0)组成的溶液中。
背景杂交可能由于例如待筛选的基因组DNA文库中存在的其他核苷酸序列而发生。
与用靶DNA观察到的特异性相互作用相比较，强度小2倍或任选地强度小10倍的信号视为背景。相互作用的强度可以例如通过放射性标记探针如用32P进行测量。
如本文所使用的，术语“分离的”意指取自某物源于其的环境并且转移至不同环境，包括完整细胞的环境并且将其转移至细胞裂解物。
“纯化形式”意指就其他蛋白质和/或核酸污染物(w/w)而言，超过80％，例如但不限于超过90％、超过95％、超过98％、超过99％或更多。
肽酶底物
肽酶底物(例如但不限于前体I)一般可以描述为二肽衍生物。底物的实例包括但不限于，简单二肽例如ala-ala和ala-gly。与肽酶具有最高亲和力的底物是cys-gly和cys-ala衍生物，特别是L-cys-L-gly和L-cys-L-ala衍生物，其中cys-gly或cys-ala残基的S原子如本文所描述的是烷基化的。
cys-gly衍生物可以是天然存在的例如但不限于前体I，或合成类似物包括但不限于S-苄基-Cys-Gly。
给定二肽衍生物是否是肽酶底物可以通过下述容易地测定：使其与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4肽酶温育，并且测定所述底物是否通过如本文所描述的肽酶进行酶促反应。
底物包括但不限于与酶具有高亲和力的底物，其可以具有下文显示的式FI
Figure GPA00001091833400141
并且其中X选自S和O，并且其中R1是选自H和甲基的残基，并且其中R2是选自直链或分支C1至C10烷基、直链或分支C1至C10烷醇、苯基和苄基的残基。
有用底物的具体组是式FI的底物，其中X是S，R1是甲基，并且R2是选自直链或分支C1至C10烷基、直链或分支C1至C10烷醇、苯基和苄基的残基。
就R2残基而言，“C1至C10烷基”包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基和癸基；并且“C1至C10烷醇”包括但不限于，甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇，以及任选任何分支形式的烷基或烷醇。
生理学相关底物是在上文中作为“前体I”指出的那些，并且具有式FII
Figure GPA00001091833400151
其中R1是选自由甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基组成的烷基残基，
并且其中R2和R 3独立地选自H和甲基。
肽酶底物的具体实例包括但不限于S-苄基-Cys-Gly、O-苄基-Ser-Gly、(1-(2-羟乙基)-1-甲基丁基)-L-半胱氨酰基-甘氨酸、S-苄基-Cys-Ala、O-苄基-Ser-Ala、Pro-Gly、Ala-Gly、Ala-Ala、Pro-Ala。它们的化学结构显示于下表中。
Figure GPA00001091833400152
Figure GPA00001091833400161
肽酶反应产物：
用肽酶的酶促反应的产物是对于简单二肽底物的2种游离氨基酸，或对于甘氨酸衍生物，游离甘氨酸和S-取代的cys或O-取代的ser衍生物，或对于ala衍生物，游离丙氨酸和S-取代的cys或O-取代的ser衍生物。
最终恶臭物产物仅在所得到的肽酶的酶促反应产物(例如前体II)暴露于β-裂合酶时形成，其通过所述β-裂合酶切割以释放硫烷基醇。
提供的新型构建体和产物(DNA、载体、重组细菌、蛋白质/肽酶)在并不限于就肽酶反应的抑制剂筛选时是有用的。
调节剂和抑制剂的鉴定：
其为抑制剂的调节剂有利地加入产品(特别是个人护理产品包括但不限于除臭剂)中，以阻止身体恶臭形成。类似地，在下文中描述的筛选方法可以用于鉴定其他调节剂例如增强剂，其将在此种产品中避免。
为了鉴定调节剂，使肽酶及其底物暴露于合适浓度的至少一种测试试剂(潜在调节剂)，所述合适浓度例如但不限于1nm至1mM、或10nm至10microM。
随后通过本领域众所周知的方法例如但不限于，通过如本文所描述的方法，监控调节剂对酶促切割/反应速率的作用。
通过离析物切割速率或产物形成速率(后者包括次级产物)测定酶促切割/反应速率的改变。
例如，通过监控底物消失的速率、或底物的切割产物出现的速率(例如，游离氨基酸反应产物包括但不限于gly或ala出现的速率)，测定切割/反应速率。
在潜在调节剂的高流通量筛选的一个实施方案中，通过用胺-基团衍生剂衍生游离Nα基团来测量游离L-gly或L-ala的释放，其在与胺基团反应后形成生色团或荧光分子。在这点上有用的可以是荧光胺(Fluka，Buchs，Switzerland)的使用，以在与L-gly或L-ala反应后形成荧光分子。最后，L-gly-底物的切割可以与对照反应相比较，并且从而可以定量测试化合物影响特别是抑制反应的潜力。
如果将作用于肽酶反应产物的β-裂合酶或另一种酶同样加入反应，那么备选地或另外地，可以监控恶臭物(硫烷基醇)或其他释放的硫分子出现的速率。监控速率中的改变指示测试试剂和潜在调节剂对酶的作用。当与在无抑制剂测试试剂的情况下的反应或预定标准速率相比较时，通过切割产物形成的较低速率或游离氨基酸释放的较低速率或硫分子形成的较低速率来鉴定抑制剂。
切割/反应速率可以通过例如但不限于下述方法进行监控：通过高效液相色谱法(HPLC)或薄层色谱法(TLC)或毛细管电泳分析底物或形成的游离氨基酸或其他切割产物；在使游离氨基酸与荧光探针(例如但不限于荧光胺)反应后的荧光分光光度法；在使游离硫分子与荧光探针(例如但不限于单溴二胺(monobromobimane))反应后的荧光分光光度法；释放硫分子的气相色谱法；或通过生物化学测试检测反应产物。
有用的肽酶包括但不限于，SEQ ID NO：2的肽酶和SEQ ID NO：4的肽酶。SEQ ID NO：4的肽酶具有比SEQ ID NO：2的肽酶更低的活性，但作为筛选靶或验证筛选命中和/或在不同细菌物种中筛选广泛范围活性的抑制剂仍是非常有用的。这些筛选可以顺次或并行执行，使用这两种酶在一个反应孔中。
与采用如本文所描述的肽酶的筛选方法并行或顺次地，还可以使用另外的恶臭形成酶，例如但不限于，β-裂合酶和AMRE中的一种或多种。为此，β-裂合酶和/或AMRE可以与肽酶及其底物和测试试剂并行或顺次进行温育，并且通过硫烷基醇(由肽酶和β-裂合酶释放)和/或羧酸或谷氨酰胺(由AMRE释放)的形成中的改变，测定测试试剂对酶的切割/反应速率的作用。备选地，可以测定反应离析物的反应速率中的改变。
肽酶SEQ ID NO：2、肽酶SEQ ID NO：4和实质性同源物中的一种或多种的经鉴定的抑制剂是希望的除臭剂成分，因为它们抑制在从没有气味的汗液中释放硫化学物中的限速步骤。特别有利的是抑制超过一种棒状杆菌肽酶的抑制剂，例如但不限于肽酶SEQ ID NO：2和肽酶SEQ ID NO：4二者，并且因此将提供针对许多不同棒状杆菌属物种的广谱活性。
本文在下文实施例中的结果显示β-裂合酶仅切割cys-缀合物，而不切割FIII的前体I，指出β-裂合酶单独无法负责腋窝分泌中数量上最丰富的底物的切割。相比之下，源自从人测试受试者的腋窝中分离的棒状杆菌属物种Ax 20的含肽酶的提取物的确从FIII的前体I(在实施例中：cys-gly缀合物)中释放硫烷基醇恶臭物，并且这种反应通过金属肽酶抑制剂邻二氮杂菲终止。这是令人惊讶的，因为WO2006079934假定β-裂合酶切割FIII的前体I。它推断细胞提取物包含除β-裂合酶外涉及FIII的前体I切割的另一种酶。但因为如本文实施例中显示的，不存在能从FIII的前体I中释放恶臭物硫挥发物的Ax20细胞提取物的单一级份，并且再次如本文实施例中显示的，因为单一级份在β-裂合酶的存在下能从FIII的前体I中释放恶臭物硫挥发物，所以推断2种酶顺次从FIII的前体I中释放恶臭物，即肽酶释放gly，并且从而形成β-裂合酶的底物，所述β-裂合酶再按序释放硫分子。
在测定法中使用的细胞：
合适的细菌细胞包括天然表达肽酶的所有棒状杆菌，例如但不限于，棒状杆菌属物种、棒状杆菌属物种Ax 20、纹带棒状杆菌、Corynebacterium glaucum、杰氏棒状杆菌、杰氏棒状杆菌K411、干燥棒状杆菌、Corynebacterium appendicis、Corynebacteriumcoyleae、Corynebacterium mucifaciens、Corynebacterium riegelii和Corynebacterium tuberculostearicum。
备选地，肽酶可以在宿主菌株中异源表达，所述宿主菌株例如但不限于，细菌菌株(包括但不限于大肠杆菌(E.coli)菌株)、酵母菌株、或真核细胞系(包括但不限于，昆虫细胞、哺乳动物细胞、两栖动物细胞和蠕虫细胞)。这些宿主菌株用合适载体进行转化，所述合适载体携带编码肽酶的核苷酸序列和关于宿主的相关控制元件，如本领域众所周知的。
用于表达肽酶的载体构建体可以以本身已知的方式来产生，使用聚合酶链反应(PCR)以扩增源自棒状杆菌的染色体DNA的编码区，并且在验证序列后，将编码序列亚克隆到合适载体内。合适载体是商购可得的，例如出自Invitrogen(Groningen，The Netherlands)的载体。有用的载体是载体pET-3a(Studier和Moffatt，1986)。将所得到的质粒转化到合适的大肠杆菌宿主菌株内。载体-宿主菌株组合的适合性依赖于所选择的宿主菌株，对于其载体与之相容或就其进行最佳化(例如将载体pET-3a转化到宿主菌株BL21(DE3)内)。
备选地，各种表达载体/宿主系统可以用于包含且表达编码肽酶的序列。这些包括例如不同微生物，包括用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)或用细菌表达载体(例如pBR322质粒)感染的昆虫细胞系统。
酵母表达系统可以用于产生肽酶。包含组成型或诱导型启动子例如α因子、醇氧化酶和PGH启动子的许多载体，可以在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)中使用。此外，此种载体指导表达蛋白质的分泌或细胞内保留，并且使得外源序列能够整合到宿主基因组内用于稳定繁殖。
对于异源蛋白质在昆虫细胞系例如鳞翅目昆虫杆状病毒的衍生物中的表达，可以使用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornica multicapsid nucleo-virus，AcMNPV)。在该系统中，外源基因表达由非常强的晚期病毒启动子多角体蛋白或p10启动子指导，并且最佳化重组蛋白质的表达和回收的广泛多样载体是可用的。这些载体使得能够以高水平表达膜结合的和分泌的蛋白质。许多载体是商购可得的，例如，出自Invitrogen的InsectSelectTMSystem。
使用纯化肽酶的测定法：
对于使用基于细胞的测定法备选地，使用本领域众所周知的方法从在上文中描述的肽酶表达细胞中纯化肽酶，并且随后执行酶促测定法通常更简单，所述酶促测定法使纯化肽酶、其底物和测试试剂体外接触，并且如本文所描述的测定肽酶反应速率中的改变。任选地，结果可以如本文所描述的使用可源于人腋窝的棒状杆菌在体内加以验证。
肽酶转录测定法：
对于基于细胞的测定法或酶促测定法备选地，可以执行鉴定作用于基因转录水平的调节剂的测定法。将测试试剂加入肽酶表达野生型棒状杆菌中。在有限时间(例如，30分钟至8小时)后，通过洗涤细菌细胞或通过经由离心收获细胞来去除测试试剂。细菌细胞随后就肽酶量进行分析，并且使这个值与未暴露于测试试剂的对照细胞相比较。抑制剂减少由细菌形成的肽酶量，并且因此降低其形成恶臭的潜力。细菌细胞的肽酶量可以这样测定：通过活性测定法使用如本文所描述的方法和底物，或通过产生针对肽酶包括但不限于SEQ ID 2或SEQ ID4的特异性抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)进行测定，并且随后使用合适的免疫学检测方法，例如但不限于，免疫斑点印迹、蛋白质印迹、或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，以特异性检测细菌细胞中的肽酶。
关于肽酶的表达系统：
