KR20010085373A - 포유류 말로닐 ＣｏＡ 데카복실라아제 억제제, 효능제 및길항제를 동정하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

포유류 말로닐 ＣｏＡ 데카복실라아제 억제제, 효능제 및길항제를 동정하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20010085373A
KR20010085373A KR1020017001831A KR20017001831A KR20010085373A KR 20010085373 A KR20010085373 A KR 20010085373A KR 1020017001831 A KR1020017001831 A KR 1020017001831A KR 20017001831 A KR20017001831 A KR 20017001831A KR 20010085373 A KR20010085373 A KR 20010085373A
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노르우드 데이비드 씨.
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Abstract

본 발명은 지방산 산화 분야에 관한 것이며, 일반적으로 지방산 산화 억제제를 동정 및 시험하기 위한 조성물 및 방법, 특히 심장에서의 지방산 산화의 주요 조절인자로서 동정된 MCD의 신규한 심장 이소-형태(isoform)를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 랫트 췌장, 심장 및 간으로부터의 말로닐 CoA 데카복실라아제의 핵산 서열이 설명된다. 이러한 서열 및 유도된 생성물은 MCD 경로의 효능제와 길항제를 동정하고 시험하기 위한 방법을 스크리닝하는 데에 유용하다.

Description

포유류 말로닐 ＣｏＡ 데카복실라아제 억제제, 효능제 및 길항제를 동정하기 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR IDENTIFYING MAMMALIAN MALONYL COA DECARBOXYLASE INHIBITORS, AGONISTS AND ANTAGONISTS}
심장, 간 및 기타 기관에서의 대부분의 에너지 생성은 지방산의 산화로부터 유도되는 것으로 공지되어 있다[참조: Bing et al., Am J Med 15:284-296(1953)]. 기타 중요한 에너지 공급원은 탄수화물의 산화로부터 유도된 것이며, 어느 정도는 당분해작용으로부터의 ATP 생성이다. 이들 경로가 전반적인 ATP 생성에 기여하는 정도는, 상당 부분은 심장이나 기타 기관에 전달된 탄소 기질 프로필에 따라서 상당히 좌우될 뿐만 아니라 이러한 표적 기관 내에서의 기초 병리 상태의 존재 여부에 따라서 좌우될 수 있다. 개개의 에너지 기질 대사 경로 연구에 관한 광범위한 노력에도 불구하고, 예를 들어, 심장에서의 탄수화물과 지방산 산화 간의 통합된 조절 조사에 관한 연구가 거의 행해지지 않았다.
지방산이 탄수화물 산화를 억제하는 기전(즉, 랜들 주기)이 밝혀지긴 하였지만, 탄수화물이 심장에서 지방산 산화를 어떻게 조절하는지에 관해서는 공지된 바가 훨씬 적다. (피루베이트 데하이드로게나제 복합체를 통한) 탄수화물 산화로부터 유도된 미토콘드리아내 아세틸 CoA의 증가가 지방산의 β-산화를 하향 조절할 수 있다는 것은 명백하지만, 탄수화물 산화가 증가할 때 미토콘드리아 내로의 지방산 아실 그룹의 도입이 어떻게 하향 조절되는지에 관해서는 명백하지가 않다.
심장, 간 및 췌장에서 지방산 산화의 조절에 관여하는 것으로 공지된 중요한 단백질은 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제 1(CPT1)이다. 이러한 단백질은 미토콘드리아 외막 내에 위치하고 있으며, 지방산 산화의 제1 단계에 관여하는 주요 조절성 효소이다[참조: McGarry and Foster, Ann Rev. Biochem. 49:395-420(1980); McGarry et al., Diabetes 5: 271-284(1989)]. 아세틸-CoA 카복실라아제(ACC)에 의해 생성되는 말로닐-CoA는 CPT1의 강력한 억제제이다[참조: McGarry and Foster, Ann Rev. Biochem. 49:395-420(1980); McGarry et al., J. Biol. Chem. 253:4128-4136(1978)]. CPT1의 88kDa 이소-형태가 우세하는 간과는 달리, 심장은 주로, 말로닐 CoA에 의한 억제에 대해 훨씬 더 민감한(10 내지 50배) CPT1의 82kDa 이소-형태[참조: Esser et al., J. Biol. Chem. 268:5810-5816(1993)]를 발현한다[참조: McGarry and Foster, Ann Rev. Biochem. 49:395-420(1980); McGarry et al., J.Biol. Chem. 253:4128-4136(1978); McGarry et al., Biochem. J. 214:21-28(1983)]. 또한, 지방산 산화가 광범위하게 다양할 수 있는 조건 하에서는, 말로닐 CoA에 대한 미토콘드리아 CPT1의 IC50이 변하지 않는 것으로 관찰되었다[참조: Kudo et al., J. Biol. Chem. 270:17513-17520(1995); Lopaschuk et al., J. Biol. Chem. 269:25871-25878(1994)]. 예를 들면, 후-허혈성 랫트 심장에서는, 지방산 산화율이 매우 높긴 하지만, 말로닐 CoA 억제에 대한 CPT1의 민감도는 변하지 않는다[참조: Kudo et al., J. Biol. Chem. 270:17513-17520(1995); Lopaschuk et al., J. Biol. Chem. 269:25871-25878(1994)]. 오히려, 실질적인 말로닐 CoA 수준이 떨어져, CPT1 활성이 증가하게 된다. 따라서, 현재 증거들은 말로닐 CoA 억제에 대한 CPT1의 민감도 변화와는 반대로, 실제적인 말로닐 CoA 수준 변화가 심장에서의 지방산 산화 변화를 조절하는 주요 인자인 것으로 여겨진다고 제시하고 있다. 현 연구 결과[참조: Kudo et al., J. Biol. Chem. 270:17513-17520(1995); Lopaschuk et al., J. Biol. Chem. 269:25871-25878(1994); Kudo et al., Biochem. Biophys. Acta. 1301:67-75(1996); Kudo et al., Circulation 92:1-77(1996)], 심장에서의 ACC가 말로닐 CoA의 생성을 통하여, 지방산 산화의 주요 조절인자로서 작용하는 것으로 밝혀졌다[참조: Lopaschuk et al., Biochem. Biophys. Acta. 1213:263-276(1994)]. 예를 들면, 래빗트 심장에서는, ACC 활성이 태어난지 1일 후와 7일 후 사이에 감소한다[[참조: Lopaschuk et al., J. Biol. Chem. 269:25871-25878(1994)]. 이는 말로닐 CoA 수준의 현격한 감소와 지방산 산화율의 증가를 수반한다[참조: Lopaschuk et al., J. Biol. Chem. 269:25871-25878(1994)]. 이는 탄수화물 산화율이 증가하는 경우에 미토콘드리아 내로의 아실 CoA 수송을 감소시키는 피드백 루프 내의 주요 효소 중의 하나이다. 따라서, ACC는 심장에서 탄수화물 대사와 지질 대사 간의 발란스를 조절하는데 있어서 중요한 역할을 한다. 후-허혈성 심장에서는, ACC 활성 감소가 또한, 말로닐 CoA 수준 감소와 지방산 산화율 증가를 수반한다[참조: Kudo et al., J. Biol. Chem. 270:17513-17520(1995)]. 이러한 지방산 산화율 증가는 심장 에너지 요구량의 90 내지 100%를 제공할 수 있다. 공교롭게도, 이는 정상적인 심장 수축 기능에 중요한 글루코오스 산화를 치루고서야 일어난다.
선행 보고서는 허혈성 심장의 재관류 동안의 낮은 글루코오스 산화율이 수축 마비의 원인이 되고, 지방산 산화를 억제함으로써 글루코오스 산화가 허혈성 손상의 중증도를 증가 및 저하시킬 것이라고 지시하고 있다. 수 많은 임상 시도가 이들 관찰을 확인시켜 주었으며, 지방산 산화를 특이적으로 억제시키는 약제학적 제제, 예를 들면, 라놀라진 및 트리메타지딘이 현재 임상용으로 허가되었다. 그러므로, 비정상적인 지방산 대사를 특징적으로 나타내는 병리학적 상황에서는, 지방산 또는 글루코오스 산화를 조절하는 효소가 잠재적으로 약물 개발에 대한 표적이 될 수 있었다. 저혈당성 제제로서의 플루오로옥시란 탄수화물이 지방산 산화 억제제로서 사용되어 왔다. 이들 지방산 산화 억제제는 미토콘드리아 내로의 지방산의 수송을 방지하면서 CPT1을 억제함으로써 작동된다[참조: 본원에 참조문헌으로 삽입된 미국 특허 제4,788,306호]. 이들 화합물은 글루코오스 및 지방산 대사 장애,예를 들면, 당뇨병을 치료하는데 있어서 특정한 유용성을 지니고 있으며, 정상적인 심장 기능 결함에 대해 상당히 저하된 잠재성을 지니고 있는 것으로 여겨진다.
간이 대부분 생합성 기관으로서 인식되고 있긴 하지만, 이는 에너지 공급원으로서 지방산을 산화시키기도 한다[참조: Goodridge, Fatty and synthesis in eucaryotes. In: Biochemistry of lipids, liposomes and membranes. Ed: Vance and Vance 111-139(1991)]. 말로닐 CoA는 이러한 과정에 중요한데, 이는 말로닐 CoA가 지방산의 미토콘드리아내 흡수에 관여하고 있는 속도-제한 효소인 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제 1(CPT1)를 억제하기 때문이다[참조: McGarry and Brown, Eur J. Biochem 244:1-14(1997); Alam and Saggerson, Biochem J 334:233-241(1988); Bird and Saggerson, Biochem 222:639-647(1984)]. CPT1을 억제함으로써, 지방산의 미토콘드리아내 흡수가 감소되고 이로써 미토콘드리아내 지방산 산화가 저하된다[참조: Lopaschuk et al., J. Biol. Chem. 269:25871-25878(1994)]. 영양 결핍증이나 당뇨병에 걸린 동안에는, 말로닐 CoA의 감소로 인해 지방산 합성이 제한되고 지방산 산화가 상향 조절될 수 있다. 지방산 신타아제가 활성이 아닌 경우에는 말로닐 CoA가 간에서 어떻게 분해되는지에 관해서는 여전이 의문이다.
콜라튜쿠디(Kolattukudy) 등[참조: Kolattukudy et al., Methods Enzymol 71:150-153(1981); Jang et al., J. Biol Chem 264:3500-3505(1989)]은 말로닐 CoA를 아세틸 CoA로 탈카복시화시키는 것에 관여하는, 조류 조직과 포유류 조직 모두에 존재하는 효소를 앞서 동정하였다. 말로닐 CoA 데카복실라아제(MCD)로 명명된 이러한 효소는 처음에는, 메틸말로닐 CoA 뮤타아제 및 피루베이트 카복실라아제와같은 특정한 미토콘드리아내 효소가 미토콘드리아 유도된 말로닐 CoA에 의해 억제되는 것을 막아주는 특정 미토콘드리아내 효소인 것으로 기재되었다[참조: Jang et al. J. Biol Chem 264:3500-3505(1989)]. 미토콘드리아에서는, 프로피오닐 CoA 카복실라아제가, 말로닐 CoA를 생성시키기 위한 기질로서 아세틸 CoA를 저효율로 이용할 수 있다[참조: Jang et al. J. Biol Chem 264:3500-3505(1989)]. 그러나, 이는 생성된 총 세포내 말로닐 CoA의 단지 작은 분획에만 해당되는 것으로 보인다. 말로닐 CoA의 주 공급원은 ACC에 의한 시토졸성 아세틸 CoA의 전환으로부터 유래되는 것으로 여겨진다. 최근에는, MCD가 세포질성 말로닐 CoA 수준 뿐만 아니라 미토콘드리아내 말로닐 CoA 수준을 조절할 수 있다고 제안하고 있다[참조: Alam and Saggerson, Biochem J 334: 233-241(1998); Dyck et al., Am J Physiology 275:H2122-H2129(1998)]. 본 발명자들의 연구 결과, ACC 활성 감소와 연계된 MCD 활성 증가 또는 유지는 아마도, 말로닐 CoA 수준 감소와 분만-후 심장과 재관류된 허혈성 심장 모두에서 보여지는 지방산 산화 증가와 관계가 있는 것으로 밝혀졌다[참조: Dyck et al., Am J Physiology 275:H2122-H2129(1998)]. 유사하게도, 알람(Alam)과 사거슨(Saggerson)은 랫트 골격근에서의 시토졸성 말로닐 CoA 수준을 변화시킬 수 있는 시토졸성 MCD 활성의 간접적인 증가를 제공하였다[참조: Alam and Saggerson, Biochem J 334: 233-241(1998)]. 따라서, 이들 연구는 MCD를 지방산 산화의 조절인자로서 암시하고 있다. 이와 같이 관찰된 시토졸성 말로닐 CoA 수준 감소가 MCD의 세포질성 형태로 인한 것인지 아니면 몇몇 공지되지 않은 과정으로 인한 것인지는 명확하지 않다.
심장, 간, 췌장 또는 기타 기관에서든 간에, 어떠한 부작용도 나타내지 않는, MCD 경로 활성을 조절하는 약물을 동정할 필요성이 대두되고 있다. 따라서, 심장, 간 또는 췌장 기능을 손상시키지 않거나 독성을 부여하지 않을 뿐만 아니라 지방산 산화 억제제 화합물을 비용면에서 효율적이고 고 처리량으로 스크리닝하게 해주는, 약리학적 중재용 표적을 동정하는데 적합한 검정법이 요망된다.
발명의 요약
본 발명은 일반적으로, 말로닐 CoA 데카복실라아제("MCD"로서 후술됨) 억제제를 동정 및 시험하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이며, 특히 지방산 산화의 주요 조절인자인 MCD 효소의 신규한 심장 이소-형태를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 효소는 말로닐 CoA가 아세틸 CoA로 전환(이는 이어서14C-표지된 옥살로아세테이트와 결합하여14C-표지된 시트레이트를 생성한다)되는 것을 억제하게 될 화합물을 동정하는데 유용하다. 부가적으로, 본 발명은 MCD를 암호화하는 랫트 심장, 간 및 췌장 유전자의 DNA 서열을 단리 및 결정화하는 것에 관한 것이다.
