CN108135181A

CN108135181A - 定新型抗生素及相关组合物的方法

Info

Publication number: CN108135181A
Application number: CN201680058081.8A
Authority: CN
Inventors: 丹尼斯·W·沃兰; 安娜·欧文斯比
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 2015-09-04
Filing date: 2016-09-01
Publication date: 2018-06-08
Also published as: EP3344043A4; EP3344043A2; JP2018532384A; WO2017040762A2; WO2017040762A3; CA2997530A1; US20190144912A1

Abstract

本发明提供纯化的重组生成的细菌脂蛋白信号肽酶(Lsp)以及监测Lsp催化活性的体外测定法。本发明还提供了鉴定新型抗生素药剂的方法及其用于治疗细菌感染的治疗应用。本发明进一步提供了在治疗由细菌感染引起的疾病中可用作杀菌剂的特异性Lsp抑制化合物。

Description

定新型抗生素及相关组合物的方法

相关申请的交叉引用

本专利申请要求美国临时专利申请号62/214,695(2015年9月4日提交)的优先权。该优先申请的全部公开内容通过引用全部并入本文并用于所有目的。

背景技术

所有细菌都依赖于脂蛋白发挥多种重要作用，包括营养摄取，信号转导，细胞壁稳定性，粘附和毒力。共价脂质修饰将所有脂蛋白锚定在细菌细胞膜上，并且脂质附着过程完全取决于完整膜脂蛋白信号肽酶(Lsp)。Lsp代表了广泛和新型抗菌药物研发的重要靶标，因为它在整个细菌界(包括革兰氏阴性菌类群和革兰氏阳性菌类群)都高度保守，并且不存在人类同源物。后者的标准对于在对宿主给药时消除分子混杂和脱靶效应至关重要。这类分子特异性最好的例子是β-内酰胺抗生素青霉素，其靶向DD-转肽酶，这是一种限于细菌界的独特功能。尽管Lsp有许多特性使得该蛋白成为药物发掘中引人注目的靶标，但还没有报道过小分子抑制剂。

本领域迫切需要其它更好的药物来治疗细菌感染。本发明针对本领域中的这种需求和其他未实现的需求。

发明内容

一方面，本发明提供了用于测量脂蛋白信号肽酶(Lsp)的催化活性的测定系统的方法。该系统含有(a)重组表达的可溶的纯化的Lsp酶和(b)Lsp底物。在一些系统中，Lsp是细菌Lsp，如大肠杆菌Lsp。在一些实施方案中，Lsp表达为His-标记的融合蛋白。在一些实施方案中，Lsp用洗涤剂例如正十二烷基β-D-麦芽糖苷(DDM)溶解。在一些实施方案中，底物是含有脂质修饰的半胱氨酸残基的肽，肽模拟物或蛋白质。在一些实施方案中，底物用荧光共振能量转移(FRET)供体-受体对标记。

另一方面，本发明提供了鉴定抑制脂蛋白信号肽酶(Lsp)的药物的方法。这些方法包括(a)在存在测试化合物的情况下，使重组产生的纯化的Lsp与Lsp底物接触，和(b)检测一种或一种以上测试化合物对Lsp酶解底物的抑制作用。在一些实施方案中，Lsp是细菌Lsp，例如大肠杆菌Lsp。在一些实施方案中，Lsp表达为His-标记的融合蛋白。在一些实施方案中，Lsp用洗涤剂例如正十二烷基β-D-麦芽糖苷(DDM)溶解。在一些实施方案中，底物是含有脂质修饰的半胱氨酸残基的肽，肽模拟物或蛋白质。在一些实施方案中，底物用荧光共振能量转移(FRET)供体-受体对标记。在一些实施方案中，通过荧光共振能量转移来检测Lsp催化活性。在一些实施方案中，筛选以高通量形式进行。在一些实施例中，测试化合物是小的有机化合物。本发明的一些方法还涉及检查所鉴定药剂的杀菌活性。

另一方面，本发明提供了抑制微生物细胞(例如细菌)中Lsp催化活性的方法。该方法包括在允许Lsp抑制剂化合物抑制存在于所述细胞中的Lsp的条件下使所述微生物细胞与Lsp抑制剂化合物接触，其中所述Lsp抑制剂化合物为化合物BBS-8，化合物BBS-20或在图12中所示的化合物中的任意一种，例如化合物01000270728-1或其功能变体。在一些实施方案中，所述微生物细胞存在于受试者体内。在一些这种实施方案中，受试者患有微生物细胞的感染。

在相关方面，本发明提供了用于抑制微生物(例如细菌)生长并用于治疗受试者体内微生物感染(例如细菌感染)的方法。这些方法涉及对患有微生物感染的受试者施用包含治疗有效量的Lsp抑制剂化合物的药物组合物。在这些方法中，Lsp抑制剂化合物是化合物BBS-8，化合物BBS-20或图12所示的化合物中的任意一种，如化合物01000270728-1或其功能变体。在一些优选的实施方案中，所述受试者是人。

另一方面，本发明提供了生成能够在测定系统中测量催化活性的洗涤剂溶解的活性跨膜酶的方法。该方法包括(a)构建能够表达活性跨膜酶的表达载体；(b)通过表达表达出活性跨膜酶；和(c)在基于洗涤剂的系统中溶解并纯化活性跨膜酶。在一些这种方法中，所使用的跨膜酶是Lsp。在一些相关的实施方案中，本发明提供了根据这些方法产生的跨膜酶在测量酶的催化活性的测定中的用途。一些用途涉及用于鉴定细菌跨膜酶(例如Lsp)的特定抑制剂的高通量筛选。

另一方面，本发明提供了鉴定具有改进性质的Lsp抑制性化合物的方法。该方法包括(a)合成一种或一种以上先导Lsp抑制剂化合物的结构类似物；(b)对所述类似物进行功能测定以鉴定相对于上述先导化合物具有改进的生物或药学性质的类似物；从而鉴定具有改进性质的Lsp抑制性化合物。在一些实施方案中，所述先导Lsp抑制剂化合物是化合物BBS-8，化合物BBS-20或图12中所示化合物中的任意一种，例如化合物01000270728-1或其功能变体。在一些这种方法中，改善的生物或药学性质是增强的对Lsp催化活性的抑制作用。在一些方法中，功能测定使用洗涤剂溶解的纯化的Lsp酶。

通过参考说明书的其余部分和权利要求，可以实现对本发明的本质和优点的进一步理解。

附图说明

图1是Lsp FRET肽底物的示意图。

图2显示了10-板Maybridge HitFinder^TM分析的散点图。

图3显示40-板Maybridge HitFinder^TM分析的散点图。

图4显示Maybridge HitFinder^TM筛选中的命中化合物和Lsp活性的％抑制。

图5显示重复三次测量的Sharpless化合物文库的抑制作用。

图6显示了命中化合物BBS-8和BBS-20的结构。

图7显示BBS-20对Lsp的剂量依赖性抑制。

图8显示BBS-20通过非竞争机制抑制Lsp。

图9显示对用于产生功能变体的化合物BBS-20的一些修饰。

图10是超高通量筛选Lsp抑制剂中所使用的浓度和体积的示意图。

图11显示关于LSP初级滴定分析和对抗(counterscreen)筛选滴定测定结果的数据。图中A，B和C显示了LSP初级滴定测定分析和对抗筛选滴定测定以及两种分析中对照化合物的CRC的总体统计总结。图D是在滴定测定中所测试的344种化合物的聚类排序，其使用最大％反应对比聚类ID进行绘图。请注意，344个化合物中有55个类群，命中率最高的17个化合物以红色点显示。有代表性的命中率最高的化合物结构显示在每个类群的红点附近。

图12显示了在对抗筛选滴定测定中鉴定的以剂量依赖性方式抑制Lsp的化合物的实例。

图13显示了化合物SR-01000270728-1的合成和体外验证，并伴随有剂量依赖性分析。

具体实施方式

I.概述

尽管本领域的需求长期存在，但目前还没有Lsp特异性抑制剂。这可能归因于与活性跨膜酶的纯化和测定研发相关的巨大困难。本发明部分取决于本发明人研发的第一种用于整合膜蛋白酶的体外高通量筛选(HTS)。如本文详述的，发明人成功表达、纯化并溶解了大肠杆菌脂蛋白信号肽酶(Lsp)。本发明人还研发了基于荧光共振能量转移(FRET)监测Lsp切割活性的体外测定法。该测定使用了用荧光团标记的脂蛋白模拟肽底物和荧光猝灭剂。本发明人通过选择能够鉴定所有可能的抑制形式(即竞争性和非竞争性)的酶，底物和文库化合物浓度来优化HTS。此外，发明人对Maybridge HitFinder收藏中的15,000种化合物进行了临时试验筛选。另外对内部文库(“Sharpless化合物文库”)的筛选使先导化合物得以鉴定，其在体外功能测定中被验证为Lsp抑制剂。这些结果表明Lsp是药物发掘的可行靶标，并且该测定具有可重复性和稳固性，正如通过足够的信号背景比和远远高于统计学显著值0.5的Z-prime所强调的那样。作为对本文所述纯化的Lsp酶和体外筛选系统的用途的进一步验证，本发明人进一步对Lsp抑制剂进行超高通量筛选和验证测定。该筛选使用1,536孔形式并筛选了646,275种候选化合物的文库。如本文详述的，通过初级测定获得总共2,271种活性化合物。通过二级测定，发现约344种化合物显示选择性活性。通过进一步的合成和验证测定对示例性化合物的性质进行了确认。