为了表达编码所需蛋白质的cDNAs，一般将合适cDNA亚克隆到表达载体内，所述表达载体包含指导转录的强启动子、转录/翻译终止子、和核糖体结合位点用于翻译起始。合适的细菌启动子是本领域众所周知的，例如大肠杆菌、芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)和沙门氏菌属(Salmonella)，并且用于此种表达系统的试剂盒是商购可得的。相似地，关于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核生物表达系统是商购可得的。真核生物表达载体可以是例如腺病毒载体、腺伴随病毒载体或逆转录病毒载体。
表达盒还应包含在结构基因下游的转录终止区以提供有效终止。终止区可以得自与启动子序列相同的基因或可以得自不同基因。
对于蛋白质的表达，可以使用本领域众所周知的用于在真核或原核细胞中表达的常规载体。载体的实例包括细菌表达载体，例如质粒包括基于pBR322的质粒、基于pBAD的质粒、pSKF和pET23D、以及融合表达系统例如GST和LacZ。
包含源自真核生物病毒的调节元件的表达载体一般在真核生物表达载体中使用，例如SV40载体、巨细胞病毒载体、乳头状瘤病毒载体、和衍生自EB病毒的载体。其他示例性真核生物载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE、pcDNA3.1、pIRES和任何其他载体，允许在SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白质启动子、或显示对于在真核细胞中的表达有效的启动子指导下表达蛋白质。
某些表达系统具有提供基因扩增的标记，例如胸苷激酶、潮霉素B磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶等。
一般在表达载体中包括的元件还可以包括在大肠杆菌中起作用的复制子、允许选择具有重组质粒的细菌的编码药物抗性的基因、和允许插入真核生物序列的在质粒非必需区中的独特限制位点。所选择的具体药物抗性基因并不是关键的，本领域已知的许多药物抗性基因中的任何都是合适的。原核生物序列任选如此选择，使得需要时，它们不干扰DNA在真核生物细胞中的复制。
在细菌系统中，肽酶cDNA片段可以单独或作为融合蛋白表达，其中使目的肽酶蛋白质与大肠杆菌周质麦芽糖结合蛋白质(MBP)融合，其中MBP包括其信号肽与肽酶的氨基末端连接。将野生型肽酶cDNA或MBP：肽酶融合cDNA亚克隆到合适质粒例如pBR322内，其中在大肠杆菌中，肽酶表达由lac野生型启动子驱动。
载体-宿主菌株组合的具体实例是在菌株大肠杆菌DH5αPRO(Clontech，Palo Alto，CA，USA)中的载体pPROTet.E133或在大肠杆菌菌株TOP 10(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)中的载体pBAD-myc-his-A。
表达载体和宿主菌株的其它实例在T.Maniatis等人(MolecularCloning，cold spring Harbor Laboratory，1982)中描述。
在体外转录和翻译是表达肽酶的另一种备选方法。
肽酶的超表达：
肽酶可以通过将其置于强组成型启动子例如CMV早期启动子的控制下进行超表达。备选地，超表达可以在诱导型启动子的控制下达到，例如但不限于，在载体pBAD-myc-his-A中的阿拉伯糖启动子或在下文中描述的T-rex系统中。
肽酶表达载体构建体转染到细胞内：
标准转染方法可以用于产生表达大量蛋白质的细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系。
可以使用用于将核苷酸序列引入宿主细胞内的任何已知方法。仅需要所使用的具体基因工程操作能够将相关基因成功引入能够表达目的蛋白质的宿主细胞内。这些方法可以涉及将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其他外源遗传材料引入宿主细胞内，并且包括磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、脂质体、显微注射、血浆载体、病毒载体等的使用。
例如，但不限于，可以使用T-RexTM表达系统(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)。所述T-RexTM系统是四环素调节的哺乳动物表达系统，其使用源自大肠杆菌Tn10-编码的四环素(Tet)抗性操纵子的调节元件。在T-RexTM系统中的四环素调节基于四环素与Tet阻遏子的结合和控制目的基因表达的启动子的去阻遏。
转染后，转染细胞可以使用本领域众所周知的标准培养条件进行培养。对于技术人员显而易见的是，不同细胞需要不同培养条件包括合适温度和细胞培养基。
肽酶蛋白质回收：
需要时，蛋白质可以使用标准技术从细胞中回收。例如细胞可以机械或通过渗透压休克爆裂开。所得到的粗酶可以就此使用，或可以例如通过实施沉淀和色谱法步骤与细胞碎片、细胞蛋白质、细胞核酸和细胞污染物中的一种或多种分开，所述色谱法步骤包括但不限于离子交换、疏水相互作用、反相和尺寸排阻色谱法步骤。在每个步骤后，经洗脱的蛋白质可以通过包括但不限于过滤和超滤的方法得到进一步纯化和/或浓缩。备选地，重组蛋白质可以从重组细胞已在其中进行培养的培养基中回收(条件是肽酶已连同提供输出到培养基内的序列一起表达)。
可以通过测定法鉴定的调节剂：
肽酶活性的调节剂且特别是抑制剂可以如下文所述进行鉴定。
以下为在本文描述的方法中待鉴定的试剂的定义。
调节剂是影响下述中的一种或多种的增加或减少的试剂：底物与肽酶的结合、底物(例如但不限于，恶臭物前体)与恶臭物或第二种恶臭物前体的反应。调节剂其自身可以在底物结合位点处或以其他位点与肽酶结合，并且可以以不同速率或完全不切割或反应，或可以与底物结合并且从而影响其反应/切割速率。
调节剂包括各种类型的化合物，包括小分子、肽、蛋白质、核苷酸、抗体或其片段。这些可以衍生自各种来源，包括合成或天然、天然材料的提取物，例如源自动物、哺乳动物、昆虫、植物、细菌或真菌细胞材料或培养细胞、或此种细胞的条件培养基。
底物是与肽酶结合且由其切割或反应的试剂。
抑制剂是与在无抑制剂的情况下的底物结合相比较，减少底物与肽酶的结合，和/或减少底物的反应/切割速率，和/或减少总体肽酶活性的调节剂。
增强剂与在无增强剂的情况下的底物结合相比较，增加底物与肽酶的结合，和/或增加底物的反应/切割速率，和/或增加总体肽酶活性。
肽酶结合底物和反应/切割底物以形成第二种前体且最终形成恶臭物的活性或活性的改变可以通过在下文中描述的方法进行测定。
底物鉴定：
为了鉴定底物，使测试试剂与肽酶一起温育，并且通过如本文所描述的分析方法跟踪反应产物的形成或潜在底物的消失。被肽酶反应的任何化合物都定义为底物。为了评估底物与其他已知底物相比较的亲和力，使连续稀释的底物与固定浓度的肽酶一起温育，并且测定在给定时间后在每个底物浓度下的切割速率。基于所得到的曲线，测定生物化学参数vmax(通过一个肽酶分子每秒切割的分子底物中的最大反应速率)和Km(给出其中酶以50％最大反应速率活性的底物浓度的米氏常数)。低Km指示肽酶对于其底物的高亲和力，并且因此具有低Km和高vmax的底物是对于酶特别良好的底物。然而，对于筛选测定法，也可以使用具有高Km和低vmax的底物。
鉴定调节剂的试剂盒：
试剂盒，例如筛选试剂盒或高流通量筛选试剂盒，包括分离肽酶(源自野生型或重组细胞)或表达肽酶的重组细胞，或与其实质性同源的序列；并且包括肽酶的底物，例如但不限于S-苄基-Cys-Gly、O-苄基-Ser-Gly、(1-(2-羟乙基)-1-甲基丁基)-L-半胱氨酰基-甘氨酸、S-苄基-Cys-Ala、O-苄基-Ser-Ala、Pro-Gly、Ala-Gly、Ala-Ala、Pro-Ala。
底物以合适浓度提供，例如1microM至10mM、或10microM至1mM、例如50microM至1mM、或50microM至500microM。
任选试剂盒组分可以包括用于培养提供的重组细胞的合适培养基和培养装置，以使细胞在例如微量滴定板中生长，这些任选组分对于技术人员将是容易获得的。
试剂盒可以如下使用：
(i)使表达肽酶的重组细胞生长，或备选地，提供分离肽酶，
(ii)在以合适浓度的肽酶底物的存在下加入至少一种测试试剂，和
(iii)通过对比存在和不存测试试剂下的应答，测定底物/其一种或多种产物被肽酶切割/反应的速率的改变，或底物与肽酶结合中的改变，并且从而鉴定测试试剂为调节剂。
特别地，对于使用经分离的肽酶的试剂盒：
(i)将任选地以约1纳摩尔至约5毫摩尔浓度的测试试剂加入包含肽酶的测定法缓冲液中，
(ii)在允许测试试剂与肽酶结合的限定预温育时间段后(任选地，0至15分钟)，加入以合适浓度的选择底物，
(iii)通过对比存在和不存测试试剂下的应答，测定底物/其一种或多种产物被肽酶切割/反应的速率的改变，或底物与肽酶结合中的改变，并且从而鉴定测试试剂为调节剂。
可以执行相似测定法，其中肽酶不是以分离的形式，而是以细胞提取物形式，或以完整原核或真核细胞形式提供：
(i)使表达肽酶蛋白质的重组细胞在培养中生长，
(ii)在以合适浓度的底物的存在下，将任选地以约1纳摩尔至5毫摩尔的测试试剂加入培养基中，
(iii)通过对比存在和不存测试试剂下的应答，测定底物/其一种或多种产物被肽酶切割/反应的速率的改变，或底物与肽酶结合中的改变，并且从而鉴定测试试剂为调节剂。
例如但不限于，步骤(iii)可以根据在上文中描述的任何一种方法进行。这可能需要特异性选择或相适应的重组细胞，这也在上文中描述。
经鉴定的调节剂的证实：
如下文详述的，通过使用测试人实验组对嗅样品的简单感官实验，可以容易地证实通过在上文中描述的方法鉴定的调节剂。样品已暴露于肽酶和β-裂合酶，并且包含作为底物的下式FI的化合物和任何形成的酶促反应产物。
Figure GPA00001091833400271
其中X选自S，并且其中R1是选自H和甲基的残基，并且其中R2是选自C1至C10烷基、C1至C10烷醇、苯基和苄基的残基。
与不含调节剂的阴性对照相比较，样品由实验组嗅，以证实调节剂调节例如抑制恶臭形成。
大规模筛选测定法：
在上文中描述的测定法充分适合于在文库中筛选调节肽酶活性的试剂。
测定法可以设计为通过使测定法步骤自动化并且给测定法提供源自任何方便来源的化合物来筛选大型化学文库，其一般并行运行(例如，在机器人测定法中在微量滴定板上以微量滴定形式)。
测定法可以在高流通量筛选方法中运行，其涉及提供包含大量潜在调节剂的组合化学或肽文库。此种文库随后在上文中描述的一种或多种测定法中筛选，以鉴定显示在上文中描述的活性的这些文库试剂(特别是化学种类或亚类)。因此鉴定的调节剂可以直接使用，或可以充当引导以通过制备且测试衍生物鉴定其它调节剂。
合成化合物文库从许多公司包括Maybridge Chemical Co.(Trevillet，Cornwall，UK)、Comgenex(Princeton，N.J.)、BrandonAssociates(Merrimack，N.H.)和Microsource(NewMilford，Conn.)商购可得。
结合测定法：
对于通过测量离析物和直接或间接产物(例如但不限于，底物/前体I、前体II、恶臭物)的增加或减少来测量切割/反应速率中的改变的上文所描述的功能方法备选地，底物结合可以通过测量底物与肽酶的结合的结合测定法进行测定，所述结合测定法是本领域众所周知的。调节剂与肽酶多肽的结合可以例如但不限于通过测量光谱学特征(例如荧光、吸收或折射指数)中的改变、流体动力学方法(采用例如形状)、色谱法、测量肽酶多肽的可溶性性质进行测定。
测试试剂文库：
组合化学文库是通过化学合成或生物学合成，通过使许多化学制品“构建块”例如试剂相组合产生的不同化合物的集合。例如，线性组合化学文库例如多肽文库这样形成：通过使一组化学构建块(氨基酸)以每种可能方式相组合给定化合物长度(即，多肽化合物中的氨基酸数目)。通过化学构建块的此种组合混合可以合成数百万种化合物。
罕见的化学文库可从Aldrich(Milwaukee，Wis.)获得。
以细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库是例如从Pan Laboratories(Bothell，Wash.)或MycoSearch(NC)商购可得的，或通过本领域众所周知的方法容易地产生。另外，天然和合成产生的文库和化合物通过常规化学、物理和生物化学方法容易地进行修饰。