본 발명이 특정한 MCD 단백질로 제한되지는 않는다. 각종 종에서 지방산 산화를 조절하는데 관여하고 있는, 밀접하게 관련된 MCD의 각종 척추동물 상동체가 고려된다.
한 양태에서는, 이러한 MCD 효소가 완전한 길이의 본래의 폴리펩티드가 아니다. 오히려, 이는 완전한 길이의 본래의 효소의 특정 부분이다. 바람직하게는, 이러한 부분 또는 단편은 활성 결합 부위를 함유하고 있다. 예를 들면, 본 발명은부분적으로 정제된 MCD 효소와 기질 간의 복합체를 고려하고 있지만, 이로 제한되지는 않는다. 또 다른 양태에서는, MCD가 야생형 서열로부터 돌연변이된 폴리펩티드를 지니고 있다.
유사하게, 본 발명은 MCD 본래의 서열로만 제한되지 않는다. 일정 부분이나 단편이 이용되는 경우일지라도, 이들 부분이나 단편은 변형된 아미노산 서열을 지닐 수도 있다. 따라서, 본 발명은 또한, MCD 또는 이의 동족체를 포함하는 기질-효소 복합체를 고려한다.
본 발명은 또한, 각종 검정 포맷을 이용한 화합물 스크리닝을 고려하고 있다. 한 양태에 있어서, 본 발명은 a) i) 말로닐 CoA 데카복실라아제를 포함하는 정제된 제제, ii) 기질 및 iii) 시험 화합물을 제공하는 단계; b) 상기 말로닐 CoA 데카복실라아제가 상기 기질 상에 작용하여 생성물을 생성할 수 있도록 해주는 조건 하에 상기 말로닐 CoA 데카복실라아제와 상기 기질을 혼합하는 단계로서, 혼합이 상기 시험 화합물의 존재 및 부재 하에서 수행되는 단계; 및 c) 상기 시험 화합물의 존재 및 부재 하에서 생성된 생성물의 양을 직접적으로 또는 간접적으로 측정하는 단계를 포함하는, 화합물 스크리닝 방법을 고려하고 있다.
부가적으로, 본 발명은 일반적으로, 말로닐 CoA 데카복실라아제 경로 효능제 및 길항제를 동정 및 시험하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 기타 조직 또는 세포 유형에 대해서 본래의 상태일 수 있는 MCD의 정상적이거나 돌연변이 상동체를 동정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상동성 또는 돌연변이체 MCD 유전자가 잠복할 수 있는 조직을 동정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 본 발명으로부터 유도된 시약을 생성시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 조성물로서, 심장으로부터의 야생형 랫트 MCD 유전자(SEQ ID NO:1), 간으로부터의 야생형 랫트 MCD 유전자(SEQ ID NO:2) 또는 췌장으로부터의 야생형 랫트 MCD 유전자(SEQ ID NO:3)를 고려하고 있다. 본 발명은 또한, 이러한 서열을 스크리닝 방법에 이용하는 것을 고려하고 있다. 한 양태에 있어서, 본 발명은 MCD에 대해 효능성이거나 길항성인 화합물을 스크리닝하는데 상기 유전자들을 활용하는 것을 고려하고 있다. 한 가지 바람직한 양태에서는, 센스 또는 안티-센스 MCD DNA, 또는 이의 부분을 함유하는 구성물을 세포에 형질감염시킨다. 이러한 DNA를 발현 구성물 내로 용이하게 삽입할 수 있으며, 본 발명은 이러한 구성물 뿐만 아니라 이들의 용도를 고려하고 있다. 이어서, MCD 활성에 대해 효능성이거나 길항성인 것으로 추정되는 화합물을 가하고 MCD 활성을 당해 분야에 공지된 방법으로 측정한다. 본 발명은 또한, 상기-지시된 cDNA로부터 전사된 RNA 뿐만 아니라 이러한 RNA로부터 번역된 단백질(전형적으로는 정제된 단백질)을 고려하고 있다. 더욱이, 본 발명은 상기 번역된 단백질로 면역시킴으로써 생성된 항체를 고려하고 있다.
본 발명은 또한, 상기-지시된 DNA(즉, "형질전환된 유전자(transgene)") 또는 이의 부분을 포함하는 형질전환된 동물을 고려하고 있다. 특정 양태에서는, 이러한 본 발명의 형질전환된 동물이, 유도성이고 조직 특이성인 프로모터 내에 함유된 형질전환된 유전자를 이용하여 생성될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기-명명된 조성물을 스크리닝 검정에 사용하는 것을 고려하고 있다. 본 발명은 특정 스크리닝 방법으로만 제한되지 않는다. 한 양태에서는, 포유류 세포가 사용될 수 있다. 본 발명은 상기 형질감염 구성물의 종류로만 제한되지 않는다. 이용되는 형질감염 구성물은 검정 설정시 선택된 세포주에 대해 이용 가능한 최적의 구성물일 것이다. 한 양태에 있어서, 본 발명은 형질감염된 세포주를 이용하는 시스템에서 추정되는 화합물을 스크리닝하는 것을 고려하고 있다. 한 양태에서는, 이러한 세포가 일시적으로 형질감염될 수 있다. 또 다른 양태에서는, 이러한 세포가 안정적으로 형질감염될 수 있다. 세포를 안정적으로 형질감염시키기 위해 사용된 구성물은 유도성 프로모터를 이용하거나 이용하지 않을 수 있다. 또 다른 양태에서는, 본 발명의 번역 생성물이 세포-무함유 검정 시스템에 사용될 수 있다. 또한 또 다른 양태에서는, 본 발명의 번역 생성물에 대해 생성된 항체가 면역침전 검정에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, MCD를 암호화하는 cDNA와 유사한 유전자에서의 돌연변이를 명백히 해주는 종양에 대해 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 한 양태에서는, MCD를 암호화하는 cDNA를 마이크로칩 검정에 사용할 수 있다. 본 발명은 a) i) SEQ ID NO:1, 2 또는 3의 올리고누클레오티드 서열의 적어도 일정 부분을 암호화하는 cDNA를 포함하는 마이크로검정용 마이크로칩, ii) SEQ ID NO:1, 2 또는 3과 유사한 유전자에서 돌연변이를 갖는 것으로 추정되는 하나 이상의 조직 샘플로부터의 DNA를 어떠한 순서로든 제공하는 단계; b) 상기 마이크로검정용 마이크로칩을 상기 DNA와 접촉시키는 단계; 및 c) 상기 cDNA와 상기 조직 샘플 DNA와의 하이브리드화를 검출하는 단계를 포함하는, 종양에 대해 스크리닝하는 방법을 고려한다. 이어서, 단리된 DNA는 서열화하여 유전적 돌연변이에 대해 검정할 것이다.
본 발명의 유전자 서열을 이용하여 상동체에 대해 스크리닝할 수도 있다. 한 양태에서는, MCD를 암호화하는 cDNA가 마이크로칩 검정에 사용될 수 있다. 본 발명은 a) i) SEQ ID NO:1, 2 또는 3의 올리고누클레오티드 서열의 적어도 일정 부분을 암호화하는 cDNA를 포함하는 마이크로검정용 마이크로칩, ii) SEQ ID NO:1, 2 또는 3과 유사한 유전자에 특정 서열을 갖는 것으로 추정되는 하나 이상의 조직 샘플로부터의 DNA를 어떠한 순서로든 제공하는 단계; b) 상기 마이크로검정용 마이크로칩을 상기 DNA와 접촉시키는 단계; 및 c) 상기 cDNA와 상기 조직 샘플 DNA와의 하이브리드화를 검출하는 단계를 포함하는, 상동체에 대해 스크리닝하는 방법을 고려한다. 이어서, 단리된 DNA는 서열화하여 유전적 돌연변이에 대해 검정할 것이다.
본 발명은 또한, MCD 경로의 신규한 또는 돌연변이체 구성분을 동정하는데 사용될 수 있다. 한 양태에서는, 본 발명의 번역 생성물에 대해 생성된 항체를 면역침전 실험에 사용하여 신규한 MCD 경로 구성분 또는 이의 천연 돌연변이물을 단리시킬 수 있다. 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 융합 단백질을 생성시키는데 사용될 수 있으며, 이러한 융합 단백질은 또한 신규한 MCD 경로 구성분 또는 이의 천연 돌연변이물을 단리하는데 사용될 수 있다. 또 다른 양태에서는, 효모 2-하이브리드 시스템을 이용하여 스크린을 구성할 수 있다. 본 발명은 또한, 표준 분자 과정을 사용하여 동족체에 대해 스크리닝하는 것을 고려하고 있다. 한 양태에서는, 노던(Northern) 및 서던(Southern) 블롯팅을 사용하여 스크린을 구성할 수 있다.
본 발명은 a) i) SEQ ID NO:1, 2 또는 3의 올리고누클레오티드 서열의 적어도 일정 부분을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 세포의 제1 그룹, ii) SEQ ID NO:1, 2 또는 3으로부터의 올리고누클레오티드의 어떠한 부분도 갖지 않는 상기 사용된 플라스미드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 세포의 제2 그룹 및 iii) MCD 경로 활성을 조절하는 능력을 지니고 있는 것으로 추정되는 하나 이상의 화합물을 어떠한 순서로든 제공하는 단계; b) 상기 세포의 제1 그룹 및 제2 그룹을 상기 화합물과 접촉시키는 단계; 및 c) 상기 화합물의 MCD 활성이 억제되거나 증진되었는지를 검출하는 단계를 포함하는, 특정 화합물을 스크리닝하는 방법을 고려한다.
본 발명은 또한, a) i) SEQ ID NO:1, 2 또는 3의 서열의 적어도 일정 부분을 포함하는 제1 핵산과 ii) 상기 상동체를 포함하는 것으로 추정되는 세포 또는 조직으로부터의 DNA 라이브러리를 어떠한 순서로든 제공하는 단계; 및 b) 상기 핵산을, 상기 상동체를 암호화하는 것으로 추정되는 DNA가 검출되도록 하는 조건 하에서 상기 라이브러리의 DNA를 하이브리드화시키는 단계를 포함하는, 동족체에 대해 스크리닝하는 방법을 고려한다.
본 발명은 또한, a) i) SEQ ID NO:1, 2 또는 3에 의해 암호화된 펩티드 서열의 적어도 일정 부분을 포함하는 펩티드(융합 단백질, 즉 단백질 정제에 유용한 부분과 같은 또 다른 부분을 함유하는 단백질의 일부인 일정 부분을 포함하지만 이에제한되지는 않는다)와 b) 상기 상호활성 펩티드를 갖는 것으로 추정되는 공급원(예: 세포 또는 조직)으로부터의 추출물을 어떠한 순서로든 제공하는 단계; 및 c) 이러한 펩티드를, 상기 상호활성 펩티드가 검출되도록 하는 조건 하에서 상기 추출물과 혼합하는 단계를 포함하는, 상호활성 펩티들에 대해 스크리닝하는 방법을 고려한다.
본 발명은 a) i) SEQ ID NO:1, 2 또는 3에 의해 암호화된 펩티드의 적어도 일정 부분과 반응성인(및 이에 대해 통상적으로 특이적인) 항체와 ii) 상기 상호활성 펩티드(들)를 갖는 것으로 추정되는 공급원(예: 세포 또는 조직)으로부터의 추출물을 어떠한 순서로든 제공하는 단계; 및 b) 이러한 항체를, 상기 상호활성 펩티드가 검출되도록 하는 조건 하에서 상기 추출물과 혼합하는 단계를 포함하는, 상호활성 펩티들에 대해 스크리닝하는 또 다른 접근법을 고려한다.
본 발명은 지방산 산화 분야에 관한 것이며, 일반적으로 지방산 산화 억제제를 동정 및 시험하기 위한 조성물 및 방법, 특히 심장에서의 지방산 산화의 주요 조절인자로서 동정된, 말로닐 CoA 데카복실라아제(MCD)의 신규한 심장 이소-형태(isoform)를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 부가적으로, 본 발명은 랫트 췌장 섬, 심장 및 간 세포로부터의 말로닐 CoA 데카복실라아제의 포유류 cDNA 서열을 포함하는 조성물 뿐만 아니라 지방산 산화 효능제 및 길항제를 동정 및 시험하는데 사용하기 위한 이들 서열 및 유도체의 용도에 관한 것이다.
도 1은 랫트 간 말로닐 CoA 데카복실라아제(MCD)의 생화학적 특징을 도시한 것이다. (A)는 항-MCD 항체를 사용한 랫트 간 MCD의 면역블롯 분석[비-변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동: 레인 1) 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동: 레인 2)] 및 무관한 항-카탈라아제 항체를 사용한 랫트 간 MCD의 면역블롯 분석(레인 3)을 나타내는 대표적인 사진이다. (B)는 항-MCD 항체를 사용한 면역블롯 분석의 대표적인 사진이고, 이는 랫트 간(레인 1)과 랫트 심장(레인 2)로부터의 MCD를 비교한 것이다.
도 2는 1일생 및 7일생 래빗트 심장에서의 말로닐 CoA 데카복실라아제 활성을 그래프로 도시한 것이다. 수치는 양 래빗트에 대한 8개 심장에 관한 평균±S.E.이다.
도 3은 호기성, 허혈성 및 재관류된 허혈성 랫트 심장에서의 말로닐 CoA 데카복실라아제 활성을 그래프로 도시한 것이다. 수치는 모든 그룹에 대한 5 내지 10개 심장에 관한 평균 ±S.E.이다.
도 4는 호기성, 허혈성 및 재관류된 허혈성 랫트 심장에서의 말로닐 CoA 데카복실라아제 단백질의 수준을 지시해주는 항-MCD 항체를 사용한 면역블롯 분석의 대표적인 사진이다.
도 5는 신생아(A)와 재관류된 허혈성 삼징(B)에서의 지방산 산화 조절에 있어서의 5'AMP-활성화된 단백질 키나아제, 아세틸 CoA 카복실라아제 및 말로닐 CoA 데카복실라아제의 역할을 도시한 도식도이다. (A)는 AMPK와 MCD가 모두 신생아 주기 동안에 활성화된다는 것을 지시해준다. (B)는 허혈증이 AMPK를 활성화하는 반면, MCD 활성은 유지시킨다는 것을 나타낸다.
도 6은 랫트 심장 말로닐 CoA 데카복실라아제를 암호화하는 DNA 서열을 나타낸다(SEQ ID NO:1).