根据这些研究，本发明提供了用于监测和定量Lsp酶活性的新型测定系统。本发明还提供了鉴定用于抑制Lsp酶活性和抑制细菌生长的新药的方法。这类药物提供可广泛用于治疗细菌感染的新型抗生素。本发明还提供了可用作针对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的杀菌剂的特异性Lsp抑制性化合物。本发明进一步提供了使用鉴定的Lsp抑制性分子作为先导化合物来鉴定具有改善的生物和/或药物性质的其他抗生素药物的方法。下文提供了制备和使用本发明组合物以及实施本发明方法的进一步指导。

II.定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。以下参考文献为技术人员提供本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(第2版，1994)；THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker编辑，1988)；以及Hale&Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY(1991)。另外，提供以下定义以帮助读者实施本发明。

术语“药剂”或“测试药剂”包括任何物质，分子，元素，化合物，实体或其组合。它包括但不限于例如蛋白质，多肽，小有机分子，多糖，多核苷酸等。它可以是天然产物，合成化合物或化学化合物，或两种或两种以上物质的组合。除非另有说明，术语“药剂”，“物质”和“化合物”可以互换使用。

术语“类似物”在本文中用于指结构上类似于参比分子但通过用替代取代基替换参比分子的特定取代基以定向和受控的方式修饰的分子。与参比分子相比，本领域技术人员预计类似物会表现出相同，相似或改进的效用。合成和筛选类似物，以鉴定具有改进特性(例如对靶分子的更高结合亲和力)的已知化合物的变体是药物化学中众所周知的方法。

术语“接触”具有其一般含义并且指将两种或两种以上药剂(例如多肽或小分子化合物)或组合剂与细胞(例如小分子和细胞)组合。接触可体外发生，例如，将两种或两种以上药剂组合或将测试药剂与细胞或细胞裂解物在试管或其他容器中组合。接触也可发生在细胞中或原位发生，或者发生在细胞裂解物中，在细胞中或原位发生的接触例如通过在细胞中共表达编码两种多肽的重组多核苷酸使两种多肽在细胞中接触。

EDANS，5-[(2-氨乙基)氨基]萘-1-磺酸，是研发基于FRET的核酸探针和蛋白酶底物最常用的供体之一。EDANS经常与基于FRET的探针中的DABCYL或DABSYL配对。它的荧光对环境敏感。Dabsyl(二甲基氨基偶氮苯磺酸)在绿色光谱中吸收并且经常与荧光素一起使用。它是暗猝灭剂，所述暗猝灭剂是从荧光团吸收激发能量并将能量以热量形式消散的物质。而典型的(荧光)猝灭剂将大部分能量以光线形式重新释放。在分子生物学中暗猝灭剂与荧光团结合使用。当两者紧密结合时(如在分子或蛋白质中)，荧光团的发射受到抑制。这种效应可用来研究分子几何结构和运动。

格罗泊霉素(globomycin)是抑制革兰氏阴性菌如大肠杆菌生长的环肽抗生素。参见例如Inukai等，J.Antibiot.31：410-420,1978。格罗泊霉素抑制Lsp并导致二酰甘油基前脂蛋白在内膜中积聚。因此，对胞壁前脂蛋白加工成脂蛋白的抑制作用导致革兰氏阴性菌对格罗泊霉素敏感。

如本文所用，IC₅₀是指达到酶活性最大抑制的一半的化合物浓度。

在两个核酸序列或氨基酸序列的上下文中，术语“相同”或“序列同一性”是指当在特定比较窗口上比对以达到最大对应性时两个序列中的残基相同。用于比较的序列比对方法在本领域中是公知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法进行；通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的比对算法进行；通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat.Acad.SciU.S.A.85:2444的相似性搜索方法进行；通过这些算法的计算机操作(包括但不限于Intelligentics,Mountain View,CA的PC/Gene程序中的CLUSTAL；以及WisconsinGenetics Software Package,Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,Wis.,U.S.A.中的GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA或TFASTA)。通常也通过检查和手动比对来进行比对。

术语“基本相同”的核酸或氨基酸序列是指通过使用上述程序(例如BLAST)用标准参数与参比序列相比，核酸或氨基酸序列包含具有至少90％序列或更高，优选至少95％，更优选至少98％并且最优选至少99％的序列同一性。优选地，基本相同存在于序列长度至少约50个残基，更优选至少约100个残基的区域，最优选地，序列在至少约150个残基上基本相同。在最优选的实施方案中，序列在编码区全长上基本相同。

细菌脂蛋白的特征在于它们的脂肪酰化氨基末端，通过脂肪酰化氨基末端将细菌脂蛋白锚定到脂质膜中。它们在细菌中具有多种生物学功能，例如维持细胞包膜结构(Lpp和Pal)，插入并稳定外膜蛋白(BamB)，吸收营养和金属(OppA和SitC)，蛋白质折叠(PrsA)，细菌素释放(BRP)以及粘附和侵入(OspC和Lmb)。占细菌蛋白质组2-3％的脂蛋白在细胞质中合成为前体蛋白，并含有称为脂质框(lipobox)的保守脂蛋白标签基序，所述脂质框使脂蛋白修饰机制得以识别。不变的半胱氨酸+1位成为修饰后的成熟蛋白的第一个氨基酸；-4至-1位残基作为信号肽的一部分被切掉。

通过三种膜结合酶的顺序作用将脂蛋白插入膜中并在膜上进行修饰。第一步由脂蛋白二酰基甘油基转移酶(Lgt)催化，其催化保守的半胱氨酸残基和衍生自膜磷脂酰甘油的二酰甘油(DAG)基团之间形成硫醚键。这导致硫醚连接的二酰甘油基-前脂蛋白和甘油磷酸酯作为副产物形成。在脂质附着之后，脂蛋白信号肽酶(Lsp)通过切割位于二酰基化半胱氨酸残基的氨基末端的二酰甘油基-前脂蛋白去除信号肽，使DAG-修饰的半胱氨酸作为新形成的载脂蛋白的新N端。第三种酶，脂蛋白N-酰基转移酶(Lnt)将另一酰基从膜磷脂转移到脂质修饰的半胱氨酸的新生成的α-氨基上，生成完全成熟的三酰化脂蛋白。酶Lgt和Lsp在所有类型的细菌中都是保守的，而Lnt仅存在于革兰氏阴性细菌和一些革兰氏阳性种中。已显示所有三种酶在大肠杆菌和其他革兰氏阴性菌的存活中发挥重要作用。相比之下，在革兰氏阳性细菌中，Lgt和Lsp似乎在至少一些被测试的放线菌[高鸟嘌呤+胞嘧啶(GC)含量物种]中是必需的，但在厚壁菌属(低GC含量物种)中则不是必需的。

脂蛋白信号肽酶(LSP)，也称为“前脂蛋白信号肽酶”，“信号肽酶II”，“胞壁质前-前导肽酶”和“前导肽酶II”，切割存在于前脂蛋白的脂化半胱氨酸残基之前的信号肽。例如，大肠杆菌Lsp是具有四个跨膜区的整合膜蛋白。其N端和C端都面向细胞质。包括大肠杆菌在内的19个菌种的II型信号肽酶中的两个保守天冬氨酸残基(枯草芽孢杆菌Lsp中的D102和D129)对于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和天蓝色链霉菌(S.coelicolor)的Lsp的活性都很重要。这两个天冬氨酸可能作为胃蛋白酶型天冬氨酸蛋白酶的催化双体发挥作用。大肠杆菌Lsp严格切割脂质修饰的半胱氨酸残基的N端的肽键，而来自一些革兰氏阳性菌的Lsp可能对底物具有较低的特异性或不同的识别模式。Lsp的酶活性可被环状缩酚酸肽抗生素格罗泊霉素非竞争性地抑制。

术语“调节(modulation)”或“调节(modulating)”是指化合物或其他药剂引起另一分子(例如Lsp酶)的生物学活性改变或引起由另一种分子(例如Lsp酶)介导的功能性反应改变的活性。术语“调节”是指靶分子的生物学活性或细胞活性(例如，酶促活性或信号传导活性)的变化。调节可以是上调(即激活或刺激)或下调(即抑制或压制)。例如，调节可引起靶酶(例如Lsp)的催化活性或靶分子介导的任何其他生物学活性或功能或介导的细胞或免疫学活性(例如酶与底物结合)降低方面的变化。作用模式可以是直接的，例如通过结合靶分子。该变化也可以是间接的，例如通过结合和/或修饰(例如酶促方式)另一调节靶分子的分子。

“纯化”是指物质(例如Lsp蛋白或其片段)已从其制造环境中移出。物质可以是部分纯化或基本纯化的，不需要完全(100％)纯。例如，本发明的Lsp蛋白质可以在重组合成后通过除去一些或全部未反应的化学物质，副产物，细胞碎片和其他组分进行纯化。如本文所用，“基本纯化的”或“基本纯的”是指所述物质至少75％，80％，85％，90％，95％或99％不含其他物质或组分。