其他文库包括蛋白质/表达文库，源自天然来源包括例如生物、植物、动物、细菌的cDNA文库，表达一种或多种多肽的随机或系统突变变体的文库，在用于表达一种细胞或组织的mRNA含量的病毒载体中的基因组文库。
在高流通量测定法中，可以在单天中筛选高达数千种不同调节剂或底物。特别地，微量滴定板的每个孔可以用于运行针对选择的潜在调节剂/底物的分开测定法，或如果待观察浓度或温育时间效应，每5-10个孔可以测试单一调节剂。因此，单块标准微量滴定板可以测试约100种调节剂。如果使用1536孔板，那么单块板可以容易地测试约100至约1500种不同化合物。可以测试数块不同板/天；测定法筛选高达约6,000-20,000不同化合物是可能的。
可以在测定方法中就其肽酶调节效应进行测试的测试试剂类型：
测试试剂可以是任何试剂，包括小化合物、化学聚合物、生物聚合物、肽、蛋白质、糖、碳水化合物、核酸和脂质。试剂可以是合成化合物、化合物混合物、天然产物或天然样品例如植物提取物、培养上清液或组织样品。
个人护理产品：
鉴定的酶抑制剂/恶臭消除剂可以加入各种产品中，以阻止身体恶臭。例如个人护理产品包括但不限于，除臭剂、止汗剂、洗剂、乳霜、软膏、粉剂、润肤露(body lotion)、油膏(unguent)、肥皂、洗发水、精制香精、花露水(eau de Cologne)、淡香水(eau de toilet)。个人护理产品可以是有香味的或可以是无香味的。此种产品通常包含本领域众所周知的许多赋形剂。个人护理产品的恶臭消除剂效应可以通过删去鉴定为肽酶增强剂的任何成分得到进一步改善。
鉴定的调节剂/抑制剂可以加入水溶液、乳液、醇溶液、硅溶液、油或蜡中。
核酸和蛋白质序列：
在上文中描述的构建体和方法中采用的序列可以在下文中列出的序列表中找到：
SEQ ID NO：1：源自棒状杆菌属物种Ax20的肽酶的核苷酸序列
SEQ ID NO：2：源自棒状杆菌属物种Ax20的肽酶的氨基酸序列
SEQ ID NO：3：源自杰氏棒状杆菌K411的肽酶的核苷酸序列
SEQ ID NO：4：源自杰氏棒状杆菌K411的肽酶的氨基酸序列
SEQ ID NO：5：源自棒状杆菌属物种Ax20的β-裂合酶的核苷酸序列
SEQ ID NO：6：源自棒状杆菌属物种Ax20的β-裂合酶的氨基酸序列
现在随后为用于举例说明上述主题的一系列实施例。下述实施例仅是举例说明性的，并且不应解释为以任何方式限制本文描述的包括多肽、核酸/核苷酸、表达载体、宿主细胞、方法、试剂盒和个人护理产品的主题。
实施例
所有实施例使用衍生自棒状杆菌特别是棒状杆菌属物种Ax20(“Ax20”)，DSM 14267和杰氏棒状杆菌K411(“K411”)(Tauch等2005，J Bacteriol.187(13)：4671-82)的DNA序列，所述DSM 14267已于2001年4月26日提交给International DepositoryAuthority DSMZ-German Collection of Microorganisms and CellCultures，D-38124 Braunschweig(登记号DSM 14267)。
在实施例中，cys-gly-缀合物指下述二肽化合物：
Figure GPA00001091833400301
在实施例中的cys-缀合物指下述化合物：
实施例中的“β-裂合酶”指在Natsch等人2004，Chemistry &Biodiversity，1，1058中描述的β-裂合酶。β-裂合酶基因(metC基因，1134bp)的完全开放读码框可在登记号AY646680(gi|51556860|gb|AY646680.1|[51556860])下从Genebank获得。它还包括在序列表中(SEQ ID NO：5，核苷酸序列，和SEQ ID NO：6，蛋白质序列)。
“AMRE”或“AMRE酶”是“腋窝恶臭释放酶”的缩写，并且指定由Natsch在EP1258531中描述的恶臭的酸释放酶Na-酰基-谷氨酰胺-氨基酰化酶。AMRE氨基酸序列是EP 1258531中的SEQ ID NO：1，AMRE基因的开放读码框是EP1258531中的SEQ ID NO：5。它的异源表达在EP1258531的实施例6中描述。
实施例1
肽酶(SEQ ID NO：2)的分离
细胞提取物如下形成：通过离心收获Ax20的过夜培养物，并且重悬浮于小体积的缓冲液A(50mM NaCl；50mM NaH2PO4/K2HPO4；pH 7)中，用10倍体积的玻璃珠(425-600μm，Sigma，St-Louis，USA)修正，并且通过使它们以最大速度涡旋30分钟进行机械破碎。使裂解物离心，并且保存上清液。所得到的棒状杆菌属物种Ax20细胞提取物随后经过下述柱进行顺次分级：1.苯基-琼脂糖(疏水作用色谱法)，2.Mono-Q(强阴离子交换)，3.Mono-P(弱阴离子交换)和4.Superdex200(凝胶过滤)。
使每个级份的样品与β-裂合酶和与cys-gly-缀合物同时进行温育，并且通过对于游离SH基团特异的荧光测试来测定3-硫烷基-3-甲基-己醇的释放：为此通过加入0.5体积包含0.5mM单溴二胺(monobromobimane)的NaCO3缓冲液(0.1M，pH8.8)终止酶反应，从而使游离巯基衍生。随后在Flex-station(Molecular devices，Sunnyvale，CA，USA)上测量荧光，用385nm的激发波长和480nm的发射波长。
在每个纯化步骤中发现单重峰活性(3-硫烷基-3-甲基-己醇释放的)，指明仅一种酶涉及释放反应。
在这4个纯化步骤后，在SDS-Page-凝胶上分离该制剂。切割对于活性级份独特的凝胶条带并且从而获得所述肽酶。
实施例2
基因(SEQ ID NO：1)的克隆和编码肽酶的核酸序列(SEQ ID NO：2) 的分离
对实施例1中获得的肽酶实施胰蛋白酶消化和肽序列分析。基于这些分离的肽序列，设计引物以通过聚合酶链反应扩增基因的部分序列，使用棒状杆菌属物种Ax20的基因组DNA作为模板。
随后用棒状杆菌属物种Ax20的染色体文库通过染色体步移分离完整基因序列。
从而，获得如SEQ ID NO：1中所示的肽酶序列的完整开放读码框。
实施例3
Ax20肽酶的异源表达、产生和纯化
通过PCR使用特异性引物从棒状杆菌属物种Ax 20的染色体DNA扩增肽酶(SEQ ID NO：1)的开放读码框(ORF)。使ORF连接成编码6x组氨酸-标记的序列，并且克隆到表达载体(pET-3a，Studier和Moffatt，1986)内。随后将所得到的质粒转化到大肠杆菌菌株(BL21(DE3))内。
备选地，将不含6x组氨酸-标记的ORF克隆到相同载体内。
含或不含6x组氨酸-标记的重组大肠杆菌菌株在NZCYM培养基(酪蛋白水解物10.0g；NaCl 5.0g；酪蛋白氨基酸(Difco)1.0g；酵母提取物5.0g；MgSO4x7 H2O 2.0g；麦芽糖2.0g；蒸馏水1000.0ml)中生长，用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)诱导，并且在4小时后，通过在磷酸盐缓冲液(100mM，pH7)中3次经过弗氏压碎器裂解细胞。通过在10′000g下离心15分钟使细胞裂解物澄清。
为了纯化酶，将澄清的细胞裂解物加载到Ni-NTA亲和柱(Qiagen，Hilden，Germany)上。该柱用包含20mM咪唑的缓冲液进行洗涤，并且最后用具有渐增浓度的100-250mM咪唑的缓冲液洗脱。所得到的洗脱物包含如通过SDS page显示的＞95％纯度的重组酶。
实施例4
K411肽酶(SEQ ID NO：4)的异源表达和产生
如对于SEQ ID NO：2所描述地表达、产生且纯化源自棒状杆菌K411的SEQ ID NO：4肽酶。
实施例5
Ax20和K411肽酶的活性
收获如实施例3和4中所述形成的50ml重组大肠杆菌培养物，重悬浮于终体积3ml的磷酸盐缓冲液中，并且随后用超声处理破裂。通过离心使可溶性提取物澄清。使所得到的提取物的不同稀释物与cys-gly-缀合物(1mM)以及在过量β-裂合酶的存在以及不存在下进行温育。作为阴性对照，使用源自用空载体转化的大肠杆菌的澄清细胞裂解物，和具有cys-gly-缀合物但不含β-裂合酶的细胞裂解物。
该表显示了如用实施例1中描述的荧光测试测定的以mM表示的恶臭物(3-硫烷基-3-甲基-己醇)的释放。
如下表中所示，参见第2至4列，恶臭物(3-硫烷基-3-甲基-己醇)仅通过用包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的质粒转化的重组大肠杆菌菌株(表达SEQ ID NO：2/Ax20或SEQ ID NO：4/K411肽酶)并且仅在β-裂合酶的存在下从cys-gly-缀合物中释放。
K411肽酶以比Ax20肽酶更低的效率切割cys-gly-缀合物(参见第5列)。
Figure GPA00001091833400331
Figure GPA00001091833400341
这显示SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的分离的核苷酸序列编码具有相关酶促活性的肽酶。
如显示的，组氨酸标记对肽酶活性不具有任何显著作用。
实施例6
Ax20肽酶的底物特异性
使如实施例3中所述形成的重组Ax20肽酶(亲和柱纯化的经标记的酶)与不同化合物特别是潜在候选的二肽底物一起温育，以表征底物特异性且鉴定用于筛选测定法的底物(例如，以筛选调节剂包括抑制剂)。
下表列出了测试化合物(大多数二肽由其缩写名称指示，例如ala-gly用于丙氨酸-甘氨酸二肽)并且指出它们是否由肽酶切割。Z指示在肽的N末端处的苄氧-羰基保护基团。
切割通过薄层色谱法进行测定。
量是定性的，其中(+++)指示在1小时的温育过程中1mM溶液通过0.1μg/ml肽酶＞80％的切割；(++)指示在1小时的温育过程中1mM溶液通过1μg/ml肽酶的完全切割，和(+)指示在1小时的温育过程中1mM溶液通过1μg/ml肽酶的部分切割(20-80％)，和(-)指示不存在任何切割。
  化合物/潜在底物   切割
  Cys-gly-缀合物   +++
  H-Cys(Bzl)-Gly-OH(＝S-苄基-Cys-Gly)   +++
  Ala-Gly   ++
  Ala-Ala   ++
  化合物/潜在底物   切割
  Gly-Gly   +
  Pro-Gly   +
  Z-Gly-Gly -
  Z-Ala -
  Z-Gly -
实施例7
鉴定肽酶调节剂/抑制剂的方法
通过添加重组Ax20肽酶(SEQ ID NO：2)切割肽底物Pro-Gly释放独特的游离NH2基团，所述游离NH2基团可以通过荧光胺(FluramTM，Fluka，Buchs，Switzerland)进行衍生。
使测试化合物(例如，潜在的酶抑制剂)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，例如在微量滴定板的个别孔中。
将溶解于磷酸盐缓冲液中的Ax20肽酶加入微量滴定板的个别孔(1μg/ml肽酶)中，并且温育5分钟以允许可能存在的抑制剂的平衡和与肽酶结合。
将溶解于磷酸盐缓冲液中的底物Pro-Gly加入每个孔中的测试化合物/肽酶混合物中，以给出1mM的终浓度。
备选地，可以使用另一种底物化合物。有用的底物包括Ala-Ala、Ala-Gly、Cys-gly-缀合物和S-苄基-Cys-Gly。如果使用这些化合物，那么代替通过荧光测定法，通过测定所形成的游离甘氨酸(通过薄层色谱法(TLC)或通过高效液相色谱法(HPLC))来执行切割的检测。
在37℃下60分钟的温育时间后，通过加入溶解于乙腈中的Fluram至1mM的Fluram终浓度和25％v/v的乙腈终浓度使从Pro-Gly中释放的甘氨酸的游离NH2基团衍生，并且在5分钟温育后，在Flex-station(Molecular devices，Sunnyvale，CA，USA)上测定荧光，用381nm的激发波长和470nm的发射波长。对照并行运行，并且实施相同操作。阳性对照包含无抑制剂的DMSO，阴性对照不包含底物。
抑制％基于与阳性对照(0％抑制/100％活性)的比较进行计算。因此鉴定的活性抑制剂的实例显示于下表中。
  测试化合物   c[microM]   源自Pro-Gly的游离NH2基团的释放抑制[抑制％]
  乙二胺四乙酸   62.5   101.4
  测试化合物   c[microM]   源自Pro-Gly的游离NH2基团的释放抑制[抑制％]