도 7은 랫트 간 말로닐 CoA 데카복실라아제의 크로마토그래피적 정제를 나타낸 것이다. (NH4)2SO440 내지 55%에 침전된 미토콘드리아내 단백질을 부틸 세파로오스 650M 컬럼 상에 부하하고 (NH4)2SO41 내지 0M의 구배로 용리시킨다. (A)는 MCD 활성을 함유하는 분획을 모으고 페닐 세파로오스 HP 컬럼 상에 부하한 다음 단백질을 상기와 동일한 구배로 용리시키는 것을 나타낸다. (B)는 Q 세파로오스 HP 컬럼 상에서의 크로마토그래피를 나타낸다. (C)는 SP 세파로오스 HP 컬럼 상에서의 크로마토그래피를 나타낸다. (D) 7B 및 7C는 결합된 단백질을 사용하여 수행하고, 이를 0 내지 0.3M 및 0 내지 0.4M NaCl의 구배로 각각 용리시킨다. MCD 활성은 상대적인 형광 단위/분의 변화로서 표현하였으며, 단백질 농도에 대해 표준화하지는 않았다.
도 8은 랫트 간 말로닐 CoA 데카복실라아제를 암호화하는 DNA 서열을 도시한 것이다(SEQ ID NO:2).
도 9는 정제된 랫트 간 말로닐 CoA 데카복실라아제의 역학적 특성을 도시한 것이다. 9A, 정제된 랫트 간 MCD의 활성에 대한 말로닐 CoA 농도의 효과(최대 MCD 활성율(%)로서 표현됨). 9B, MCD의 활성은 검정 완충액의 pH를 변화시킴으로써 영향을 받는다.
도 10은 말로닐 CoA 데카복실라아제 항체의 특징을 나타낸 것이다. (A) 랫트 간 MCD에 대해 지시된 폴리클로날 항체를, 랫트 간 미토콘드리아내 분획으로부터의 단백질을 사용하여 시험한다. MCD239 항체(레인 1)는 MCD 만을 인식하는 반면, MCD240(레인 2)은 카탈라아제와 MCD 모두를 인식하였으며, 카탈라아제는 좌측에 지시되어 있다. (B) MCD 항체 모두를 사용하여 면역-억제 연구를 수행하였다. MCD 항체 또는 면역전 혈청 혼합물을 대상으로 하여, MCD 활성에 대해 측정하고, 동일한 시간 동안(30분) 혈청 없이 예비-배양된 MCD의 %로서 표현하였다.
도 11은 말로닐 CoA 데카복실라아제의 조직 분포도와 세포내 국재도를 도시한 것이다. (A) MCD240 항체를 사용하여 각종 랫트 조직에서 MCD의 단백질 수준을 측정한다. 150㎍의 심장(레인 1), 골격근(레인 2), 간(레인 3), 신장(레인 4), 폐(레인 5), 췌장(레인 6), 뇌(레인 7)를 2% SDS 겔 부하용 완충액에서 비등시키고 웨스턴 분석시킨다. (B) 이중 표지화 면역세포화학 기술을 사용하여 맥아르들(McArdle) RH-7777 랫트 간암 세포에서의 MCD의 세포내 국재도를 결정한다. MCD239 항체로부터의 영상(박스 1)과 항 Hsp 60 항체로부터의 영상(박스 2)을 합하여 공동-국재도(박스 3)를 결정한다. 유사하게, MCD240 항체로부터의 영상(박스 4)과 항 미토-트랙커-레드(Mito-Tracker-Red)로부터의 영상(박스 5)을 합하여 공동-국재도(박스 6)를 결정한다.
도 12는 대조군 랫트와 6주생 스트렙토조토신 랫트에서의 랫트 간 말로닐 CoA 데카복실라아제 활성과 단백질을 수준을 도시한 것이다. MCD 활성(A)과 MCD 단백질 정량화(B)를 6주생 대조군 랫트 및 6주생 스트렙토조토신 처리된 랫트로부터의 랫트 간에서 수행한다. MCD 단백질을 각 그룹의 바닥 패널에 위치시키고 카탈라아제 단백질 수준을 상단 패널 내의 부하 및 전이 대조군으로서 포함시킨다. 웨스턴 블롯에 밀도 측정 분석을 수행하고, MCD 단백질의 수준을 정량화한다(C).
도 13은 대조군 랫트와 JCR:LA-비만한 랫트에서의 랫트 간 말로닐 CoA 데카복실라아제 활성과 단백질을 수준을 도시한 것이다. MCD 활성(A)과 MCD 단백질 정량화(B)를 JCR:LA-비만한 대조군 및 Cp/Cp 랫트로부터의 랫트 간에서 수행한다. MCD 단백질을 각 그룹의 바닥 패널에 위치시키고 카탈라아제 단백질 수준을 상단 패널 내의 부하 및 전이 대조군으로서 포함시킨다. 웨스턴 블롯에 밀도 측정 분석을 수행하고, MCD 단백질의 수준을 정량화한다(C).
도 14는 대조군 랫트, 절식시킨 랫트 및 재공급시킨 랫트에서의 랫트 간 말로닐 CoA 데카복실라아제 활성과 단백질을 수준을 도시한 것이다. MCD 활성(A)과 MCD 단백질 정량화(B)를 대조군 랫트, 절식시킨 랫트 및 재공급된 랫트로부터의 랫트 간에서 수행한다. MCD 단백질을 각 그룹의 바닥 패널에 위치시키고 카탈라아제 단백질 수준을 상단 패널 내의 부하 및 전이 대조군으로서 포함시킨다. 웨스턴 블롯에 밀도 측정 분석을 수행하고, MCD 단백질의 수준을 정량화한다(C).
도 15는 랫트 췌장 말로닐 CoA 데카복실라아제를 암호화하는 DNA 서열(SEQ ID NO:3)을 도시한 것이다.
도 16은 각종 조직에서의 MCD mRNA의 노던 블롯 및 RT-PCR 분석을 도시한 것이다. (A)는 겔에 대한 RNA 부하용 대조군으로서 사용된 18S 리보좀성 RNA cDNA 단편 및 랫트 MCD 프로브를 사용한 랫트 조직의 노던 블롯 분석을 도시한 것이다. (B)는 각종 랫트 조직과 분류된 췌장섬 세포로부터 단리된 총 RNA를 사용하여 MCD(상단) 및 β-악틴(바닥)으로 수행된 RT-PCR 실험의 에티듐 브로마이드 염색된 아가로오스 겔을 도시한 것이다.
정의
본 발명의 이해를 돕기 위하여, 수 많은 용어가 다음과 같이 정의된다:
본원에서 사용된 약어는 다음과 같다: MCD, 말로닐 CoA 데카복실라아제; ATP, 아데노신 트리포스페이트; FA, 지방산; FAS, 지방산 신타아제; ACC, 아세틸-CoA 카복실라아제; 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제 1, CPT1.
본원에서 사용된 용어 "지시약"은 생성물을 지칭하는 것이 아니라, 특정 생성물의 존재, 바람직하게는 생성물의 수준을 간접적으로 지시해준다. 예를 들어, 한 양태에서는, 이러한 "지시약"이 시트레이트이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "표지"는 검출 가능한(바람직하게는 정량화 가능한) 시그날을 제공하기 위해 사용될 수 있고 특정 핵산 또는 단백질에 부착될 수 있는 모든 원자 또는 분자를 지칭한다. 표지는 형광성, 방사능, 비색 정량, 중량, X-선 회절 또는 흡수, 자성, 효소 활성 등에 의해 검출 가능한 시그날을 제공할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "기질"은 효소가 작용하는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 한 양태에서는, 이러한 기질이 말로닐 CoA이다.
본원에서 사용된 용어 "상동체"는 모 분자 또는 참조 분자와 구조면에서는 상이하지만 유사한 기능을 지니고 있는 분자를 포괄한다. 예를 들면, 특정 효소에 대한 특정 상동체는 동일한 개괄적인 효소 활성을 지니고 있지만(활성 특이성과 활성 수준은 상이할 수도 있다) 구조가 상이하다(예를 들어, 아미노산 변형물 또는 치환물). 상동체는, 새로운 염기를 DNA 서열에 도입시킴으로써 아미노산 치환물을 생성시키는, PCR 반응에 프라이머를 사용하는 것과 같은 각종 기술에 의해 생성될 수 있다. 이러한 프라이머는 본원에 제시된 방법으로 정제된 단백질의 말단 아미노산을 서열화함으로써 MCD의 심장 이소-형태와 하이브리드화하도록 고안될 수 있다. 또 다른 방법으로는, 효소의 비-사람 형태[예를 들면, 거위 MCD(GenBank 수탁 번호 JO4482)]에 상보적인 프라이머를 이용할 수 있다.
용어 "유전자"는 특정 폴리펩티드 또는 이의 전구체의 생성에 필수적인 암호화 서열과 대조 서열을 포함하는 특정 DNA 서열을 지칭한다. 이러한 폴리펩티드는 완전한 길이의 암호화 서열 또는 이러한 암호화 서열의 어떠한 부분에 의해서도 암호화될 수 있다.
용어 "관심있는 핵산 서열"은 이의 조작이 당해 분야의 숙련인에 의해 어떠한 이유로든 바람직한 것으로 여겨질 수 있는 모든 핵산 서열을 지칭한다.
특정 유전자와 관련하여 사용되는 경우의 용어 "야생형"은 천연 공급원으로부터 단리된 특정 유전자의 특징을 지니고 있는 유전자를 지칭한다. 특정 유전자 생성물과 관련하여 사용되는 경우의 용어 "야생형"은 천연 공급원으로부터 단리된 유전자 생성물의 특징을 지니고 있는 특정 유전자 생성물을 지칭한다. 야생형 유전자는 특정 집단에 가장 자주 관찰되는 것이므로 임의로 이러한 유전자의 "정상" 또는 "야생형" 형태로 명명된다. 이와는 달리, 특정 유전자 또는 유전자 생성물과 관련하여 사용되는 경우의 용어 "변형된" 또는 "돌연변이체"는 각각, 야생형 유전자 또는 유전자 생성물과 비교해서, 서열 및/또는 기능상 특성에서의 변형을 나타내는(즉, 변형된 특징을 나타내는) 특정 유전자 또는 유전자 생성물을 지칭한다. 천연의 돌연변이체를 단리할 수 있으며, 이들은 야생형 유전자 또는 유전자 생성물과 비교해서 변형된 특징을 지니고 있다는 사실로써 동정된다는 것을 인지해야 한다.
DNA 분자와 관련하여 사용된 경우의 용어 "재조합체"는 분자 생물학 기술을 통하여 함께 연결된 DNA의 절편으로 구성된 특정 DNA 분자를 지칭한다. 특정 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 사용된 경우의 용어 "재조합체"는 재조합 DNA 분자를 사용하여 발현되는 단백질 분자를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "벡터" 및 "비히클"은 DNA 절편(들)을 하나의 세포로부터 또 다른 세포로 옮기는 핵산 분자와 관련하여 상호 교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "발현 구성물", "발현 벡터", 또는 "발현 카셋트"는 목적하는 암호화 서열, 및 특정한 숙주 유기체에서 작동적으로 연결된 암호화 서열의 발현에 필요한 적당한 핵산 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자를 지칭한다. 원핵 생물에서의 발현에 필요한 핵산 서열은 통상적으로, 종종 기타 서열과 함께, 프로모터, 작동인자(임의), 및 리보좀 결합 부위을 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 인핸서(enhancer), 및 말단화 및 폴리아데닐화 시그날을 이용하는 것으로 공지되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "작동 가능한 조합으로", "작동 가능한 순서로" 및 "작동적으로 연결된"이란 소정의 유전자의 전사 및/또는 목적하는 단백질 분자의 합성을 지시할 수 있는 특정 핵산 분자가 생성되도록 하는 방식으로 핵산 서열이 연결된 것을 지칭한다. 이러한 용어는 또한, 기능성 단백질이 생성되는 방식으로 아미노산 서열이 연결된 것을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "하이브리드화"는 핵산의 특정 쇄가 염기쌍 형성을 통하여 상보적 쇄와 함께 연결되는 모든 과정을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은, 폴리누클레오티드와 관련하여 사용된 경우의 용어 " 상보적" 또는 "상보성"은 염기쌍 형성 법칙에 의해 관계되는 폴리누클레오티드를 지칭한다. 예를 들면, 서열 5'-AGT-3'는 서열 5'-ACT-3'에 상보적이다. 상보성은 "부분적"일 수 있는데, 여기서는 단지 몇개의 핵산의 염기가 염기쌍 형성 법칙에 따라서 매칭된다. 또는, 핵산들 간에 "완전한" 또는 "전체" 상보성이 있을 수도 있다. 핵산 쇄들 간의 상보성 정도는 핵산 쇄들 간의 하이브리드화 효능과 세기에 상당한 영향을 미친다. 이는 증폭 반응 뿐만 아니라 핵산들 간의 결합에 의존하는 검출 방법에 특히 중요하다.
핵산과 관련하여 사용된 경우의 용어 "상동성"은 상보성 정도를 지칭한다. 부분적 상동성 또는 완전한 상동성(즉, 동일성)이 존재할 수 있다. 부분적으로 상보적인 서열은, 기능성 용어 "실질적으로 상동성"을 이용하여 지칭되는, 완전하게 상보적인 서열이 특정 표적 핵산과 하이브리드화되는 것을 적어도 부분적으로 억제시키는 것이다. 완전하게 상보적인 서열이 표적 서열과 하이브리드화되는 것을 억제하는 것은 낮은 엄격성 조건하에서 하이브리드화 검정(서던 또는 노던 블롯, 용액 하이브리드화 등)을 사용하여 검사할 수 있다. 실질적으로 상동성인 서열 또는 프로브는 낮은 엄격성 조건 하에서 특정 표적에 대해 완전하게 상동성인 특정 서열의 결합(즉, 하이브리드화)과 경쟁하고 이러한 결합을 억제시킬 것이다. 낮은 엄격성 조건이란 비-특이적 결합이 허용되도록 하는 조건을 의미하는 것은 아니며; 낮은 엄격성 조건은 서로에 대한 두 서열의 결합이 특이적(즉, 선택적) 상호작용인 것을 요구한다. 비-특이적 결합의 부재 여부는 부분적인 상보성 정도가 상당히 결여되어 있는(예를 들면, 약 30% 미만의 동일률) 제2의 표적을 사용함으로써 시험될수 있으며; 비-특이적 결합의 부재하에서는, 프로브가 제2의 비-상보적 표적과 하이브리드화하지 않을 것이다.