术语“受试者”是指哺乳动物，特别是人类。它包括其他非人类动物，如牛，马，绵羊，猪，猫，狗，小鼠，大鼠，兔子，豚鼠，猴子。

分子的“变体”是指与整个分子或其片段在结构和生物学活性上基本相似的分子。因此，假设两个分子具有相似的活性，那么认为它们为变体，因为即使所述分子中的一个的组成或二级，三级或四级结构与在另一个中发现的组成或二级，三级或四级结构不同，或者如果氨基酸残基序列不同，在本文中仍使用该术语。如本文所用，功能变体或功能性衍生物是指与参比分子具有相似生物学功能(例如，催化功能)的参比分子(例如，Lsp酶)的变体。

III.重组产生的、溶解并纯化的Lsp蛋白

本发明提供了如本文所述重组产生的纯化和溶解的Lsp蛋白。如本文所例示的，一些纯化的Lsp蛋白是洗涤剂溶解的。本发明还提供了这些功能性Lsp酶在用于监测Lsp催化活性的测定系统中的用途。Lsp在各种细菌，支原体和古细菌物种中表达。根据本文所述的方法可以表达和纯化来自任何这些物种的Lsp。在一些优选的实施方案中，本发明实践中使用的Lsp来自细菌，包括G⁺和G-两种细菌，在许多菌种中Lsp是很保守的。这些菌种包括例如大肠杆菌和肠杆菌属，假单胞菌属，分枝杆菌，李斯特菌，链球菌和葡萄球菌的菌种。来自许多菌种的Lsp的序列和结构在本领域中都是已知的并已被表征。参见，例如，Innis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3708-3712,1984；Isaki等，J.Bacteriol.172：469-472，1990；Reglier-Poupet等人，J.Bacteriol.158：632-635,2003；Sander等人，Mol.Microbiol.52：1543-1552,2004；Witke等人，FEMS Microbiol.Lett.126：233-239,1995；De Greeff等,Microbiol.149：1399-407,2003；Zhao等人,FEBS Lett.173:80-84,1992。在本领域中也可获得各种Lsp酶的结构信息的其它描述。这些包括来自R.typhi伤寒沙门氏菌(Rt)(GenBank登录号NC_006142)，R.prowazekii(Rp)(GenBank登录号AJ235271)，R.bellii(Rb)(GenBank登录号NZ_AARC01000001)，R.canadensis(Rcan)(GenBank登录号NZ_AAFF01000001)，R.akari(Ra)(GenBank登录号NZ_AAFE01000001)，R.ororii(Rc)(GenBank登录号NC_003103)，R.sibirica(Rs)(GenBank登录号AABW01000001)，R.rickettsii利什曼原虫(Rr)(GenBank登录号NZ AADJ01000001)，R.felis弗氏利斯特氏菌(Rf)(GenBank登录号NC_007109)和大肠杆菌(Ec)(GenBank登录号X00776)的Lsp的序列。任何这些Lsp序列或与其基本相同的序列都可用于生产本发明中的重组Lsp或变体。

本领域众所周知的分子生物学和生物化学的一般技术(例如PCR和亲和层析)可用于克隆，表达和纯化本发明的Lsp蛋白质。例如在Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press(第3版，2001)；以及Brent等，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.(ringbou ed.，2003)中描述了这种常规实践的方法和技术。然而，本发明人研发了用于表达和纯化功能性可溶Lsp酶的一些具体方案，并在本文的实施例中详细描述。以大肠杆菌Lsp为例，可以首先通过菌落PCR克隆其编码序列来生成全长蛋白质。大肠杆菌Lsp编码序列在本文的SEQ ID NO：3中显示。为了便于随后的纯化，Lsp可过表达成具有适当标签的融合蛋白。如本发明人在大肠杆菌Lsp发现，N端His-标签极大地促进了Lsp表达和纯化。这可用合适的表达载体和宿主细胞系，例如pET19b载体和大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Agilent)细胞容易地实现。除本文中例示的N端His-标签外，本发明的重组表达和纯化策略还可利用C端His-标签，可类似地通过蛋白水解来切割该C端His-标签。过表达之后，细胞裂解并且可使用合适的试剂溶解膜蛋白。发现一些特定的洗涤剂(例如正十二烷基β-D-麦芽糖苷(DDM))使蛋白质达到最优溶解以确保纯化和维持其结构完整性。如本文所例示的，本文所述的蛋白质表达和纯化方案(包括使用N端His标签和增溶洗涤剂)能够通过亲和柱和凝胶过滤层析有效纯化蛋白质。这也生成保留酶活性的纯化的完整的可溶性膜蛋白Lsp。

由于Lsp在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中高度保守，因此可以容易地应用相同的重组表达和纯化方案从多种其他菌种获得可溶的功能性重组Lsp蛋白。因此，除了大肠杆菌Lsp酶，可类似地，如本文对大肠杆菌Lsp所述的，将来自任何其他种的Lsp蛋白克隆到pET载体(例如，pET19b)中并进行纯化。

事实上，本发明人也克隆并表达来自许多其他种的Lsp酶。例如，如本文所说明的，为大肠杆菌Lsp研发的同样方案已成功用于克隆，表达和纯化来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)和海栖热袍菌(Thermotoga maritima)中的Lsp。具体而言，通过NdeI和XhoI克隆位点将编码序列(SEQ ID NO：4)克隆到载体pET23b中来将酿脓链球菌菌株M1GAS的Lsp蛋白表达和纯化为C端His ₆标记的融合物。类似地，通过NdeI和BamHI克隆位点将编码序列(SEQ ID NO：5)克隆到载体pET19b中来将来自海栖热袍菌菌株MSB8的Lsp表达和纯化为N端His₆标记的蛋白。

IV.溶解膜蛋白的测定系统和筛选方法

本发明提供了利用如本文针对Lsp举例说明的洗涤剂溶解的活性酶的测定系统。所述测定系统和相关的筛选方法可用于测量许多其他膜蛋白的催化活性并用于筛选其调节剂。除了涉及本文所述的细菌脂蛋白生物发生的酶(包括Lsp)外，本领域已知的许多其他膜酶也可适用于本发明的测定系统和筛选方法。实例包括水解酶，磷脂酶(例如磷脂酶A和C)，胆固醇氧化酶，脂氧合酶，类胡萝卜素加氧酶，铁螯合酶，乙醇酸氧化酶，糖基转移酶等。利用本领域熟知的适合这些酶的底物，这些酶中的每一种可以类似于本文例举的Lsp的测定系统和筛选方法的系统和方法进行检测。

为了获得测定系统或实施筛选方法，通常首先生成表达构建体，其能够表达如本文针对Lsp举例说明的活性跨膜酶。随后通过表达构建体表达活性跨膜酶。然后将表达的跨膜酶在基于洗涤剂的系统中溶解并纯化，这使洗涤剂溶解的活性跨膜酶得以形成。然后可以本发明的测定系统或筛选方法使用洗涤剂溶解的功能性酶来测量特定催化活性。如本文对Lsp所说明的，所述测定系统可用于测量洗涤剂溶解的酶的催化活性。在一些实施方案中，洗涤剂溶解的酶用于高通量筛选以鉴定酶的特异性抑制剂。如本文所述，这些抑制剂可从各种候选化合物，例如小分子，肽，多肽或其嵌合形式中鉴定出来。本发明的一些实施方案使用如本文所例示的洗涤剂溶解的Lsp，以筛选具有抗微生物活性的Lsp的特异性抑制剂。

作为举例说明，本发明提供了使用本文所述的洗涤剂溶解的活性Lsp酶来监测Lsp催化活性的测定系统。除了重组产生的纯化的Lsp蛋白之外，该测定系统通常还含有Lsp底物和任选地可检测底物上酶的催化事件的方法。底物可以是可被Lsp的酶促功能识别和特异性切割的任何肽，多肽或肽模拟物。底物通常含有Lsp切割位点，即脂化半胱氨酸残基。在一些实施方案中，底物与标记基团结合，这使切割事件得以被检测到。标记基团可以是在底物中切掉后发生改变的具有荧光性质的分子，或荧光共振能量转移(FRET)化合物的配对的供体-受体对。在一些实施方案中，荧光供体基团和荧光受体基团对在Lsp切割位点的相对侧上连接至底物肽，从而通过检测荧光共振能量转移来监测底物的切割。监测可包括检测荧光受体基团的激发和/或发射最大值的变化，该变化是由于通过Lsp肽酶活性使荧光受体基团从底物中释放而引起的。

