JP2018532384A - 新規な抗生物質を同定するための方法および関連組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、精製され、組換え産生された、細菌リポタンパク質シグナルペプチダーゼ(Lsp)酵素、およびLsp触媒活性をモニターするためのインビトロアッセイを提供する。また、本発明では、新規な抗生剤を同定するためのスクリーニング方法、および細菌感染症を治療するためのそれらの治療適用も提供される。さらに、本発明では、細菌感染症に起因する疾患を治療する際に殺菌剤として使用することのできる特異的Lsp阻害化合物が提供される。【選択図】図1
Description
関連出願の相互参照
本特許出願は、米国特許仮出願第62/214,695号(2015年9月4日出願)に対する優先権の利益を主張する。優先権出願の全開示は、参照によりあらゆる目的においてその全文が本明細書に援用される。
本特許出願は、米国特許仮出願第62/214,695号(2015年9月4日出願)に対する優先権の利益を主張する。優先権出願の全開示は、参照によりあらゆる目的においてその全文が本明細書に援用される。
全ての細菌は、栄養素の取り込み、シグナル伝達、細胞壁安定性、接着、および毒性をはじめとする多数の多様な重要な役割をリポタンパク質に依存している。共有結合脂質の修飾は、全てのリポタンパク質を細菌細胞膜に係留し、脂質付着のプロセスは、膜内在性リポタンパク質シグナルペプチダーゼ(Lsp)に完全に左右される。Lspは、細菌界(グラム陰性細菌門と陽性細菌門)で高度に保存され、ヒト相同体が存在しないので、広範かつ新規な抗菌薬の開発の注目される標的となっている。ヒト相同体が存在しないという基準は、宿主に投与された際に分子の乱交雑およびオフターゲット作用を除去するために非常に重要である。この種類の分子特異性の最もよい例は、細菌界に限定される特有の機能である酵素DD−トランスペプチダーゼを標的にする、β−ラクタム抗生物質のペニシリンである。タンパク質を魅力的な創薬標的にするLspの多数の特質にもかかわらず、小分子阻害剤はこれまでに報告されていない。
細菌感染症の治療のための、さらなるより良い薬物が当技術分野で強く必要とされている。本発明は、当技術分野のこれらの実現されていない必要性に向けられる。
一態様では、本発明は、リポタンパク質シグナルペプチダーゼ(Lsp)の触媒活性を測定するためのアッセイ系のための方法を提供する。この系は、(a)組換え発現され、可溶性の、精製されたLsp酵素と(b)Lsp基質を含む。一部の系では、Lspは、大腸菌(E.coli)Lspなどの細菌Lspである。一部の実施形態では、Lspは、Hisタグ付き融合タンパク質として発現する。一部の実施形態では、Lspは、界面活性剤、例えば、n−ドデシルβ−D−マルトシド(DDM)によって可溶化される。一部の実施形態では、基質は、ペプチド、ペプチド模倣物、または、脂質修飾システイン残基を含有するタンパク質である。一部の実施形態では、基質は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)ドナー−アクセプター対で標識されている。
別の態様では、本発明は、リポタンパク質シグナルペプチダーゼ(Lsp)を阻害する作用剤を同定するための方法を提供する。この方法は、(a)組換え産生され、精製されたLspとLsp基質を被験化合物の存在下で接触させること、および(b)1以上の被験化合物によって、前記基質のLsp切断の阻害を検出することを伴う。一部の実施形態では、Lspは、大腸菌Lspなどの細菌Lspである。一部の実施形態では、Lspは、Hisタグ付き融合タンパク質として発現する。一部の実施形態では、Lspは、界面活性剤、例えば、n−ドデシルβ−D−マルトシド(DDM)によって可溶化される。一部の実施形態では、基質は、ペプチド、ペプチド模倣物、または、脂質修飾システイン残基を含有するタンパク質である。一部の実施形態では、基質は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)ドナー−アクセプター対で標識されている。一部の実施形態では、Lsp触媒活性は蛍光共鳴エネルギー移動によって検出される。一部の実施形態では、スクリーニングはハイスループット形式で実施される。一部の実施形態では、被験化合物は、小さい有機化合物である。本発明の一部の方法は、同定された作用剤を殺菌活性について調べることをさらに含む。
別の態様では、本発明は、微生物細胞(例えば、細菌)においてLsp触媒活性を阻害するための方法を提供する。この方法は、細胞に存在するLspを化合物に阻害させる条件下で、微生物細胞をLsp阻害化合物と接触させることを伴う。この際、Lsp阻害化合物は、Compound BBS−8、Compound BBS−20、または図12に示される化合物のいずれか、例えばCompound 01000270728−1など、あるいはそれらの機能性変異体である。一部の実施形態では、微生物細胞は、被験体の内部に存在している。一部のこれらの実施形態では、被験体は、微生物細胞による感染に罹患している。
関連する態様では、本発明は、被験体において微生物(例えば、細菌)の増殖を阻害するための方法、および微生物感染症(例えば、細菌感染症)を治療するための方法を提供する。これらの方法は、微生物感染に罹患した被験体に、治療上有効な量のLsp阻害化合物を含む医薬組成物を投与することを含む。これらの方法では、Lsp阻害化合物は、Compound BBS−8、Compound BBS−20、または図12に示される化合物のいずれか、例えばCompound 01000270728−1など、あるいはそれらの機能性変異体である。一部の好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
別の態様では、本発明は、アッセイ系の触媒活性を測定することの可能な、活性界面活性剤で可溶化された膜貫通酵素を生成するための方法を提供する。この方法は、(a)活性膜貫通酵素を発現することの可能な発現ベクターを構築すること;(b)活性膜貫通酵素を発現から発現させること;および(c)界面活性剤に基づく系において活性膜貫通酵素を可溶化し精製することを伴う。一部のこれらの方法では、用いる膜貫通酵素はLspである。一部の関連する実施形態では、本発明は、これらの方法に従って生成した膜貫通酵素を、酵素の触媒活性を測定するアッセイで使用することを提供する。この使用の一部は、細菌の膜貫通酵素、例えばLspの特異的阻害剤を同定するためのハイスループットスクリーニングに関する。
別の態様では、本発明は、改良された特性を備えるLsp阻害化合物を同定するための方法を提供する。この方法は、(a)リードLsp阻害化合物の1以上の構造類似体を合成すること;(b)機能アッセイを前記類似体に実施して、前記リード化合物のものと比較して改良された生物学的または薬学的特性を有する類似体を同定すること;それにより、改良された特性を備えるLsp阻害化合物を同定することを伴う。一部の実施形態では、リードLsp阻害化合物は、Compound BBS−8、Compound BBS−20、または図12に示される化合物のいずれか、例えばCompound 01000270728−1など、あるいはそれらの機能性変異体である。一部のこれらの方法では、改良された生物学的または薬学的特性は、Lsp触媒活性の阻害の向上である。一部の方法では、機能アッセイは、精製され、界面活性剤で可溶化されたLsp酵素を用いる。
本発明の性質および利点のさらなる理解は、明細書の残りの部分および特許請求の範囲を参照することによって実現されるであろう。
I.概要
当技術分野で長年必要とされてきたにもかかわらず、現在、Lspに特異的な阻害剤はない。これは、活性膜貫通酵素の精製およびアッセイ開発に関連する途方もない困難によるものであると思われる。本発明は、本発明者らによる膜内在性プロテアーゼの最初のインビトロハイスループットスクリーニング(HTS)の開発に一部分基づいている。本明細書において詳述されるように、本発明者らは、大腸菌リポタンパク質シグナルペプチダーゼ(Lsp)を発現させ、精製し、可溶化することに成功した。本発明者らはさらに、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)に基づいてLsp切断活性をモニターするインビトロアッセイを開発した。このアッセイは、フルオロフォアおよび蛍光消光剤で標識したリポタンパク質模倣ペプチド基質を用いた。本発明者らは、全ての可能性のある阻害様式(すなわち、競合的および非競合的)を同定することの可能な酵素、基質、およびライブラリー化合物濃度を選択することによってHTSを最適化した。さらに、本発明者らは、Maybridge HitFinderコレクションから15,000の化合物の暫定的なパイロットスクリーニングを実施した。内部ライブラリー(「Sharpless化合物ライブラリー」)のさらなる選別の結果、リード化合物が同定され、それはインビトロ機能アッセイでLsp阻害剤と確認された。十分なシグナル対バックグラウンドと統計学的に有意な値0.5をはるかに上回るZ−primeに強調されるように、これらの結果は、Lspが創薬の実行可能な標的であること、およびアッセイが再現性があり頑強であることを実証した。本明細書に記載される精製されたLsp酵素およびインビトロスクリーニング系の実用性をさらに検証するものとして、本発明者らは、超ハイスループットスクリーニングおよびLsp阻害剤の検証アッセイをさらに実施した。この選別は1,536のウェル形式を用い、646,275の候補化合物のライブライリーを選別した。本明細書において詳述されるように、合計2,271の活性化合物が一次アッセイから得られた。二次アッセイによって、約344の化合物が選択的活性を示すことが見出された。例示的な化合物の特性を、さらなる合成および検証アッセイで確認した。
当技術分野で長年必要とされてきたにもかかわらず、現在、Lspに特異的な阻害剤はない。これは、活性膜貫通酵素の精製およびアッセイ開発に関連する途方もない困難によるものであると思われる。本発明は、本発明者らによる膜内在性プロテアーゼの最初のインビトロハイスループットスクリーニング(HTS)の開発に一部分基づいている。本明細書において詳述されるように、本発明者らは、大腸菌リポタンパク質シグナルペプチダーゼ(Lsp)を発現させ、精製し、可溶化することに成功した。本発明者らはさらに、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)に基づいてLsp切断活性をモニターするインビトロアッセイを開発した。このアッセイは、フルオロフォアおよび蛍光消光剤で標識したリポタンパク質模倣ペプチド基質を用いた。本発明者らは、全ての可能性のある阻害様式(すなわち、競合的および非競合的)を同定することの可能な酵素、基質、およびライブラリー化合物濃度を選択することによってHTSを最適化した。さらに、本発明者らは、Maybridge HitFinderコレクションから15,000の化合物の暫定的なパイロットスクリーニングを実施した。内部ライブラリー(「Sharpless化合物ライブラリー」)のさらなる選別の結果、リード化合物が同定され、それはインビトロ機能アッセイでLsp阻害剤と確認された。十分なシグナル対バックグラウンドと統計学的に有意な値0.5をはるかに上回るZ−primeに強調されるように、これらの結果は、Lspが創薬の実行可能な標的であること、およびアッセイが再現性があり頑強であることを実証した。本明細書に記載される精製されたLsp酵素およびインビトロスクリーニング系の実用性をさらに検証するものとして、本発明者らは、超ハイスループットスクリーニングおよびLsp阻害剤の検証アッセイをさらに実施した。この選別は1,536のウェル形式を用い、646,275の候補化合物のライブライリーを選別した。本明細書において詳述されるように、合計2,271の活性化合物が一次アッセイから得られた。二次アッセイによって、約344の化合物が選択的活性を示すことが見出された。例示的な化合物の特性を、さらなる合成および検証アッセイで確認した。
これらの研究に従って、本発明は、Lsp酵素活性をモニターし、数量化するための新規なアッセイ系を提供する。また、本発明では、Lsp酵素活性を阻害し、細菌の増殖を阻害する新規な作用剤を同定するための方法が提供される。そのような作用剤は、細菌感染症を治療するために広く用いることのできる新規な抗生物質をもたらす。本発明はさらに、グラム陰性生物およびグラム陽性生物に対する殺菌剤として使用することのできる特異的Lsp阻害化合物を提供する。さらに、本発明では、同定したLsp阻害分子をリード化合物として使用して、改良された生物学的および/または薬学的特性をもつさらなる抗生剤を同定する方法が提供される。以下の項は、本発明の組成物を作製し、使用するための、そして本発明の方法を実行するためのさらなるガイダンスを提供する。
II.定義
別に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味をもつ。次の参考文献は、本発明で使用する多くの用語の一般的定義を当業者に与える:Singleton et al.,Dictionary of Microbiology And Molecular Biology(2d ed.1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed.,1988);およびHale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。加えて、以下の定義が本発明の実践において読者を助けるために記載される。
別に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味をもつ。次の参考文献は、本発明で使用する多くの用語の一般的定義を当業者に与える:Singleton et al.,Dictionary of Microbiology And Molecular Biology(2d ed.1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed.,1988);およびHale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。加えて、以下の定義が本発明の実践において読者を助けるために記載される。
用語「作用剤」または「被験剤」には、任意の物質、分子、元素、化合物、実体、またはそれらの組合せが含まれる。それには、限定されるものではないが、例えば、タンパク質、ポリペプチド、有機小分子、多糖、ポリヌクレオチド、および同類のものが含まれる。それは、天然物、合成化合物、または化学物質、あるいは2以上の物質の組合せであり得る。別に指定されない限り、用語「作用剤」、「物質」、および「化合物」は同義的に使用され得る。