핵산 하이브리드화와 관련하여 사용된 경우의 낮은 엄격성 조건은 5X SSPE(43.8g/l NaCl, 6.9g/l NaH2PO4·H2O 및 1.85g/l EDTA, NaOH로 7.4로 조정된 pH), 0.1% SDS, 5X 덴하르트 시약[500ml당 50X 덴하르트 내용물: 5g 피콜(유형 400, Pharmacia), 5g BSA(분획 V; Sigma)] 및 100㎍/ml 변성 연어 정자 DNA로 이루어진 용액에서 42℃ 하에 결합 또는 하이브리드화 반응시킨 다음, 길이가 약 500개 누클레오티드인 프로브가 이용되는 경우에 42℃에서 5X SSPE, 0.1% SDS을 포함하는 용액에서 세척시키는 것과 등가의 조건을 포함한다.
핵산 하이브리드화와 관련하여 사용된 경우의 높은 엄격성 조건은 5X SSPE(43.8g/l NaCl, 6.9g/l NaH2PO4·H2O 및 1.85g/l EDTA, NaOH로 7.4로 조정된 pH), 0.5% SDS, 5X 덴하르트 시약 및 100㎍/ml 변성 연어 정자 DNA로 이루어진 용액에서 42℃ 하에 결합 또는 하이브리드화 반응시킨 다음, 길이가 약 500개 누클레오티드인 프로브가 이용되는 경우에 42℃에서 0.1X SSPE, 1.0% SDS을 포함하는 용액에서 세척시키는 것과 등가의 조건을 포함한다.
핵산 하이브리드화와 관련하여 사용되는 경우, 당해 분야에는 낮은 또는 높은 엄격성 조건을 포함하는 수 많은 등가 반응을 이용할 수 있다는 것이 널리 공지되어 있으며; 프로브의 길이 및 특성(DNA, RNA, 염기 조성) 및 표적의 특성(용액 또는 고정화 등에 존재하는, DNA, RNA, 염기 조성), 및 염과 기타 성분들의 농도(예를 들어, 포름아미드, 덱스트란 설페이트, 폴리에틸렌 글리콜의 존재 또는 부재)와 같은 요인들이 고려되고, 하이브리드화 용액은 다양하여 상기 열거된 조건과는 상이하지만 등가의 낮은 또는 높은 엄격한 하이브리드화 조건을 발생시킬 수 있다.
핵산 하이브리드화와 관련하여 사용된 경우의 "엄격성"은 전형적으로, 약 Tm-5℃(프로브의 Tm보다 5℃ 아래임) 온도에서부터 보다 약 20 내지 25℃ 아래의 온도 범위에서 일어난다. 당해 분야의 숙련인에 의해 인지되는 바와 같이, 엄격한 하이브리드화를 이용하여 동일한 폴리누클레오티드 서열을 동정 또는 검출할 수 있거나 또는 유사하거나 관련된 폴리누클레오티드 서열을 동정 또는 검출할 수 있다. "엄격한 조건" 하에서, 관심있는 핵산 서열은 이의 정확한 보체 및 밀접하게 관련된 서열과 하이브리드화할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "융합 단백질"은 외인성 단백질 단편(비-MCD 서열로 이루어진 융합 파트너)와 결합된 관심있는 단백질(즉, MCD 및 이의 단편)을 함유하는 키메릭 단백질을 지칭한다. 이러한 융합 파트너는 검출 가능한 잔기를 제공할 수 있거나, 숙주 세포로부터의 재조합 융합 단백질의 정제를 허용해주는 친화성 태그를 제공할 수 있거나 둘 다를 제공할 수 있다. 경우에 따라, 상기 융합 단백질은 당해 분야에 공지된 각종 효소적 수단 또는 화학적 수단에 의해 관심있는 단백질로부터 제거할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "정제된" 또는 "정제하기 위한"이란 특정 샘플로부터의 오염물의 제거를 지칭한다. 본 발명은 정제된 조성물(상기 논의됨)을 고려한다.
본원에서 사용된 바와 같이, ("소정의 단백질의 특정 부분"에서와 같이) 특정 단백질과 관련하여 사용된 경우의 용어 "부분"은 상기 단백질의 단편을 지칭한다. 이러한 단편은 크기가 4개의 아미노산 잔기에서부터 전체 아미노산 서열 마이너스 1개의 아미노산의 범위일 수 있다.
"항체"는 이의 생성을 유발시키는, 특정 제제(항상은 아니지만, 통상적으로 펩티드) 또는 구조적으로 유사한 제제와 고 특이성으로 결합되는 B 세포에 의해 생성된 당단백질로서 정의되어야 한다. 항체는 공지된 기술 중의 어떠한 방법에 의해서도 생성될 수 있으며, 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있다.
"돌연변이체"는 각종 상호활성 분자에 대한 특이성, 반응 속도 및 돌연변이체 분자의 장수 여부를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 수 많은 방식들 중의 한 가지 이상에서 증진되거나 저하된 효능으로 작용되는 번역 생성물을 생성시키는, 천연적으로 또는 인공적으로 야생형 누클레오티드 서열에 대해 만들어진 모든 변화체로서 정의되어야 한다.
본 발명은 일반적으로, 말로닐 CoA 데카복실라아제(MCD) 억제제를 동정 및 시험하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이며, 특히 심장에서의 지방산 산화의 주요 조절인자로서 동정된, MCD의 신규한 심장 이소-형태를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 부가적으로, 본 발명은 MCD 경로 효능제 및 길항제를 동정하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이고, 특히 랫트 심장, 간 및 췌장 DNA의 신규한 DNA 서열을포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 설명은 A) 심근 허혈증 후의 심장 재관류 동안의 지방산 산화 변화, B) 심장에서의 말로닐 CoA 및 C) 간 및 췌장에서의 말로닐 CoA을 포함한다.
A. 심근 허혈증 후의 심장 재관류 동안의 지방산 산화 변화
허혈증 동안과 허혈증 후의 심장의 에너지 기질 선호 경향은 허혈증 후 기능성 회복 정도의 중요한 결정 요인이다. 예를 들면, 허혈증 후의 높은 지방산 산화율은 재관류 동안의 심장 기능과 효능을 저하시킬 수 있다. 이들 높은 지방산 산화율은 미토콘드리아내 지방산 흡수의 강력한 억제제인 말로닐 조효소-A(CoA) 수준의 감소로써 설명될 수 있다. 특히, 5'-AMP-활성화 단백질 키나아제의 활성화와 아세틸 CoA 카복실라아제의 억제가 이러한 말로닐 CoA의 감소의 원인인 것으로 여겨진다. 그 결과, 5'-AMP-활성화 단백질 키나아제를 억제하고/하거나 아세틸 CoA 카복실라아제를 자극하는 것이 재관류 동안의 심근 지방산 산화를 억제시키는 약리학적 접근 방법이 될 수 있다. 지방산 산화를 저하시키면 이와 병행해서 글루코오스 산화가 증가하게 되며, 이로써 재관류된 허혈성 심장에서의 심장 기능과 효능 모두가 증진된다[참조: Lopaschuk, Am J Cardiol 80:11A-16A(1997)].
B. 심장에서의 말로닐 CoA
허혈증 후의 심장에서의 높은 지방산 산화율은 1차적으로 심근 말로닐 CoA 수준의 현격한 저하로 인한 것이다. 말로닐-CoA는 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제 1(CPT1)의 강력한 억제제이고 미토콘드리아 내로의 지방산 흡수를 조절하는데 있어서 중요하다. 말로닐 CoA 합성 감소가 부분적으로는, 말로닐 CoA 허혈증 후의저하와 관련이 있다. 심장 특이적 형태의 ACCC에 의한 심장에서의 말로닐 CoA의 합성이 널리 밝혀지긴 하였지만, 말로닐 CoA가 심장 내에서 어떻게 분해되는지에 관해서는 어떠한 정보도 입수 가능하지가 않다. 본 발명은 심장이 말로닐 CoA를 아세틸 CoA로 전환시키는 활성 말로닐 CoA 데카복실라아제(MCD)를 가지고 있다는 사실을 제시해준다. 이는 광범위한 단백질 정제를 요구하지 않는, 말로닐 CoA 데카복실라아제(MCD) 활성을 측정하는 신규하고도 신뢰성 있는 검정법을 개발함으로써 촉진되었다. 이러한 검정법을 사용하여, MCD 활성이 랫트 심장에서 확인되었고 지방산 산화를 조절하는데 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 MCD 효소는 포스포릴화 조절하에 있으며, 실험 조건 하에서 활성화되어 효소 탈포스포릴화를 가져다줄 수 있다. 심장에서의 대다수의 MCD는 미토콘드리아와 연합되어 있으며, 여기서 미토콘드리아를 옥틸글루코시드로 처리하면 MCD 활성이 14배 증가하게 된다. 심장 MCD를 부분적으로 정제한 결과, 대략 45kDa의 단백질이 나타났으며, 이는 폴리아클리아미드 겔 전기영동시켰을 때 레트라메릭(retrameric) 복합체로서 작용한다. MCD는 메틸말로닐 CoA 뮤타아제 및 프로피오닐 CoA와 같은 특정한 미토콘드리아내 효소가 미토콘드리아 유도된 말로닐 CoA에 의해 억제되지 못하도록 하는데 관여하는 미토콘드리아내 효소로서 선행 기술에 기재되어 있다[참조: Kim and Kolattukudy, Arch. Biochem. Biophys 190:234-246(1978), Scholate, Biochim. Biophys. Acta 178:137-144(1969); Landriscina et al., Eur. J. Biochem. 19:573-580(1971); Koeppen et al., Biochemistry 13:3589-3595(1974)]. 포유류 MCD에 관해서는 거의 공지된 바가 없긴 하지만, 2개의 이소-형태의 MCD가거위 미지선(uropygial gland)에서 동정되었다[참조: Courchesne-Smith et al., Arch. Biochem. Biophys. 298:576-586(1992)]. 이들 단백질은 각각이 별개의 전사 및 번역 개시 부위를 가지고 있긴 하지만 동일한 유전자로부터 유래된다. 이들 대체 개시 부위는 2개의 단백질을 생성시키는데, 하나는 미토콘드리아 매트릭스를 표적으로 하고, 다른 하나는 세포질을 표적으로 한다. 미지선에 덧붙여, MCD의 비-미토콘드리아내 수준이 또한 간에서 낮은 수준으로 검출되었다. 지금까지, MCD 활성 및 하위세포성(subcellular) 국재도가 심장에서 확인된 바가 없다.
본 발명에서 지방산 산화를 조절하는데 있어서의 MCD의 역할을, 신생아 래빗트 및 다 자란 랫트로부터 단리된 관류된 심장을 사용하여 연구하였다. 신생아 래빗트 심장에서는, 지방산 산화가 태어난지 1일 후와 7일 후 사이에 현격하게 증가하였으며, 이는 ACC 활성과 말로닐 CoA 수준 모두의 증가를 수반하였다. 이와 병행해서, 1일생 심장과 비교해서 7일생 심장에서 MCD 활성 증가가 관찰되었다. 피가 흐르지 않는 허혈증 증세가 있은지 30분 후에 다 자란 랫트 심장을 호기적으로 재관류시킨 경우에는, 말로닐 CoA 수준이 현격하게 감소하였으며, 이는 지방산 산화율 증가를 수반하였다. 재관류 동안의 말로닐 CoA 감소는 ACC 활성 감소와 MCD 활성 유지로써 설명될 수 있다. 이러한 데이타는 심장이 지방산 산화율을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 하는 MCD을 가지고 있다는 것을 제시해준다. 또한, MCD는 탄생 후 래빗트 심장 또는 심근 허혈증 후 랫트 심장에서 말로닐 CoA 수준을 감소시키는 것과 관련될 수 있는 주요 효소인 것으로 여겨진다. 이 효소의 억제가 임상적으로 상당히 효능이 있는 것으로 간주될 수 있는데, 이는 비정상적인 지방산대사를 특징적으로 나타내는 병리학적 상황에서 약리학적 중재에 대한 잠재적으로 중요한 부위를 나타내기 때문이다. MCD를 약리학적으로 억제시키면, 재관류된 허혈성 심장에서의 심근 말로닐 CoA 수준이 증가하게 될 것이다. 이는 지방산 산화율을 보다 낮게 하고, 글루코오스 산화를 증가시키며, 재관류된 허혈성 심장의 수축 기능을 증진시킬 것이다.
C. 간 및 췌장에서의 말로닐 CoA
간이 대부분 생합성 기관으로서 인식되고 있긴 하지만, 이는 에너지 공급원으로서 지방산을 산화시키기도 한다[참조: Goodridge, Fatty and synthesis in eucaryotes. In: Biochemistry of lipids, liposomes and membranes. Ed: Vance and Vance 111-139(1991)]. 말로닐 CoA는 이러한 과정에 중요한데, 이는 말로닐 CoA가 지방산의 미토콘드리아내 흡수에 관여하고 있는 속도-제한 효소인 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제 1(CPT1)를 억제하기 때문이다[참조: McGarry and Brown, Eur J. Biochem 244:1-14(1997); Alam and Saggerson, Biochem J 334:233-241(1988); Bird and Saggerson, Biochem 222:639-647(1984)]. CPT1을 억제함으로써, 지방산의 미토콘드리아내 흡수가 감소되고 이로써 미토콘드리아내 지방산 산화가 저하된다[참조: Lopaschuk et al., J. Biol. Chem. 269:25871-25878(1994)]. 영양 결핍증이나 당뇨병에 걸린 동안에는, 말로닐 CoA의 감소로 인해 지방산 합성이 제한되고 지방산 산화가 상향 조절될 수 있다. 지방산 신타아제가 활성이 아닌 경우에는 말로닐 CoA가 간에서 어떻게 분해되는지에 관해서는 여전이 의문이다.