在一些实施方案中，通过荧光共振能量转移(FRET)测定监测由标记的底物肽的切割产生的荧光信号来检测和定量Lsp催化活性。FRET是一种非辐射过程，该过程为当供体和受体具有重叠的发射/吸收光谱(伴随合适的取向和距离(例如，在的范围内))时，来自供体的能量被转移给受体。本领域已知的任何荧光共振转移能量对(荧光团和荧光猝灭剂)均可用于标记Lsp肽底物。在一些优选的实施方案中，测定系统可利用如本文所例示的用EDANS和Dabsyl的FRET供体-受体对标记的底物肽模拟物。除了这些示例性标记之外，本领域已知的其他FRET供体-受体对也可用于本发明的实践中。例如，绿色荧光蛋白(GFP)是一种自发荧光蛋白，已作为融合蛋白的优异报告子组件被普遍采用。GFP最重要的特征是GFP变体已经显示出可用作FRET的供体和受体的优越的光谱性质。原始的荧光蛋白对是具有相对低的量子产率，容易漂白和高自发荧光背景的蓝色荧光蛋白(BFP)供体和GFP受体(Heim，Methods Enzymol.，302：408-423,1999)。作为改进，具有较长波长的GFP突变体对，即青色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)已显示具有更好的FRET效率(参见例如Miyawaki等，Nature 388：882-887,1997)。另外，来自珊瑚的红色荧光蛋白也被克隆并与YFP配对以产生红移的激发和发射峰(参见例如Mizuno等，Biochemistry，40：2502-2510,2001)。可用于实施本发明的FRET供体-受体对的其它实例包括氨基苯甲酸和硝基酪氨酸；7-甲氧基-3-氨基甲酰基-4-甲基香豆素和二硝基苯酚；或7-二甲基氨基-3-氨基甲酰基-4-甲基香豆素和二甲氨基偶氮苯甲酰(dabsyl)。

在相关方面，本发明提供了用于鉴定能够抑制Lsp酶活性的药剂的筛选方法。根据本发明，细菌Lsp的新型抑制剂通常以高通量筛选(HTS)形式体外鉴定。筛选方法利用上述测定系统，并在测试药剂或候选化合物存在下监测Lsp催化活性，所述测定系统包含纯化的Lsp酶，如大肠杆菌Lsp(或功能变体或片段)和脂化蛋白质或肽底物。为了使酶活性得以检测，可以用荧光团和荧光猝灭剂标记底物。基于荧光共振能量转移(FRET)量化Lsp切割活性。如本文所例示的，Lsp酶被洗涤剂溶解以促进对底物蛋白或肽模拟物的催化反应。除了用于实施下面详述的筛选方法的具体方案之外，本发明的筛选方法可以使用本领域公知的各种常规生物化学和分子生物学技术或测定法。这些技术描述于例如Handbook of DrugScreening，Seethala等人(编)，Marcel Dekker(第1版，2001)；High ThroughputScreening：Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology，190)，Janzen(编)，Humana出版(第1版，2002)；Current Protocols in Immunology，Coligan等(编)，JohnWiley&Sons Inc.(2002)；Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor出版(第2版，2001)；和Brent等，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，Inc.(ringbou编，2003)。

如本文实施例3和4所例示的，本发明人研发的高通量筛选形式允许通过在存在测试药剂库的每一成员的情况下同时进行Lsp催化测定来鉴定Lsp调节剂。通过在存在测试药剂的情况下检测下调的Lsp催化活性，然后可以从测试药剂中获得潜在的或候选的Lsp抑制剂。为了成为候选Lsp抑制剂，下调的Lsp活性通常应该代表与在不存在任何测试化合物时进行的测定获得的基线Lsp活性的显著差异。由于化合物之间的固有差异和实验误差，如果确定的水平落在通常用已知对Lsp酶功能无影响的对照化合物观察到的范围之外，则认为偏离基线水平或活性是显著的。例如，在一些方法中，如果确定的水平不在对照化合物水平的平均值加一个标准误差范围内，则认为偏离是显著的。通常，如果测量的水平与基线水平之间的差异至少为20％，30％或40％，则会发生显著偏差。优选地，所述差异至少为50％或60％。更优选地，所述差异大于至少70％或80％。最优选地，所述差异至少为90％。确定的值与标准或对照化合物的基准值之间的偏离程度还提供了所鉴定的命中化合物的可能的可靠性或抑制功能的指标。在一些实施方案中，筛选方法还可在筛选测定中使用已知的Lsp抑制剂(例如格罗泊霉素)作为阳性对照以评估所鉴定的命中物的可能活性。

一旦命中化合物通过初始筛选被鉴定出来，它们通常可经过进一步筛选或功能验证。因此，在一些实施方案中，如本文针对化合物BBS-8和BBS-20(图6)和化合物SR-01000270728-1(图14和15)所例示的，可在体外进一步测试命中化合物抑制Lsp酶活性的能力。在一些实施方案中，可检测通过这种体外验证的命中化合物的杀菌活性。这可用高通量测定来进行，该测定敏感得足以检测由于与化合物接触而被杀死的细胞。在一些实施方案中，可以使用具有G⁺和G^-两种菌种的实验组通过熟知的杀伤曲线测定来检测候选Lsp抑制剂的杀菌活性。参见例如Sanfilippo等人，Chemother.18：297-303,1973。在一些实施方案中，细菌杀伤可通过经由适当手段检测一个或一个以上生存力指标来检测。所述生存力指标可以是任何可用于区分活细胞与死细胞，或区分受损但活着的细胞与未受损并活着的细胞的信号。在一些实施方案中，所述生存力指标通过监测与细胞生存力指标相关的光学信号来检测。例如，基于荧光的测定可用于评估细菌生存力。这些测定中的一些使用核酸染色来区分活细胞和死细胞。许多测定和使用的染色剂可通过商业方式获得，例如来自MolecularProbes(Eugene，Oregon)的LIVE/DEAD BacLight细菌存活试剂盒和来自Promega的BacTiter-Glo^TM测定。本领域描述了用于检测本发明的Lsp抑制性化合物的杀菌活性的其它测定法，例如Roth等人，Appl.Environ.Microbiol.63：2421-243，1997。

在一些实施方案中，可以进一步筛选鉴定的候选抑制剂抑制其它催化细菌脂蛋白生物发生的酶的能力。例如，可测试鉴定的候选Lsp抑制剂抑制脂蛋白二酰基甘油基转移酶(Lgt)的酶促功能的能力。可选地，可以在检测Lsp抑制功能之前首先就Lgt抑制药剂方面筛选测试化合物。在一些实施方案中，可就抑制Lgt和Lsp两者的活性方面同时筛选测试化合物。可进一步分析具有这种双重抑制活性的候选化合物的杀菌功能。在一些其他实施方案中，通过初始筛选鉴定的候选Lsp抑制化合物可例如通过合理设计进行修饰以产生具有改善的或期望的生理化学或药学性质的类似物或衍生化合物。然后可将此类似物或衍生化合物进行本文所述的后续筛选或进一步功能性检测。

除了完整Lsp分子或编码完整Lsp分子的核酸之外，具有基本相同序列的Lsp功能片段(例如带有底物结合结构域和催化结构域的片段)，类似物，衍生物或变体蛋白也可用于本发明的筛选方法中。可用于这些测定的Lsp片段通常保留Lsp分子的一种或一种以上生物学活性(例如其肽酶活性)。如上所述，来自不同种的Lsp已被测序并被充分表征，包括对酶活性位点的描绘。参见例如Jjalsma等，J.Biol.Chem.274:28191-28197,1999。因此，可以使用本领域公知的方法容易地获得适用于本发明的它们的片段，类似物，衍生物或融合蛋白。例如，Lsp的功能性衍生物可由本文所述的重组产生的Lsp蛋白经由蛋白水解切割，然后通过本领域技术人员已知的常规纯化步骤来制备。可选地，功能衍生物可由重组DNA技术通过仅表达保留其底物结合和酶活性的Lsp片段来产生。

V.测试化合物

可用本发明方法筛选的测试化合物或候选药剂包括小分子有机化合物，多肽，β-转角模拟物，多糖，磷脂，激素，前列腺素，类固醇，芳香族化合物，杂环化合物，苯并二氮杂，低聚物N-取代的甘氨酸，低聚氨基甲酸酯，多肽，糖类，脂肪酸，类固醇，嘌呤，嘧啶，其衍生物，结构类似物或组合。一些测试药剂是合成分子，而另一些是天然分子。

测试药剂可从各种来源获得，包括合成或天然化合物文库。组合文库可就可以逐步合成的许多类型的化合物方面而生成。许多小有机分子文库是公开的或商业上可获得的，或者可用于药物筛选。实例包括Maybridge HitFinder文库(Thermo Fisher)，分子文库小分子库(NIH)和来自Selleckchem(Boston，Massachusetts)的几种小分子化合物文库。这样的文库也可如本领域所述合成，例如Carell等人，Chem&Biol.2:171-183,1995。还可通过“DNA编码的化学文库”(DEL)或“编码的合成文库”(ESL)方法构建小分子化合物的大组合文库。这是一种用于合成和筛选前所未有规模的小分子化合物的技术。DEL用于医药化学，以连通组合化学领域和分子生物学领域。在WO 95/12608，WO 93/06121，WO 94/08051，WO 95/35503和WO 95/30642中描述了构建DEL文库的详细步骤。肽文库也可通过噬菌体展示方法产生(参见例如Devlin，WO 91/18980)。细菌，真菌，植物和动物提取物形式的天然化合物文库可从商业来源获得或在该领域中收集。已知的药理学试剂可进行定向或随机化学修饰，例如酰化，烷基化，酯化，酰胺化以产生结构类似物。

小分子，肽或其他化合物的组合文库可以完全随机化，化合物中没有优选的基团或在任何位置没有优选的序列偏好或优选常数。可选地，所述文库可以是有偏好性的，即有机化合物中的一些基团或肽序列内的一些位置保持恒定。例如，在一些情况下，核苷酸或氨基酸残基在一类特定的如疏水性氨基酸，亲水性残基，空间位置偏好性(小或大)残基范围内被随机分布，有助于生成用于交联的半胱氨酸，生成适合于SH-3结构域的脯氨酸，生成适合于磷酸化位点，或者嘌呤的丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸或组氨酸。