用語「類似体」は、本明細書において、参照分子に構造的に似ているが、参照分子の特定の置換基を代わりの置換基で置換することにより、標的化され制御された方法で修飾された分子をさすために使用される。参照分子と比較して、類似体が同じ、同程度、または改良された有用性を示すことを当業者は予想する。改良された形質(例えば標的分子に対するより高い結合親和性など)を有する既知化合物の変異体を同定する、類似体の合成およびスクリーニングは、製薬化学で周知の手法である。
用語「接触させる」はその通常の意味を有し、2以上の作用剤(例えば、ポリペプチドまたは小分子化合物)を組み合わせること、または作用剤と細胞(例えば、小分子および細胞)を組み合わせることをさす。接触は、インビトロで行うことができる(例えば、試験管またはその他の容器中で2以上の作用剤を組み合わせるか、または被験剤と細胞もしくは細胞溶解液を組み合わせる)。接触は、細胞でまたはインサイチュでも行うことができる(例えば、2つのポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドの細胞中での同時発現によって細胞中で、あるいは細胞溶解液中で、細胞内の2つのポリペプチドを接触させる)。
EDANS、5−[(2−アミノエチル)アミノ]ナフタレン−1−スルホン酸は、FRETに基づく核酸プローブおよびプロテアーゼ基質を開発するための最も一般的なドナーの1つである。EDANSは、FRETに基づくプローブ中でDABCYLまたはDABSYLと対になる場合が多い。その蛍光は環境に感受性である。Dabsyl(ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸)は、緑色のスペクトルを吸収し、フルオレセインとともに使用される場合が多い。それは、励起エネルギーをフルオロフォアから吸収し、エネルギーを熱として放散する物質であるダーククエンチャーである。一方、典型的な(蛍光)クエンチャーは、このエネルギーの多くを光として再放出する。ダーククエンチャーは、分子生物学においてフルオロフォアと併せて使用される。これら2つが接近している場合(例えば分子またはタンパク質の状態で)、フルオロフォアの放出は抑制される。この作用を使用して、分子幾何学および分子運動を研究することができる。
グロボマイシンは、グラム陰性細菌、例えば大腸菌の増殖を阻害する環状ペプチド抗生物質である。例えば、Inukai et al.,J.Antibiot.31:410−420,1978を参照されたい。グロボマイシンは、Lspを阻害し、ジアシルグリセリルプロリポタンパク質を内膜に蓄積させる。従って、グラム陰性生物は、リポタンパク質に対するムレイン・プロリポタンパク質プロセシングの阻害のためにグロボマイシンに感受性がある。
本明細書において使用する場合、IC50とは、酵素活性の最大半量の阻害に達する化合物の濃度をさす。
用語「同一の」または「配列同一性」とは、2つの核酸配列またはアミノ酸配列の文脈において、明示された比較ウィンドウにわたる最大一致を求めて整列させた場合に同じである2つの配列中の残基をさす。比較のための配列アライメントの方法は当技術分野で周知である。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482の局所相同性アルゴリズムによって;Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443のアライメントアルゴリズムによって;Pearson and Lipman(1988)Proc.Nat.Acad.Sci U.S.A.85:2444の類似性検索の方法によって;これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施によって(限定されるものではないが、Intelligentics,Mountain View,CAによるPC/Geneプログラム中のCLUSTAL;およびGenetics Computer Group(GCG),575 Science Dr.,Madison,Wis.,U.S.A.のWisconsin Genetics Software Package中のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、またはTFASTAを含む)実行してよい。アラインメントは、検査および手動アラインメントによって実施される場合も多い。
用語「実質的に同一の」核酸またはアミノ酸配列とは、核酸またはアミノ酸配列が、標準的なパラメータを使用して上記のプログラム(例えば、BLAST)を使用して参照配列と比較して、少なくとも90%以上の配列同一性、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。好ましくは、実質的な同一性は、少なくとも約50残基長の配列の領域にわたって存在し、より好ましくは少なくとも約100残基の領域にわたって存在し、最も好ましくは、配列は少なくとも約150残基にわたって実質的に同一である。最も好ましい実施形態では、配列は、コード領域の全長にわたって実質的に同一である。
細菌リポタンパク質は、それを脂質膜に固定するその脂肪アシル化アミノ末端を特徴とする。細菌リポタンパク質は、細菌において幅広い種類の生物学的機能を有し、例えば、細胞エンベロープ構造の維持(LppおよびPal)、外膜タンパク質の挿入および安定化(BamB)、栄養分および金属の取り込み(OppAおよびSitC)、タンパク質折り畳み(PrsA)、バクテリオシン放出(BRP)、ならびに接着および侵入(OspCおよびLmb)を行う。細菌のプロテオームの2〜3%を構成するリポタンパク質は、細胞質でプロリポタンパク質として合成され、リポタンパク質修飾機構による認識を可能にするリポボックスと呼ばれる保存されたリポタンパク質シグネチャーモチーフを含む。インバリアントシステイン+1は修飾語の成熟タンパク質の第1のアミノ酸となる;残基−4〜−1は、シグナルペプチドの一部として切断除去される。
リポタンパク質は、3つの膜結合酵素の連続作用によって膜に挿入され、膜で修飾される。最初のステップは、リポタンパク質ジアシルグリセリルトランスフェラーゼ(Lgt)に触媒され、これは、保存されたシステイン残基と、膜ホスファチジルグリセロールに由来するジアシルグリセロール(DAG)部分との間のチオエーテル結合の形成を触媒する。これにより、チオエーテル結合ジアシルグリセリル−プロリポタンパク質および副生成物としてグリセロールリン酸塩が形成される。脂質に付着した後、リポタンパク質シグナルペプチダーゼ(Lsp)は、ジアシル化システイン残基のアミノ末端でジアシルグリセリル−プロリポタンパク質を切断することによってシグナルペプチドを除去し、DAG修飾システインを新しく形成されたアポリポタンパク質の新しいN末端として残す。第3の酵素、リポタンパク質N−アシルトランスフェラーゼ(Lnt)は、さらなるアシル基を膜リン脂質から脂質修飾システインの新しく生成されたα−アミノ基に転移させ、完全に成熟したトリアシル化リポタンパク質を生成する。酵素LgtおよびLspは、全てのクラスの細菌で保存されているが、Lntはグラム陰性細菌と一部のグラム陽性種だけに存在する。3種類の酵素は全て大腸菌およびその他のグラム陰性細菌の生存において重要な役割を果たすことが示されている。対照的に、グラム陽性細菌では、LgtおよびLspは、少なくとも一部の試験した放線菌門(Actinobacteria)[高グアニン+シトシン(GC)含量種]において必須であるが、ファーミキューテス門(Firmicutes)(低GC含量種)ではそうではないと思われる。
リポタンパク質シグナルペプチダーゼ(Lsp)は、「プロリポタンパク質シグナルペプチダーゼ」、「シグナルペプチダーゼII」、「プレムレイン−リーダーペプチダーゼ」および「リーダーペプチダーゼII」とも呼ばれ、プロリポタンパク質の脂質化システイン残基の前に位置するシグナルペプチドを切断する。実例として、大腸菌Lspは、4つの膜貫通セグメントをもつ内在性膜タンパク質である。そのN末端とC末端の両方は、細胞質に面する。大腸菌を含む19の細菌種のII型シグナルペプチダーゼで保存された2つのアスパラギン酸残基(枯草菌(B.subtilis)LspのD102およびD129)は、枯草菌とS.セリカラー(S.coelicolor)の両方のLsp活性に重要である。これらの2つのアスパラギン酸は、ペプシン型アスパラギン酸プロテアーゼの触媒二分子として作用する可能性がある。大腸菌Lspは、脂質修飾システイン残基のN末端のペプチド結合を忠実に切断するが、一部のグラム陽性細菌由来のLspは、基質に対して特異性が低いか、または異なる認識様式を有することがある。Lspの酵素活性は、環状デプシペプチド抗生物質グロボマイシンによって非競合的に阻害することができる。
用語「調節」または「調節すること」とは、別の分子(例えば、Lsp酵素)の生物活性、または別の分子(例えば、Lsp酵素)に媒介される機能的応答に変化を起こす際の化合物またはその他の作用剤の活性をさす。用語「調節する」とは、標的分子の生物学的または細胞活性(例えば、酵素活性またはシグナル伝達活性)の変化をさす。調節は、上方制御(すなわち活性化または刺激)または下方制御(すなわち、阻害または抑制)であり得る。例えば、調節は、標的酵素(例えば、Lsp)の触媒活性の低下、または、標的分子の任意のその他の生物学的活性もしくは機能、または標的分子(例えば、基質との酵素の結合)に媒介される細胞活性もしくは免疫活性に変化を引き起こすことがある。作用様式は、直接的、例えば、標的分子との結合によるものであってよい。変化は間接的、例えば、そうでなければ標的分子を調節する別の分子との結合および/または別の分子の(例えば、酵素的)修飾によるものであってもよい。
「精製された」とは、材料(例えば、Lspタンパク質またはそのフラグメント)が、それが作製された環境から取り出されていることを意味する。材料は、部分的にまたは実質的に精製されてよく、完全に(100%)純粋である必要はない。例えば、本発明のLspタンパク質は、それが組換えによって合成された後に、一部または全ての未反応化学物質、副生成物、細胞残屑およびその他の成分を除去することによって精製されてよい。本明細書において使用する場合、「実質的に精製された」または「実質的に純粋」とは、材料が、その他の物質または成分を少なくとも75%、80%、85%、90%、95%または99%含まないことを意味する。
用語「被験体」とは、哺乳動物、特にヒトをさす。それはその他の非ヒト動物、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ネズミ、ラット、ウサギ、モルモット、サルを包含する。
分子の「変異体」とは、構造および生物活性が分子全体かまたはその断片と実質的に同様の分子をさす。従って、2つの分子が類似した活性を有するならば、たとえ分子の1つの組成または二次、三次、または四次構造が、他方の分子に見出されるそれと同一でないか、またはアミノ酸残基の配列が同一でないとしても、その用語が本明細書において使用されるように、それらは変異体と考えられる。本明細書において使用する場合、機能性変異体または機能性誘導体とは、参照分子のものに類似する生物学的機能(例えば、触媒機能)を共有する参照分子(例えば、Lsp酵素)の変異体をさす。
III.組換えによって産生され、可溶化され、精製されたLspタンパク質
本発明は、本明細書に記載されるように組換え産生され、精製され、可溶化されたLspタンパク質を提供する。本明細書において例証されるように、一部の精製されたLspタンパク質は、界面活性剤で可溶化される。また、本発明では、Lsp触媒活性をモニターするためのアッセイ系におけるこれらの機能性Lsp酵素の使用が提供される。Lspは、様々な細菌、マイコプラズマおよび古細菌種で発現する。これらの種のいずれかに由来するLspは、本明細書に記載される方法に従って発現させ、精製することができる。一部の好ましい実施形態では、本発明の実践で使用されるLspは、グラム陽性とグラム陰性の両細菌種を含む細菌に由来する。Lspは、多くの細菌種においてよく保存されている。これらには、例えば、大腸菌および、エンテロバクター属(Enterobacter)、シュードモナス属(Pseudomonas)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、リステリア属、連鎖球菌属(Streptococcus)、およびブドウ球菌属(Staphylococcus)の種が含まれる。いくつかの細菌種由来のLspの配列および構造は、当技術分野で全て公知であり特徴づけられている。例えば、Innis et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3708−3712,1984;Isaki et al.,J.Bacteriol.172:469−472,1990;Reglier−Poupet et al.,J.Bacteriol.158:632−635,2003;Sander et al.,Mol.Microbiol.52:1543−1552,2004;Witke et al.,FEMS Microbiol.Lett.126:233−239,1995;De Greeff et al.,Microbiol.149:1399−407,2003;Zhao et al.,FEBS Lett.173:80−84,1992を参照されたい。様々なLsp酵素の構造情報のさらなる説明は、当技術分野でも入手可能である。これらとしては、発疹熱リケッチア(R.typhi)(Rt)(GenBank受託番号NC_006142)、発疹チフスリケッチア(R.prowazekii)(Rp)(GenBank受託番号AJ235271)、R.ベリイ(R.bellii)(Rb)(GenBank受託番号NZ_AARC01000001)、R.カナデンシス(R.canadensis)(Rcan)(GenBank受託番号NZ_AAFF01000001)、痘瘡リケッチア(R.akari)(Ra)(GenBank受託番号NZ_AAFE01000001)、R.コノリイ(R.conorii)(Rc)(GenBank受託番号NC_003103)、R.シビリカ(R.sibirica)(Rs)(GenBank受託番号AABW01000001)、R.リケッチイ(R.rickettsii)(Rr)(GenBank受託番号NZ_AADJ01000001)、R.フェリス(R.felis)(Rf)(GenBank受託番号NC_007109)、および大腸菌(Ec)(GenBank受託番号X00776)由来のLspの配列が挙げられる。これらのLsp配列またはその実質的に同一の配列のどれでも、本発明において組換えLspまたは変異体を産生する際に用いることができる。