췌장 중의 β-세포에서는, 심장과 간에서와 마찬가지로, 말로닐-CoA/CPT1 상호작용이 "연료 크로스-톡(fuel cross-talk)" 시그날링 네트워크의 중추 요소이고 췌장 β-세포에서의 인슐린 분비의 단기간 및/또는 장기간 조절과 연관이 있을 수 있다[참조: Chen et al., Diabetes 43:878-883(1994); Prentki et al., J. Biol Chem 267:5802-5810(1992)]. 간과 같은 지방형성 조직과 아디포오스 조직에서의 말로닐-CoA의 세포내 농도는 아세틸-CoA 카복실라아제(ACC)에 의한 이의 형성율과 지방산 신타아제(FAS)에 의한 이의 활용으로부터 비롯되는 것으로 인식된다. 그러나, 췌장섬과 같은 기타 조직[참조: Brun et al., Diabetes 45:190-198]은 FAS를 극히 낮은 수준으로 발현하지만, 이의 농도를 증가 또는 감소시키는 수 많은 실험 조건 하에서 말로닐-CoA의 신속한 변화(다양성)를 나타낸다. β-세포에서의 말로닐-CoA의 운명은 명확하지 않고, 이러한 대사 시그날링 분자의 세포내 농도가, 적어도 낮은 FAS를 발현하는 비-지방형성 조직에서 부가의 효소에 의해 조절된다고 설득력있게 여겨진다. 이러한 기능에 대한 가장 유력한 후보가 MCD이다.
바람직한 양태의 상세한 설명
일반적으로, 후술되는 명명법과 다음에 기재된 세포 배양, 분자 유전학, 및 핵산 화학 및 하이브리드화에서의 실험 과정은 당해 분야에 널리 공지된 것이며 통상 이용되는 것이다. 재조합 핵산 방법, 폴리누클레오티드 합성, 및 미생물 배양 및 형질전환(예를 들어, 전기천공, 리포펙틴)에 대해서는 표준 기술이 사용된다. 일반적으로, 효소 반응 및 정제 단계는 제조업자의 명세에 근거하여 수행한다. 기술 및 과정은 일반적으로 당해 분야에서의 통상적인 방법 및 각종 참조문헌에 따라서 수행한다[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratoty Manual, 2ded.(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., and Current Protocols in Molecular Biology(1996) John Wiley and Sons, Inc., N.Y.].
제조업자에 의해 제공된 명세 내용에 따라서, 어플라이드 바이오시스템즈 올리고누클레오티드 합성기 상에서 올리고누클레오티드를 합성할 수 있다[상세한 내역은 Sinha et al., Nucleic Acids Res. 12:4539(1984) 참조한다]. 상보적 올리고누클레오티드는 NaCl(200mM)을 함유하는 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 8.0)의 용액에서 90℃로 가열한 다음 이를 실온으로 서서히 냉각시킴으로써 어닐링시킨다. 결합 및 턴오버 검정을 위해, 이중체 DNA를 본래의 폴리아크릴아미드(15%w/v) 겔로부터 정제한다. 이본쇄 DNA에 상응하는 밴드를 절단하고 EDTA(1mM)을 함유하는 0.30M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.0)에서 밤새 침지시킨다. 침지 후, 상등액을 페놀/클로로포름(1/1 v/v)로 추출하고 에탄올로 침전시킨다. DNA 기질을 [δ-32P]ATP 및 T4 폴리누클레오티드 키나아제로 처리함으로써 이들의 5'-OH 그룹 상에 방사성표지시킨다. 염과 혼입되지 않은 누클레오티드를 세파덱스 G-컬럼 상에서 크로마토그래피함으로써 제거한다.
본 발명은 특히, (1) MCD 활성을 억제함으로써 말로닐 CoA가 아세틸 CoA로 분해되는 것을 활성화시키거나 억제시키는 단백질 또는 작은 분자를 동정하기 위한 스크린을 고안 및 실행하는데 유용하고, (2) 합리적인 약물 고안에 대한 높은 처리량 스크린을 개발하는데 유용하며, (3) MCD 내부 특이적 및 상호 특이적 상동체 또는 돌연변이체를 동정하는데 유용할 것이다. 부가적으로, 본 발명은, 고-처리량 스크리닝 포맷이 길항제 또는 효능제를 동정하기 위한 큰 제제 뱅크(예: 화합물 라이브러리, 펩티드 라이브러리 등)와 함께 사용되는 경우, MCD 활성을 억제하거나 증진시키는 제제의 능력을 검출하는 검정법을 고려하고 있다. 이러한 MCD 경로 길항제 및 효능제는 효능있는 치료 도구, 및 진단 또는 예후 도구로서 추가로 개발될 수 있다.
스크리닝 검정
본 발명의 스크리닝 검정은 단리되거나 부분적으로 정제된 형태의 검정 성분(또는 MCD 효소)을 이용할 수 있다. "정제된"이란 이들의 본래의 환경(예를 들어, 특정 세포, 효모 원형질의 세포질 또는 핵 분획, 또는 재조합 생성에 의한 세포질 또는 핵 분획)으로부터 분리시킨 본 발명의 효소를 지칭한다. 이러한 효소가 약 10 내지 50% 이상의 순도로 정제되는 것이 바람직하다. 실질적으로 순수한 조성물은 상동성, 즉 약 70 내지 90% 순도에 접근하는 상기 MCD 효소(들) 또는 복합체를 포함한다. "순수한" 제제란 순도가 90% 초과, 더욱 바람직하게는 순도가 95%를 초과한 것을 지칭한다. 바람직한 양태는 재조합 방법으로 생성되거나 화학적으로 합성되는 심장 MCD를 이용하는 결합 검정을 포함한다. 한 양태에서는, 스크리닝 방법이 MCD 및 기질 말로닐 CoA 이외에도,14C-표지된 시트레이트를 생성시키는14C-표지된 옥살로아세테이트의 용도를 이용한다.
본 발명의 스크리닝 검정이 특히 MCD 활성을 억제하게될 제제를 동정할 것이라고 고려된다. 이러한 억제제는 허혈증의 치료(예를 들어, MCD의 약리학적 억제로 인해, 재관류된 허혈성 심장에서의 심근 말로닐 CoA 수준이 증가해야 한다) 뿐만 아니라 기타 장애의 치료에 유용한 것으로 간주된다. 이는 지방산 산화율을 보다 낮게 하고, 글루코오스 산화를 증가시키며 재관류된 허혈성 심장의 수축 기능을 증진시킬 것이다.
본 발명은 각종 검정 포맷을 이용한 화합물 스크리닝을 고려하고 있다. 한 양태에 있어서, 본 발명은 a) i) 말로닐 CoA 데카복실라아제를 포함하는 정제된 제제, ii) 기질 및 iii) 시험 화합물을 제공하는 단계; b) 상기 시험 화합물의 존재 및 부재하에서, 상기 말로닐 CoA 데카복실라아제가 상기 기질 상에 작용하여 생성물을 생성할 수 있도록 해주는 조건 하에 상기 말로닐 CoA 데카복실라아제와 상기 기질을 혼합하는 단계; 및 c) 상기 시험 화합물의 존재 및 부재 하에서 생성된 생성물의 양을 직접적으로 또는 간접적으로 측정하는 단계를 포함하는, 화합물 스크리닝 방법을 고려하고 있다. 한 양태에서는, [14C]시트레이트 수준 감소로써 평가된 바와 같이 아세틸 CoA 형성을 검출함으로써 억제를 측정한다.
말로닐 CoA 데카복실라아제 검정:MCD 활성을 측정하기 위하여, MCD 반응 생성물인 아세틸 CoA를 검출하는 신규한 MCD 검정을 본 발명에서 개발하였다. MCD로부터 유도된 아세틸 CoA를 [14C]옥살로아세테이트 및 시트레이트 신타아제(0.73μU/μL)의 존재하에서 배양하여 시트레이트를 형성한다. L-[14C(U)]아스파테이트(2.5μCi/ml) 및 2-옥소글루타레이트(2mM)를 이용하여 실온에서 20분동안 아민기 전이 반응을 수행함으로써 [14C]옥살로아세테이트를 초기에 생성한다. 이러한 검정의 이점 중의 하나는 검정에 앞서 광범위한 MCD의 정제가 요구되지 않으며, 효소 활성의 시험관내 측정이 생체내 효소 활성율에 반영된다는 것이다(반응식 A 참조).
1. MCD의 효능제 또는 길항제를 동정하기 위한 스크린
MCD 활성을 특이적으로 억제하거나 증진시키는 물질을 구하기 위해 본 발명에 의해 고려된 몇 가지 상이한 접근법이 있다. 한 가지 접근법은 MCD를 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 구성물로 세포를 형질감염시키고, 이러한 세포를 MCD 활성을 조절하는 것으로 추정되는 화합물에 노출킨 후에 대조군과 비교해서 MCD 활성 변화를 측정하는 것이다. 세포를 유도성 프로모터의 조절 하에 상기 구성물로 일시적으로 형질감염시키거나 안정적으로 형질감염시킬 수 있다. 초생리학적 수준의 MCD 발현(초생리학적이란 상기 유전자를 함유하는 구성물로 세포을 형질감염 및 발현시키지 않고서 세포를 정상적으로 발현시키는 것 보다 높은 수준에서의 상기 유전자 생성물의 발현 수준으로서 정의된다)은 정상적이지만 난해한 세포내 MCD 상호작용을 증진시켜, 지금까지 검정 불가능하였던 현상에 관한 연구를 상당히 허용해줄 수 있다. 기타 양태는 상응하는 RNA의 번역과 펩티드의 정제를 포함할 것이다. 이어서, 이와 같이 정제된 펩티드를 사용하여 특이적 화합물:단백질 상호작용을 시험할 수 있다. 부가적으로, RIA, ELISA 또는 웨스턴 블롯과 같은(이에 제한되지는 않는다) 면역학적 검정법의 개발을 허용해주면서 상기와 같이 해석된 발명에 대한항체를 생성시키는 것이 가능하다. 더욱이, 생체내 검정을 수행하도록 해주면서 형질전환된 동물을 생성시킬 수 있다.
A. 형질감염 검정
형질감염 검정은 검정 개발에 있어서 상당한 융통성을 허용해준다. 광범위한 시판용 형질감염 벡터가 상당 수의 세포 유형에서 본 발명의 MCD 유전자의 발현을 허용해줄 것이다. 한 양태에서는, 1) MCD를 암호화하는 핵산과 2) 유도성 프로모터의 작동 가능한 조합을 포함하는 발현 구성물로 세포를 일시적으로 형질감염시킨다. MCD 활성을 조절하는 것으로 추정되는 제제에 세포를 노출시키고, MCD 발현을 작동시킨 다음 MCD 활성을 측정한다. 재조합 MCD를 발현하는 세포에서의 MCD 활성율을 대조군 발현 벡터(예를 들면, 빈 발현 벡터)로 형질감염된 세포에서의MCD 활성율과 비교한다. MCD 활성율은 문헌에 보고되어 있고 당해 분야의 숙련인에게 공지된 수 많은 방법에 의해 정량화할 수 있다.
또 다른 양태에서는, 안정하게 형질감염된 세포주, 즉 본 발명의 MCD 유전자를 안정하게 발현하는 세포주를 발현한다. 유도성 프로모터의 용도가 이들 시스템에 활용될 것이다. MCD 활성을 조절하는 것으로 추정되는 화합물에 대한 스크리닝 검정이 일시적인 형질감염 검정의 경우와 동일한 방식으로 수행될 것이다. 안정하게 형질감염된 세포주를 사용하여, 실험들 간의 보다 큰 일관성을 나타낼 수 있으며 실험들을 서로 비교할 수 있게 된다.
2. 유사하거나 상동성인 유전자 돌연변이물을 발현하는 조직을 동정하기 위한 스크린
한 양태에서는, 마이크로검정 마이크로칩 기술을 사용하여 조직 스크린을 수행할 것이다. 이는 서열화된 MCD 유전자와 유사하거나 이와 상동성인 돌연변이체 유전자를 발현하는 조직을 동정하기 위한 고-처리량 스크린의 개발을 허용해줄 것이다.
3. MCD 시그날 경로 구성분을 동정하기 위한 스크린
a. 시험관내 검정
MCD 상호활성 분자를 동정하기 위한 몇 가지 상이한 접근법이 있다. 본 발명은 비활성(또는 저하된 활성) MCD 또는 구성적으로 활성인 MCD 분자와만 연합될 수 있는 단백질의 동정을 허용해줄 것이다. 이러한 단백질은 MCD 기능을 조절할 수 있다. 사용될 수 있는 기술은 본 발명의 전사 생성물에 대해 생성된 항체를 이용하여 MCD를 면역침전시키는 것이지만, 이에 제한되지는 않는다. 이는 또한, 연합되어 결합된 어떠한 단백질도 분리시킬 수 있다. 또 다른 방법은 글루타치온 S-트랜스퍼라아제와 같이 일반적으로 인식된 풀-다운(pull-down) 단백질에 연결된 돌연변이 형태의 MCD를 함유하는 융합 단백질을 생성시키는 것이다. 이어서, 결합된 단백질을 빼낸 다음 분석한다.
i) 면역침전
야생형 및 돌연변이체 MCD에 대한 항체를 생성시킨 후, 형질감염된 MCD를 발현하는 세포를 용해시킨 다음, 상기 항체들 중의 하나와 함께 배양한다. 이어서, 결합된 MCD 및 모든 연합 단백질과의 항체를 표준 기술을 사용하여 단백질-A 세파로오스 또는 단백질-G 세파로오스 비이드로 풀-다운시킨다.
ii) 융합 단백질 풀-다운
면역침전과 유사한 방법은 MCD와 글루타치온 S-트랜스퍼라아제(GST)의 융합 단백질을 구성하는 것이다. 이어서, 상기 MCD 융합 단백질을 세포 추출물과 함께 배양한 다음, 글루타치온 세파로오스 비이드로 제거한다. 이어서, 결합된 모든 MCD 단백질의 특징을 확인한다.
4. MCD 상동체를 동정하기 위한 스크린
표준 분자 생물학 기술을 사용하여 랫트, 사람 또는 기타 종에서 MCD 상동체를 동정할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 DNA-DNA 하이브리드화 기술(예: 서던 블롯) 및 DNA-RNA 하이브리드화 기술(예: 노던 블롯)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 각종 접근법을 고려한다. 부가의 기술에는, 예를 들어, SEQ ID NO:1, 2또는 3의 번역 생성물에 대해 생성된 항체를 이용하여 라이브러리 스톡으로부터 만든 단백질을 면역스크리닝하는 것이 포함될 수 있다. 더욱이, MCD의 공지되거나 추정되는 상호활성 단백질을 면역침전시킨 후에, SEQ ID NO:1, 2 또는 3의 번역 생성물에 대해 생성된 항체로 가능한 돌연변이체 MCD 상동체를 동정할 수 있다.