测试药剂可以是天然存在的蛋白质或其片段。这样的测试药剂可从天然来源(例如细胞或组织裂解物)获得。多肽药剂库也可例如通过可商购的cDNA文库或通过常规方法产生的cDNA文库制备。测试药剂还可以是肽，例如约5至约30个氨基酸的肽，其中约5至约20个氨基酸的肽是优选的，约7至约15个氨基酸的肽是特别优选的。这些肽可以是天然存在的蛋白质的消化物，随机肽或“偏好的”随机肽。在一些方法中，测试药剂是多肽或蛋白质。测试药剂也可以是核酸。核酸测试药剂可以是天然存在的核酸，随机核酸或“偏好的”随机核酸。例如，原核或真核基因组的消化物可以类似于如上对蛋白质所描述的那样使用。

在一些优选的方法中，所述测试药剂是小分子，例如分子量不超过约500或1,000的分子。优选地，调整高通量测定法并将其用于筛选这样的小分子。在一些方法中，如上所述的小分子测试药剂的组合文库可以容易地用于通过本文所述的测定系统筛选Lsp的小分子调节剂。本领域还提供了筛选小分子化合物的组合文库的一些通用指导。参见例如Schultz等，Bioorg.Med.Chem.Lett 8:2409-2414,1998；Weller等人，Mol.Divers.3:61-70,1997；Fernandes等人,Curr.Opin.Chem.Biol.2：597-603,1998；和Sittampalam等，Curr.Opin.Chem.Biol.1：384-91,1997。适用于本发明的高通量筛选方法的示例性小分子化合物文库在下面的实施例4中描述。

在一些实施方案中，用于本发明筛选方法中的测试药剂是由已知化合物生成的类似物或衍生化合物。例如，所述测试药剂可以是格罗泊霉素的衍生物或类似物。格罗泊霉素是Lsp抑制剂。格罗泊霉素是由几种链霉菌属菌种生成的肽类抗生素，通过抑制Lsp而抑制革兰氏阴性菌。已经显示格罗泊霉素衍生物对革兰氏阳性菌具有有效活性。在一些其他实施方案中，测试药剂可以是衍生自本文鉴定的特定Lsp-抑制化合物的类似物，例如化合物BBS-8，化合物BBS-20或图12中所示的化合物中任意一种，如化合物01000270728-1。根据以下提供的公开内容可制备基于这些基础化合物的类似物或衍生化合物。典型地，筛选已知化合物的类似物或衍生化合物以鉴定相比已知化合物具有改善的生物学或药物性质的药剂。

也可以基于Lsp酶，其片段或类似物的结构研究生成待用所要求保护的方法筛选的测试药剂库。这样的结构研究使很可能结合Lsp多肽的测试药剂得以鉴定。可用多种方式研究Lsp多肽的三维结构，例如晶体结构和分子建模。使用X射线晶体学研究蛋白质结构的方法在文献中是众所周知的。参见Physical Bio-chemistry，Van Holde，K.E.(Prentice-Hall，New Jersey 1971)，第221-239页和Physical Chemistry with Applications tothe Life Sciences，D.Eisenberg和D.C.Crothers(Benjamin Cummings，MenloPark1979)。Lsp多肽结构的计算机建模为设计用于筛选Lsp抑制剂的测试药剂提供了另一方法。文献中描述了分子建模方法，例如，名称为“System and method for molecularmodeling utilizing a sensitivity factor”的美国专利5,612,894和名称为“Molecularmodeling method and system”的美国专利5,583,973。另外，蛋白质结构也可以通过中子衍射和核磁共振(NMR)来确定。参见例如Physical Chemistry，第四版，Moore，W.J.(Prentice-Hall，New Jersey1972)和NMR of Proteins and Nucleic Acids，K.Wüthrich(Wiley-Interscience，New York 1986)。

VI.性质改进的新型Lsp抑制剂及其类似物

用于监测和定量Lsp催化活性的本发明的体外测定系统使发明人能够鉴定新的Lsp抑制化合物。通过试验性筛选鉴定的这种新型Lsp抑制化合物的两个实例是3-(4-((8R，9S，13S，14S)-3-((氟磺酰基)氧)-17-羟基-13-甲基-7,8，9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊二烯并[a]菲-17-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-N，N，N-三甲基丙-1-铵(本文中也称为“BBS-8”)和2-(4-(2-(二乙基氨基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-N-(((1R，4aS，10aR)-7-异丙基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a，9,10,10a-八氢菲-1-基)甲基)乙酰胺(本文中也称为“BBS-20”)。如实施例中详述的，通过使用不同浓度的化合物来评估它们对Lsp催化功能的抑制作用，来进一步体外验证经由筛选鉴定的这两个命中物。如本文实施例4中详述的，通过进一步超高通量筛选方式获得大量额外的Lsp抑制剂化合物。在通过筛选鉴定的活性化合物中，一些化合物的选择性Lsp抑制活性通过二级测定来证实(图12)。这些额外的Lsp抑制剂之一，化合物SR-010000270728-1，表现出优异的功能特征和结构性质(图13)。本文中鉴定的一些其他Lsp抑制剂的Lsp抑制活性在图4和14中显示。本发明的特定Lsp抑制化合物，它们的类似物和功能性衍生物或变体可全部用作本文所述的抗菌剂或治疗剂。

通过发现本文所述的先导Lsp抑制性化合物以及体外Lsp测定系统的可用性，本发明提供了用于鉴定具有改进性质的已知Lsp抑制化合物的类似物或衍生物的筛选方法。药物发掘过程中的一个重要步骤是选择合适的先导化学模板作为化学模拟程序的基础。鉴定给定分子靶标的先导化学模板的过程通常涉及以功能测定筛选大量化合物(通常超过100,000)，根据用于确认活性的二级分析中的测试的一些任意的活性阈值选择子集，然后评估剩余的活性化合物是否适合化学加工。

本文所述的Lsp抑制化合物(例如图4,6和14中所示的化合物)以及其它已知的Lsp抑制剂(例如格罗泊霉素)提供了先导化合物以寻找具有改进的生物学或药物性质的相关化合物。例如，可以筛选这些化合物的类似物或衍生物以鉴定对Lsp具有更高亲和力，更好的抑制特征或增强的体外或体内稳定性的化合物。具有这种改进性质的化合物可能更适合于各种药物应用。在其他实施方案中，这样的类似物或衍生化合物可用作本发明第二轮或后续轮次筛选方法中的测试药剂。

这些方法通常涉及合成已知Lsp抑制剂(例如化合物SR-010000270728-1，化合物BBS-8或BBS-20)的类似物，衍生物或变体。通常，制备Lsp抑制剂的结构类似物文库用于筛选。然后进行功能测定以鉴定一种或一种以上相对于先导化合物具有改善的生物学性质的类似物或衍生物，所述类似物或变体衍生自所述先导化合物。在一些实施方案中，筛选抑制Lsp催化活性的能力增强的类似物。在一些实施方案中，可以测定所述类似物以鉴定具有更好的药物性质(例如稳定性)的化合物。

为了基于已知或当前描述的Lsp抑制剂的化学骨架合成类似物或衍生物，仅需要本领域普通技术人员熟知的常规实践的有机化学方法。在一些实施方案中，已知化合物的类似物可以通过根据如在例如Rostovtsev等人，Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599,2002；和Himo等人，J.Am.Chem.Soc.127:210-216,2005中描述的常见“点击”化学修饰化合物生成。举例来说，可对化合物BBS-20进行一些修饰以生成图9所示的类似物或衍生化合物。在一些实施方案中，已知化合物的化学类似物的组合文库可使用上述方法产生。用于合成各种化合物的类似物的示例性方法在例如以下文献中描述：Overman，Organic Reactions，第1-62卷，Wiley-Interscience(2003)；Broom等人，Fed Proc.45：2779-83,1986；Ben-Menahem等，Recent Prog。HORM.RES.54：271-88,1999；Schramm等人，Annu.Rev.Biochem.67：693-720,1998；Bolin等，Biopolymers 37：57-66,1995；Karten等人，Endocr.Rev.7：44-66,1986；Ho等人，Tactics of Organic Synthesis，Wiley-Interscience；(1994)；和Scheit等人，Nucleotide Analogs：Synthesis and BiologicalFunction，John Wiley&Sons(1980)。

此外，可以使用常规实施的测定法(例如结合测定法)中的任意一种来鉴定Lsp抑制剂的类似物或衍生物中的改善的性质(例如对Lsp的结合亲和力增强或抑制特征增强)。可以使用的其它生物化学或药物测定法也是本领域公知并常规实施的。例如，类似化合物的改善的稳定性可以使用例如Di等人，Comb.Chem.High Throughput Screen.11：469-76，2008；和Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Co.(1990)中描述的那些方法进行测定。