  乙二胺四乙酸   31.25   102.6
  乙二胺四乙酸   15.625   101.0
  邻二氮杂菲   62.5   100.0
  邻二氮杂菲   31.25   95.5
  邻二氮杂菲   15.625   83.9
  吡啶-2，6-二羧酸   62.5   100.9
  吡啶-2，6-二羧酸   31.25   92.4
  吡啶-2，6-二羧酸   15.625   72.4
  乙二胺-N，N′-二乙酸   62.5   93.9
  乙二胺-N，N′-二乙酸   31.25   81.0
  乙二胺-N，N′-二乙酸   15.625   65.7
  2，2′-亚乙基二硫代-二乙酸酯   62.5   -5.3
  2，2′-亚乙基二硫代-二乙酸酯   31.25   -2.6
  2，2′-亚乙基二硫代-二乙酸酯   15.625   0.1
该表中的结果显示化合物Pro-Gly是用于高流通量筛选的有用底物。存在的唯一NH2基团是通过由肽酶切割释放的Gly中的，允许极佳的信噪比。
抑制剂通常通过至少50％抑制的抑制进行鉴定，例如在1mM、100microM、10microM、1microM或更低的浓度下。
实施例7b
使用各种肽酶鉴定肽酶调节剂/抑制剂的方法
实施例7可以如所述的执行，除替换肽酶且使用SEQ ID NO：4(K411肽酶)或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：2(Ax20肽酶)的同系物中的一种或多种外。
实施例7c
鉴定具有广泛抑制谱的肽酶调节剂/抑制剂的方法
实施例7可以如所述的执行，除顺次或并行使用选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：2的同系物中的2种或更多种肽酶外。当并行执行时，酶促反应可以使用相容缓冲液在相同孔中执行。
这具有鉴定作用于肽酶的化合物且鉴定具有针对各种细菌菌株的广泛抑制活性的抑制化合物的优点。
实施例8
鉴定针对肽酶和/或β-裂合酶有活性的肽酶调节剂/抑制剂的方 法
该实施例作为如实施例7中描述的筛选测定法的备选方法执行，伴随下述修饰。
作为底物，使用cys-gly-缀合物或如具有在上文中所述的底物结构的化合物。
这些包括(S-苄基)-cys-gly、(S-苄基)-cys-ala、或任何S-取代的cys-gly或cys-Ala缀合物，例如，S-乙基-、S-丙基-、S-丁基-、S-戊基-、S-己基-、S-苯基-cys-gly或-cys-ala。
备选地，使用经取代的ser-ala或ser-gly衍生物，其在丝氨酸的OH基团上取代。与半胱氨酸一样在丝氨酸上的相同广泛多样的取代基是可能的。
对于下文显示的结果，使用(S-苄基)-cys-gly。
以0.1μg/ml浓度的肽酶(SEQ ID NO：2)与以5μg/ml浓度的β-裂合酶组合使用；使2种酶同时溶解于相同磷酸盐缓冲液中。
同时筛选β-裂合酶和肽酶的抑制剂具有更有效筛选的优点(即同时鉴定肽酶或β-裂合酶或两者的抑制剂)。随后，进一步分析每个筛选“命中”(恶臭物释放的调节/抑制)，以分别测定肽酶活性和/或β-裂合酶活性。
代替通过加入Fluram使缀合物的游离NH2基团衍生，通过加入溶解于NaCO3缓冲液(100mM，pH 8.8)的单溴二胺(Fluka，Buchs，Switzerland)以给出0.5mM至1mM的终浓度，使通过这两种酶的顺次作用从缀合物中释放的游离SH基团衍生。在5至15分钟温育后，在Flex-station(Molecular devices，Sunnyvale，CA，USA)上测量荧光，用385nm的激发波长和480nm的发射波长。
备选地，使用其他巯基衍生剂包括N-(9-吖啶基)马来酰亚胺和在359/440nm处的荧光检测。
因此鉴定的活性肽酶抑制剂显示于下表中。
  测试化合物   c[microM]   在肽酶和β-裂合酶的存在下源自S-苄基-cys-gly的游离SH基团的释放抑制[抑制％]
  乙二胺四乙酸   62.5   99.0
  乙二胺四乙酸   31.25   96.5
  乙二胺四乙酸   15.625   99.3
  邻二氮杂菲   62.5   93.1
  邻二氮杂菲   31.25   79.9
  测试化合物   c[microM]   在肽酶和β-裂合酶的存在下源自S-苄基-cys-gly的游离SH基团的释放抑制[抑制％]
  邻二氮杂菲   15.625   54.2
  吡啶-2，6-二羧酸   62.5   95.9
  吡啶-2，6-二羧酸   31.25   83.4
  吡啶-2，6-二羧酸   15.625   49.6
  乙二胺-N，N′-二乙酸   62.5   90.4
  乙二胺-N，N′-二乙酸   31.25   73.1
  乙二胺-N，N′-二乙酸   15.625   50.2
  2，2′-亚乙基二硫代-二乙酸酯   62.5   -8.7
  2，2′-亚乙基二硫代-二乙酸酯   31.25   -9.1
  2，2′-亚乙基二硫代-二乙酸酯   15.625   -10.1
实施例9
鉴定针对一种或多种肽酶(SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：4)和 AMRE有活性的广谱调节剂/抑制剂的方法
在实施例7或8的另外步骤中，鉴定的肽酶抑制剂就其针对AMRE酶(Natsch在EP1258531中描述的Na-酰基-谷氨酰胺-氨基酰化酶)的调节效应进行测试，从而鉴定涉及恶臭释放的这两种金属肽酶的双重抑制剂。
备选地，步骤可以在酶的存在下同时并行执行。
如EP1258531的实施例6中所述形成AMRE。
结果在下表中列出。
  测试化合物   c[microM]   源自N-月桂酰基-谷氨酰胺的游离NH2基团的释放抑制(由AMRE释放)[抑制％]
  乙二胺四乙酸   62.5   61.6
  乙二胺四乙酸   31.25   59.8
  测试化合物   c[microM]   源自N-月桂酰基-谷氨酰胺的游离NH2基团的释放抑制(由AMRE释放)[抑制％]
  乙二胺四乙酸   15.625   62.4
  邻二氮杂菲   62.5   96.1
  邻二氮杂菲   31.25   81.8
  邻二氮杂菲   15.625   42.4
  吡啶-2，6-二羧酸   62.5   72.2
  吡啶-2，6-二羧酸   31.25   52.0
  吡啶-2，6-二羧酸   15.625   28.8
  乙二胺-N，N′-二乙酸   62.5   42.7
  乙二胺-N，N′-二乙酸   31.25   7.2
  乙二胺-N，N′-二乙酸   15.625   7.4
  2，2′-亚乙基二硫代-二乙酸酯   62.5   19.6
  2，2′-亚乙基二硫代-二乙酸酯   31.25   12.7
  2，2′-亚乙基二硫代-二乙酸酯   15.625   22.4
因此，结果证实可以用如所述的测定法组合鉴定针对超过一种恶臭形成酶活性的活性抑制剂，在这种情况下金属螯合剂，从而允许鉴定广谱调节剂/抑制剂的有效测定法。
实施例10
当用Ax20细胞裂合酶或β-裂合酶切割时，cys-gly-缀合物切割 中的差异
使测试化合物(Cys-缀合物(1mM)或Cys-Gly-缀合物(1mM))与β-裂合酶一起温育。
还使测试化合物(cys-缀合物(1mM)或cys-gly-缀合物(1mM))与天然包含SEQ ID NO：2肽酶的野生型菌株棒状杆菌属物种Ax20提取物一起温育。如实施例1中所述制备野生型菌株棒状杆菌属物种Ax20细胞提取物。当调整至OD 4的光密度时，使所得到的提取物稀释至与原始培养物具有的相同体积。使底物与提取物一起温育24小时。
通过气相色谱法测量切割，以测定以mM表示的3-硫烷基-3-甲基-己醇的释放。结果显示于下表中。
  源自cys-缀合物的3-硫烷基-3-甲基-己醇的释放[mM]   源自cys-gly-缀合物的3-硫烷基-3-甲基-己醇的释放[mM]
  β-裂合酶   0.59   ＜0.03
  棒状杆菌属物种Ax20提取物   0.31   0.21
结果显示仅cys缀合物而不是cys-gly-缀合物由重组β-裂合酶切割，指出β-裂合酶无法切割腋窝分泌中的主要底物(参见上表的第2行)。
然而，从人测试受试者的腋窝中分离的源自棒状杆菌属物种Ax 20的提取物的确从这两种缀合物中释放3-硫烷基-3-甲基-己醇(参见上表的第3行)。
实施例11
分离的棒状杆菌属物种Ax20提取物级份无法释放恶臭物
使用Mono-Q阴离子交换柱使如实施例1中所述得自棒状杆菌属物种Ax20的细胞提取物分级。所得到的级份与cys-gly-缀合物分开温育，并且如实施例1中所述测量3-硫烷基-3-甲基-己醇(恶臭物)的释放。
结果显示不存在能够从cys-gly-缀合物中释放3-硫烷基-3-甲基-己醇的棒状杆菌属物种Ax20提取物的单一级份。这证实在棒状杆菌属物种提取物中不存在可以从cys-gly-缀合物中释放恶臭物的单一酶。
实施例12
当与β-裂合酶相组合时，棒状杆菌属物种提取物级份释放恶臭物
如实施例11中所述形成棒状杆菌属物种Ax20细胞提取物的级份。
使每个级份与β-裂合酶和与cys-gly-缀合物一起温育。如上文在实施例1中所述测量3-硫烷基-3-甲基-己醇(恶臭物)的释放。
结果显示单一级份在β-裂合酶的存在下从cys-gly-缀合物中释放3-硫烷基-3-甲基-己醇。其他级份或β-裂合酶其自身不能释放恶臭物。
连同实施例11的结果，这证实2种酶介导cys-gly-缀合物的切割：首先肽酶切割在gly和cys残基之间的二肽，并且随后β-裂合酶顺次从由肽酶形成的cys-缀合物中释放恶臭物。
实施例3
由棒状杆菌提取物的恶臭释放受肽酶抑制剂抑制
如实施例1中所述形成源自棒状杆菌属物种Ax20和杰氏棒状杆菌K411的提取物。
向提取物批次中加入邻二氮杂菲(0.5mM)——金属肽酶抑制剂或CompleteTM(无EDTA)——蛋白酶抑制剂混合物(Rochebiochemicals，Switzerland；使用如由制造商指示的浓度)，其包含广泛特异性丝氨酸和天冬氨酸-肽酶抑制剂但不含金属肽酶抑制剂，并且温育10分钟。
随后将cys-缀合物或cys-gly-缀合物(1mM)——恶臭物3-硫烷基-3-甲基-己醇的所述两种前体，加入包含不同抑制剂的棒状杆菌属物种Ax20或杰氏棒状杆菌K411提取物中。
如实施例12和13中所述测量恶臭物3-硫烷基-3-甲基-己醇的释放，这指示棒状杆菌细菌裂解物中的酶活性。
结果(与不加入抑制剂的反应相比较，3-硫烷基-3-甲基-己醇释放的抑制％)在下表中指出。
如实施例10中所示，用棒状杆菌属物种Ax20提取物温育从这两种缀合物诱导显著恶臭物释放，并且杰氏棒状杆菌K411提取物也切割这两种底物，尽管以较低速率。
当使用源自棒状杆菌属物种的提取物时，金属肽酶抑制剂邻二氮杂菲的添加不抑制Cys-缀合物切割(0％抑制)，但抑制cys-gly-缀合物切割(100％抑制)。类似地，对于杰氏棒状杆菌提取物，对于cys-缀合物不存在显著抑制，但存在cys-gly-缀合物的高抑制(93％)。
这显示cys-gly-缀合物(而不是cys-缀合物)的切割由对通过金属肽酶抑制剂邻二氮杂菲的抑制敏感的酶介导。
这还指示β-裂合酶反应(Cys-缀合物的切割)不受邻二氮杂菲阻断，而仅cys-gly键的切割得到抑制，并且显示在源自棒状杆菌的提取物中的金属肽酶专一地催化这种反应。
对不同丝氨酸和天冬氨酸-肽酶具有广泛特异性的蛋白酶抑制剂的混合物(CompleteTM)不显著阻断任一缀合物的切割，显示丝氨酸/天冬氨酸-肽酶不涉及恶臭物的释放。
尽管肽酶、核苷酸、表达载体、宿主细胞、方法和试剂盒已在上文结合特定举例说明性实施方案进行描述，但应当理解可以使用其他相似实施方案，或可以对所述实施方案进行修饰和添加用于执行一种或多种相同功能。此外，公开的所有实施方案不一定在备选方案中，因为各种实施方案可以相组合以提供所需特征。可以由本领域普通技术人员进行变化，而不背离公开内容的精神和范围。因此，核苷酸、多肽/肽酶、表达载体、宿主细胞、方法和试剂盒不应限制于任何单个实施方案，而是以依照附加权利要求所述的宽度和范围解释。
序列表
<110>Givaudan SA
Natsch，Andreas
Emter，Roger
 