실험
다음 실시예는 본 발명의 특정의 바람직한 양태 및 국면을 예시하기 위한 것이며 이로써 본 발명의 범주가 제한되지는 않는다. 후술되는 실험 기재 내용에서, 다음 방법론이 적용된다.
방법론
재료: L-[14C(U)]아스파테이트 및 [9,10-14C]팔미테이트는 만델(Mandel)로부터 구입하고, 하이아민 하이드록시드(메틸벤제토늄; 메탄올 용액 중의 1M)는 ICN으로부터 구입한다. 소의 혈청 알부민(분획 V)은 베링거 만하임(Boehringer Mannheim; West Germany)로부터 구입한다. 도웩스 50W-X8 양이온 교환 수지(100 내지 200메쉬 수소 형태)는 바이오-래드 라보라토리즈(Bio-Rad Laboratories; Richmond, CA)로부터 수득한다. ACS 아쿠어스 계수 신틸란트는 아머샴 캐나다(Amersham Canada; Oakville, Ontario)로부터 구입한다. 기타 모든 화학물질은 시약 등급이다.
1. 랫트 심장 말로닐 CoA 데카복실라아제의 제조
수컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 랫트(300 내지 350g)를 나트륨 펜토바르비톨로 마취시키고, 심장을 신속하게 절개한다. 이어서, 심장을 MCD 측정을 위해 즉시 균질화시키고, 미토콘드리아 제조를 위해 즉시 사용하며(다음 참조) 액상 N2에서 동결시키거나, 단리된 작용 심장 관류물에 사용한다. 또한, 단리된 심장 관류물용으로 마취시킨 1일 및 7일생 뉴질랜드산 화이트 래빗트로부터 심장을 수득하고 다음과 같이 기술한다. MCD 측정에 사용된 신선하거나 동결된 심장(10 내지 15mg의 조직)을, NaF(50mM) 및 NaPPi(5mM)을 사용하거나 사용하지 않으면서, KCl(75mM), 슈크로오스(20mM), HEPES(10mM), EGTA(1mM)으로 구성되는 완충액 중에서 2 x 15초 동안 균질화시킨다. 2mg의 조직에 상응하는 상기 균질물의 일정 분획을 MCD 검정에 사용한다.
랫트 심장 미토콘드리아의 단리 및 말로닐 CoA 데카복실라아제의 정제: 랫트 심장을 절개하고 이들의 심방으로부터 분리시킨다. 이어서, 심실을 1mm 입방체로 자르고 찬 얼음 만니톨/슈크로오스/EGTA(MSE) 완충액(225mM 만니톨; 75mM 슈크로오스; 1mM EGTA, pH 7.5)으로 세정한다. MSE 완충액 대 습윤 조직의 중량비를 2:1로 하여 준비한 다음, 테플론 막자가 있는 유리 균질화기 5스트로크를 사용하여 균질화시킨다. 이어서, 이러한 균질물을 MSE를 사용하여 10ml/g의 습윤 조직으로 희석시키고 480 xg으로 5분 동안 원심분리시킨다. 상등액을 2층의 치즈 천 조각을 통해 여과시킨 다음, 10,000 xg으로 30분 동안 원심분리시킨다. 이어서, 0.5mM 디티오에리트리톨(DTE)을 함유하는 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.6)에 펠릿을 재현탁시킨다(50ml/g의 습윤 미토콘드리아 펠릿). 트리톤 X-100을 상기 현탁액에 가한다음(0.1%), 슬러리를 4℃에서 16시간 동안 교반시켜 미토콘드리아를 용해시킨다. 이어서, 상기 용액을 24,000 xg으로 10분 동안 원심분리시키고, 분말상 황산암모늄을 사용하여 상등액을 40%로 포화시킨 다음, 얼음 상에서 1시간 동안 교반시킨다. 침전된 단백질을 24,000 xg으로 10분 동안 원심분리시킴으로써 제거한다. 상기 상등액을 분말상 황산암모늄을 사용하여 55%로 포화시키고, 얼음 상에서 1시간 동안 교반시킨 다음, 24,000 xg로 10분 동안 원심분리시킨다. 이 펠릿을 0.1M 인산칼륨(pH 7.4), 1mM DTT 및 1M 암모늄 SO4완충액에 재현탁시킨다.
부틸 세파로오스 650M 상에서의 크로마토그래피:그 다음, 상기 인산칼륨/MCD 용액을, 1mM DTT 및 1M 암모늄 SO4를 함유하는 0.1M 인산칼륨 완충액(pH 7.4)으로 앞서 평형시킨 100ml 부틸-세파로오스 650M 상으로 부하한다. 이 컬럼을 3컬럼 용적의 상기 완충액으로 세척하고, 총 500ml의 용량으로 1 내지 0M 암모늄 SO4의 선형 구배를 이용하여 단백질을 용리시키는데, 이때 10ml 분획을 수집한다. MCD 활성을 함유하는 분획을 모으고, 밀리포어 울트라프리(Millipore Ultrafree) 15ml 원심분리용 여과 장치인 바이오맥스(Biomax) 10K NMWL을 사용하는 한외여과를 이용하여 농축시킨다. 이로써 생성된 1ml 용액을 0.1M 인산칼륨(pH 7.4), 1mM DTT 및 1M 암모늄 SO4완충액에서 50ml로 만든다.
페닐 세파로오스 HP 상에서의 크로마토그래피:그 다음, 상기 효소 용액을, 1mM DTT 및 1M 암모늄 SO4완충액을 함유하는 0.1M 인산칼륨 완충액(pH 7.4)으로 앞서 평형시킨 25ml 페닐 세파로오스 HP 컬럼 상으로 부하한다. 이 컬럼을 3컬럼 용적의 상기 완충액으로 세척하고, 총 500ml의 용량으로 1 내지 0M 암모늄 SO4의 선형 구배를 이용하여 단백질을 용리시키는데, 이때 10ml 분획을 수집한다. MCD 활성을 함유하는 분획을 모으고, 상기와 같이 한외여과를 이용하여 농축시킨다. 이로써 생성된 1ml 용액을 1mM DTT를 함유하는 20mM 비스-트리스(pH 7) 완충액에서 50ml로 만든다.
Q 세파로오스 HP 상에서의 크로마토그래피:그 다음, 상기 효소 용액을, 1mM DTT을 함유하는 20mM 비스-트리스(pH 7) 완충액으로 앞서 평형시킨 10ml Q 세파로오스 HP 컬럼에 적용한다. 이 컬럼을 3컬럼 용적의 상기 완충액으로 세척하고, 총 100ml의 용량으로 0 내지 0.3M NaCl의 선형 구배를 이용하여 결합된 단백질을 용리시킨다. 5ml 분획을 수집하고, MCD 활성을 함유하는 분획을 모은 다음, 상기와 같이 농축시킨다. 이와 같이 농축된 풀을 1mM DTT를 함유하는 50mM 말로네이트(pH 5.6) 완충액 50ml에 재현탁시킨다.
SP 세파로오스 HP 상에서의 크로마토그래피:그 다음, 상기 효소 용액을, 1mM DTT을 함유하는 50mM 말로네이트(pH 5.6) 완충액으로 앞서 평형시킨 5ml SP 세파로오스 HP 컬럼에 적용한다. 이 컬럼을 3컬럼 용적의 상기 완충액으로 세척하고, 총 50ml의 용량으로 0 내지 0.3M NaCl의 선형 구배를 이용하여 결합된 단백질을 용리시킨다. 2ml 분획을 수집하고, MCD 활성을 함유하는 분획을 모은 다음, pH 7.0이 되게 중화시키며, 상기와 같이 농축시킨다. 이와 같이 농축된 풀을 1mM DTT를 함유하는 50mM 말로네이트(pH 5.6) 완충액 5ml에 재현탁시킨다.
SP 세파로오스 HP로부터의 말로닐 CoA 친화성 용리:그 다음, 상기 효소 용액을 상기와 같이 앞서 평형시킨 0.5ml SP 세파로오스 HP 컬럼에 다시 적용한다. 이 컬럼을 세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거한 다음, 1mM DTT 및 10μM 말로닐 CoA를 함유하는 50mM 말로네이트(pH 5.7) 완충액으로 용리시킨다. 이로써, MCD를 고도로 특이적으로 용리시킬 수 있다. 제2 SP 세파로오스 HP 컬럼으로부터 용리된 단백질 분획을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 재용해시키고, 쿠마시 용액을 사용하여 가시화를 위해 염색한다. 단백질의 MCD 밴드를 겔로부터 절단하고, "겔 중에서" 트립신으로 분해시킨다. 일단 분해되면, 트립신 처리된 펩티드를 마이크로보어(microbore) HPLC 상에서 분리시키고, 선택된 펩티드를 대상으로 하여 단백질 서열화를 위해 에드만 분해시킨다.
말로닐 CoA 데카복실라아제 검정:MCD 활성을 측정하기 위하여, MCD 반응 생성물인 아세틸 CoA를 검출하는 신규한 MCD 검정을 본 발명에서 개발하였다. MCD로부터 유도된 아세틸 CoA를 [14C]옥살로아세테이트 및 시트레이트 신타아제(0.73μU/μL)의 존재하에서 배양하여 시트레이트를 형성한다. L-[14C(U)]아스파테이트(2.5μCi/ml) 및 2-옥소글루타레이트(2mM)를 이용하여 실온에서 20분 동안 아민기 전이 반응을 수행함으로써 [14C]옥살로아세테이트를 초기에 생성한다. 이러한 검정의 이점 중의 하나는 검정에 앞서 광범위한 MCD의 정제가 요구되지 않으며, 효소 활성의 시험관내 측정이 생체내 효소 활성율에 반영된다는 것이다.
MCD 검정을 개시하기 위하여, 심장 균질물 또는 미토콘드리아 제제를, NaF(50mM) 및 NaPPi(5mM)의 존재 또는 부재하에서, 37℃ 하에 210㎕ 반응 혼합물(0.1M 트리스, pH 8.0; 0.5mM 디티오트레이톨, 1mM 말로닐 CoA)에서 10분 동안 배양한다. 과염소산(0.5mM) 40㎕를 가함으로써 상기 반응을 중지시키고, 2.2M KHCO3(pH 10) 10㎕으로 중화시키며, 10,000 xg로 5분 동안 원심분리시켜 침전된 단백질을 제거한다. 심장 샘플을 말로닐 CoA와 함께 배양하면, 말로닐 CoA를 아세틸 CoA로 전환시킬 수 있으며, 이어서 이를 [14C]옥살로아세테이트(0.17μCi/ml)과 합하여 [14C]시트레이트를 제조한다. 이어서, 나트륨 글루타메이트(6.8mM) 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(0.533μU/㎕)를 가한 다음 실온에서 20분 동안 배양함으로써, 반응되지 않은 [14C]옥살로아세테이트를 상기 반응 혼합물로부터 제거한다. 이로써, 반응되지 않은 [14C]옥살로아세테이트가 다시 [14C]아스파테이트로 아민기 전이될 수 있다. 이어서, 이로써 생성된 용액을 도웩스 50W-8X(100 내지 200메쉬)의 1:2 현탁액에서 교반시키고 400 xg로 10분 동안 원심분리시킨다. 이러한 펠릿화 도웩스 분획은 [14C]아스파테이트를 제거한 반면, 상기 상등액은 [14C]시트레이트를 함유하고 있다. 이어서, [14C]시트레이트의 형태로 존재하는14C을 알아보기 위하여 상기 상등액 분획을 계수한다. 이어서, MCD에 의해 생성된 아세틸 CoA의 양은, 상기 언급된 바와 동일한 검정 조건을 적용시킨 아세틸 CoA 표준 곡선과 비교함으로써 정량화한다. 표준 아세틸 CoA 농도 곡선을 각 실험마다 수행한다. 이들 곡선은 항상 선형인 것으로 밝혀졌다(r=0.99).
CoA 에스테르의 결정:CoA 에스테르를 분말상 조직으로부터 6% 과염소산 내로 추출하고, 선행 기술 분야에 기재된 변형된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)[참조: Lopaschuk et al., J. Biol. Chem. 269:25871-25878(1994)]를 사용하여 측정한다. 필수적으로, 각 샘플(각 100㎕)을 예비컬럼 카트릿지(C18, 크기 3cm, 7㎛) 및 벡크만 시스템 골드 HPLC 상에서의 마이크로소르브 짧은 원-컬럼(유형 C18, 입자 크기 3㎛, 크기 4.6 x 100mm)을 통하여 수행시킨다. 흡광도를 254mM로 설정하고 유속은 1ml/min으로 설정한다. 완충액 A(0.2M NaH2PO4, pH 5.0)와 완충액 B(0.25M NaH2PO4및 아세토니트릴, pH 5.0)를 80:20(v/v)의 비율로 사용하여 구배를 개시한다. 초기 조건을 2.5분 동안 유지시킨 다음, 벡크만의 곡선 3을 사용하여 5분간에 걸쳐 18% B로 변화시킨다. 15분째에, 구배를 3분에 걸쳐 37% B로 선형으로 변화시키고, 연속적으로 17분에 걸쳐 90% B로 변화시킨다. 42분째에, 조성물을 0.5분에 걸쳐 다시 3% B로 선형으로 회귀시키고, 50분째에는, 컬럼 평형을 완료시킨다. 벡크만 시스템 골드 소프트웨어 패키지에 의해 피크를 통합한다.
아세틸-CoA 카복실라아제 검정:대략 200mg의 동결된 심장 조직을 균질화시키고, 원심분리시킨 다음 앞서 기재된 바와 같이 투석시킨다[참조: Lopaschuk et al., J. Biol. Chem. 269:25871-25878(1994)]. 투석물 25㎕를, 60.6mM 트리스 아세테이트, pH 7.5; 1mg/ml 소의 혈청 알부민; 1.32μM β-머캅토에탄올; 2.12mMATP; 1.06mM 아세틸 CoA; 5.0mM 마그네슘 스테아레이트; 18.2mM NaHCO3; 및 10mM 마그네슘 시트레이트를 함유하는 반응 혼합물(총 용적 160㎕)에 가한다. 샘플을 37℃에서 0, 1, 2, 3 또는 4분 동안 배양하고, 10% 과염소산 25㎕를 가함으로써 반응을 중지시킨다. 이어서, 샘플을 2분 동안 13,000rpm으로 방사하고, 상기 언급된 HPLC 과정을 이용하여 상등액 중에서의 말로닐 CoA 농도를 측정한다.