VII.治疗应用

本发明针对Lsp抑制剂的HTS测定法能够鉴定对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有有效杀菌活性的新型抗生素药剂。实际上，显示通过非竞争性机制抑制Lsp(就像本文中例示的化合物BBS-20一样)的天然存在的环状肽格罗泊霉素具有杀菌性。因此，本文所述的特定Lsp抑制化合物(例如化合物BBS-8，化合物BBS-20或图12中所示化合物中的任意一种如化合物01000270728-1)以及它们的类似物或功能变体(例如，图9中所示的化合物)可用于各种治疗应用。在一些实施方案中，这些化合物可用于抑制微生物细胞(例如细菌)中的Lsp催化活性或抑制微生物生长。所述微生物细胞可以体外或体内存在(在受试者中)。在一些实施方案中，本发明提供了治疗各种受试者的细菌感染和治疗由微生物感染引起或介导的疾病和病症的方法。本发明的一些实施方案涉及治疗与细菌感染有关或相关的疾病的方法。

适合用本发明的Lsp调节性化合物治疗的疾病或病症包括表达Lsp酶的任何细菌或其它微生物(例如葡萄球菌属物种或芽孢杆菌属物种)感染受试者，特别是感染人受试者。由细菌感染引起或与细菌感染有关的人类疾病的具体例子包括例如肺结核(由结核分枝杆菌引起)，肺炎(由链球菌和假单胞菌引起)，胃炎和溃疡(由幽门螺杆菌引起)，食源性疾病(由诸如大肠杆菌，志贺氏菌，弯曲杆菌和沙门氏菌之类的细菌引起)，淋病(由淋病奈瑟菌引起)，脑膜炎(由脑膜炎奈瑟菌引起)，破伤风，伤寒，白喉，梅毒和麻风病。

Lsp抑制性化合物可用于治疗作为任何致病细菌的携带者的受试者。它们可用于治疗被诊断患有活性细菌感染的受试者。这些化合物也可用于治疗或预防这些受试者体内与细菌感染相关的病症。尚未被诊断为患有细菌感染相关疾病(例如狼疮)但被认为感染了致病细菌并有发生该疾病风险的受试者也适合用本发明的Lsp抑制性化合物治疗。

本发明的Lsp抑制剂可以在无菌条件下直接施用于待治疗的受试者。这些化合物可以单独施用或作为药物组合物的活性成分施用。本发明的治疗组合物也可与用于治疗细菌感染的其它治疗剂(例如，其他已知抗生素)组合或联合使用。在一些应用中，第一Lsp抑制剂与第二Lsp抑制剂组合使用，以单独使用一种Lsp抑制剂时无法达到的更广泛的程度抑制细菌感染。在一些其他应用中，本发明的Lsp-调节化合物可与已知的抗生素药剂(如青霉素)联合使用。

本发明提供了衍生自本文所述的特异性Lsp抑制剂或其功能性衍生物的药物组合物。本发明的药物组合物通常包含至少一种作为活性成分的Lsp特异性抑制剂。所述组合物还可任选地含有一种或一种以上其可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，本发明药物组合物的活性成分由本文所述的Lsp抑制性化合物组成或基本上由本文所述的Lsp抑制性化合物组成。药学上可接受的载体增强或稳定所述组合物，或促进所述组合物的制备。药学上可接受的载体在某种程度上由正施用的特定组合物(例如，核酸，蛋白质或小分子)以及用于施用所述组合物的特定方法确定。从与其他成分相容并且对受试者无害的意义上来说，它们也应该是药学上和生理学上可接受的。取决于给药所需的制剂形式，例如口服，舌下，直肠，鼻腔，静脉内或肠胃外，该载体可以采取多种形式。例如，Lsp抑制化合物可以在施用之前与载体蛋白例如卵清蛋白或血清白蛋白复合，以增强稳定性或药理学性质。

药物组合物可以以各种形式制备，例如颗粒剂，片剂，丸剂，栓剂，胶囊剂等。制剂中治疗活性化合物的浓度可为0.1至100重量％。治疗制剂通过药学领域众所周知的任何方法制备。治疗制剂可通过可用于治疗的任何有效方式递送。参见例如Goodman&Oilman的ThePharmacological Bases of Therapeutics，Hardman等人编，McGraw-Hill Professional(第10版，2001)；Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Gennaro(编)，Lippincott Williams&Wilkins(第20版，2003)；和Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems，Ansel等人(编)，Lippincott Williams&Wilkins(第7版，1999)。

治疗制剂可以单位剂量形式方便地提供并且以合适的治疗剂量施用。合适的治疗剂量可以通过众所周知的方法中的任意一种来确定，例如对哺乳动物物种临床研究以确定最大可耐受剂量，以及对正常人受试者临床研究以确定安全剂量。除了在可能需要更高剂量时的某些情况下，Lsp抑制性化合物的优选剂量通常在每天约0.001mg至约1000mg，更通常地，约0.01mg至约500mg的范围内。

Lsp抑制剂的优选剂量和给药方式对于不同的受试者可以不同，取决于可以由治疗医师单独评估的因素，例如待治疗的病症或多种病症，待施用的组合物的选择(包括特定的Lsp抑制剂)，个体受试者的年龄，体重和反应，受试者症状的严重程度以及所选择的给药途径。作为一般规则，施用的Lsp抑制剂的量是有效且可靠地预防或最小化受试者症状的最小剂量。因此，上述剂量范围旨在为本文的教导提供一般指导和支持，但无意限制本发明的范围。

实施例

提供以下实施例来说明，但不限制本发明。

实施例1：脂蛋白信号肽酶(Lsp)的表达和纯化

我们研发了获得重组产生并溶解的功能性Lsp酶的策略。使用正向引物CGCCATATGAGTCAATCGATCTGTTCAACAG(SEQ ID NO：1)和反向引物CGCGGATCCTTATTGTTTTTTCGCTTTAGAAGGTAAAAAACC(SEQ ID NO：2)用大肠杆菌K12的菌落PCR生成全长大肠杆菌Lsp克隆，并通过双链质粒测序验证。然后我们在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞(Agilent)中用pET19b载体(Agilent)将Lsp蛋白过表达为N端His标签融合物。具体而言，细胞在37℃下，在补充有100μg/ml羧苄青霉素和35μg/ml氯霉素的2xYT培养基中生长至OD_600nm为0.6。然后将烧瓶转移至16℃，并用0.1mM IPTG过夜诱导蛋白表达。收集细胞并重悬于冰冷裂解缓冲液(PBS，5％v/v甘油，pH 7.4，补充有1mg/ml溶菌酶，0.1mg/ml DNA酶，1mM MgCl₂，1mM CaCl₂)中并进行2轮微射流(Microfluidics)裂解。

为了溶解膜蛋白，添加正十二烷基β-D-麦芽糖苷(DDM)以达到终浓度0.8％w/v，并且将裂解物在4℃下搅拌2小时。加入洗脱缓冲液(PBS，5％甘油，0.1％DDM，500mM咪唑，pH7.4)至咪唑终浓度为20mM。然后将未澄清的裂解物上样至1ml HisTrap FF粗Ni-NTA亲和柱(GE)。用洗涤缓冲液(PBS，5％甘油，0.1％DDM，20mM咪唑，pH7.4)预平衡柱子，并用20个柱体积的线性梯度洗脱。立即将洗脱的蛋白质在PBS，5％甘油，0.1％DDM，pH 7.4中进行凝胶过滤层析(Superdex 200，GE)。含有Lsp的部分用甘油补充至终浓度为20％，在液氮中冷冻并储存于-80℃。通过SDS-PAGE评估，我们确定纯Lsp产量约为1mg/L培养物，纯度>95％。

除了大肠杆菌Lsp之外，我们还克隆并表达了来自多个菌种的Lsp，因为该蛋白质在“革兰氏阳性”和“革兰氏阴性”种中均高度保守。使用为大肠杆菌Lsp研发的相同策略，我们克隆，表达和纯化了来自酿脓链球菌和海栖热袍菌中的Lsp。结果表明，所有的Lsp蛋白，不管种类如何，都可以如对于大肠杆菌Lsp所描述的那样类似地克隆至pET载体(例如，pET19b)中并进行纯化。

实施例2.Lsp FRET底物的合成

Lsp FRET肽底物序列Dabsyl-VTGC((R)-2,3-二(棕榈酰氧)-丙基)AKD(EDANS)(图1)基于来自酿脓链球菌的推定酸性磷酸酶的脂框区(NCBI参考序列：NP_269874)。在用重组纯化的大肠杆菌Lsp的测定中选择该序列以提供最大的信号背景比，所述重组纯化的大肠杆菌Lsp来自基于已知脂蛋白序列或普通脂框残基排列的不同长度的脂蛋白模拟肽文库。使用FRET荧光供体和受体对EDANS/Dabsyl，在NovaSyn TGR树脂(EMD Millipore)上用标准Fmoc固相合成化学合成肽。具体而言，根据Hida等人，J.Antibiot.(Tokyo)48,589-603,1995，将Fmoc-(R)-Cys((R)-2,3-二(棕榈酰氧)-丙基)-OH制备成纯的非对映体。室温下，使用3当量Fmoc-氨基酸，3当量苯并三唑-1-基-氧三吡咯烷基磷六氟磷酸盐(PyBOP)和6当量二异丙基乙胺(DIPEA)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液进行肽偶联持续1小时，并使用20％v/v吡咯烷的DMF溶液进行脱保护持续15分钟。经由Fmoc-Asp(EDANS)-OH和Dabsyl通过与3当量的Dabsyl氯化物和6当量的DIPEA反应过夜来掺入EDANS。