本発明は、本明細書に記載されるように組換え産生され、精製され、可溶化されたLspタンパク質を提供する。本明細書において例証されるように、一部の精製されたLspタンパク質は、界面活性剤で可溶化される。また、本発明では、Lsp触媒活性をモニターするためのアッセイ系におけるこれらの機能性Lsp酵素の使用が提供される。Lspは、様々な細菌、マイコプラズマおよび古細菌種で発現する。これらの種のいずれかに由来するLspは、本明細書に記載される方法に従って発現させ、精製することができる。一部の好ましい実施形態では、本発明の実践で使用されるLspは、グラム陽性とグラム陰性の両細菌種を含む細菌に由来する。Lspは、多くの細菌種においてよく保存されている。これらには、例えば、大腸菌および、エンテロバクター属(Enterobacter)、シュードモナス属(Pseudomonas)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、リステリア属、連鎖球菌属(Streptococcus)、およびブドウ球菌属(Staphylococcus)の種が含まれる。いくつかの細菌種由来のLspの配列および構造は、当技術分野で全て公知であり特徴づけられている。例えば、Innis et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3708−3712,1984;Isaki et al.,J.Bacteriol.172:469−472,1990;Reglier−Poupet et al.,J.Bacteriol.158:632−635,2003;Sander et al.,Mol.Microbiol.52:1543−1552,2004;Witke et al.,FEMS Microbiol.Lett.126:233−239,1995;De Greeff et al.,Microbiol.149:1399−407,2003;Zhao et al.,FEBS Lett.173:80−84,1992を参照されたい。様々なLsp酵素の構造情報のさらなる説明は、当技術分野でも入手可能である。これらとしては、発疹熱リケッチア(R.typhi)(Rt)(GenBank受託番号NC_006142)、発疹チフスリケッチア(R.prowazekii)(Rp)(GenBank受託番号AJ235271)、R.ベリイ(R.bellii)(Rb)(GenBank受託番号NZ_AARC01000001)、R.カナデンシス(R.canadensis)(Rcan)(GenBank受託番号NZ_AAFF01000001)、痘瘡リケッチア(R.akari)(Ra)(GenBank受託番号NZ_AAFE01000001)、R.コノリイ(R.conorii)(Rc)(GenBank受託番号NC_003103)、R.シビリカ(R.sibirica)(Rs)(GenBank受託番号AABW01000001)、R.リケッチイ(R.rickettsii)(Rr)(GenBank受託番号NZ_AADJ01000001)、R.フェリス(R.felis)(Rf)(GenBank受託番号NC_007109)、および大腸菌(Ec)(GenBank受託番号X00776)由来のLspの配列が挙げられる。これらのLsp配列またはその実質的に同一の配列のどれでも、本発明において組換えLspまたは変異体を産生する際に用いることができる。
当技術分野で周知の分子生物学および生化学の一般的技術(例えば、PCRおよびアフィニティークロマトグラフィー)を、本発明のLspタンパク質のクローニング、発現および精製で利用することができる。そのような常套的に行われる方法および技法は、例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(3rd ed.,2001);およびBrent et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.(ringbou ed.,2003)に記載されている。しかし、機能性可溶性のLsp酵素を発現および精製するためのいくつかの特定のプロトコールが、本発明者によって開発され、本明細書中の実施例において詳細に記載されている。一例として、大腸菌Lspを使用し、コロニーPCRによってそのコード配列を最初にクローニングすることによって、全長タンパク質を生成することができる。大腸菌Lspコード配列は、本明細書において配列番号3に示される。その後の精製を容易にするために、適切なタグを有する融合タンパク質としてLspを過剰発現させることができる。大腸菌Lspに関して本発明者らが見出したように、N末端のHisタグはLspの発現および精製を大いに促進した。これは、適した発現ベクターおよび宿主細胞株、例えば、pET19bベクターおよび大腸菌BL21(DE3)pLysS(Agilent)細胞によって容易に実現することができる。本明細書において例証されるN末端のHisタグ以外に、本発明の組換え発現および精製戦略は、タンパク質切断によって同様に切断されることのできるC末端のHisタグも利用することができる。過剰発現の後、細胞を溶解し、適切な作用剤を使用して膜タンパク質を可溶化することができる。一部の特定の界面活性剤、例えばn−ドデシルβ−D−マルトシド(DDM)は、精製およびその構造完全性の維持を確実にするために最適なタンパク質の可溶化を可能にすることが見出された。本明細書において例証されるように、N末端のHisタグおよび可溶化界面活性剤の使用を含む、本明細書に記載されるタンパク質発現および精製スキームは、アフィニティーカラムおよびゲル濾過クロマトグラフィーによってタンパク質の効率的な精製を可能にする。これは、その酵素活性を保持する、精製され無傷の可溶性膜タンパク質Lspも導く。
Lspはグラム陽性とグラム陰性の両細菌種で高度に保存されているので、同じ組換え発現および精製スキームを、多様なその他の細菌種由来の可溶性で機能性の組換えLspタンパク質を得るために容易に適用させることができる。従って、大腸菌Lsp酵素に加えて、任意のその他の種由来のLspタンパク質をpETベクター(例えば、pET19b)に同様にクローニングし、大腸菌Lspについて本明細書に記載されるように精製することができる。実際に、本発明者らは、いくつかのその他の種由来のLsp酵素もクローニングし、発現させた。例えば、本明細書において実証されるように、大腸菌Lspのために開発された同じプロトコールを上手く用いて化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)およびサーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)由来のLspをクローニングし、発現させ、精製した。具体的に言うと、C末端のHis6タグ付き融合物として、NdeIおよびXhoIクローニング部位を介してコード配列(配列番号4)をベクターpET23bにクローニングすることによって、化膿連鎖球菌株M1GASのLspタンパク質を発現させ、精製した。同様に、N末端のHis6タグ付きタンパク質として、NdeIおよびBamHIクローニング部位を介してコード配列(配列番号5)をベクターpET19bにクローニングすることによって、サーモトガ・マリチマ株MSB8由来のLspを発現させ、精製した。
IV.可溶化された膜タンパク質のためのアッセイ系およびスクリーニング方法
本発明は、Lspについて本明細書中で例証されるように、活性界面活性剤で可溶化された酵素を利用するアッセイ系を提供する。アッセイ系および関連するスクリーニング方法は、多くのその他の膜タンパク質の触媒活性を測定するために、そしてその修飾物質をスクリーニングするために用いることができる。本明細書に記載される細菌リポタンパク質新生に関連する酵素(Lspを含む)に加えて、当技術分野で公知の多くのその他の膜酵素も本発明のアッセイ系およびスクリーニング方法に適していることがある。例としては、ヒドロラーゼ、ホスホリパーゼ(例えば、ホスホリパーゼAおよびC)、コレステロールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、カロテノイドオキシゲナーゼ、フェロケラターゼ、グリコール酸オキシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼなどが挙げられる。当技術分野で周知の適切な基質をこれらの酵素に対して使用して、本明細書において例証したLspのものに類似するアッセイ系およびスクリーニング方法でこれらの酵素の各々を調べることができる。
本発明は、Lspについて本明細書中で例証されるように、活性界面活性剤で可溶化された酵素を利用するアッセイ系を提供する。アッセイ系および関連するスクリーニング方法は、多くのその他の膜タンパク質の触媒活性を測定するために、そしてその修飾物質をスクリーニングするために用いることができる。本明細書に記載される細菌リポタンパク質新生に関連する酵素(Lspを含む)に加えて、当技術分野で公知の多くのその他の膜酵素も本発明のアッセイ系およびスクリーニング方法に適していることがある。例としては、ヒドロラーゼ、ホスホリパーゼ(例えば、ホスホリパーゼAおよびC)、コレステロールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、カロテノイドオキシゲナーゼ、フェロケラターゼ、グリコール酸オキシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼなどが挙げられる。当技術分野で周知の適切な基質をこれらの酵素に対して使用して、本明細書において例証したLspのものに類似するアッセイ系およびスクリーニング方法でこれらの酵素の各々を調べることができる。
アッセイ系を得るために、またはスクリーニング方法を実施するために、一般に、Lspについて本明細書中で例証されるような活性膜貫通酵素を発現することの可能な発現構築物を最初に生成する。この後に、活性膜貫通酵素を発現構築物から発現させる。発現した膜貫通酵素は、次に、界面活性剤に基づく系で可溶化され、精製される。この系は、活性膜貫通界面活性剤で可溶化された酵素の形成を可能にする。この機能性界面活性剤可溶化酵素は、次に本発明のアッセイ系またはスクリーニング方法で特異的触媒活性を測定するために用いることができる。Lspについて本明細書中で実証されるように、アッセイ系は、界面活性剤で可溶化された酵素の触媒活性を測定するために使用することができる。一部の実施形態では、界面活性剤で可溶化された酵素は、酵素の特異的阻害剤を同定するためのハイスループットスクリーニングで使用される。本明細書に記載されるように、そのような阻害剤は、様々な候補化合物、例えば、小分子、ペプチド、ポリペプチドまたはそれらのキメラ型から同定されることができる。本発明の一部の実施形態は、本明細書中で例証されるような界面活性剤で可溶化されたLspは、抗菌活性を有するLspの特異的阻害剤についてスクリーニングするために使用される。
実例として、本発明は、Lsp触媒活性をモニターするための、本明細書に記載される界面活性剤で可溶化された活性Lsp酵素を用いるアッセイ系を提供する。組換え産生され、精製されたLspタンパク質に加えて、このアッセイ系は、一般に、Lsp基質も含み、その基質上の酵素の触媒イベントを検出することのできる手段も含んでよい。基質は、Lspの酵素の機能によって認識され、特異的に切断されることのできるあらゆるペプチド、ポリペプチドまたはペプチド模倣物であり得る。基質は一般にLsp切断部位、すなわち脂質化システイン残基を含有する。一部の実施形態では、基質は、切断イベントの検出を可能にする標識部分と結合している。標識部分は、基質からの切断によって変化する蛍光特性を有する分子、または蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)化合物の一致したドナー−アクセプター対であり得る。一部の実施形態では、基質切断のモニタリングが蛍光共鳴エネルギー移動を検出することによって実施されるように、蛍光ドナー部分および蛍光アクセプター部分対はLsp切断部位の反対側で基質ペプチドと結合している。モニタリングには、蛍光アクセプター部分の励起および/または発光最大値のシフトを検出することが含まれ得、そのシフトは、Lspペプチダーゼ活性による基質からの蛍光アクセプター部分の放出に由来する。
一部の実施形態では、Lsp触媒活性は、標識された基質ペプチドの切断に由来する蛍光シグナルをモニタリングすることによる蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)アッセイによって検出され、定量化される。FRETは、ドナーとアクセプターが適した配向および距離(例えば、10〜100Åの範囲内)をもつ重なり合った発光/吸収スペクトルを有する場合に、ドナーからのエネルギーがアクセプターに移動する、非放射性プロセスである。当技術分野で公知のどんな蛍光共鳴移動エネルギー対(フルオロフォアと蛍光消光剤)も、Lspペプチド基質を標識するために使用することができる。一部の好ましい実施形態では、アッセイ系は、本明細書中で例証されるようなEDANSおよびDabsylのFRETドナー−アクセプター対で標識される基質ペプチド模倣物を利用することができる。この例証される標識に加えて、当技術分野で公知のその他のFRETドナー−アクセプター対も本発明の実践で使用されてよい。例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)は、融合タンパク質の優れたレポーターモジュールとして一般に採用されている自発的蛍光タンパク質である。GFPの最も重要な特徴は、GFPの変異体が、FRETのドナーおよびアクセプターとして使用され得る顕著なスペクトル特性を示したことである。蛍光タンパク質の最初の対は、比較的低い量子収率、容易な漂白、および高い自己蛍光バックグラウンドをもつ、青色蛍光タンパク質(BFP)ドナーとGFPアクセプターであった(Heim,Methods Enzymol.,302:408−423,1999)。改良版として、より長い波長をもつGFP変異株の対、すなわちシアン蛍光タンパク質(CFP)と黄色蛍光タンパク質(YFP)が、より良好なFRET効率を有することが示された(例えば、Miyawaki et al.,Nature 388:882−887,1997を参照)。その上、サンゴ由来の赤色蛍光タンパク質もクローニングされ、YFPと対にされて、赤色シフトした励起および発光ピークを作り出した(例えば、Mizuno et al.,Biochemistry,40:2502−2510,2001を参照)。本発明の実践で使用されてよいFRETドナー−アクセプター対のさらなる例としては、アミノ安息香酸とニトロ−チロシン;7−メトキシ−3−カルバモイル−4−メチルクマリンとジニトロフェノール;または7−ジメチルアミノ−3−カルバモイル−4−メチルクマリンとダブシルが挙げられる。