웨스턴 블롯 분석:샘플을 비-변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동시키거나 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동시킨 다음, 앞서 기재된 바와 같이 니트로셀룰로오스에 옮긴다[참조: Lopaschuk et al., J. Biol. Chem. 269:25871-25878(1994)]. 막을 랫트 항-MCD 항체로 면역블롯팅시키거나 1% 분유 중의 소의 항-카탈라아제 항체(Chemicon)로 면역블롯팅시킨다. 제조업자에 의해 지시된 바와 같이 아머샴 증진된 화학 발광성 웨스턴 블롯팅 및 검출 시스템을 사용하여 상기 항체를 가시화한다.
심장 관류:단리되고 관류된 심장을 신생아 뉴질랜드산 화이트 래빗트(1일생 및 7일생) 또는 다 자란 스프라그-돌리 랫트로부터 수득한다. 1일생 래빗트 심장을 30mmHg의 관상 관류압에서, 앞서 기재된 바와 같이 단리 및 관류시킨다[참조: Lopaschuk et al., J. Biol. Chem. 269:25871-25878(1994)]. 7일생 심장은 7.5mm Hg 좌심방 예비 하중 및 30mm Hg 대동맥 후반 하중으로 앞서 기재된 바와 같이 관류시킨다[참조: Lopaschuk et al., J. Biol. Chem. 269:25871-25878(1994)]. 랫트 심장은 11.5mm Hg 좌심방 예비 하중 및 80mm Hg 대동맥 후반 하중으로 관류시킨다[참조: Lopaschuk et al., J. Biol. Chem. 269:25871-25878(1994)].
신생아 래빗트 심장을, 3% 소의 혈청 알부민, 0.4mM [9,10-14C]팔미테이트, 11mM 글루코오스 및 100μU/ml의 인슐린을 함유하는 크렙스-한젤라이트(Krebs'-Henseleit) 용액으로 관류시킨다. 심장을 40분 주기 동안 관류시키고 지방산 산화를 다음에 기재되는 바와 같이 측정한다. 랫트 심장을 11mM 글루코오스, 1.2mM 팔미테이트 및 100μU/ml의 인슐린을 함유하는 크렙스-한젤라이트 용액으로 관류시킨다. 심장을 60분의 호기성 기간, 30분의 호기성 및 30분의 총 허혈성 기간 동안 관류시키거나, 또는 30분의 호기성, 30분의 총 허혈성 및 60분의 재관류 기간 동안 관류시킨다.
모든 관류가 끝날 무렵, 심장을 액상 N2의 온도로 냉각된 집게를 이용하여 동결시킨다. 관류된 심장으로부터 동결된 심실 조직을 칭량하고, 액상 N2의 온도로 냉각된 모르타르 및 막자에서 분말화한다. 이와 같은 분말상 조직의 일정 부분을 사용하여 상기 심실의 건조-대-습윤 중량비를 결정한다. 캐뉼라 상에 잔존하는 심방 조직을 제거하고, 100℃에서 12시간 동안 오븐에서 건조시킨 다음, 칭량한다. 건조된 심방 조직을 이용하여, 동결된 총 심실 중량, 및 심실 건조-대-습윤 중량비, 심장의 총 건조 중량을 결정한다.
팔미테이트 산화 측정:[1-14C]팔미테이트(대략 50,000dpm/ml 완충액)으로 관류된 심장으로부터 생성된14CO2를 정량적으로 수집함으로써, 신생아 래빗트 심장과호기성 및 재관류된 허혈성 심장 모두에서 정상 상태의 팔미테이트 산화율을 측정한다. 산소화 챔버에서 기체로서 방출된14CO2와 관류물 중의 NaHCO3에 트랩핑된14CO2의 수집은 앞서 기재된 바와 같이 수행한다[참조: Lopaschuk et al., J. Biol. Chem. 269:25871-25878(1994)].
통계학적 분석:두 그룹 평균의 통계학적 차이를 결정하기 위하여 쌍을 이루지 않은 ε-시험을 사용한다. 3개 그룹에 대해, 변수를 분석한 다음 네민-킬(Nemine-Keels) 시험을 사용한다. p<0.05의 값이 유의성인 것으로 간주된다. 제시된 모든 데이타는 평균±평균치의 표준 오차(S.E.M)로서 나타내었다.
2. 랫트 간/췌장 말로닐 CoA 데카복실라아제의 제조
수컷 스프라그-돌리 랫트(300 내지 350g)를 나트륨 펜토바르비톨로 마취시키고, 간/췌장을 신속하게 절개한다. 50 랫트 간을 1mm 입방체로 자르고 찬 얼음 MSE 완충액(225mM 만니톨; 75mM 슈크로오스; 1mM EGTA, pH 7.5)으로 세정한다. MSE 완충액 대 조직의 2:1 비율을 간 마다 사용한 다음, 테플론 막자가 있는 유리 균질화기 5스트로크를 사용하여 균질화시킨다. 이어서, 이러한 균질물을 MSE를 사용하여 10ml/g의 습윤 조직으로 희석시키고 480 xg으로 5분 동안 원심분리시킨다. 상등액을 2층의 치즈 천 조각을 통해 여과시킨 다음, 10,000 xg으로 30분 동안 원심분리시킨다. 이어서, 0.5mM 디티오에리트리톨(DTE)을 함유하는 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.6)에 펠릿을 재현탁시킨다(5ml/g의 습윤 미토콘드리아 펠릿). 트리톤X-100을 상기 현탁액에 가한 다음(0.1%), 슬러리를 4℃에서 16시간 동안 교반시켜 미토콘드리아를 용해시킨다. 이어서, 상기 용액을 24,000 xg으로 10분 동안 원심분리시키고, (NH4)2SO4을 사용하여 상등액을 40%로 포화시킨 다음, 얼음 상에서 1시간 동안 교반시킨다. 침전된 단백질을 24,000 xg으로 10분 동안 원심분리시킴으로써 제거한다. 상기 상등액을 (NH4)2SO4을 사용하여 55%로 포화시키고, 얼음 상에서 1시간 동안 교반시킨 다음, 24,000 xg로 10분 동안 원심분리시킨다. MCD 활성이 풍부한 상기 펠릿을, 제1 컬럼에 대비하기 위하여 0.1M 인산칼륨(pH 7.4), 1mM DTT 및 1M (NH4)2SO4완충액에 재현탁시킨다.
말로닐 CoA 데카복실라아제 검정:시트레이트 신타아제 및 말레이트 데하이드로게나제를 사용하는 커플링된 검정에서 말로닐 CoA로부터 아세틸 CoA를 형성해주는 형광 분석 검정을 이용하여, MCD 활성을 측정한다. 1.4ml의 반응 혼합물은 0.1M 트리스-HCl, pH 8.0, 1mM DTE, 0.01M 말산, 0.17mM NAD+, 0.136mM 말로닐 CoA, 11U 말레이트 데하이드로게나제, 0.44U 시트레이트 신타아제를 함유한다. 효소 활성에 따라서 각종 양의 MCD(10 내지 50㎕)를 가함으로써 반응을 개시한다. 이 반응물을 대상으로 하여, 시마즈두(Shimazdu) 분광형광계 RF-5000을 사용하여 4분에 걸쳐 NAD+로부터의 NADH의 형성을 측정하였다. NADH의 형성은 340nm의 여기 파장 및 460nm의 방출 파장에서 측정하였다[참조: Sherwin and Natelson, Clin Chem 21:230-234(1975)].
방사측정 MCD 검정을 또한, 완전한 조직에서의 MCD 활성 측정을 위해 사용한다[참조: Dyke et al., Am J Physiology 275:H2122-H2129(1998)]. MCD로부터 유도된 아세틸 CoA를 [14C]옥살로아세테이트 및 시트레이트 신타아제(0.73μU/μL)의 존재하에서 배양하여 시트레이트를 형성한다. L-[14C(U)]아스파테이트(2.5μCi/ml) 및 2-옥소글루타레이트(2mM)를 이용하여 실온에서 20분 동안 아민기 전이 반응을 수행함으로써 [14C]옥살로아세테이트를 초기에 생성한다. MCD 검정을 개시하기 위하여, 제제를 NaF(50mM) 및 NaPPi(5mM)의 존재 또는 부재하에서, 37℃ 하에 210㎕ 반응 혼합물(0.1M 트리스, pH 8.0; 0.5mM 디티오트레이톨(DTT), 1mM 말로닐 CoA)에서 10분 동안 배양한다. 과염소산(0.5mM) 40㎕를 가함으로써 상기 반응을 중지시키고, 2.2M KHCO3(pH 10) 10㎕으로 중화시키며, 10,000 xg로 5분 동안 원심분리시켜 침전된 단백질을 제거한다. 심장 샘플을 말로닐 CoA와 함께 배양하면, 말로닐 CoA를 아세틸 CoA로 전환시킬 수 있으며, 이어서 이를 [14C]옥살로아세테이트(0.17μCi/ml)과 합하여 [14C]시트레이트를 제조한다. 모든 반응을, 존재하는 시트레이트가 비-MCD 유도된 아세틸 CoA를 생성시킬 수 없도록 반응의 후기 단계에 잔존하는 과량의 CoA를 제거시키는 N-에틸말레이미드의 존재하에 수행한다. 나트륨 글루타메이트(6.8mM) 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(0.533μU/㎕)를 가한 다음 실온에서 20분 동안 배양함으로써, 반응되지 않은 [14C]옥살로아세테이트를 상기 반응 혼합물로부터 제거한다. 이로써, 반응되지 않은 [14C]옥살로아세테이트가 다시 [14C]아스파테이트로 아민기 전이될 수 있다. 이어서, 이로써 생성된 용액을 도웩스 50W-8X(100 내지 200메쉬)의 1:2 현탁액에서 교반시키고 400 xg로 10분 동안 원심분리시킨다. 이러한 펠릿화 도웩스 분획은 [14C]아스파테이트를 제거한 반면, 상기 상등액은 [14C]시트레이트를 함유하고 있다. 이어서, [14C]시트레이트의 형태로 존재하는14C을 알아보기 위하여 상기 상등액 분획을 계수한다. 이어서, MCD에 의해 생성된 아세틸 CoA의 양은, 상기 언급된 바와 동일한 검정 조건을 적용시킨 아세틸 CoA 표준 곡선과 비교함으로써 정량화한다. 표준 아세틸 CoA 농도 곡선을 각 실험마다 수행한다. 이들 곡선은 항상 선형인 것으로 밝혀졌다(r=0.99)(데이타는 제시되지 않음).
부틸 세파로오스 650M 상에서의 크로마토그래피:1M (NH4)2SO4로 조정된 MCD 용액을, 1mM DTT 및 1M (NH4)2SO4을 함유하는 0.1M 인산칼륨 완충액(pH 7.4)으로 앞서 평형시킨 100ml 부틸-세파로오스 650M 컬럼(2.6cm x 40cm) 상으로 부하한다. 이 컬럼을 3컬럼 용적의 상기 완충액으로 세척하고, 총 150ml의 용량으로 1 내지 0M (NH4)2SO4의 구배를 이용하여 단백질을 용리시키는데, 이때 9ml 분획을 수집한다. MCD 활성을 함유하는 분획을 모으고, 0.1M 인산칼륨(pH 7.4), 1mM DTT 및 1M (NH4)2SO4완충액에서 100ml로 만든다.
페닐 세파로오스 HP 상에서의 크로마토그래피:상기 효소 용액을, 1mM DTT및 1M (NH4)2SO4완충액을 함유하는 0.1M 인산칼륨 완충액(pH 7.4)으로 앞서 평형시킨 25ml 페닐 세파로오스 HP 컬럼(2.6cm x 20cm) 상으로 부하한다. 이 컬럼을 3컬럼 용적의 상기 완충액으로 세척하고, 총 175ml의 용량으로 1 내지 0M (NH4)2SO4의 구배를 이용하여 단백질을 용리시키는데, 이때 9ml 분획을 수집한다. MCD 활성을 함유하는 분획을 모으고, 한외여과시킴으로써 농축시킨다. 이로써 생성된 1ml 용액을 1mM DTT를 함유하는 20mM 비스-트리스(pH 7) 완충액에서 50ml로 만든다.
Q 세파로오스 HP 상에서의 크로마토그래피:상기 효소 용액을, 1mM DTT을 함유하는 20mM 비스-트리스(pH 7) 완충액으로 앞서 평형시킨 10ml Q 세파로오스 HP 컬럼(1.5cm x 20cm)에 적용한다. 이 컬럼을 3컬럼 용적의 상기 완충액으로 세척하고, 총 80ml의 용량으로 0 내지 0.3M NaCl의 구배를 이용하여 결합된 단백질을 용리시킨다. 4ml 분획을 수집하고, MCD 활성을 함유하는 분획을 모은 다음, 한외여과시킴으로써 농축시킨다. 이와 같이 농축된 풀을 1mM DTT를 함유하는 50mM MES(pH 5.5) 완충액 50ml에 재현탁시킨다.
SP 세파로오스 HP 상에서의 크로마토그래피:상기 효소 용액을, 1mM DTT을 함유하는 50mM MES(pH 5.6) 완충액으로 앞서 평형시킨 5ml SP 세파로오스 HP 컬럼(1.5cm x 20cm)에 적용한다. 이 컬럼을 3컬럼 용적의 상기 완충액으로 세척하고, 총 150ml의 용량으로 0 내지 0.4M NaCl의 선형 구배를 이용하여 결합된 단백질을 용리시킨다. 4ml 분획을 수집하고, MCD 활성을 함유하는 분획을 모은 다음, pH 7.0이 되게 중화시키며, 한외여과시킴으로써 농축시킨다. 이와 같이 농축된 풀을1mM DTT를 함유하는 50mM 말레이트(pH 5.6) 완충액 5ml에 재현탁시킨다.