在完成肽合成后，在室温下用三氟乙酸，三异丙基硅烷和水(95％，2.5％，2.5％v/v/v)的混合物从树脂中释放底物2小时。使用XBridge Amide柱(Waters)和甲醇/二氯甲烷流动相，在线性梯度为15-100％的甲醇条件下，通过正相HPLC纯化粗底物。Dabsyl-VTGC((R)-2,3-二(棕榈酰氧)-丙基)AKD(EDANS)的最终纯度超过95％(HPLC)并通过质谱法验证：预期的m/z 1776.96，LC/MS(ESI)m/z1777.97(M+H-)和889.99(M+2H-)。在测定缓冲液(PBS，5％甘油，0.5％DDM pH 7.4)中用400nM纯化Lsp对肽水解的Michaelis-Menten动力学测量产生K_M＝20±5μM，具有显著高于100μM的明显的底物抑制作用。

在用于测定Lsp活性的FRET底物中，我们可以用包含脂化的Cys残基的任何肽序列取代特定肽。例如，我们生成了基于Braun脂蛋白的FRET底物以及图1中特定肽实例的几种不同长度和氨基酸取代。

实施例3.Lsp抑制剂的高通量筛选

利用纯化的溶解的Lsp酶，我们研发了用于整合膜蛋白酶Lsp的体外高通量功能性筛选。首先，使用BioRAPTR试剂分配器(Beckman Coulter)在黑色聚苯乙烯384孔低容量板(Greiner#788076)中进行Maybridge HitFinder库(Thermo Fisher)的筛选。在测定缓冲液(PBS，5％甘油，0.5％DDM pH 7.4)中将纯化的Lsp稀释至500nM，并将10μl该原液加至每个孔中。接下来，将100nL 2mM文库化合物的原液固定(pin)于每个孔中，并将板短暂离心。在室温温育30分钟后，向每个孔中加入2.5μL250μM Lsp FRET底物的25％二甲基亚砜(DMSO)溶液，75％测定缓冲液。将板离心并在室温下温育30分钟。用2.5μL含有500mM氯化锌的水溶液淬灭测定，得到83mM的终浓度。活性测定过程中Lsp，FRET底物和文库化合物的浓度分别为400nM，50μM和16μM。测定中的最终DMSO浓度为5％，其中最大Lsp活性在5-10％DMSO中出现。

催化信号被定义为仅固定DMSO的全部酶活性，并且通过将底物加至不含Lsp的测定缓冲液中测量背景信号。初始筛选3200种化合物(图2)产生Z'＝0.79，信号背景比(S/B)＝2.1，平均％抑制(μ)＝-4.32，％抑制的标准误差(σ)＝20.89。对于μ+3σ的截止值，命中率为0.15％。12,800种化合物的较大规模筛选(图3)产生Z'＝0.74，S/B＝2.0，μ＝-3.66，σ＝16.90。对于μ+3σ的截止值，命中率为0.3％。抑制百分比最高的命中物主要由具有已知非特异性反应性或泛-测定干扰的化合物组成(图4)。另外，筛选Sharpless实验室化合物(图5)以相同的方式进行，只是每一化合物一式三份存在于筛选板上，产生Z'＝0.86和S/B＝2.2。

从Sharpless文库中，我们鉴定了基于萜类天然产物的两种抑制剂：BBS-8(A环羟基上装有氟磺酸酯弹头的雌二醇衍生物)，和双萜胺(leelamine)衍生物BBS-20(图6)。我们验证了不同浓度BBS-20对400nM纯化Lsp的抑制作用并计算出IC ₅₀为15±4μM(图7)。我们针对不同浓度的Lsp FRET底物测试了几种固定浓度的BBS-20以确定抑制机制(图8)。增加BBS-20的浓度降低了酶的最大初始速度，但是误差内的表观K_M并不降低，表现出与肽Lsp抑制剂格罗泊霉素相似的非竞争性抑制模式。

如对BBS-20所示，所有命中物可以用我们的体外FRET底物裂解测定法重新验证。另外，可以进行二次体外验证测定。该测定包括通过凝胶过滤尺寸排阻层析和/或HPLC检测底物切割。Lsp与小分子抑制剂的结合动力学可通过表面等离子体共振(SPR)以及由等温量热法(ITC)中结合事件释放的热量来测量。还可以检测来自各菌种的Lsp的晶体结构，这将有助于所有抑制剂的发现和发展。此外，通过体外验证测定的目的小分子可以使用一组革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌进行杀伤曲线测定，以确定用作杀菌剂的功效。

实施例4.用于Lsp抑制剂的超高通量筛选和验证测定

我们对整合膜蛋白酶Lsp的体外高通量功能筛选进一步优化并小型化为1,536孔形式。在The Scripps Research Institute，Florida(TSRI FL)进行了646,275种ScrippsDrug Discovery Library(SDDL)化合物的初级筛选。在测定缓冲液(PBS，5％甘油，10mMDTT，0.5％DDM pH 7.4)中将纯化的Lsp稀释至200nM，并将4μL该原液加至每个孔中。接下来，将50nL TSRI FL文库化合物原液固定于每个孔中至最终浓度为8.4μM，并将板短暂离心。在室温下孵育30分钟后，将1μL Lsp FRET底物的25％二甲基亚砜(DMSO)溶液，75％测定缓冲液加至每个孔中以达到20μM的最终底物浓度。将板离心并在室温下温育60分钟。用含有500mM氯化锌的水溶液淬灭测定，得到最终浓度为83mM。测定中的最终DMSO浓度为5％，其中最大Lsp活性在5-10％DMSO中出现(图10)。荧光在EnVision pate读取器上得以测量(例如355nm；em.495nm)。

将原始荧光测定数据输入到TSRI公司数据库中，并随后使用Symyx软件进行分析。使用以下公式在每板基础上计算每种化合物的活性：

其中“高对照”表示含有无LSP+DMSO的孔，“低对照”表示含LSP+DMSO的孔，“数据孔”含有LSP+测试化合物。使用高对照和低对照孔计算该测定的Z'和信号背景比(S/B)。645,275种SDDL化合物的筛选产生Z'＝0.69±0.05，S/B为1.35±0.05(n＝519个板)。使用“间隔截止值”(＝27.92％抑制)，初级测定产生2,271种活性化合物(“命中物”)。

确认筛选使用与初级筛选测定相同的试剂和检测系统，但是以单一浓度(标称8.43μM)一式三份测试2,271种化合物中的每一种。预猝灭的对抗筛选测定形式上与LSP初级测定相似，并使用相同的试剂和相同的读数，但在猝灭酶促反应后固定化合物。用于该对抗筛选测定的“高对照”也是无LSP+DMSO。“低对照”是LSP+DMSO。该测定用于鉴定影响荧光测量的各种“脱靶”命中物，如荧光猝灭剂。

LSP确认测定性能优异，平均Z'为0.74±0.02，S/B为1.41±0.01。使用27.92％反应的测定截止值(初始截止值)，确认活性大于27.92％的698种命中物。预淬灭的对抗筛选测定性能也很好，平均Z'为0.73±0.03，S/B为1.38±0.01。使用与确认测定相同的截止值，发现455种命中物。在所测试的2,271种化合物中，在LSP初级测定中证实了698种化合物的活性，证明了其中344种的选择性活性，即它们在预淬灭的对抗筛选测定中无活性。

通过10点剂量反应滴定(3倍稀释)，一式三份对344种化合物进行剂量依赖性滴定试验。LSP初级测定和预猝灭滴定测定采用与二级测定相同的试剂，方案和检测系统。LSP初级滴定测定性能优异，平均Z'为0.73±0.03，S/B为1.32±0.01。LSP预淬灭对抗筛选滴定测定性能也很好，平均Z'为0.70±0.03，S/B为1.29±0.02(图11)。两种滴定测定都包括格罗泊霉素作为对照。对于每种测试化合物，将活性百分比相对于化合物浓度作图。然后使用Assay Explorer软件(Symyx Technologies Inc.)将描述S形剂量–反应曲线的四参数方程与可调节的基线拟合。通过求解Y截距值的50％活性水平处的X截距值，由拟合曲线生成所报告的IC₅₀值。图12显示了代表性化合物和具有来自一式三份实验的误差线的剂量反应曲线。

如图13所示，我们从起始材料合成了SR-01000270728-1。在大肠杆菌Lsp上进行体外剂量反应测定并显示以2.2μM的EC50进行抑制。对于图12中的其他化合物，可以容易地进行类似的合成和验证测定。

***

大肠杆菌Lsp编码序列(登录号CAQ30547；SEQ ID NO:3):

ATGGGCCATCATCATCATCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCAT

ATCGACGACGACGACAAGCATATGAGTCAATCGATCTGTTCAACAGGGCTACGC

TGGCTGTGGCTGGTGGTAGTCGTGCTGATTATCGATCTGGGCAGCAAATACCTG

ATCCTCCAGAACTTTGCTCTGGGGGATACGGTCCCGCTGTTCCCGTCGCTTAATC

TGCATTATGCGCGTAACTATGGCGCGGCGTTTAGTTTCCTTGCCGATAGCGGCGG

CTGGCAGCGTTGGTTCTTTGCCGGTATTGCGATTGGTATTAGCGTGATCCTGGCA

GTGATGATGTATCGCTCGAAGGCCACGCAGAAGCTAAACAATATCGCTTACGCG

CTGATTATTGGCGGCGCGCTGGGCAACCTGTTCGACCGCCTGTGGCACGGCTTC

GTTGTCGATATGATCGACTTCTACGTCGGCGGCTGGCACTTCGCCACCTTCAACC

TTGCCGATACTGCCATCTGTGTCGGTGCGGCACTGATTGTGCTGGAAGGTTTTTT ACCTTCTAAAGCGAAAAAAC A ATA A.