関連する態様では、本発明は、Lsp酵素活性を阻害することの可能な作用剤を同定するためのスクリーニング方法を提供する。本発明によれば、細菌Lspの新規な阻害剤は、一般にハイスループットスクリーニング(HTS)形式でインビトロで同定される。スクリーニング方法は、上記のアッセイ系を利用する。それは大腸菌Lsp(または機能性変異体または断片)などの精製されたLsp酵素および脂質化タンパク質またはペプチド基質を含み、被験剤または候補化合物の存在下でLsp触媒活性をモニターする。酵素活性の検出を可能にするために、基質をフルオロフォアおよび蛍光消光剤で標識することができる。Lsp切断活性は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)に基づいて定量化される。本明細書において例証されるように、Lsp酵素は、界面活性剤で可溶化されて、基質タンパク質またはペプチド模倣物での触媒反応を促進する。下に詳述されるスクリーニング方法を実行するための特定のプロトコールに加えて、当技術分野で周知の様々な一般的な生化学および分子生物学の技法またはアッセイを本発明のスクリーニング方法で用いることができる。そのような技法は、例えば、Handbook of Drug Screening,Seethala et al.(eds.),Marcel Dekker(1st ed.,2001);High Throughput Screening:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology,190),Janzen(ed.),Humana Press(1st ed.,2002);Current Protocols in Immunology,Coligan et al.(Ed.),John Wiley & Sons Inc.(2002);Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(3rd ed.,2001);およびBrent et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.(ringbou ed.,2003)に記載されている。
本明細書の実施例3および4に例証されるように、本発明者らが開発したハイスループットスクリーニング形式は、被験剤のライブラリーの各メンバーの存在下で同時にLsp触媒アッセイを実施することによって、Lsp調節剤の同定を可能にする。被験剤の存在下で下方制御されたLsp触媒活性を検出することにより、有望な、すなわち候補Lsp阻害剤を次にこれらの被験剤から得ることができる。候補Lsp阻害剤であるとみなされるためには、下方制御されたLsp活性が、一般に被験化合物のいずれかの不在下で実施したアッセイから得られるベースラインLsp活性から有意な逸脱を示さなければならない。ベースラインレベルまたは活性からの逸脱は、化合物と実験誤差との間の固有の変動のために、Lsp酵素機能に影響を及ぼさないことが公知の対照化合物で一般に観察される範囲から所定のレベルが外れる場合に、有意であるとみなされる。例えば、一部の方法では、逸脱は、所定のレベルが対照化合物のレベルの平均値+1標準偏差の範囲に含まれない場合に有意であるとみなされ得る。一般に、有意な逸脱は、測定されたレベルとベースラインレベルとの間の差が少なくとも20%、30%、または40%である場合に起こる。好ましくは、この差は少なくとも50%または60%である。より好ましくは、この差は少なくとも70%または80%よりも大きい。最も好ましくは、この差は少なくとも90%である。所定の値と、対照化合物の標準的なまたはベースラインの値との間の逸脱の程度も、同定されたヒット化合物の可能性の高い信頼性または阻害機能の指標をもたらす。一部の実施形態では、スクリーニング方法は、スクリーニングアッセイで陽性対照として公知のLsp阻害剤(例えば、グロボマイシン)をさらに用いて、同定されたヒット化合物の可能性の高い活性を評価することができる。
ヒット化合物が最初のスクリーニングで同定されれば、それらは一般にさらなるスクリーニングまたは機能検証を受けることができる。従って、Compounds BBS−8およびBBS−20(図6)およびCompound SR−01000270728−1(図14および15)について本明細書中で例証されるように、一部の実施形態では、ヒット化合物は、インビトロでLsp酵素活性を阻害するその能力を試験されることができる。一部の実施形態では、そのようなインビトロ検証を通過するヒット化合物は、殺菌活性について調べられることができる。これは、化合物との接触が原因で死滅した細胞を検出するのに十分な感受性のあるハイスループットアッセイで実施することができる。一部の実施形態では、候補Lsp阻害剤は、グラム陽性とグラム陰性の両細菌種のパネルを使用する周知の殺菌曲線アッセイによって殺菌活性について調べることができる。例えば、Sanfilippo et al.,Chemother.18:297−303,1973を参照されたい。一部の実施形態では、細菌の死滅は、適した手段によって1以上の生存力指標を調べることによって検出することができる。生存力指標は、生細胞と死細胞を区別するために、または損傷しているが生きている細胞と損傷を受けておらず生きている細胞を区別するために使用することのできるどんなシグナルでもあり得る。一部の実施形態では、生存力指標は、細胞生存力指標と相関する光信号をモニターすることによって調べられる。例えば、蛍光に基づくアッセイは、細菌の生存力を評価するために使用され得る。これらのアッセイの一部は、生細胞と死細胞を区別するために核酸染色を使用する。アッセイおよび使用された染色の多くは、商業的に入手することができる(例えば、Molecular Probes(オレゴン州ユージーン)製LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability KitおよびPromega製BacTiter−Glo(商標)アッセイ)。本発明のLsp阻害化合物の殺菌活性を調べるためのさらなるアッセイは、当技術分野で、例えば、Roth et al.,Appl.Environ.Microbiol.63:2421−2431,1997に記載されている。
一部の実施形態では、同定された候補阻害剤は、細菌リポタンパク質新生を触媒するその他の酵素を阻害する能力についてさらにスクリーニングされ得る。例えば、同定された候補Lsp阻害剤を、リポタンパク質ジアシルグリセリルトランスフェラーゼ(Lgt)の酵素の機能を阻害する能力について試験することができる。あるいは、被験化合物を、Lsp阻害機能について調べる前に、最初にLgt阻害剤についてスクリーニングしてもよい。一部の実施形態では、被験化合物を、LgtとLspの両方の阻害活性について同時にスクリーニングしてよい。そのような二重の阻害活性をもつ候補化合物は、殺菌機能についてさらに分析されることができる。一部のその他の実施形態では、最初のスクリーニングで同定された候補Lsp阻害化合物を例えば合理的設計によって修飾して、改良されたかまたは望ましい生理化学的または薬学的特性を有する類似体または誘導体化合物を生成することができる。そのような類似体または誘導体化合物は、それから、本明細書に記載される後のスクリーニングまたはさらなる機能試験を受けることがある。
無傷のLsp分子または無傷のLsp分子をコードする核酸に加えて、Lsp機能性断片(例えば、基質結合ドメインおよび触媒ドメインを有する断片)、類似体、誘導体、または実質的に同一の配列をもつ変異体タンパク質も、本発明のスクリーニング方法で使用することができる。これらのアッセイで用いることのできるLsp断片は、通常、Lsp分子の生物活性(例えば、そのペプチダーゼ活性)の1以上を保持する。上記のように、異なる種由来のLspは既に配列決定され、酵素の活性部位の描写をはじめとしてよく特徴づけられている。例えば、Jjalsma et al.,J.Biol.Chem.274:28191−28197,1999を参照されたい。そのため、本発明に適したそれらの断片、類似体、誘導体、または融合タンパク質は、当技術分野で周知の方法を用いて容易に得ることができる。例えば、Lspの機能性誘導体は、本明細書に記載される組換え産生されたLspタンパク質から、当業者に公知の従来のタンパク質切断とそれに続く精製手順によって調製することができる。あるいは、機能性誘導体は、その基質結合および酵素活性を保持するLspの断片だけを発現させることによる、組換えDNA技術によって産生させることができる。
V.被験化合物
本発明の方法でスクリーニングされることのできる被験化合物または候補作用剤としては、小分子有機化合物、ポリペプチド、βターンミメティクス、多糖、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーN−置換グリシン、オリゴカルバメート、ポリペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはそれらの組合せが挙げられる。一部の被験剤は合成分子であるが、その他の被験剤は天然分子である。
本発明の方法でスクリーニングされることのできる被験化合物または候補作用剤としては、小分子有機化合物、ポリペプチド、βターンミメティクス、多糖、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーN−置換グリシン、オリゴカルバメート、ポリペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはそれらの組合せが挙げられる。一部の被験剤は合成分子であるが、その他の被験剤は天然分子である。
被験剤は、合成または天然化合物のライブラリーをはじめとする幅広い種類の供給源から得ることができる。コンビナトリアルライブラリーは、段階的な方法で合成することのできる、多種類の化合物について作製することができる。多くの有機小分子のライブラリーは、薬物スクリーニングのために公的にまたは商業的に利用可能であるか、あるいはアクセス可能である。例としては、Maybridge HitFinder ライブラリー(Thermo Fisher)、the Molecular Libraries Small Molecule Repository(NIH)、およびSelleckchem(マサチューセッツ州ボストン)のいくつかの小分子化合物ライブラリーが挙げられる。そのようなライブラリーは、例えば、当技術分野においてCarell et al.,Chem.& Biol.2:171−183,1995に記載されるように合成することもできる。小分子化合物の大型のコンビナトリアルライブラリーは、「DNAにコードされた化学物質ライブラリー」(DEL)または「コードされた合成ライブラリー」(ESL)法によって構築することもできる。これは、前例のない大きさの小分子化合物のコレクションを合成およびスクリーニングするための技術である。DELは、コンビナトリアルケミストリーと分子生物学の分野に橋を架けるために医薬品化学で使用されている。DELライブラリーを構築するための詳細な手順は、国際公開第95/12608号、国際公開第93/06121号、国際公開第94/08051号、国際公開第95/35503号および国際公開第95/30642号に記載されている。ペプチドライブラリーは、ファージディスプレイ方法によっても生成することができる(例えば、Devlin、国際公開第91/18980号参照)。細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、商業的に入手可能な供給源から得るかまたは当分野で収集することができる。公知の薬理学的作用剤は、定方向もしくはランダム化学修飾、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などに付して構造類似体を生成することができる。
小分子、ペプチドまたはその他の化合物のコンビナトリアルライブラリーは、完全に無作為化されることができ、どんな位置にも好ましい化合物の基または配列が優先的にまたは定常的に存在しない。あるいは、ライブラリーにバイアスをかける、すなわち一部の有機化合物の基またはペプチド配列内の位置を一定に保持することができる。例えば、一部の例では、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基は、定義されたクラスの中で、例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的にバイアスをかけた(小さいかまたは大きい)残基の中で、架橋のためのシステインの作製、SH−3ドメインのためのプロリン、リン酸化部位のためのセリン、トレオニン、チロシンまたはヒスチジン、あるいはプリンが生じるよう無作為化される。
被験剤は、天然に存在するタンパク質またはそれらの断片であり得る。そのような被験剤は天然源、例えば、細胞または組織溶解液から得ることができる。ポリペプチド作用剤のライブラリーはまた、例えば、商業的に入手可能であるかまたは日常的な方法で生成したcDNAライブラリーからも作製することができる。被験剤は、ペプチド、例えば、約5〜約30アミノ酸のペプチドであってもよく、約5〜約20アミノ酸が好ましく、約7〜約15が特に好ましい。ペプチドは、天然に存在するタンパク質、ランダムペプチド、または「バイアスをかけた」ランダムペプチドの消化物であり得る。一部の方法では、被験剤はポリペプチドまたはタンパク質である。被験剤は核酸でもあり得る。核酸被験剤は、天然に存在する核酸、ランダム核酸、または「バイアスをかけた」ランダム核酸であり得る。例えば、原核生物または真核生物ゲノムの消化物は、タンパク質について上に記載されるのと同様に使用されることができる。
一部の好ましい方法では、被験剤は、小分子、例えば、分子量がせいぜい約500または1,000の分子である。好ましくは、ハイスループットアッセイをそのような小分子をスクリーニングするために適合させて使用する。一部の方法では、上記のような小分子被験剤のコンビナトリアルライブラリーは、本明細書に記載されるアッセイ系によって、Lspの小分子修飾物質をスクリーニングするために容易に用いることができる。小分子化合物のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするためのいくらかの一般的なガイダンスは当技術分野でも提供される。例えば、Schultz et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett 8:2409−2414,1998;Weller et al.,Mol.Divers.3:61−70,1997;Fernandes et al.,Curr.Opin.Chem.Biol.2:597−603,1998;およびSittampalam et al.,Curr.Opin.Chem.Biol.1:384−91,1997を参照されたい。本発明のハイスループットスクリーニング方法に適した小分子化合物の例となるライブラリーは、下の実施例4に記載される。