<120>酶促方法和酶
 
<130>30341/PCT
 
<160>6
 
<170>PatentIn version 3.3
 
<210>1
<211>1368
<212>DNA
<213>棒状杆菌属物种Ax20
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1368)
 
<400>1
atg agc aac gac aag gca gca acc agc acg aat ttc aac ctg acg ccg    48
Met Ser Asn Asp Lys Ala Ala Thr Ser Thr Asn Phe Asn Leu Thr Pro
1               5                   10                  15
aac cgg gag cgc atc ttc cag gag ctc tcg gag cta atc tcc cac tac    96
Asn Arg Glu Arg Ile Phe Gln Glu Leu Ser Glu Leu Ile Ser His Tyr
            20                  25                  30
tcg ccg cac tcg atg ccg gag cac gcc gac acc cac gag gag gcc gcg    144
Ser Pro His Ser Met Pro Glu His Ala Asp Thr His Glu Glu Ala Ala
        35                  40                  45
aag tgg gtg acc gcc aag ctc gag gag ctc ggc ctc gat gtc acc cgc    192
Lys Trp Val Thr Ala Lys Leu Glu Glu Leu Gly Leu Asp Val Thr Arg
    50                  55                  60
cac ccg acg gtg gat gat gcg gac acc atc atc ggc gtg aag gaa cca    240
His Pro Thr Val Asp Asp Ala Asp Thr Ile Ile Gly Val Lys Glu Pro
65                  70                  75                  80
gtg ggc gac gcc ccg acc atc ctc ctc tac tcg cac tac gac gtc gtc    288
Val Gly Asp Ala Pro Thr Ile Leu Leu Tyr Ser His Tyr Asp Val Val
                85                  90                  95
ccc gca cag aac cct gcc gtg tgg acg aac gac ccg ctc gag ctc gat    336
Pro Ala Gln Asn Pro Ala Val Trp Thr Asn Asp Pro Leu Glu Leu Asp
            100                 105                 110
gag cgg gat ggc cgc tgg tac ggc cgc ggg gcc gcg gac tgc aag ggc    384
Glu Arg Asp Gly Arg Trp Tyr Gly Arg Gly Ala Ala Asp Cys Lys Gly
        115                 120                 125
aac gtc atc atg cac ctc gag gcc ctg cgc atg gtc cag gaa aac ggc    432
Asn Val Ile Met His Leu Glu Ala Leu Arg Met Val Gln Glu Asn Gly
    130                 135                 140
ggc acc gac ctc ggc ctc aag gtg gtc atg gaa ggt tcg gaa gag ctc    480
Gly Thr Asp Leu Gly Leu Lys Val Val Met Glu Gly Ser Glu Glu Leu
145                 150                 155                 160
ggc ggc gag gac ggc ctg ggc aag ctc atc gac gcc aac cct gag ctg    528
Gly Gly Glu Asp Gly Leu Gly Lys Leu Ile Asp Ala Asn Pro Glu Leu
                165                 170                 175
ttc acc gca gac gtc att ttc atc ggc gac ggt ggc aac gtg gcc gtc    576
Phe Thr Ala Asp Val Ile Phe Ile Gly Asp Gly Gly Asn Val Ala Val
            180                 185                 190
ggc atc ccg acc ttg acc acc cat ctg cgc ggt ggc gca cag ctg cgc    624
Gly Ile Pro Thr Leu Thr Thr His Leu Arg Gly Gly Ala Gln Leu Arg
        195                 200                 205
ttc aag gtg gat acc ctc gag ggc ccg gtc cac tcc ggt ggt tgg ggc    672
Phe Lys Val Asp Thr Leu Glu Gly Pro Val His Ser Gly Gly Trp Gly
    210                 215                 220
ggc gcg gcc ccg gat gcg gcg cac gca ctg atc cgc atc atc gat tcc    720
Gly Ala Ala Pro Asp Ala Ala His Ala Leu Ile Arg Ile Ile Asp Ser
225                 230                 235                 240
ttc ttc gac gag cac ggc cgc acc acg atc gag ggc gtg gac act acc    768
Phe Phe Asp Glu His Gly Arg Thr Thr Ile Glu Gly Val Asp Thr Thr
                245                 250                 255
gcg aag tgg gag ggc gat ccg tac gac cgc gag acc ttc cgc aag gac    816
Ala Lys Trp Glu Gly Asp Pro Tyr Asp Arg Glu Thr Phe Arg Lys Asp
            260                 265                 270
gcc cgc gtc ctc gac ggc gtg cag ctg ctg ggc acc gtc gac gac gaa    864
Ala Arg Val Leu Asp Gly Val Gln Leu Leu Gly Thr Val Asp Asp Glu
        275                 280                 285
ccg gcg gac atg gtg tgg gct cgc ccg gca atc acc gtc atc ggg ttc    912
Pro Ala Asp Met Val Trp Ala Arg Pro Ala Ile Thr Val Ile Gly Phe
    290                 295                 300
acc tcg gtg ccg gtg gag gac gcg acc aac atc gtg aac ccg acc gcc    960
Thr Ser Val Pro Val Glu Asp Ala Thr Asn Ile Val Asn Pro Thr Ala
305                 310                 315                 320
gag gca cag ttc aac ctg cgc gtg ccc gca ccg cag tcc gct gct gag    1008
Glu Ala Gln Phe Asn Leu Arg Val Pro Ala Pro Gln Ser Ala Ala Glu
                325                 330                 335
gta gcg aag aag gtc gag gag cag atc cgc gca cgc gcc ccg tgg ggc    1056
Val Ala Lys Lys Val Glu Glu Gln Ile Arg Ala Arg Ala Pro Trp Gly
            340                 345                 350
gca aag gtc gag gtg agc atc acc ggc gtg aac gag ccg ttc tcc acc    1104
Ala Lys Val Glu Val Ser Ile Thr Gly Val Asn Glu Pro Phe Ser Thr
        355                 360                 365
gac ccg aac ggc ccg gcg gtg cag cac ttc ggc aag tgc ctg cag gac    1152
Asp Pro Asn Gly Pro Ala Val Gln His Phe Gly Lys Cys Leu Gln Asp
    370                 375                 380
gcc tac ggc gcg gag cac ctc acc gtg gtc ggc acc ggt ggc tcc atc    1200
Ala Tyr Gly Ala Glu His Leu Thr Val Val Gly Thr Gly Gly Ser Ile
385                 390                 395                 400
ccg ctg act gtg acc ctg cag aag cac ttc ccg gac gca gag ttc gcg    1248
Pro Leu Thr Val Thr Leu Gln Lys His Phe Pro Asp Ala Glu Phe Ala
                405                 410                 415
ctc tac ggc gtc gcg gat ccg gcc gcg aac atc cac ggc gtc gac gag    1296
Leu Tyr Gly Val Ala Asp Pro Ala Ala Asn Ile His Gly Val Asp Glu
            420                 425                 430
tcc gtc gat ccg acg gag atc gag cac gtc gct att gcc gaa gca gaa    1344
Ser Val Asp Pro Thr Glu Ile Glu His Val Ala Ile Ala Glu Ala Glu
        435                 440                 445
ttc ctg ctc acc tac ggg aaa tag                                    1368
Phe Leu Leu Thr Tyr Gly Lys
    450                 455
 