S.pyogenes Lsp编码序列(登录号AAK33759；SEQ ID NO:4):

ATGAAAAAACGATTGTTTGTGCTTAGCTTGATCCTCCTTGTAGCTTTG

GATCAACTTAGTAAATTTTGGATTGTTTCTCATATAGCGCTTGGAGAAGTGAAAC

CCTTTATCCCAGGTATCGTCAGCTTGACTTACTTGCAAAACAATGGGGCTGCCTT

TTCCATATTGCAGGACCAGCAATGGTTCTTTGTTGTCATAACGGTTTTAGTTATC

GGTTATGCTATTTATTACCTTGCTACTCATCCCCATTTAAATATCTGGAAACAAT

TAGCTCTCTTGCTTATTATTTCTGGTGGAATCGGGAATTTTATTGATCGTTTGCGT

TTAGCTTACGTGATTGATATGATTCATTTAGACTTTGTGGATTTTGCCATTTTTAA

TGTGGCAGATTCATACCTTACCGTTGGTGTCATATTATTATTGATATGTTTATGG

AAAGAAGAGGATTATGGAAATCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA.

T.maritima Lsp编码序列(登录号NP_228273；SEQ ID NO:5):

ATGGGCCATCATCATCATCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCAT

ATCGACGACGACGACAAGCATATGGCGTTTGTGATGGTTCTCACAATTGTTCTG

GATCAGCTTACAAAGCGGATAGCAAGCGAGATACACGGAACTTTTTTCATAGTT

CCGGGTTTTTTGAGATTCGTGAAGGCAACCAACCGAGGAATCGCACTCGGGTTG

TTTAAAAATCTTTCCGAACAGCTTCTCTGGACCGTGATGTTCGTTGTTGTTTTTCT

CTCCCTGCTTCCTTATATTTTCAAGTTCAGCAGGCTGGAAAGAATAGCCATGGGC

TTCATTCTTGGGGGAGCTCTCGGCAACCTTCTCGACAGAATCAGATTCGGATACG

TTCTTGATTTTCTGAACTTGACCTTTCTCCCAACGATATTCAACCTAGCGGATGT

GTTCATCATAGTCGGAGGAGCGCTTATGATACTGGGAGTTTTCAGAGGTGGAGA

CAATGAAAGTTTGGAGAGTCGAAAAAAGAGAAGAGGGCTGGAGACTGGATCAG

TTTTTGAAGGAGAAGACACCATCATGGATCTCGAGATCAATGATTCAAAAAGCG

ATAAAAGAGGGCAAAGTGAAGGTCAACGGTCAGATTAA.

#**

应该理解，本文描述的实例和实施方案仅用于说明的目的，并且将其启示下的各种修改或变化建议给本领域技术人员，这将被包括在本申请的实质内容和权限内以及所附权利要求的范围内。尽管在本发明的实践或测试中可以使用那些与本文描述类似或等同的任何方法和材料，但是优选的方法和材料已在文中描述。

本文引用的所有出版物，GenBank序列，专利和专利申请均通过引用全部明确地并入本文，并且用于如同每个单独如此表示的所有目的。

Claims

1.用于检测脂蛋白信号肽酶(Lsp)的催化活性的测定系统，其包含(a)重组表达的可溶且纯化的Lsp酶和(b)Lsp底物。

2.如权利要求1所述的测定系统，其中，所述所述Lsp是细菌Lsp。

3.如权利要求2所述的测定系统，其中，所述Lsp是大肠杆菌Lsp。

4.如权利要求1所述的测定系统，其中，所述Lsp被表达为His-标记的融合蛋白。

5.如权利要求4所述的测定系统，其中，所述His-标记的融合蛋白包含N端His₆标签。

6.如权利要求1所述的测定系统，其中，所述Lsp用洗涤剂溶解。

7.如权利要求6所述的测定系统，其中，所述洗涤剂是正十二烷基β-D-麦芽糖苷(DDM)。

8.如权利要求1所述的测定系统，其中，所述底物是含有脂质修饰的半胱氨酸残基的肽，肽模拟物或蛋白质。

9.如权利要求1的测定系统，其中，所述底物用荧光共振能量转移(FRET)供体-受体对标记。

10.一种鉴定抑制脂蛋白信号肽酶(Lsp)的药剂的方法，包括(a)在测试化合物存在下使重组产生的纯化的Lsp与Lsp底物接触，和(b)检测一种或一种以上测试化合物对所述底物的Lsp裂解的抑制作用；从而鉴定出抑制脂蛋白信号肽酶(Lsp)的药剂。

11.如权利要求10所述的方法，其中，所述Lsp是细菌Lsp。

12.如权利要求11所述的方法，其中，所述Lsp是大肠杆菌Lsp。

13.如权利要求10所述的方法，其中，所述Lsp是His标记的融合蛋白。

14.如权利要求14所述的方法，其中，所述His标记的融合蛋白包含N端His₆标签。

15.如权利要求10所述的方法，其中，所述Lsp用洗涤剂溶解。

16.如权利要求16所述的方法，其中，所述洗涤剂是正十二烷基β-D-麦芽糖苷(DDM)。

17.如权利要求10所述的方法，其中，所述底物是含有脂质修饰的半胱氨酸残基的肽，肽模拟物或蛋白质。

18.如权利要求10所述的方法，其中，所述底物用荧光共振能量转移(FRET)供体-受体对标记。

19.如权利要求10所述的方法，其中，通过荧光共振能量转移检测Lsp催化活性。

20.如权利要求10所述的方法，其以高通量形式实施。

21.如权利要求10所述的方法，其中，所述测试化合物是小有机化合物。

22.如权利要求10所述的方法，还包括检测所鉴定的药剂的杀菌活性。

23.如权利要求10所述的方法，进一步包括检测所鉴定的药剂抑制细菌脂蛋白二酰基甘油基转移酶(Lgt)的能力。

24.一种抑制细菌细胞中Lsp催化活性的方法，包括在允许Lsp抑制剂化合物抑制存在于所述细胞中的Lsp的条件下使所述细菌细胞与所述Lsp抑制剂化合物接触，其中，所述Lsp抑制剂化合物为化合物SR-010000270728-1、化合物BBS-8或化合物BBS-20或其功能性变体。

25.如权利要求24所述的方法，其中，所述细菌细胞存在于受试者体内。

26.如权利要求25所述的方法，其中，所述受试者患有由所述细菌细胞引起的感染。

27.如权利要求25所述的方法，其中，对所述受试者施用治疗有效量的所述Lsp抑制剂化合物。

28.一种用于抑制受试者体内细菌生长并治疗受试者体内细菌感染的方法，包括对患有细菌感染的受试者施用包含治疗有效量的Lsp抑制剂化合物的药物组合物，从而抑制受试者体内细菌生长并治疗受试者体内细菌感染；其中，所述Lsp抑制剂化合物是化合物SR-010000270728-1、化合物BBS-8或化合物BBS-20或其功能变体。

29.如权利要求28所述的方法，其中，所述受试者是人。

30.一种生成能够在测定系统中测量催化活性的洗涤剂溶解的活性跨膜酶的方法，包括：(a)构建能够表达所述活性跨膜酶的表达载体；(b)由所述载体表达所述活性跨膜酶；和(c)在基于洗涤剂的体系中溶解并纯化所述活性跨膜酶；由此生成能够在测定系统中测量特定催化活性的洗涤剂溶解的活性跨膜酶。

31.如权利要求30所述的方法，其中，所述跨膜酶是Lsp。

32.根据权利要求30生成的跨膜酶在检测酶的催化活性的测定中的用途。

33.根据权利要求30生成的跨膜酶在用于鉴定所述跨膜酶的特异性抑制剂的高通量筛选中的用途。

34.根据权利要求33生成的跨膜酶的用途，其中，所述跨膜酶是Lsp。

35.鉴定具有改进性质的Lsp抑制性化合物的方法，包括(a)合成一种或一种以上先导Lsp抑制剂化合物的结构类似物；(b)对所述类似物进行功能测定以鉴定相对于上述先导化合物具有改进的生物或药学性质的类似物；从而鉴定具有改进性质的Lsp抑制性化合物。

36.如权利要求35所述的方法，其中，所述先导Lsp抑制剂化合物是化合物SR-010000270728-1、化合物BBS-8、化合物BBS-20或其功能变体。

37.如权利要求35所述的方法，其中，所述改进的生物或药学性质是增强的对Lsp催化活性的抑制作用。

38.如权利要求37所述的方法，其中，所述功能测定使用纯化的洗涤剂溶解的Lsp酶。

39.如权利要求35所述的方法，其中，所述改进的生物或药学性质是增加的稳定性或血清半衰期。