一部の実施形態では、本発明のスクリーニング方法で用いられる被験剤は、既知化合物から生成される類似体または誘導体化合物である。例えば、被験剤は、グロボマイシンの誘導体または類似体であり得る。グロボマイシンはLsp阻害剤である。グロボマイシンは、数種類のストレプトマイセス属(Streptomyces)の種から作製され、Lspの阻害を通してグラム陰性細菌を阻害するペプチド抗生物質である。グロボマイシン誘導体も、グラム陽性細菌に対して強力な活性を有することが示されている。一部のその他の実施形態では、被験剤は、本明細書において同定される特異的Lsp阻害化合物、例えば、Compound BBS−8、Compound BBS−20、またはCompound 01000270728−1などの図12に示される化合物のいずれかから誘導された類似体であり得る。これらのベース化合物に基づく類似体または誘導体化合物は、下に記載される本開示に従って調製することができる。既知化合物の類似体または誘導体化合物は、一般に、既知化合物と比較して改良された生物学的または薬学的特性をもつ作用剤を同定するためにスクリーニングされる。
特許請求される方法によってスクリーニングされる被験剤のライブラリーは、Lsp酵素、それらの断片または類似体の構造研究に基づいて生成することもできる。そのような構造研究は、Lspポリペプチドと結合する可能性のより高い被験剤の同定を可能にする。Lspポリペプチドの三次元構造は、いくつかの方法、例えば、結晶構造および分子モデリングで研究することができる。x線結晶学を用いてタンパク質構造を研究する方法は文献において周知である。Physical Bio−chemistry,Van Holde,K.E.(Prentice−Hall,New Jersey 1971),221−239頁、およびPhysical Chemistry with Applications to the Life Sciences,D.Eisenberg & D.C.Crothers(Benjamin Cummings,Menlo Park 1979)を参照されたい。Lspポリペプチド構造のコンピュータ・モデリングは、Lsp阻害剤をスクリーニングするための被験物質を設計するための別の手段をもたらす。分子モデリングの方法は、文献、例えば、米国特許第5,612,894号、標題「System and method for molecular modeling utilizing a sensitivity factor」、および米国特許第5,583,973号、標題「Molecular modeling method and system」に記載されている。その上、タンパク質構造は、中性子回折法および核磁気共鳴法(NMR)によっても決定することができる。例えば、Physical Chemistry,4th Ed.Moore,W.J.(Prentice−Hall,New Jersey 1972)、およびNMR of Proteins and Nucleic Acids,K.Wuthrich(Wiley−Interscience,New York 1986)を参照されたい。
VI.改良された特性をもつ新規なLsp阻害剤およびその類似体
Lsp触媒活性をモニターし、定量化するための本発明のインビトロアッセイ系により、本発明者らが新規なLsp阻害化合物を同定することが可能になった。パイロットスクリーニングから同定されたそのような新規なLsp阻害化合物の2つの例が、3−(4−((8R,9S,13S,14S)−3−((フルオロスルホニル)オキシ)−17−ヒドロキシ−13−メチル−7,8,9,11,12,13,14,15,16,17−デカヒドロ−6H−シクロペンタ[a]フェナントレン−17−イル)−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)−N,N,N−トリメチルプロパン−1−アミニウム(本明細書中では、別称「BBS−8」)および2−(4−(2−(ジエチルアミノ)エチル)−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)−N−(((1R,4aS,10aR)−7−イソプロピル−1,4a−ジメチル−1,2,3,4,4a,9,10,10a−オクタヒドロフェナントレン−1−イル)メチル)アセトアミド(本明細書中では、別称「BBS−20」)である。実施例で詳述されるように、スクリーニングから同定されたこれらの2つのヒットを、様々な濃度の化合物を使用してLsp触媒機能へのそれらの阻害効果を評価することによってインビトロでさらに検証した。本明細書中の実施例4に詳述されるように、さらなる超ハイスループットスクリーニング形式によって、多数のさらなるLsp阻害化合物が得られた。スクリーニングで同定された活性化合物の中で、一部の化合物の選択的Lsp阻害活性を二次アッセイによって確認した(図12)。これらのさらなるLsp阻害剤の1つである、Compound SR−010000270728−1は、優れた機能プロフィールおよび構造特性を実証した(図13)。本明細書において同定されるいくつかのその他のLsp阻害剤のLsp阻害活性を図4および14に示す。本明細書に記載されるように、本発明の特異的Lsp阻害化合物、それらの類似体、および機能性誘導体または変異体は、全て抗菌薬または治療薬として使用することができる。
Lsp触媒活性をモニターし、定量化するための本発明のインビトロアッセイ系により、本発明者らが新規なLsp阻害化合物を同定することが可能になった。パイロットスクリーニングから同定されたそのような新規なLsp阻害化合物の2つの例が、3−(4−((8R,9S,13S,14S)−3−((フルオロスルホニル)オキシ)−17−ヒドロキシ−13−メチル−7,8,9,11,12,13,14,15,16,17−デカヒドロ−6H−シクロペンタ[a]フェナントレン−17−イル)−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)−N,N,N−トリメチルプロパン−1−アミニウム(本明細書中では、別称「BBS−8」)および2−(4−(2−(ジエチルアミノ)エチル)−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)−N−(((1R,4aS,10aR)−7−イソプロピル−1,4a−ジメチル−1,2,3,4,4a,9,10,10a−オクタヒドロフェナントレン−1−イル)メチル)アセトアミド(本明細書中では、別称「BBS−20」)である。実施例で詳述されるように、スクリーニングから同定されたこれらの2つのヒットを、様々な濃度の化合物を使用してLsp触媒機能へのそれらの阻害効果を評価することによってインビトロでさらに検証した。本明細書中の実施例4に詳述されるように、さらなる超ハイスループットスクリーニング形式によって、多数のさらなるLsp阻害化合物が得られた。スクリーニングで同定された活性化合物の中で、一部の化合物の選択的Lsp阻害活性を二次アッセイによって確認した(図12)。これらのさらなるLsp阻害剤の1つである、Compound SR−010000270728−1は、優れた機能プロフィールおよび構造特性を実証した(図13)。本明細書において同定されるいくつかのその他のLsp阻害剤のLsp阻害活性を図4および14に示す。本明細書に記載されるように、本発明の特異的Lsp阻害化合物、それらの類似体、および機能性誘導体または変異体は、全て抗菌薬または治療薬として使用することができる。
リードLsp阻害化合物の発見ならびに本明細書に記載されるインビトロLspアッセイ系の有効性によって、本発明は、改良された特性をもつ既知のLsp阻害化合物の類似体または誘導体を同定するためのスクリーニング方法を提供する。創薬プロセスの重要なステップは、化学類似体プログラムの基になる、適したリード化学鋳型の選択である。所与分子標的のためのリード化学鋳型を同定するプロセスは、一般に、機能アッセイにおいて多数の化合物(多くの場合100,000個超)をスクリーニングし、活性を確認するための二次アッセイで試験するためのいくらかの任意の活性閾値に基づくサブセットを選択し、その後、化学的合成(chemical elaboration)の適合性について残りの活性化合物を評価することを伴う。
本明細書に記載されるLsp阻害化合物、例えば、図4、6および14に示される化合物、ならびにその他の公知のLsp阻害剤(例えば、グロボマイシン)は、改良された生物学的または薬学的特性を有する関連する化合物を探すためのリード化合物をもたらす。例えば、これらの化合物の類似体または誘導体は、Lspに対する高い親和性を有するか、良好な阻害プロフィールを有するか、あるいはインビトロまたはインビボでの安定性の向上した化合物を同定するためにスクリーニングされることができる。そのような改良された特性をもつ化合物は、様々な薬学的適用に一層適している。その他の実施形態では、そのような類似体または誘導体化合物は、2回目またはそれ以降の本発明のスクリーニング方法で被験剤として使用することができる。
これらの方法は、一般に、既知Lsp阻害剤(例えば、Compound SR−010000270728−1、Compound BBS−8またはBBS−20)の類似体、誘導体または変異体を合成することを伴う。多くの場合、Lsp阻害剤の構造類似体のライブラリーは、スクリーニングのために作製される。次に、機能アッセイを実施して、類似体または変異体が誘導されるリード化合物のものと比較して改良された生物学的特性を有する類似体または誘導体の1つを同定する。一部の実施形態では、類似体はLsp触媒活性を阻害する能力の向上についてスクリーニングされる。一部の実施形態では、それらは、より良好な薬学的特性、例えば、安定性をもつ化合物を同定するためにアッセイされることができる。
既知のまたは現在記載されるLsp阻害剤の化学骨格に基礎を置く類似体または誘導体を合成するために、当業者に周知の有機化学の日常的に行われる方法だけが必要とされる。一部の実施形態では、既知化合物の類似体は、例えば、Rostovtsev et al.,Angew.Chem.Int.Ed.41:2596−2599,2002;およびHimo et al.,J.Am.Chem.Soc.127:210−216,2005に記載されるように一般的な「クリック」化学に従って化合物を修飾することによって生成することができる。実例として、類似体または誘導体化合物を生成するためにCompound BBS−20に行うことのできるいくつかの修飾を図9に示す。一部の実施形態では、既知化合物の化学類似体のコンビナトリアルライブラリーは、上記の方法を用いて作製することができる。様々な化合物の類似体を合成するための例となる方法は、例えば、Overmanによる、Organic Reactions,Volumes 1−62,Wiley−Interscience(2003);Broom et al.,Fed Proc.45:2779−83,1986;Ben−Menahem et al.,Recent Prog.Horm.Res.54:271−88,1999;Schramm et al.,Annu.Rev.Biochem.67:693−720,1998;Bolin et al.,Biopolymers 37:57−66,1995;Karten et al.,Endocr.Rev.7:44−66,1986;Ho et al.,Tactics of Organic Synthesis,Wiley−Interscience;(1994);およびScheit et al.,Nucleotide Analogs:Synthesis and Biological Function,John Wiley & Sons(1980)に記載されている。
その上、日常的に行われるアッセイのいずれか(例えば、結合実験)を用いてLsp阻害剤の類似体または誘導体において改良された特性(例えば、Lspに対する結合親和性または阻害プロフィールの向上)を同定することができる。用いることのできるさらなる生化学的または薬学的アッセイも周知であり、当技術分野で日常的に行われている。例えば、類似体化合物の改良された安定性は、例えば、Di et al.,Comb.Chem.High throughput Screen.11:469−76,2008;およびRemington’s Pharmaceutical Sciences,18th ed.,Mack Publishing Co.(1990)に記載される方法などを用いてアッセイすることができる。
VII.治療適用
Lsp阻害剤についての本発明のHTSアッセイは、グラム陽性およびグラム陰性の生物に対して強力な殺菌活性をもつ新規な抗生剤の同定を可能にする。実際に、本明細書中で例証されるCompound BBS−20のような非競合的機構によってLspを阻害することが示された、天然に存在する環状ペプチドグロボマイシンは、殺菌性である。従って、本明細書に記載される特異的Lsp阻害化合物(例えば、Compound BBS−8、Compound BBS−20、または図12に示される化合物のいずれか、例えばCompound 01000270728−1など)、ならびにそれらの類似体または機能性変異体(例えば、図9に示される化合物)は、様々な治療適用で使用されることができる。一部の実施形態では、これらの化合物を用いて、微生物細胞(例えば、細菌)中でLsp触媒活性を阻害するか、または微生物の増殖を阻害することができる。微生物細胞は、インビトロかまたは(被験体の)インビボに存在してよい。一部の実施形態では、本発明は、様々な被験体において細菌感染症を治療するための方法、ならびに微生物感染に起因するかそれに媒介される疾患および状態を治療するための方法を提供する。本発明の一部の実施形態は、細菌感染症に関連するかまたはそれに付随する疾患を治療するための方法に向けられる。
Lsp阻害剤についての本発明のHTSアッセイは、グラム陽性およびグラム陰性の生物に対して強力な殺菌活性をもつ新規な抗生剤の同定を可能にする。実際に、本明細書中で例証されるCompound BBS−20のような非競合的機構によってLspを阻害することが示された、天然に存在する環状ペプチドグロボマイシンは、殺菌性である。従って、本明細書に記載される特異的Lsp阻害化合物(例えば、Compound BBS−8、Compound BBS−20、または図12に示される化合物のいずれか、例えばCompound 01000270728−1など)、ならびにそれらの類似体または機能性変異体(例えば、図9に示される化合物)は、様々な治療適用で使用されることができる。一部の実施形態では、これらの化合物を用いて、微生物細胞(例えば、細菌)中でLsp触媒活性を阻害するか、または微生物の増殖を阻害することができる。微生物細胞は、インビトロかまたは(被験体の)インビボに存在してよい。一部の実施形態では、本発明は、様々な被験体において細菌感染症を治療するための方法、ならびに微生物感染に起因するかそれに媒介される疾患および状態を治療するための方法を提供する。本発明の一部の実施形態は、細菌感染症に関連するかまたはそれに付随する疾患を治療するための方法に向けられる。