<210>2
<211>455
<212>PRT
<213>棒状杆菌属物种Ax20
 
<400>2
 
Met Ser Asn Asp Lys Ala Ala Thr Ser Thr Asn Phe Asn Leu Thr Pro
1               5                   10                  15
Asn Arg Glu Arg Ile Phe Gln Glu Leu Ser Glu Leu Ile Ser His Tyr
            20                  25                  30
Ser Pro His Ser Met Pro Glu His Ala Asp Thr His Glu Glu Ala Ala
        35                  40                  45
Lys Trp Val Thr Ala Lys Leu Glu Glu Leu Gly Leu Asp Val Thr Arg
    50                  55                  60
His Pro Thr Val Asp Asp Ala Asp Thr Ile Ile Gly Val Lys Glu Pro
65                  70                  75                  80
Val Gly Asp Ala Pro Thr Ile Leu Leu Tyr Ser His Tyr Asp Val Val
                85                  90                  95
Pro Ala Gln Asn Pro Ala Val Trp Thr Asn Asp Pro Leu Glu Leu Asp
            100                 105                 110
Glu Arg Asp Gly Arg Trp Tyr Gly Arg Gly Ala Ala Asp Cys Lys Gly
        115                 120                 125
Asn Val Ile Met His Leu Glu Ala Leu Arg Met Val Gln Glu Asn Gly
    130                 135                 140
Gly Thr Asp Leu Gly Leu Lys Val Val Met Glu Gly Ser Glu Glu Leu
145                 150                 155                 160
Gly Gly Glu Asp Gly Leu Gly Lys Leu Ile Asp Ala Asn Pro Glu Leu
                165                 170                 175
Phe Thr Ala Asp Val Ile Phe Ile Gly Asp Gly Gly Asn Val Ala Val
            180                 185                 190
Gly Ile Pro Thr Leu Thr Thr His Leu Arg Gly Gly Ala Gln Leu Arg
        195                 200                 205
Phe Lys Val Asp Thr Leu Glu Gly Pro Val His Ser Gly Gly Trp Gly
    210                 215                 220
Gly Ala Ala Pro Asp Ala Ala His Ala Leu Ile Arg Ile Ile Asp Ser
225                 230                 235                 240
Phe Phe Asp Glu His Gly Arg Thr Thr Ile Glu Gly Val Asp Thr Thr
                245                 250                 255
Ala Lys Trp Glu Gly Asp Pro Tyr Asp Arg Glu Thr Phe Arg Lys Asp
            260                 265                 270
Ala Arg Val Leu Asp Gly Val Gln Leu Leu Gly Thr Val Asp Asp Glu
        275                 280                 285
Pro Ala Asp Met Val Trp Ala Arg Pro Ala Ile Thr Val Ile Gly Phe
    290                 295                 300
Thr Ser Val Pro Val Glu Asp Ala Thr Asn Ile Val Asn Pro Thr Ala
305                 310                 315                 320
Glu Ala Gln Phe Asn Leu Arg Val Pro Ala Pro Gln Ser Ala Ala Glu
                325                 330                 335
Val Ala Lys Lys Val Glu Glu Gln Ile Arg Ala Arg Ala Pro Trp Gly
            340                 345                 350
Ala Lys Val Glu Val Ser Ile Thr Gly Val Asn Glu Pro Phe Ser Thr
        355                 360                 365
Asp Pro Asn Gly Pro Ala Val Gln His Phe Gly Lys Cys Leu Gln Asp
    370                 375                 380
Ala Tyr Gly Ala Glu His Leu Thr Val Val Gly Thr Gly Gly Ser Ile
385                 390                 395                 400
Pro Leu Thr Val Thr Leu Gln Lys His Phe Pro Asp Ala Glu Phe Ala
                405                 410                 415
Leu Tyr Gly Val Ala Asp Pro Ala Ala Asn Ile His Gly Val Asp Glu
           420                 425                 430
Ser Val Asp Pro Thr Glu Ile Glu His Val Ala Ile Ala Glu Ala Glu
    435                 440                 445
Phe Leu Leu Thr Tyr Gly Lys
450                 455
<210>3
<211>1404
<212>DNA
<213>杰氏棒状杆菌K411
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1404)
 
<400>3
 
atg agc gat acc aac agt gaa tcc aac acc tca cag cta gac cta gcc    48
Met Ser Asp Thr Asn Ser Glu Ser Asn Thr Ser Gln Leu Asp Leu Ala
1               5                   10                  15
cgc gcc gcc atc gcg gag cag atg cca caa ctg aag gaa gac ctc acc    96
Arg Ala Ala Ile Ala Glu Gln Met Pro Gln Leu Lys Glu Asp Leu Thr
            20                  25                  30
acc ctg gtc tcc ttc gag tcg gtc cac tct gcc cca ggc ctg gaa gag    144
Thr Leu Val Ser Phe Glu Ser Val His Ser Ala Pro Gly Leu Glu Glu
        35                  40                  45
gcc aat gct gct gcc gca caa tgg gtc atc gac aca ttc acc agc gtg    192
Ala Asn Ala Ala Ala Ala Gln Trp Val Ile Asp Thr Phe Thr Ser Val
    50                  55                  60
ggc atc ccc gtc gaa ggt cac gtc acc acc gac ggc tcc acc tcc gtc    240
Gly Ile Pro Val Glu Gly His Val Thr Thr Asp Gly Ser Thr Ser Val
65                  70                  75                  80
atc ggc cta cgc gag ccc gct gag ggc tac cca acc atc ctc cta tac    288
Ile Gly Leu Arg Glu Pro Ala Glu Gly Tyr Pro Thr Ile Leu Leu Tyr
                85                  90                  95
tcc cac ttc gac gtg cag ccc gcc ggc gac atc gag gcg tgg acc aat    336
Ser His Phe Asp Val Gln Pro Ala Gly Asp Ile Glu Ala Trp Thr Asn
            100                 105                 110
gac ccc tgg acc ctt acc gaa cgc gat ggc cgc tgg tac ggc cgc ggt    384
Asp Pro Trp Thr Leu Thr Glu Arg Asp Gly Arg Trp Tyr Gly Arg Gly
        115                 120                 125
acc gcc gac tgc aag ggt cac gtc gcc atg cac gtt gct gtg ctg cgt    432
Thr Ala Asp Cys Lys Gly His Val Ala Met His Val Ala Val Leu Arg
    130                 135                 140
gct ctt tct att ctt tcg gac gcc cac ttc ccc gcc gcc aag aat ctc    480
Ala Leu Ser Ile Leu Ser Asp Ala His Phe Pro Ala Ala Lys Asn Leu
145                 150                 155                 160
ggc atc cgg atc gtc gtc gag ggc tcg gag gaa cgc ggc gga tat ggc    528
Gly Ile Arg Ile Val Val Glu Gly Ser Glu Glu Arg Gly Gly Tyr Gly
                165                 170                 175
ctg gag gac ctg cta gcc gaa aag ccg gag ctc ttc gcg gcc gat acc    576
Leu Glu Asp Leu Leu Ala Glu Lys Pro Glu Leu Phe Ala Ala Asp Thr
            180                 185                 190
ttc ctt att gcc gac tcc ggc aat gac gcc ctg ggt gag ccg agc ctg    624
Phe Leu Ile Ala Asp Ser Gly Asn Asp Ala Leu Gly Glu Pro Ser Leu
        195                 200                 205
tgc acc gcg ctg cgc ggc tcc gcg ccg gtc acg gtg cgc acc cgc acg    672
Cys Thr Ala Leu Arg Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Arg Thr Arg Thr
    210                 215                 220
ctg gcg cag ccg atg cac tcc ggc cag ttc ggt ggc tcg gca ccg gat    720
Leu Ala Gln Pro Met His Ser Gly Gln Phe Gly Gly Ser Ala Pro Asp
225                 230                 235                 240
gcc ctg gtt gag ctg gtg caa ctc ctt tcc act ctc cat gac gaa aac    768
Ala Leu Val Glu Leu Val Gln Leu Leu Ser Thr Leu His Asp Glu Asn
                245                 250                 255
ggc cta gtg gcc gtc ccg gga ttg gag ccc aag gag cgc tgg ggt ggc    816
Gly Leu Val Ala Val Pro Gly Leu Glu Pro Lys Glu Arg Trp Gly Gly
            260                 265                 270
gtc gga cca aca gaa cag gaa ttc cgc gac aac gcc gga gta acc gac    864
Val Gly Pro Thr Glu Gln Glu Phe Arg Asp Asn Ala Gly Val Thr Asp
        275                 280                 285
ggc gtg gag cta tac gga gcc ggc gaa tgg cag ccg aac gac ctg acg    912
Gly Val Glu Leu Tyr Gly Ala Gly Glu Trp Gln Pro Asn Asp Leu Thr
    290                 295                 300
gtg atg aac cca tcg att acg atc aca ggc ctg gat gca ctg tcg gtg    960
Val Met Asn Pro Ser Ile Thr Ile Thr Gly Leu Asp Ala Leu Ser Val
305                 310                 315                 320
gcg gac tcg gtg aac tcc gtg ccg gcg acc gca gcg gcc gtg gtg agc    1008
Ala Asp Ser Val Asn Ser Val Pro Ala Thr Ala Ala Ala Val Val Ser
                325                 330                 335
ctg cgc gtg ccg ccg gga cgc gag ccg cag gag tgc cag gat ctg ctg    1056
Leu Arg Val Pro Pro Gly Arg Glu Pro Gln Glu Cys Gln Asp Leu Leu
            340                 345                 350
gtc aag cac ttg gaa agc cag aag aca aac gca cta gtg gag atc gaa    1104
Val Lys His Leu Glu Ser Gln Lys Thr Asn Ala Leu Val Glu Ile Glu
        355                 360                 365
cgc ggc tcc ttg gca gag gca ttc cag gcg gat acc tcc ggc ccg gca    1152
Arg Gly Ser Leu Ala Glu Ala Phe Gln Ala Asp Thr Ser Gly Pro Ala
    370                 375                 380
ctg cag cgg ctc ggc gag gcg ctg ggc gag gtg tac ggc aag gag acg    1200
Leu Gln Arg Leu Gly Glu Ala Leu Gly Glu Val Tyr Gly Lys Glu Thr
385                 390                 395                 400
atg gag gtc gcc tcc ggc ggg tca atc cca cta acg aac aag ctg ctg    1248
Met Glu Val Ala Ser Gly Gly Ser Ile Pro Leu Thr Asn Lys Leu Leu
                405                 410                 415
ggt gcg tac ccg cag gcg gag ctc gcg cta tac ggc atc gag gag ccg    1296
Gly Ala Tyr Pro Gln Ala Glu Leu Ala Leu Tyr Gly Ile Glu Glu Pro
            420                 425                 430
aag tgc gcc atc cac tcc gcg gac gaa tcc gtg gat ccg ggt gag atc    1344
Lys Cys Ala Ile His Ser Ala Asp Glu Ser Val Asp Pro Gly Glu Ile
        435                 440                 445
gag gcc atc gcg acg gca gag cta ctg ttc ctg cta cgc acc gcc gag    1392
Glu Ala Ile Ala Thr Ala Glu Leu Leu Phe Leu Leu Arg Thr Ala Glu
    450                 455                 460
gcg cac agc tag                                                    1404
Ala His Ser
465
<210>4
<211>467
<212>PRT
<213>杰氏棒状杆菌K411
 