本発明のLsp調節化合物による治療に従う疾患または状態は、被験体、特にヒト被験体の、Lsp酵素を発現する任意の細菌またはその他の微生物(例えば、ブドウ球菌属の種またはバチルス属(Bacillus)の種)による感染を含む。細菌感染症に起因するかまたは付随するヒト疾患の具体例としては、例えば、結核(マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)に起因)、肺炎(連鎖球菌属およびシュードモナス属に起因)、胃炎および潰瘍(ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)に起因)、食物由来の疾病(大腸菌、赤痢菌属(Shigella)、カンピロバクター属(Campylobacter)、およびサルモネラ属(Salmonella)などの細菌に起因)、淋病(淋菌(Neisseria gonorrhoeae)に起因)、髄膜炎(ナイセリア・メニンジチデス(Neisseria meningitides)に起因)、破傷風、腸チフス、ジフテリア、梅毒、およびハンセン病が挙げられる。
Lsp阻害化合物は、病原性細菌の保菌者である被験体を治療するために有用である。これらの化合物は、活動性細菌感染症と診断されている被験体を治療するために使用することができる。これらの化合物は、そのような被験体における細菌感染症に関連する状態の治療または予防にも有用である。細菌感染症関連疾患(例えば、ループス)に罹っていると診断されていないが、病原性細菌に感染していると思われる被験体、および疾患を発症するリスクがある被験体も、本発明のLsp阻害化合物による治療を受けることができる。
本発明のLsp阻害剤は、無菌条件下で治療する被験体に直接投与することができる。化合物は、単独で投与されてもよいし、医薬組成物の有効成分として投与されてもよい。本発明の治療組成物はまた、細菌感染症を治療するためのその他の治療薬(例えば、その他の公知の抗生物質)と組み合わされてもよいし、その他の治療薬を伴って使用されてもよい。一部の適用では、1種類のLsp阻害剤を個別に使用した場合に達成できない、より広範な程度まで細菌感染症を阻害するために、第1のLsp阻害剤は、第2のLsp阻害剤と組み合わせて使用される。一部のその他の適用では、本発明のLsp調節化合物は、ペニシリンなどの公知の抗生剤と組み合わせて使用されることがある。
本発明は、本明細書に記載される特異的Lsp阻害剤またはそれらの機能性誘導体から導かれる医薬組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、一般に少なくとも1つのLsp特異的阻害剤を有効成分として含む。この組成物は、その1以上の許容され得る担体または賦形剤も含んでよい。一部の実施形態では、本発明の医薬組成物の有効成分は、本明細書に記載されるLsp阻害化合物からなるか、またはそれから本質的になる。薬学的に許容され得る担体は、組成物を向上または安定化させるか、あるいは組成物の調製を促進する。薬学的に許容され得る担体は、一部分、投与される特定の組成物(例えば、核酸、タンパク質、または小分子)によって、ならびに組成物を投与するために用いられる特定の方法によって決定される。それらは、その他の成分と適合し、被験体に対して傷害性でないという意味において薬学的にも生理学的にも許容され得るべきである。この担体は、投与(例えば、経口、舌下、直腸、鼻腔、静脈、または非経口)に望ましい調製形態に応じて、幅広い種類の形態をとることができる。例えば、Lsp阻害化合物は、安定性または薬理学的特性を向上させるために、投与の前にオボアルブミンまたは血清アルブミンなどの担体タンパク質と複合体化することができる。
医薬組成物は、様々な形態、例えば顆粒剤、錠剤、丸剤、坐剤、カプセル剤、および同類のものに調製することができる。製剤中の治療活性化合物の濃度は、約0.1から100重量%まで変動することがある。治療用製剤は、薬学分野で周知のあらゆる方法によって調製される。治療用製剤は、治療に使用され得るあらゆる効果的な手段によって送達されることができる。例えば、Goodman & Gilman’s The Pharmacological Bases of Therapeutics,Hardman et al.,eds.,McGraw−Hill Professional(10th ed.,2001);Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Gennaro(ed.),Lippincott Williams & Wilkins(20th ed.,2003);および Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Deliver Systems,Ansel et al.(eds.),Lippincott Williams & Wilkins(7th ed.,1999)を参照されたい。
治療用製剤は、便宜に単位剤形で提示され、適した治療用量で投与されることができる。適した治療用量は、最大耐用量を決定するための哺乳類種での臨床研究および安全な投薬量を決定するための正常なヒト被験体での臨床研究などの周知の方法のいずれかによって決定することができる。より高い投薬量が必要とされる可能性のある、ある特定の状況下を除いて、Lsp阻害化合物の好ましい投薬量は、一般に1日あたり約0.001〜約1000mgの範囲内、さらに一般に約0.01〜約500mgである。
Lsp阻害剤の好ましい投薬量および投与様式は、治療にあたる医師が個々に検討することのできる要素、例えば治療する1または複数の状態、投与される組成物(特定のLsp阻害剤を含む)の選択、個々の被験体の年齢、体重、および応答、被験体の症状の重症度、ならびに選択された投与経路などに応じて、異なる被験体に対して変わり得る。一般に、投与されるLsp阻害剤の量は、被験体の状態を効果的にかつ確実に防ぐかまたは最小に抑える最小投薬量である。そのため、上の投薬量の範囲は、本明細書中の教示についての一般的なガイダンスおよびサポートを提供するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
[実施例]
以下の実施例は、本発明を説明するために提供されるものであり、本発明を制限するために提供されるものではない。
以下の実施例は、本発明を説明するために提供されるものであり、本発明を制限するために提供されるものではない。
[実施例1]:リポタンパク質シグナルペプチダーゼ(Lsp)の発現および精製
本発明者らは、組換え産生され、可溶化された機能性Lsp酵素を得るための戦略を開発した。全長大腸菌Lspクローンを、順方向プライマーCGCCATATGAGTCAATCGATCTGTTCAACAG(配列番号1)および逆方向プライマーCGCGGATCCTTATTGTTTTTTCGCTTTAGAAGGTAAAAAACC(配列番号2)を用いる大腸菌K12のコロニーPCRを用いて生成し、二本鎖プラスミド配列決定によって検証した。次に、本発明者らは、Lspタンパク質を、大腸菌BL21(DE3)pLysSコンピテント細胞(Agilent)中でpET19bベクター(Agilent)とのN末端His9タグ付き融合物として過剰発現させた。具体的に言うと、細胞を、37℃の100μg/mlカルベニシリンおよび35μg/mlクロラムフェニコールを添加した2xYT培地でOD600nmが0.6になるまで増殖させた。次にフラスコを16℃に移行させ、タンパク質発現を0.1mM IPTGで一晩誘導した。細胞を回収し、氷冷溶解緩衝液(1mg/mlリゾチーム、0.1mg/ml DNアーゼ、1mM MgCl2、1mM CaCl2を添加したPBS、5% v/vグリセロール、pH7.4)に再懸濁し、微小流動化(Microfluidics)による2サイクルの溶解に付した。
本発明者らは、組換え産生され、可溶化された機能性Lsp酵素を得るための戦略を開発した。全長大腸菌Lspクローンを、順方向プライマーCGCCATATGAGTCAATCGATCTGTTCAACAG(配列番号1)および逆方向プライマーCGCGGATCCTTATTGTTTTTTCGCTTTAGAAGGTAAAAAACC(配列番号2)を用いる大腸菌K12のコロニーPCRを用いて生成し、二本鎖プラスミド配列決定によって検証した。次に、本発明者らは、Lspタンパク質を、大腸菌BL21(DE3)pLysSコンピテント細胞(Agilent)中でpET19bベクター(Agilent)とのN末端His9タグ付き融合物として過剰発現させた。具体的に言うと、細胞を、37℃の100μg/mlカルベニシリンおよび35μg/mlクロラムフェニコールを添加した2xYT培地でOD600nmが0.6になるまで増殖させた。次にフラスコを16℃に移行させ、タンパク質発現を0.1mM IPTGで一晩誘導した。細胞を回収し、氷冷溶解緩衝液(1mg/mlリゾチーム、0.1mg/ml DNアーゼ、1mM MgCl2、1mM CaCl2を添加したPBS、5% v/vグリセロール、pH7.4)に再懸濁し、微小流動化(Microfluidics)による2サイクルの溶解に付した。
膜タンパク質を可溶化するために、n−ドデシルβ−D−マルトシド(DDM)を添加して、0.8% w/vの最終濃度を得、溶解液を4℃で2時間撹拌した。溶出緩衝液(PBS、5% グリセロール、0.1% DDM、500mMイミダゾール、pH7.4)を添加して最終イミダゾール濃度を20mMとした。次に、解明されていない溶解液を1ml HisTrap FF crude Ni−NTAアフィニティーカラム(GE)に装入した。カラムを洗浄緩衝液(PBS、5%グリセロール、0.1% DDM、20mMイミダゾール、pH7.4)で予備平衡化し、20カラム容量を上回る直線勾配で溶出した。溶出したタンパク質を直ちにPBS、5%グリセロール、0.1% DDM、pH7.4でゲル濾過クロマトグラフィー(Superdex 200、GE)にかけた。Lspを含有する画分にグリセロールを添加して最終濃度を20%とし、液体窒素で凍らせ、−80℃で貯蔵した。純粋なLsp収量は、SDS−PAGEによって評価して、約1mg/L培養液で純度>95%であると本発明者らは判断した。
このタンパク質はグラム陽性とグラム陰性の両方の種で高度に保存されているので、大腸菌Lspに加えて、本発明者らは多様な細菌種由来のLspもクローニングし、発現させた。大腸菌Lspのために開発した同じ戦略を用いて、本発明者らは、化膿連鎖球菌およびサーモトガ・マリチマ由来のLspをクローニングし、発現させ、精製した。結果は、全てのLspタンパク質が、種に関わらず、pETベクター(例えば、pET19b)に同様にクローニングされ、大腸菌Lspについて記載されるように精製され得ることを示す。
[実施例2]Lsp FRET基質の合成
Lsp FRETペプチド基質配列Dabsyl−VTGC((R)−2,3−ジ(パルミトイルオキシ)−プロピル)AKD(EDANS)(図1)は、化膿連鎖球菌(NCBI参照配列:NP_269874)由来の推定酸性ホスファターゼのリポボックス領域に基づいた。この配列は、既知リポタンパク質配列または共通のリポボックス残基の並べ替えに基づく、様々な長さのリポタンパク質模倣ペプチドのライブラリーからの組換え精製大腸菌Lspを用いるアッセイにおいて最大シグナル対バックグラウンドを得るために選択された。ペプチドは、FRET蛍光ドナーとアクセプターの対、EDANS/Dabsylを使用して、NovaSyn TGR 樹脂(EMD Millipore)で標準的なFmoc固相合成化学を用いて合成された。具体的に言うと、Fmoc−(R)−Cys((R)−2,3−ジ(パルミトイルオキシ)−プロピル)−OHを、Hida et al.,J.Antibiot.(Tokyo)48,589−603,1995に従って、純粋なジアステレオマーとして調製した。ペプチドカップリングは、ジメチルホルムアミド(DMF)中、3当量のFmoc−アミノ酸、3当量のベンゾトリアゾール−1−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート(PyBOP)、および6等量のジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)を室温で1時間使用して実施し、脱保護は、DMF中、20% v/vピロリジンを15分間使用して実施した。EDANSは、Fmoc−Asp(EDANS)−OHによって導入し、Dabsylは、3等量のダブシルクロライドおよび6等量のDIPEAで一晩の反応によって導入した。
Lsp FRETペプチド基質配列Dabsyl−VTGC((R)−2,3−ジ(パルミトイルオキシ)−プロピル)AKD(EDANS)(図1)は、化膿連鎖球菌(NCBI参照配列:NP_269874)由来の推定酸性ホスファターゼのリポボックス領域に基づいた。この配列は、既知リポタンパク質配列または共通のリポボックス残基の並べ替えに基づく、様々な長さのリポタンパク質模倣ペプチドのライブラリーからの組換え精製大腸菌Lspを用いるアッセイにおいて最大シグナル対バックグラウンドを得るために選択された。ペプチドは、FRET蛍光ドナーとアクセプターの対、EDANS/Dabsylを使用して、NovaSyn TGR 樹脂(EMD Millipore)で標準的なFmoc固相合成化学を用いて合成された。具体的に言うと、Fmoc−(R)−Cys((R)−2,3−ジ(パルミトイルオキシ)−プロピル)−OHを、Hida et al.,J.Antibiot.(Tokyo)48,589−603,1995に従って、純粋なジアステレオマーとして調製した。ペプチドカップリングは、ジメチルホルムアミド(DMF)中、3当量のFmoc−アミノ酸、3当量のベンゾトリアゾール−1−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート(PyBOP)、および6等量のジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)を室温で1時間使用して実施し、脱保護は、DMF中、20% v/vピロリジンを15分間使用して実施した。EDANSは、Fmoc−Asp(EDANS)−OHによって導入し、Dabsylは、3等量のダブシルクロライドおよび6等量のDIPEAで一晩の反応によって導入した。