<400>4
 
Met Ser Asp Thr Asn Ser Glu Ser Asn Thr Ser Gln Leu Asp Leu Ala
1               5                   10                  15
Arg Ala Ala Ile Ala Glu Gln Met Pro Gln Leu Lys Glu Asp Leu Thr
            20                  25                  30
Thr Leu Val Ser Phe Glu Ser Val His Ser Ala Pro Gly Leu Glu Glu
        35                  40                  45
Ala Asn Ala Ala Ala Ala Gln Trp Val Ile Asp Thr Phe Thr Ser Val
    50                  55                  60
Gly Ile Pro Val Glu Gly His Val Thr Thr Asp Gly Ser Thr Ser Val
65                  70                  75                  80
Ile Gly Leu Arg Glu Pro Ala Glu Gly Tyr Pro Thr Ile Leu Leu Tyr
                85                  90                  95
Ser His Phe Asp Val Gln Pro Ala Gly Asp Ile Glu Ala Trp Thr Asn
            100                 105                 110
Asp Pro Trp Thr Leu Thr Glu Arg Asp Gly Arg Trp Tyr Gly Arg Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Asp Cys Lys Gly His Val Ala Met His Val Ala Val Leu Arg
    130                 135                 140
Ala Leu Ser Ile Leu Ser Asp Ala His Phe Pro Ala Ala Lys Asn Leu
145                 150                 155                 160
Gly Ile Arg Ile Val Val Glu Gly Ser Glu Glu Arg Gly Gly Tyr Gly
                165                 170                 175
Leu Glu Asp Leu Leu Ala Glu Lys Pro Glu Leu Phe Ala Ala Asp Thr
            180                 185                 190
Phe Leu Ile Ala Asp Ser Gly Asn Asp Ala Leu Gly Glu Pro Ser Leu
        195                 200                 205
Cys Thr Ala Leu Arg Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Arg Thr Arg Thr
    210                 215                 220
Leu Ala Gln Pro Met His Ser Gly Gln Phe Gly Gly Ser Ala Pro Asp
225                 230                 235                 240
Ala Leu Val Glu Leu Val Gln Leu Leu Ser Thr Leu His Asp Glu Asn
                245                 250                 255
Gly Leu Val Ala Val Pro Gly Leu Glu Pro Lys Glu Arg Trp Gly Gly
            260                 265                 270
Val Gly Pro Thr Glu Gln Glu Phe Arg Asp Asn Ala Gly Val Thr Asp
        275                 280                 285
Gly Val Glu Leu Tyr Gly Ala Gly Glu Trp Gln Pro Asn Asp Leu Thr
    290                 295                 300
Val Met Asn Pro Ser Ile Thr Ile Thr Gly Leu Asp Ala Leu Ser Val
305                 310                 315                 320
Ala Asp Ser Val Asn Ser Val Pro Ala Thr Ala Ala Ala Val Val Ser
                325                 330                 335
Leu Arg Val Pro Pro Gly Arg Glu Pro Gln Glu Cys Gln Asp Leu Leu
            340                 345                 350
Val Lys His Leu Glu Ser Gln Lys Thr Asn Ala Leu Val Glu Ile Glu
        355                 360                 365
Arg Gly Ser Leu Ala Glu Ala Phe Gln Ala Asp Thr Ser Gly Pro Ala
    370                 375                 380
Leu Gln Arg Leu Gly Glu Ala Leu Gly Glu Val Tyr Gly Lys Glu Thr
385                 390                 395                 400
Met Glu Val Ala Ser Gly Gly Ser Ile Pro Leu Thr Asn Lys Leu Leu
                405                 410                 415
Gly Ala Tyr Pro Gln Ala Glu Leu Ala Leu Tyr Gly Ile Glu Glu Pro
            420                 425                 430
Lys Cys Ala Ile His Ser Ala Asp Glu Ser Val Asp Pro Gly Glu Ile
       435                 440                 445
Glu Ala Ile Ala Thr Ala Glu Leu Leu Phe Leu Leu Arg Thr Ala Glu
    450                 455                 460
Ala His Ser
465
 
<210>5
<211>1134
<212>DNA
<213>棒状杆菌属物种Ax 20
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1134)
 
<400>5
 
atg cag ttc tcc aac ctt gac acc ctg cgc acc cgt ggc acc cgc aag    48
Met Gln Phe Ser Asn Leu Asp Thr Leu Arg Thr Arg Gly Thr Arg Lys
1               5                   10                  15
tgg acc cag ttc gac gac gac gtc atc ccc atg ttc gtc gcc gag agc    96
Trp Thr Gln Phe Asp Asp Asp Val Ile Pro Met Phe Val Ala Glu Ser
            20                  25                  30
gac ttc ccc acc gca cca gcc atc aag gaa gcg att atc gac gcc tgc    144
Asp Phe Pro Thr Ala Pro Ala Ile Lys Glu Ala Ile Ile Asp Ala Cys
        35                  40                  45
gag cgc gag atg ttc ggc tac act ccc gcc ccg cac gcg cac cac ctg    192
Glu Arg Glu Met Phe Gly Tyr Thr Pro Ala Pro His Ala His His Leu
    50                  55                  60
ggc gaa gcc gtc gct gac ttc tac gac tgg cgc tac ggc tgg cgc ccg    240
Gly Glu Ala Val Ala Asp Phe Tyr Asp Trp Arg Tyr Gly Trp Arg Pro
65                  70                  75                  80
gac gcg gcg aag atc ttc ccc gtc gcc gac gtc gtg cgc ggc gtg ctg    288
Asp Ala Ala Lys Ile Phe Pro Val Ala Asp Val Val Arg Gly Val Leu
                85                  90                  95
ctg gca att cag tac ttc act gac ggc gat gtg atc gtc ccg gtg ccg    336
Leu Ala Ile Gln Tyr Phe Thr Asp Gly Asp Val Ile Val Pro Val Pro
            100                 105                 110
gcg tac ttc ccg ttc ctg ccg atc gcg gaa gcc gcc ggc cgc aac cgc    384
Ala Tyr Phe Pro Phe Leu Pro Ile Ala Glu Ala Ala Gly Arg Asn Arg
        115                 120                 125
atc gac atc agc tcc gac aag ggg ctc gag ggc ggc ctg gac atg gcc    432
Ile Asp Ile Ser Ser Asp Lys Gly Leu Glu Gly Gly Leu Asp Met Ala
    130                 135                 140
gag gtc gag gag gcg ttc aag aac ggc gcg ggc agc atc atc gtc acc    480
Glu Val Glu Glu Ala Phe Lys Asn Gly Ala Gly Ser Ile Ile Val Thr
145                 150                 155                 160
aac ccg ttc aac ccg ggc ggc tgg atg ttc aca tcg gaa gag ctc gac    528
Asn Pro Phe Asn Pro Gly Gly Trp Met Phe Thr Ser Glu Glu Leu Asp
                165                 170                 175
caa atc tgc gac atc gct cgc cgg tac aag ggc aga gtg ctt gtc gac    576
Gln Ile Cys Asp Ile Ala Arg Arg Tyr Lys Gly Arg Val Leu Val Asp
            180                 185                 190
gaa atc cat gca ccg ctc acc tac ggc aaa cgc cac gtc tgc gct gcc    624
Glu Ile His Ala Pro Leu Thr Tyr Gly Lys Arg His Val Cys Ala Ala
        195                 200                 205
gcg aat aac ccg gat gtt tgc atc acc gtg acg gcg acc tcg aag gcg    672
Ala Asn Asn Pro Asp Val Cys Ile Thr Val Thr Ala Thr Ser Lys Ala
    210                 215                 220
tgg aat gtc gcg ggg ctg aag tgc gcg cag atg atc ttc acc aac gac    720
Trp Asn Val Ala Gly Leu Lys Cys Ala Gln Met Ile Phe Thr Asn Asp
225                 230                 235                 240
gag gac gtg aag acc tgg aac gcg atc aac ccg gtg gcc aag gac ggt    768
Glu Asp Val Lys Thr Trp Asn Ala Ile Asn Pro Val Ala Lys Asp Gly
                245                 250                 255
gtc ggc acg ctg ggc atc atc gct gcg gaa gcg gcg tac gag tcc ggc    816
Val Gly Thr Leu Gly Ile Ile Ala Ala Glu Ala Ala Tyr Glu Ser Gly
            260                 265                 270
cgc gag cac ctc gat tgg cag gtc gag cag ctc aag gct aac cgc gac    864
Arg Glu His Leu Asp Trp Gln Val Glu Gln Leu Lys Ala Asn Arg Asp
        275                 280                 285
tgg ctc gtg gaa aac ctc ccc agc ctg att ccg ggg atc cgc ttc gaa    912
Trp Leu Val Glu Asn Leu Pro Ser Leu Ile Pro Gly Ile Arg Phe Glu
    290                 295                 300
atc ccg gat gcc acc tac ctc atg ttc ttg gac ttc aag gac acg aaa    960
Ile Pro Asp Ala Thr Tyr Leu Met Phe Leu Asp Phe Lys Asp Thr Lys
305                 310                 315                 320
ttg ggc gtc gat aag cct gct gct tac ctg ttg aaa cat gca cga gtg    1008
Leu Gly Val Asp Lys Pro Ala Ala Tyr Leu Leu Lys His Ala Arg Val
                325                 330                 335
gcg ctg agt gag ggg gtt gat ttc ggg cct ggt ggc gag cac cgt gcg    1056
Ala Leu Ser Glu Gly Val Asp Phe Gly Pro Gly Gly Glu His Arg Ala
            340                 345                 350
cgg atg aac ttt gcc acc tcg ccg gag atc ctg aag gag gcc acg gag    1104
Arg Met Asn Phe Ala Thr Ser Pro Glu Ile Leu Lys Glu Ala Thr Glu
        355                 360                 365
cgc atc gcc cgc gcg atc gaa gta gtc taa                            1134
Arg Ile Ala Arg Ala Ile Glu Val Val
    370                 375
 
<210>6
<211>377
<212>PRT
<213>棒状杆菌属物种Ax 20
 
<400>6
 
Met Gln Phe Ser Asn Leu Asp Thr Leu Arg Thr Arg Gly Thr Arg Lys
1               5                   10                  15
Trp Thr Gln Phe Asp Asp Asp Val Ile Pro Met Phe Val Ala Glu Ser
            20                  25                  30
Asp Phe Pro Thr Ala Pro Ala Ile Lys Glu Ala Ile Ile Asp Ala Cys
        35                  40                  45
Glu Arg Glu Met Phe Gly Tyr Thr Pro Ala Pro His Ala His His Leu
    50                  55                  60
Gly Glu Ala Val Ala Asp Phe Tyr Asp Trp Arg Tyr Gly Trp Arg Pro
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Lys Ile Phe Pro Val Ala Asp Val Val Arg Gly Val Leu
                85                  90                  95
Leu Ala Ile Gln Tyr Phe Thr Asp Gly Asp Val Ile Val Pro Val Pro
            100                 105                 110
Ala Tyr Phe Pro Phe Leu Pro Ile Ala Glu Ala Ala Gly Arg Asn Arg
        115                 120                 125
Ile Asp Ile Ser Ser Asp Lys Gly Leu Glu Gly Gly Leu Asp Met Ala
    130                 135                 140
Glu Val Glu Glu Ala Phe Lys Asn Gly Ala Gly Ser Ile Ile Val Thr
145                 150                 155                 160
Asn Pro Phe Asn Pro Gly Gly Trp Met Phe Thr Ser Glu Glu Leu Asp
                165                 170                 175
Gln Ile Cys Asp Ile Ala Arg Arg Tyr Lys Gly Arg Val Leu Val Asp
            180                 185                 190
Glu Ile His Ala Pro Leu Thr Tyr Gly Lys Arg His Val Cys Ala Ala
        195                 200                 205
Ala Asn Asn Pro Asp Val Cys Ile Thr Val Thr Ala Thr Ser Lys Ala
    210                 215                 220
Trp Asn Val Ala Gly Leu Lys Cys Ala Gln Met Ile Phe Thr Asn Asp
225                 230                 235                 240
Glu Asp Val Lys Thr Trp Asn Ala Ile Asn Pro Val Ala Lys Asp Gly
                245                 250                 255
Val Gly Thr Leu Gly Ile Ile Ala Ala Glu Ala Ala Tyr Glu Ser Gly
            260                 265                 270
Arg Glu His Leu Asp Trp Gln Val Glu Gln Leu Lys Ala Asn Arg Asp
        275                 280                 285
Trp Leu Val Glu Asn Leu Pro Ser Leu Ile Pro Gly Ile Arg Phe Glu
    290                 295                 300
Ile Pro Asp Ala Thr Tyr Leu Met Phe Leu Asp Phe Lys Asp Thr Lys
305                 310                 315                 320
Leu Gly Val Asp Lys Pro Ala Ala Tyr Leu Leu Lys His Ala Arg Val
                325                 330                 335
Ala Leu Ser Glu Gly Val Asp Phe Gly Pro Gly Gly Glu His Arg Ala
            340                 345                 350
Arg Met Asn Phe Ala Thr Ser Pro Glu Ile Leu Lys Glu Ala Thr Glu
        355                 360                 365
Arg Ile Ala Arg Ala Ile Glu Val Val
    370                 375