ペプチド合成が終了した後、室温で2時間、トリフルオロ酢酸、トリイソプロピルシラン、および水(95%、2.5%、2.5% v/v/v)のカクテルによって、基質を樹脂から遊離させた。粗基質は、XBridge Amideカラム(Waters)およびメタノール/ジクロロメタン移動相を15〜100%メタノールの直線勾配で使用する、順相HPLCによって精製した。Dabsyl−VTGC((R)−2,3−ジ(パルミトイルオキシ)−プロピル)AKD(EDANS)の最終純度は、95%(HPLC)を上回り、質量分析によって検証した:予測値 m/z 1776.96、LC/MS(ESI)m/z 1777.97(M+H−)および889.99(M+2H−)。アッセイ緩衝液(PBS、5%グリセロール、0.5% DDM pH7.4)中の400nMの精製されたLspによるペプチドの加水分解についてのミカエリス−メンテン反応速度測定値は、KM=20±5μMとなり、100μMを超える見かけの基質阻害は明白である。
Lsp活性をアッセイするためのFRET基質において、本発明者らは、特定のペプチドを、脂質化(lapidated)Cys残基を含むどんなペプチド配列とも置き換えることができる。例えば、本発明者らは、ブラウンのリポタンパク質、ならびに図1の特定のペプチドの例のいくつかの異なる長さおよびアミノ酸置換に基づいてFRET基質を作製した。
[実施例3]Lsp阻害剤についてのハイスループットスクリーニング
精製し可溶化したLsp酵素を用いて、本発明者らは、膜内在性プロテアーゼLspのためのインビトロハイスループット機能性スクリーニングを開発した。最初に、Maybridge HitFinder ライブラリー(Thermo Fisher)のスクリーニングを、黒色ポリスチレン製384ウェル低容量プレート(Greiner #788076)でBioRAPTR試薬ディスペンサー(Beckman Coulter)を使用して行った。精製したLspを、アッセイ緩衝液(PBS、5%グリセロール、0.5% DDM pH7.4)中500nMに希釈し、このストック10μLを各ウェルに添加した。次に、ライブラリー化合物の2mMストック100nLを各ウェルに固定し、プレートを暫く遠心した。室温で30分間のインキュベーションの後、25%ジメチルスルホキシド(DMSO)、75%アッセイ緩衝液中250μMのLsp FRET基質2.5μLを各ウェルに添加した。プレートを遠心沈殿し、室温で30分間インキュベートした。水中500mM塩化亜鉛を含有する溶液2.5μLでアッセイをクエンチし、83mMの最終濃度を得た。この活性測定法の間のLspの濃度、FRET基質、およびライブラリー化合物は、それぞれ400nM、50μM、および16μMであった。アッセイの最終DMSO濃度は5%であり、最大のLsp活性は5〜10%のDMSOで生じる。
精製し可溶化したLsp酵素を用いて、本発明者らは、膜内在性プロテアーゼLspのためのインビトロハイスループット機能性スクリーニングを開発した。最初に、Maybridge HitFinder ライブラリー(Thermo Fisher)のスクリーニングを、黒色ポリスチレン製384ウェル低容量プレート(Greiner #788076)でBioRAPTR試薬ディスペンサー(Beckman Coulter)を使用して行った。精製したLspを、アッセイ緩衝液(PBS、5%グリセロール、0.5% DDM pH7.4)中500nMに希釈し、このストック10μLを各ウェルに添加した。次に、ライブラリー化合物の2mMストック100nLを各ウェルに固定し、プレートを暫く遠心した。室温で30分間のインキュベーションの後、25%ジメチルスルホキシド(DMSO)、75%アッセイ緩衝液中250μMのLsp FRET基質2.5μLを各ウェルに添加した。プレートを遠心沈殿し、室温で30分間インキュベートした。水中500mM塩化亜鉛を含有する溶液2.5μLでアッセイをクエンチし、83mMの最終濃度を得た。この活性測定法の間のLspの濃度、FRET基質、およびライブラリー化合物は、それぞれ400nM、50μM、および16μMであった。アッセイの最終DMSO濃度は5%であり、最大のLsp活性は5〜10%のDMSOで生じる。
触媒シグナルを、DMSOだけで固定した全酵素活性として定義し、Lspを含まないアッセイ緩衝液に基質を添加することによってバックグラウンドシグナルを測定した。3,200の化合物の最初のスクリーニング(図2)により、Z`=0.79、シグナル対バックグラウンド比(S/B)=2.1、平均阻害%(μ)=−4.32、阻害%の標準偏差(σ)=20.89を得た。μ+3σのカットオフに対して、ヒット率は0.15%であった。それよりも大きい12,800化合物のスクリーニング(図3)は、Z`=0.74、S/B=2.0、μ=−3.66、σ=16.90をもたらした。μ+3σのカットオフに対して、ヒット率は0.3%であった。最大阻害%でのヒットは、主に既知の非特異的反応性または汎試験干渉性(pan−assay interference)をもつ化合物からなった(図4。その上、Sharpless実験室化合物のスクリーニング(図5)を、各々の化合物がスクリーニングプレートに三つ組で存在したことを除いて全く同じように実施し、Z`=0.86およびS/B=2.2を得た。
Sharplessライブラリーから、本発明者らはテルペノイド天然物に基づく2つの阻害剤を同定した:BBS−8、フルオロスルホン酸頭部(warhead)を導入したA環水酸基を含むエストラジオール誘導体、およびBBS−20、リールアミン(leelamine)誘導体(図6)。本発明者らは、様々な濃度のBBS−20の400nM精製Lspに対する阻害を検証し、IC50を15±4μMと計算した(図7)。本発明者らは、数種類の固定濃度のBBS−20を様々な濃度のLsp FRET基質に対して試験して、阻害の機構を求めた(図8)。BBS−20の濃度を高めていくと酵素の最大初期速度は低下するが、誤差の範囲内の見かけのKMは低下せず、ペプチドLsp阻害剤グロボマイシンと同様の非競合的な様式の阻害が示される。
BBS−20について示されるように、全てのヒットは、本発明者らのインビトロFRET基質切断アッセイを用いて再検証することができる。その上、二次インビトロ検証アッセイを実施することができる。このアッセイは、ゲル濾過サイズ排除クロマトグラフィーおよび/またはHPLCによる基質切断の検出を伴う。Lspと小分子阻害剤の結合速度は、表面プラズモン共鳴法(SPR)ならびに等温滴定型熱量測定(ITC)での結合イベントに起因する放出熱によって測定することができる。多様な細菌種由来のLspの結晶構造も調査することができ、それは全ての阻害剤の発見および進歩を助けることになる。さらに、インビトロ検証アッセイを通過する目的の小分子を、グラム陰性およびグラム陽性の細菌のパネルを用いる殺菌曲線アッセイに付して、殺菌剤として使用する有効性を求めることができる。
[実施例4]超ハイスループットスクリーニングおよびLsp阻害剤の検証アッセイ
本発明者らは、膜内在性プロテアーゼLspについての本発明者らのインビトロハイスループット機能性スクリーニングをさらに最適化し、1,536ウェル形式に小型化した。646,275のScripps Drug Discovery Library(SDDL)化合物の一次スクリーニングをThe Scripps Research Institute,Florida(TSRI FL)で行った。精製したLspを、アッセイ緩衝液(PBS、5%グリセロール、10mM DTT、0.5% DDM pH7.4)中200nMに希釈し、このストック4μLを各ウェルに添加した。次に、50nLのストックTSRI FLライブラリー化合物を各ウェルに固定して最終濃度8.4μMとし、プレートを暫く遠心した。室温で30分間のインキュベーションの後、25%ジメチルスルホキシド(DMSO)、75%アッセイ緩衝液中1μLのLsp FRET基質を各ウェルに添加して、最終基質濃度を20μMとした。プレートを遠心沈殿し、室温で60分間インキュベートした。水中500mM塩化亜鉛を含有する溶液1μLでアッセイをクエンチし、83mMの最終濃度を得た。アッセイの最終DMSO濃度は5%であり、最大のLsp活性は5〜10%のDMSOで生じる(図10)。蛍光をEnVisionプレートリーダーで測定した(励起355nm;発光495nm)。
本発明者らは、膜内在性プロテアーゼLspについての本発明者らのインビトロハイスループット機能性スクリーニングをさらに最適化し、1,536ウェル形式に小型化した。646,275のScripps Drug Discovery Library(SDDL)化合物の一次スクリーニングをThe Scripps Research Institute,Florida(TSRI FL)で行った。精製したLspを、アッセイ緩衝液(PBS、5%グリセロール、10mM DTT、0.5% DDM pH7.4)中200nMに希釈し、このストック4μLを各ウェルに添加した。次に、50nLのストックTSRI FLライブラリー化合物を各ウェルに固定して最終濃度8.4μMとし、プレートを暫く遠心した。室温で30分間のインキュベーションの後、25%ジメチルスルホキシド(DMSO)、75%アッセイ緩衝液中1μLのLsp FRET基質を各ウェルに添加して、最終基質濃度を20μMとした。プレートを遠心沈殿し、室温で60分間インキュベートした。水中500mM塩化亜鉛を含有する溶液1μLでアッセイをクエンチし、83mMの最終濃度を得た。アッセイの最終DMSO濃度は5%であり、最大のLsp活性は5〜10%のDMSOで生じる(図10)。蛍光をEnVisionプレートリーダーで測定した(励起355nm;発光495nm)。
生の蛍光アッセイデータをTSRI社のデータベースにインポートし、その後Symyxソフトウェアを用いて分析した。各化合物の活性は、次の方程式を用いてプレートごとの原則(per−plate basis)に基づいて計算した:
ここで「高コントロール」は、LSPなし+DMSOを含有するウェルを表し、「低コントロール」は、LSP+DMSOを含有するウェルを表し、「データウェル」は、LSP+被験化合物を含有する。このアッセイのZ’およびシグナル対バックグラウンド比(S/B)は、高コントロールウェルと低コントロールウェルを用いて計算する。645,275のSDDL化合物のスクリーニングにより、Z`=0.69±0.05、および1.35±0.05のS/Bを得た(n=519プレート)。「区間カットオフ」(=27.92%阻害)を使用して、一次アッセイで2,271の活性化合物(「ヒット」)を得た。
確認スクリーニングは、一次スクリーニングアッセイと同じ試薬および検出系を使用したが、2,271の化合物の各々を1つの濃度(名目上8.43μM)で三つ組で試験した。クエンチ前(pre−quench)カウンタースクリーニングアッセイは、LSP一次アッセイと同様の形式であり、同じ試薬および同じ読み出しを用いたが、酵素反応をクエンチした後の化合物を固定した。このカウンタースクリーニングアッセイの「高コントロール」もLSPなし+DMSOであった。「低コントロール」は、LSP+DMSOであった。このアッセイを用いて、蛍光測定に影響を及ぼす種々の「オフターゲット」ヒット、例えば蛍光消光剤などを同定した。
LSP確認アッセイの成績は、0.74±0.02の平均Z’および1.41±0.01のS/Bで優れていた。27.92応答%のアッセイカットオフ(一次カットオフ)を用いて、27.92%よりも大きい活性をもつ698のヒットを確認した。クエンチ前(pre−quench)カウンタースクリーニングアッセイの成績も、0.73±0.03の平均Z’および1.38±0.01のS/Bで優れていた。確認アッセイと同じカットオフを使用して、455のヒットを見出した。試験した2,271の化合物のうち、698の化合物がLSP一次アッセイで活性を確認し、これらのうち344が選択的活性を示した、すなわち、それらはクエンチ前(pre−quench)カウンタースクリーニングアッセイで不活性であった。
これらの344の化合物を、三つ組の10点用量反応滴定(3倍希釈)による用量依存的滴定アッセイに付した。LSP一次およびクエンチ前(pre−quench)滴定アッセイは、二次アッセイと同じ試薬、プロトコール、および検出系を用いた。LSP一次滴定アッセイの成績は、0.73±0.03の平均Z’および1.32±0.01のS/Bで優れていた。LSPクエンチ前(pre−quench)カウンタースクリーニング滴定アッセイの成績も、0.70±0.03の平均Z’および1.29±0.02のS/Bで優れていた(図11)。グロボマイシンを、対照として両方の滴定アッセイに含めた。各被験化合物について、活性パーセントを化合物濃度に対してプロットした。次に、S字状用量反応曲線を説明する4パラメータ方程式を、Assay Explorerソフトウェア(Symyx Technologies Inc.)を使用して、調節可能なベースラインに当てはめた。報告されたIC50値は、Y切片値の50%活性レベルでX切片値について解くことによって、当てはめた曲線から生成した。三つ組の実験から得た代表的な化合物および用量応答曲線とエラーバーを図12に示す。
本発明者らは、図13に示すように、SR−01000270728−1を出発物質から合成した。インビトロ用量反応アッセイは、大腸菌Lspで実施し、2.2μMのEC50で阻害することが示された。同様の合成および検証アッセイは、図12のその他の化合物について容易に実施することができる。
***
大腸菌Lspコード配列(受託番号CAQ30547;配列番号3):
ATGGGCCATCATCATCATCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCATATCGACGACGACGACAAGCATATGAGTCAATCGATCTGTTCAACAGGGCTACGCTGGCTGTGGCTGGTGGTAGTCGTGCTGATTATCGATCTGGGCAGCAAATACCTGATCCTCCAGAACTTTGCTCTGGGGGATACGGTCCCGCTGTTCCCGTCGCTTAATCTGCATTATGCGCGTAACTATGGCGCGGCGTTTAGTTTCCTTGCCGATAGCGGCGGCTGGCAGCGTTGGTTCTTTGCCGGTATTGCGATTGGTATTAGCGTGATCCTGGCAGTGATGATGTATCGCTCGAAGGCCACGCAGAAGCTAAACAATATCGCTTACGCGCTGATTATTGGCGGCGCGCTGGGCAACCTGTTCGACCGCCTGTGGCACGGCTTCGTTGTCGATATGATCGACTTCTACGTCGGCGGCTGGCACTTCGCCACCTTCAACCTTGCCGATACTGCCATCTGTGTCGGTGCGGCACTGATTGTGCTGGAAGGTTTTTTACCTTCTAAAGCGAAAAAACAATAA.