Claims (17)

1.鉴定身体恶臭形成的调节剂的方法，所述方法包括步骤：
(i)使肽酶与肽酶底物和至少一种测试试剂接触；和
(ii)测定所述至少一种测试试剂对所述肽酶介导的反应速率的影响，
其中所述肽酶具有从式FIII的底物化合物中释放甘氨酸的催化活性
其中所述肽酶与选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的多肽序列同源，具有至少40％的序列同一性；
其中所述肽酶包含下述保守的部分序列：
氨基酸105和150之间的ERDGRWYGRGXADCKG，
氨基酸150和180之间的EGSEEXG，
氨基酸205和255之间的HSGXXGGXAPDA，
氨基酸385和425之间的GGSIPL；
并且其中所述氨基酸从以其天然存在形式的实质性同源的肽酶的N末端开始编号，并且字母指单字符氨基酸编码，并且X是20种普通氨基酸中的任何一种。
2.权利要求1的方法，其中步骤(i)中的所述肽酶底物是式FI的化合物
Figure FPA00001091833300012
其中X选自S和O，并且其中R1是选自H和甲基的残基，并且其中R2是选自直链或分支C1至C10烷基、直链或分支C1至C10烷醇、苯基和苄基的残基。
3.权利要求1的方法，其中所述底物是选自S-苄基-Cys-Gly、O-苄基-Ser-Gly、(1-(2-羟乙基)-1-甲基丁基)-L-半胱氨酰基-甘氨酸、S-苄基-Cys-Ala、O-苄基-Ser-Ala、Pro-Gly、Ala-Gly、Ala-Ala和Pro-Ala的化合物。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中使另外的酶胱硫醚-β-裂合酶与所述底物和测试试剂并行或顺次温育，并且其中在步骤(ii)中，所述测试试剂对通过所述肽酶和β-裂合酶的切割的影响通过在其反应产物的至少一种的形成中的改变进行测定，所述反应产物的至少一种任选地选自硫醇反应产物和羟基反应产物。
5.试剂盒包括：
(i)肽酶，和
(ii)由所述肽酶切割的底物化合物，
用于组合使用以鉴定作为所述肽酶和恶臭形成的调节剂的测试试剂，
其中所述底物化合物任选是式FI的化合物
Figure FPA00001091833300021
其中X选自S和O，并且其中R1是选自H和甲基的残基，并且其中R2是选自直链或分支C1至C10烷基、直链或分支C1至C10烷醇、苯基和苄基的残基，
并且其中任选地式FI的所述底物化合物选自S-苄基-Cys-Gly、O-苄基-Ser-Gly、(1-(2-羟乙基)-1-甲基丁基)-L-半胱氨酰基-甘氨酸、S-苄基-Cys-Ala、O-苄基-Ser-Ala、Pro-Gly、Ala-Gly、Ala-Ala和Pro-Ala，
其中所述肽酶具有从式FIII的底物化合物中释放甘氨酸的催化活性
Figure FPA00001091833300031
其中所述肽酶与选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的多肽序列同源，具有至少40％的序列同一性。
其中所述肽酶包含下述保守的部分序列：
氨基酸105和150之间的ERDGRWYGRGXADCKG，
氨基酸150和180之间的EGSEEXG，
氨基酸205和255之间的HSGXXGGXAPDA，
氨基酸385和425之间的GGSIPL；
并且其中所述氨基酸从以其天然存在形式的实质性同源的肽酶的N末端开始编号，并且字母指单字符氨基酸编码，并且X是20种普通氨基酸中的任何一种。
6.在其切割其底物的能力方面抑制肽酶的方法，其中使所述肽酶与肽酶抑制剂接触，并且其中所述肽酶具有从式FIII的底物化合物中释放甘氨酸的催化活性
Figure FPA00001091833300032
其中所述肽酶与选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的多肽序列同源，具有至少40％的序列同一性；
其中所述肽酶包含下述保守的部分序列：
氨基酸105和150之间的ERDGRWYGRGXADCKG，
氨基酸150和180之间的EGSEEXG，
氨基酸205和255之间的HSGXXGGXAPDA，
氨基酸385和425之间的GGSIPL；
并且其中所述氨基酸从以其天然存在形式的实质性同源的肽酶的N末端开始编号，并且字母指单字符氨基酸编码，并且X是20种普通氨基酸中的任何一种。
7.根据权利要求6用于阻止或减少身体恶臭形成的方法，其中将肽酶抑制剂应用于身体表面，
其中所述肽酶具有从式FIII的底物化合物中释放甘氨酸的催化活性
Figure FPA00001091833300041
其中所述肽酶与选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的多肽序列同源，具有至少40％的序列同一性；
其中所述肽酶包含下述保守的部分序列：
氨基酸105和150之间的ERDGRWYGRGXADCKG，
氨基酸150和180之间的EGSEEXG，
氨基酸205和255之间的HSGXXGGXAPDA，
氨基酸385和425之间的GGSIPL；
并且其中所述氨基酸从以其天然存在形式的实质性同源的肽酶的N末端开始编号，并且字母指单字符氨基酸编码，并且X是20种普通氨基酸中的任何一种。
8.根据权利要求7的方法，其中所述化合物以包含至少一种赋形剂的皮肤病学可接受的组合物形式应用。
9.用于制备具有针对身体恶臭形成的效应的个人护理产品的方法，其中将肽酶抑制剂加入个人护理产品制剂中；
其中所述肽酶具有从式FIII的底物化合物中释放甘氨酸的催化活性
Figure FPA00001091833300042
其中所述肽酶与选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的多肽序列同源，具有至少40％的序列同一性；
其中所述肽酶包含下述保守的部分序列：
氨基酸105和150之间的ERDGRWYGRGXADCKG，
氨基酸150和180之间的EGSEEXG，
氨基酸205和255之间的HSGXXGGXAPDA，
氨基酸385和425之间的GGSIPL；
并且其中所述氨基酸从以其天然存在形式的实质性同源的肽酶的N末端开始编号，并且字母指单字符氨基酸编码，并且X是20种普通氨基酸中的任何一种。
10.包含肽酶底物和分离的肽酶的组合物，
其中所述肽酶底物是式FI的化合物
其中X选自S和O，并且其中R1是选自H和甲基的残基，并且其中R2是选自直链或分支C1至C10烷基、直链或分支C1至C10烷醇、苯基和苄基的残基；
其中任选地式FI的所述底物化合物选自S-苄基-Cys-Gly、O-苄基-Ser-Gly、(1-(2-羟乙基)-1-甲基丁基)-L-半胱氨酰基-甘氨酸、S-苄基-Cys-Ala、O-苄基-Ser-Ala、Pro-Gly、Ala-Gly、Ala-Ala和Pro-Ala；
其中所述肽酶是具有从式FIII的底物化合物中释放甘氨酸的催化活性的肽酶
Figure FPA00001091833300052
其中所述肽酶与选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的多肽序列同源，具有至少40％的序列同一性；
其中所述肽酶包含下述保守的部分序列：
氨基酸105和150之间的ERDGRWYGRGXADCKG，
氨基酸150和180之间的EGSEEXG，
氨基酸205和255之间的HSGXXGGXAPDA，
氨基酸385和425之间的GGSIPL；
并且其中所述氨基酸从以其天然存在形式的实质性同源的肽酶的N末端开始编号，并且字母指单字符氨基酸编码，并且X是20种普通氨基酸中的任何一种。
11.权利要求10的组合物，其中所述肽酶是选自分离形式、包含功能肽酶的制剂形式、在合适宿主细胞中的异源表达形式、表达肽酶的杰氏棒状杆菌(Corynebacterium jeikeium)形式、和表达肽酶的杰氏棒状杆菌K411形式的形式。
12.分离的肽酶，其中所述肽酶与选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的序列同源，具有至少40％的序列同一性；
其中所述肽酶具有从式FIII的底物化合物中释放甘氨酸的催化活性
Figure FPA00001091833300061
其中所述肽酶与选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的多肽序列同源，具有至少40％的序列同一性；
其中所述肽酶包含下述保守的部分序列：
氨基酸105和150之间的ERDGRWYGRGXADCKG，
氨基酸150和180之间的EGSEEXG，
氨基酸205和255之间的HSGXXGGXAPDA，
氨基酸385和425之间的GGSIPL；
并且其中所述氨基酸从以其天然存在形式的实质性同源的肽酶的N末端开始编号，并且字母指单字符氨基酸编码，并且X是20种普通氨基酸中的任何一种。
13.权利要求12的分离的肽酶，其中所述肽酶与选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的序列同源，具有至少80％的序列同一性。
14.编码肽酶的核苷酸，其选自
通过序列同一性测定的与SEQ ID NO：1的核苷酸序列实质性同源的核苷酸；
当翻译成相对应蛋白质时，不引起氨基酸改变的SEQ ID NO：1的保守修饰变体的核苷酸；
通过杂交测定的与SEQ ID NO：1实质性同源的核苷酸；
其中通过序列同一性测定的实质性同源的核苷酸具有至少80％的序列同一性；
其中所述肽酶具有从式FIII的底物化合物中释放甘氨酸的催化活性
Figure FPA00001091833300071
其中所述肽酶与选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的多肽序列同源，具有至少40％的序列同一性；
其中所述肽酶包含下述保守的部分序列：
氨基酸105和150之间的ERDGRWYGRGXADCKG，
氨基酸150和180之间的EGSEEXG，
氨基酸205和255之间的HSGXXGGXAPDA，
氨基酸385和425之间的GGSIPL；
并且其中所述氨基酸从以其天然存在形式的实质性同源的肽酶的N末端开始编号，并且字母指单字符氨基酸编码，并且X是20种普通氨基酸中的任何一种。
15.权利要求14的分离的核苷酸，其中所述分离的核苷酸构成表达载体的部分。
16.权利要求15的分离的核苷酸，其中所述表达载体构成用所述表达载体转染的宿主细胞的部分。
17.形成肽酶的方法，其包括下述步骤：在足以表达的条件下培养包含编码所述肽酶的表达载体的宿主细胞，从而形成所述肽酶，并且任选地从细胞中将其回收，其中所述肽酶具有从式FIII的底物化合物中释放甘氨酸的催化活性
Figure FPA00001091833300081
其中所述肽酶与选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的多肽序列同源，具有至少40％的序列同一性；
其中所述肽酶包含下述保守的部分序列：
氨基酸105和150之间的ERDGRWYGRGXADCKG，
氨基酸150和180之间的EGSEEXG，
氨基酸205和255之间的HSGXXGGXAPDA，
氨基酸385和425之间的GGSIPL；
并且其中所述氨基酸从以其天然存在形式的实质性同源的肽酶的N末端开始编号，并且字母指单字符氨基酸编码，并且X是20种普通氨基酸中的任何一种。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4623825B2 (ja) * 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド
EP1258531A1 (en) * 2001-05-14 2002-11-20 Givaudan SA Compounds and methods for inhibiting axillary malodour
US7630836B2 (en) * 2001-05-30 2009-12-08 The Kitasato Institute Polynucleotides
EP1846436B1 (en) * 2005-01-31 2012-09-12 Firmenich S.A. Inhibition of sweat malodour

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108135181A (zh) * 2015-09-04 2018-06-08 斯克利普斯研究院 定新型抗生素及相关组合物的方法

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