化膿連鎖球菌Lspコード配列(受託番号AAK33759;配列番号4):
ATGAAAAAACGATTGTTTGTGCTTAGCTTGATCCTCCTTGTAGCTTTGGATCAACTTAGTAAATTTTGGATTGTTTCTCATATAGCGCTTGGAGAAGTGAAACCCTTTATCCCAGGTATCGTCAGCTTGACTTACTTGCAAAACAATGGGGCTGCCTTTTCCATATTGCAGGACCAGCAATGGTTCTTTGTTGTCATAACGGTTTTAGTTATCGGTTATGCTATTTATTACCTTGCTACTCATCCCCATTTAAATATCTGGAAACAATTAGCTCTCTTGCTTATTATTTCTGGTGGAATCGGGAATTTTATTGATCGTTTGCGTTTAGCTTACGTGATTGATATGATTCATTTAGACTTTGTGGATTTTGCCATTTTTAATGTGGCAGATTCATACCTTACCGTTGGTGTCATATTATTATTGATATGTTTATGGAAAGAAGAGGATTATGGAAATCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA.
T.マリチマLspコード配列(受託番号NP_228273;配列番号5):
ATGGGCCATCATCATCATCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCATATCGACGACGACGACAAGCATATGGCGTTTGTGATGGTTCTCACAATTGTTCTGGATCAGCTTACAAAGCGGATAGCAAGCGAGATACACGGAACTTTTTTCATAGTTCCGGGTTTTTTGAGATTCGTGAAGGCAACCAACCGAGGAATCGCACTCGGGTTGTTTAAAAATCTTTCCGAACAGCTTCTCTGGACCGTGATGTTCGTTGTTGTTTTTCTCTCCCTGCTTCCTTATATTTTCAAGTTCAGCAGGCTGGAAAGAATAGCCATGGGCTTCATTCTTGGGGGAGCTCTCGGCAACCTTCTCGACAGAATCAGATTCGGATACGTTCTTGATTTTCTGAACTTGACCTTTCTCCCAACGATATTCAACCTAGCGGATGTGTTCATCATAGTCGGAGGAGCGCTTATGATACTGGGAGTTTTCAGAGGTGGAGACAATGAAAGTTTGGAGAGTCGAAAAAAGAGAAGAGGGCTGGAGACTGGATCAGTTTTTGAAGGAGAAGACACCATCATGGATCTCGAGATCAATGATTCAAAAAGCGATAAAAGAGGGCAAAGTGAAGGTCAACGGTCAGATTAA.
***
本明細書に記載される実施例および実施形態は、説明目的のためだけのものであり、それに照らして様々な修正または変更が当業者に示唆され、それらが本願の精神および範囲ならびに添付される特許請求の範囲に含まれることは当然理解される。本明細書に記載されるものと同様または等価などんな方法および材料も本発明の実践または試験で使用されることができるが、好ましい方法および材料が記載される。
大腸菌Lspコード配列(受託番号CAQ30547;配列番号3):
ATGGGCCATCATCATCATCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCATATCGACGACGACGACAAGCATATGAGTCAATCGATCTGTTCAACAGGGCTACGCTGGCTGTGGCTGGTGGTAGTCGTGCTGATTATCGATCTGGGCAGCAAATACCTGATCCTCCAGAACTTTGCTCTGGGGGATACGGTCCCGCTGTTCCCGTCGCTTAATCTGCATTATGCGCGTAACTATGGCGCGGCGTTTAGTTTCCTTGCCGATAGCGGCGGCTGGCAGCGTTGGTTCTTTGCCGGTATTGCGATTGGTATTAGCGTGATCCTGGCAGTGATGATGTATCGCTCGAAGGCCACGCAGAAGCTAAACAATATCGCTTACGCGCTGATTATTGGCGGCGCGCTGGGCAACCTGTTCGACCGCCTGTGGCACGGCTTCGTTGTCGATATGATCGACTTCTACGTCGGCGGCTGGCACTTCGCCACCTTCAACCTTGCCGATACTGCCATCTGTGTCGGTGCGGCACTGATTGTGCTGGAAGGTTTTTTACCTTCTAAAGCGAAAAAACAATAA.
化膿連鎖球菌Lspコード配列(受託番号AAK33759;配列番号4):
ATGAAAAAACGATTGTTTGTGCTTAGCTTGATCCTCCTTGTAGCTTTGGATCAACTTAGTAAATTTTGGATTGTTTCTCATATAGCGCTTGGAGAAGTGAAACCCTTTATCCCAGGTATCGTCAGCTTGACTTACTTGCAAAACAATGGGGCTGCCTTTTCCATATTGCAGGACCAGCAATGGTTCTTTGTTGTCATAACGGTTTTAGTTATCGGTTATGCTATTTATTACCTTGCTACTCATCCCCATTTAAATATCTGGAAACAATTAGCTCTCTTGCTTATTATTTCTGGTGGAATCGGGAATTTTATTGATCGTTTGCGTTTAGCTTACGTGATTGATATGATTCATTTAGACTTTGTGGATTTTGCCATTTTTAATGTGGCAGATTCATACCTTACCGTTGGTGTCATATTATTATTGATATGTTTATGGAAAGAAGAGGATTATGGAAATCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA.
T.マリチマLspコード配列(受託番号NP_228273;配列番号5):
ATGGGCCATCATCATCATCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCATATCGACGACGACGACAAGCATATGGCGTTTGTGATGGTTCTCACAATTGTTCTGGATCAGCTTACAAAGCGGATAGCAAGCGAGATACACGGAACTTTTTTCATAGTTCCGGGTTTTTTGAGATTCGTGAAGGCAACCAACCGAGGAATCGCACTCGGGTTGTTTAAAAATCTTTCCGAACAGCTTCTCTGGACCGTGATGTTCGTTGTTGTTTTTCTCTCCCTGCTTCCTTATATTTTCAAGTTCAGCAGGCTGGAAAGAATAGCCATGGGCTTCATTCTTGGGGGAGCTCTCGGCAACCTTCTCGACAGAATCAGATTCGGATACGTTCTTGATTTTCTGAACTTGACCTTTCTCCCAACGATATTCAACCTAGCGGATGTGTTCATCATAGTCGGAGGAGCGCTTATGATACTGGGAGTTTTCAGAGGTGGAGACAATGAAAGTTTGGAGAGTCGAAAAAAGAGAAGAGGGCTGGAGACTGGATCAGTTTTTGAAGGAGAAGACACCATCATGGATCTCGAGATCAATGATTCAAAAAGCGATAAAAGAGGGCAAAGTGAAGGTCAACGGTCAGATTAA.
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本明細書に記載される実施例および実施形態は、説明目的のためだけのものであり、それに照らして様々な修正または変更が当業者に示唆され、それらが本願の精神および範囲ならびに添付される特許請求の範囲に含まれることは当然理解される。本明細書に記載されるものと同様または等価などんな方法および材料も本発明の実践または試験で使用されることができるが、好ましい方法および材料が記載される。
本明細書において引用される全ての刊行物、GenBank配列、特許および特許出願は、参照によりその全文が、そしてあらゆる目的において、各々が個別にそのように表示されるように、明示的に本明細書に援用される。
Claims (39)
- リポタンパク質シグナルペプチダーゼ(Lsp)の触媒活性を測定するためのアッセイ系であって、(a)組換え発現され、可溶性の、精製されたLsp酵素および(b)Lsp基質を含む、アッセイ系。
- 前記Lspが、細菌Lspである、請求項1に記載のアッセイ系。
- 前記Lspが、大腸菌Lspである、請求項2に記載のアッセイ系。
- 前記Lspが、Hisタグ付き融合タンパク質として発現する、請求項1に記載のアッセイ系。
- 前記Hisタグ付き融合タンパク質がN末端His6タグを含む、請求項4に記載のアッセイ系。
- 前記Lspが、界面活性剤によって可溶化されている、請求項1に記載のアッセイ系。
- 前記界面活性剤が、n−ドデシルβ−D−マルトシド(DDM)である、請求項6に記載のアッセイ系。
- 前記基質が、ペプチド、ペプチド模倣物、または、脂質修飾システイン残基を含有するタンパク質である、請求項1に記載のアッセイ系。
- 前記基質が、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)ドナー−アクセプター対で標識されている、請求項1に記載のアッセイ系。
- リポタンパク質シグナルペプチダーゼ(Lsp)を阻害する作用剤を同定する方法であって、(a)組換え産生され、精製されたLspとLsp基質とを被験化合物の存在下で接触させる工程、および(b)1以上の前記被験化合物によって、前記基質のLsp切断の阻害を検出する工程;それにより、前記リポタンパク質シグナルペプチダーゼ(Lsp)を阻害する作用剤を同定する工程を含む、方法。
- 前記Lspが、細菌Lspである、請求項10に記載の方法。
- 前記Lspが、大腸菌Lspである、請求項11に記載の方法。
- 前記Lspが、Hisタグ付き融合タンパク質である、請求項10に記載の方法。
- 前記Hisタグ付き融合タンパク質がN末端His6タグを含む、請求項14に記載の方法
- 前記Lspが、界面活性剤によって可溶化される、請求項10に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、n−ドデシルβ−D−マルトシド(DDM)である、請求項16に記載の方法。
- 前記基質が、ペプチド、ペプチド模倣物、または、脂質修飾システイン残基を含有するタンパク質である、請求項10に記載の方法。
- 前記基質が、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)ドナー−アクセプター対で標識されている、請求項10に記載の方法。
- Lsp触媒活性が蛍光共鳴エネルギー移動によって検出される、請求項10に記載の方法。
- ハイスループット形式で実施される、請求項10に記載の方法。
- 前記被験化合物が小さい有機化合物である、請求項10に記載の方法。
- 前記同定された作用剤を殺菌活性について調べることをさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 前記同定された作用剤を、細菌リポタンパク質ジアシルグリセリルトランスフェラーゼ(Lgt)を阻害する能力について調べることをさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 細菌細胞においてLsp触媒活性を阻害するための方法であって、前記細胞に存在するLspを化合物に阻害させる条件下で、前記細菌細胞をLsp阻害化合物と接触させる工程を含み、前記Lsp阻害化合物が、Compound SR−010000270728−1、Compound BBS−8またはCompound BBS−20、またはそれらの機能性変異体である、方法。
- 前記細菌細胞が、被験体の内部に存在している、請求項24に記載の方法。
- 前記被験体が、前記細菌細胞による感染症に罹患している、請求項25に記載の方法。
- 前記被験体が、治療上有効な量の前記Lsp阻害化合物を投与される、請求項25に記載の方法。
- 被験体において細菌の増殖を阻害し、細菌感染症を治療するための方法であって、細菌感染症に罹患した前記被験体に、治療上有効な量のLsp阻害化合物を含む医薬組成物を投与し、それにより前記被験体において細菌の増殖を阻害し、細菌感染症を治療する工程を含み;前記Lsp阻害化合物が、Compound SR−010000270728−1、Compound BBS−8またはCompound BBS−20、またはそれらの機能性変異体である、方法。
- 前記被験体がヒトである、請求項28に記載の方法。
- アッセイ系の触媒活性を測定することの可能な、活性界面活性剤で可溶化された膜貫通酵素を生成する方法であって、(a)前記活性膜貫通酵素を発現することの可能な発現ベクターを構築する工程;(b)前記活性膜貫通酵素を前記ベクターから発現させる工程;および(c)界面活性剤に基づく系において前記活性膜貫通酵素を可溶化し精製する工程;それにより、アッセイ系の特異的触媒活性を測定することの可能な、活性膜貫通界面活性剤で可溶化された酵素を生成する工程を含む、方法。
- 前記膜貫通酵素がLspである、請求項30に記載の方法。
- 前記酵素の触媒活性を測定するためのアッセイにおいて請求項30に従って生成された前記膜貫通酵素の使用。
- 前記膜貫通酵素の特異的阻害剤を同定するためのハイスループットスクリーニングにおける、請求項30に従って生成された前記膜貫通酵素の使用。
- 前記膜貫通酵素がLspである、請求項33に従って生成された前記膜貫通酵素の使用。
- 改良された特性を備えるLsp阻害化合物を同定するための方法であって、(a)リードLsp阻害化合物の1以上の構造類似体を合成する工程;(b)機能アッセイを前記類似体に実施して、前記リード化合物のものと比較して改良された生物学的または薬学的特性を有する類似体を同定する工程;それにより、改良された特性を備えるLsp阻害化合物を同定する工程を含む、方法。
- 前記リードLsp阻害化合物が、Compound SR−010000270728−1、Compound BBS−8、Compound BBS−20、またはそれらの機能性変異体である、請求項35に記載の方法。
- 前記改良された生物学的または薬学的特性が、Lsp触媒活性の阻害の向上である、請求項35に記載の方法。
- 前記機能アッセイが、精製され、界面活性剤で可溶化されたLsp酵素を用いる、請求項37に記載の方法。
- 前記改良された生物学的または薬学的特性が、安定性または血清半減期の増加である、請求項35に記載の方法。
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