SP 세파로오스 HP로부터의 말로닐 CoA 친화성 용리:상기 효소 용액을 상기와 같이 앞서 평형시킨 0.5ml SP 세파로오스 HP 컬럼(0.5cm x 10cm)에 다시 적용한다. 이 컬럼을 1mM DTT를 함유하는 50mM 말레이트(pH 5.6) 완충액으로 세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거한 다음, 1mM DTT 및 10μM 말로닐 CoA를 함유하는 50mM 말레이트(pH 5.6) 완충액으로 용리시킨다. 이와 같이 용리된 분획을 pH 7.0이 되도록 중화시킨다. 이러한 친화성 용리 프로토콜에 의해, MCD를 고도로 특이적으로 용리시킬 수 있다.
단백질 서열화:제2 SP 세파로오스 HP 컬럼으로부터 친화성 용리된 단백질 분획을 9% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 재용해시키고, 쿠마시 블루 용액을 사용하여 가시화를 위해 염색한다. 대다수의 약 52kDa의 단백질이 MCD인 것으로 여겨지며, 이를 겔로부터 절단하고 엔도Lys C 분해시킨다. 이러한 단백질 분해물을 HPLC하고, 적당한 펩티드를 대상으로 하여, 아미노 N-말단 서열화를 수행하였다. 2개의 내부 펩티드의 아미노산 서열을 수득한다. 이스턴 퀘벡 펩티드 서열화 장비(Quebec, Canada)에 의해 단백질 분해, 및 아미노산 N-말단 서열화를 수행한다.
랫트 간 MCD에 대한 항체 생성:SP-세파로오스 컬럼으로부터 친화성 용리시킨 단백질을 대상으로 SDS-PAGE를 수행하고, 쿠마시 염색시키며, 52kDa 밴드를 겔로부터 절단한다. 단백질(3㎍)을 상기 겔 단편으로부터 용리시키고 래빗트에 주사한다. 유사하게, S-세파로오스 컬럼 단백질의 친화성 용리로부터의 또 다른분획(6㎍)을, 겔 분리 단계를 수행하지 않고서 래빗트에 주사한다. 혈청을 사용하기 전 2개월 동안 2주 간격으로 상기 래빗트에 주사한다.
3. 프로브 합성, 라이브러리 스크리닝 및 랫트 췌장 β-세포 MCD의 DNA 서열화
공급업자의 프로토콜에 따라서 슈퍼스크립트 역전사효소 및 Taq 폴리머라아제(GIBCO)를 이용하여 INS-1 세포 총 mRNA에 대해 RT-PCR을 만든다. 어닐링 온도는 55℃이다. PCR의 경우, 변성된 올리고누클레오티드를 거위 MCD 서열로부터 고안한다[참조: Jang et al., J Biol Chem 264:3500-3505(1989)]. 거위 서열의 547번 염기에 위치한 센스 프라이머는 5'GANTSTGARGCTGTGCAYCCTGT3'(SEQ ID NO:4)이고; 1102번 염기에서 출발하는 안티센스 프라이머는 5'TACARRTACCAGGCRCACARYCTCAT3'(SEQ ID NO:5)이다. 580개 염기쌍 단편을 pBluescript(Stratagene)에서 아클로닝시키고, 서열화하며, 제한-효소 분해시킨 다음, 프로브로서 사용되도록 정제한다.
무작위 프라이밍에 의해 α-[32P]-dCTP로 표지된 정제된 580bp PCR 단편을 사용하여, 람다 ZAPExpress(Stratagene)에서 구성된 췌장 β(INS) 세포 cDNA 라이브러리[참조: Bonny et al., J Biol Chem 273:1843-1846(1998)]를 스크리닝한다. 스크리닝 2라운드를 수행한 후, 4개의 클론을 생체내에서 절개하고, 인산칼슘 침전물 기술로 DNA 형질감염(5㎍/106세포)시킨지 24시간 후에 293 세포에서 MCD 활성을 알아보기 위해 검정한다. 검출 기술(Erase-a-Base, Promega) 및 염료-프라이머 서열화 방법(Pharmacia로부터의 자동화 서열화 키트 및 ALF DNA 서열)을 사용하여, 가장 높은 효소 활성을 보유하고 있는 것을 양 방향으로 서열화한다. 이러한 DNA의 크기는 2020bp이다. 부가의 양성 클론을 서열화하여, 293 세포에서의 형질감염시 높은 효소 활성을 보유하고 있는 것을 이용하여 수득된 서열을 확인한다. CMV 프로모터의 조절 하에 있는 β-갈락토시다제 유전자의 DNA 형질감염체는 MCD 활성에 대한 음성 대조군으로서 작용하고 형질감염 효율(약 20%)에 대한 양성 대조군으로서 작용한다. Ins-1 세포[참조: Asfarai et al., Endocrinology 130:167-178(1992)] 및 사람 신장 293 세포[참조: Becker et al., J Biol Chem 269:21234-21238(1994)]를 인용된 참조 문헌에 기재된 바와 같이 배양한다.
β-세포 MCD mRNA 측정:겔 제조 및 전이에 대한 표준 기술을 사용하여 노던 블롯 분석을 수행한다[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories Press, New York(1989)]. 간략하게 언급하면, 레인당 총 mRNA 20㎍을 포름알데히드의 존재하에 1% 아가로오스 겔 상에서 분리하고, 모세관에 의해 제타 프로브 QT 막(Biorad) 상으로 옮기며, UV선으로 고정시키고, 예비하이브리드화시키며, 상기 언급된 표지시킨 580bp MCD cDNA 단편의 존재하에 하이브리드화시킨 다음, 공급업자의 프로토콜에 따라서 세척한다. 시그날은 후지 인영상기(phosphorimager)로 나타내었다. 18S 리보좀성 전구체 프로브[pUC830에 아클로닝된 마우스 18S 리보좀성 rRNA cDNA의 0.77kb EcoR1-BamH1 단편, 1 내지 1780번 위치]와의 대조 하이브리드화를 동일한 막 상에서 수행하여, RNA의 에티듐 브로마이드 염색을 확인한다. 구아니디늄 이소티오시아네이트 산성 페놀 기술에 의해 랫트 조직으로부터 수득된 총 RNA를 사용하여 RT-PCR을 수행한다[참조: Chomczinskyand Sacchi, Anal. Biochem 162:156-160(1987)]. 상기 언급된 바와 같이 5㎍ RNA를 사용하여 역전사를 수행한다. 분류된 췌장 α- 및 β-세포로부터의 cDNA를 문헌[참조: Heimberg et al., Proc Nat Acad Sci USA 93:7036-7041(1996)]에 기재된 바와 같이 제조한다. 상기 언급된 바와 동일한 프라이머 및 조건을 사용하여 상기 RT 반응물의 1/3로 PCR 반응을 수행한다. 상기 조건을, 랫트 β-악틴 올리고누클레오티드 프라이머를 사용한 경우와 동일한 재료에 대해 이루어진 PCR과 비교한다[참조: Heimberg et al., Proc Nat Acad Sci USA 93:7036-7041(1996)]. 15, 25 및 35주기 후에 반응을 모니터하고, 에티듐 브로마이드로 염색된 1% 아가로오스 겔 상에서 분석한다.
랫트 간/심장 MCD의 클로닝:랫트 β-세포 MCD의 클로닝된 서열을 기준으로 한 올리고누클레오티드[참조: Voilley et al., Biochem J Submitted (1999)]을 고안하여, 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 랫트 간 cDNA로부터 MCD의 900 염기쌍 생성물을 증폭시킨다. 전진 프라이머인 PMCDF1[5'TGGTCGACGGCTTCCTGAACCTG(SEQ ID NO:6)]을 후진 프라이머인 PMCDR[5'TCCCTAGAGTTTGCTGTTGCTCTG(SEQ ID NO:7)]과 함께 PCR 반응에 사용한다. 이러한 900bp 단편을, 슈퍼스크립트 랫트 간 cDNA 라이브러리(Gibco, Life Technologies)를 스크리닝하기 위한 프로브로서 사용한다. 내부 프라이머를 사용하여 양 방향으로 완전한 길이의 cDNA 클론을 서열화하고 랫트 섬 cDNA 서열과 비교한다. 당해 분야의 숙련인에게 공지된 기술을 사용하여 동일한 방식으로 랫트 심장 MCD DNA를 클로닝한다.
면역세포화학:MCD의 세포내 국재도를 결정하기 위하여, 이중 표지화 면역세포화학 기술을 사용한다. 맥아르들 RH-7777 간암 세포를, 20% 태내 소 혈청(pH 7.4)이 보충된 α-MCD 중의 멸균 유리 커버슬립(60% 컨플루언시) 상에서 성장시킨 다음, 37℃ 하 5% CO2가 보충된 습습한 대기 하에서 배양한다. 래빗트에서 생성된 항-MCD 항체를 MCD 항원에 대해 사용하고, 마우스에서 생성된 항-열쇽 단백질(Hsp) 60 항체를 Hsp 60 항원에 대해 사용한다. 이러한 Hsp 60은 우점적으로 미토콘드리아내 특이적 매트릭스 카페론 단백질이다[참조: Strart et al., Trends Biochem Sci 19:87-92(1994)]. 60% 컨플루언시에서, 상기 커버슬립을 1x 인산염 완충 식염수(PBS; pH 7.4)에서 3회 세척한 다음, 4% 파라포름알데히드에서 10분 동안 고정시킨다. 상기 염착제를 15분 동안 1x PBS 중의 100mM 글리신으로 대체함으로써 상기 고정화 반응을 종결시킨다. 이어서, 상기 세포를 1x PBS 중의 0.1% 트리톤-X 100과 0.1% BSA(TA-PBS)의 2가지 변화물로 각각 1분 동안 세척한 다음, 동일한 배지에서 30분 동안 배양함으로써 침투시킨다. 이어서, 상기 커버슬립을 TA-PBS의 3가지 변화물로 세척한 다음, 5% 태내 소 혈청에서 20분 동안 블록킹시켜, 특별히 선택된 항체의 비-특이적 결합을 억제시킨다. TA-PBS에서 3회 세척한 후, 커버슬립을 래빗트 폴리클로날 항-MCD 항체와 함께(희석율 1:100) 실온(RT)에서 2시간 동안 배양한다. 이러한 반응이 끝날 무렵, 상기 커버슬립을 TA-PBS의 3가지 변화물로 세척한 다음, RT에서 1시간 동안 마우스 모노클로날 항 Hsp 60 항체(희석율 1:1000; Stress Gen Biotechnologies Corp., Canada)와 함께 배양한다. 그 다음, 커버슬립을 1x PBS(pH 7.4)로 3회 세척하고, RT에서 1시간 동안 고우트 항-마우스 로다민(Rh; Jackson Immuno Research Laboratories, U.S.A) 접합체(희석율 1:200) 및 고우트 항-래빗트 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC; Jackson Immuno Research Laboratories, U.S.A) 접합체(희석율 1:200)과 반응시킨다. 2차 항체 반응이 끝날 무렵, 상기 커버 슬립을 1x PBS(pH 7.4)에서 세척하고, 현미경 슬라이드 상의 항-형광성 광표백제인 1% 프로필 갈레이트를 함유하는 50% 글리세롤에 놓아 둔다. 모든 슬라이드를 올림푸스 형광 현미경으로 검사하고/하거나 실리콘 그래픽 컴퓨터에 연결된 레이저 공초점 현미경으로 검사한다.
기타 실험에서는, 신규한 미토콘드리아-선택적 염료인 미토-트랙커 레드 CMXRos(Molecular Probes)를 사용하여 배양된 세포에서 미토콘드리아를 표지시킨다. 60% 컨플루언시에서, 상기 배지를 200nM의 미토-트랙커 레드 CMXRos를 함유하는 예비가온된 배지(37℃)로 대체하고 37℃ 하 5% CO2가 보충된 습습한 대기 하에서 20분 동안 배양한다. 이어서, 상기 세포를 1x PBS에서 세척하고 4% 파라포름알데히드에서 10분 동안 고정시킨 다음, 항-MCD 항체로 프로빙하기 위해 프로세싱하여 MCD를 상기 언급된 바와 같이 세포 내에 국재시킨다.
웨스턴 블롯 분석:샘플을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동시킨 다음, 다음 문헌에 기재된 바와 같이 니트로셀룰로오스에 옮긴다[참조: Dyck et al., Am J Physiology 275:H2122-H2129(1998)]. 막을 1% 분유 중의 항-MCD 항체(희석율 1:500)로 면역블롯팅시킨다. 파마시아 증진된 화학 발광성 웨스턴 블롯팅 및 검출시스템을 사용하여 상기 항체를 가시화한다.
통계학적 분석:두 그룹 평균의 통계학적 차이를 결정하기 위하여 쌍을 이루지 않은 t-시험을 사용한다. 3개 그룹에 대해, 변수를 분석한 다음 네민-킬 시험을 사용한다. p<0.05의 값이 유의성인 것으로 간주된다. 모든 데이타는 평균±평균치의 표준 오차(S.E.M)로서 나타내었다.
실시예 1
본 실시예에서는, 래빗트 심장에서의 MCD의 성상을 확인한다. 심장 활성을 연구하는 분광 광도 측정 검정과 같은 앞서 기재된 검정을 사용하면, MCD 활성이 극도로 가변적인 것으로 입증되었으며, 심장 조직을 이용한 경우에 높은 배경 값이 수득되었다[참조: Kolattukudy et al., Meth. Enzymol. 71:150-163(1981)]. 이러한 검정은 또한, 심장 조직에서 MCD를 정확하게 측정해주는 민감도를 지니고 있지 않았으며, 이때 분광 광도 측정 판독치는 통상적으로 높은 배경 흡광치에 매우 근접해 있다. 또한,14C-말로닐 CoA을 이용하는 방사성 추적 검정법은 비용이 많이 드는 검정법이다. 따라서, MCD에 의해 형성된 아세틸 CoA의 양을 정량화하는 신규의 검정법을 개발하였다(방법론 항목 참조). 이러한 검정법은 심장 균질물에 사용할 뿐만 아니라 단리된 미토콘드리아 제제에 사용하도록 최적화하였다. 심장 균질물을 사용한 조직 단백질 표준 곡선은, 2mg의 조직이 배양한지 20분 까지는 선형인 MCD 활성을 나타내었다는 것을 증명해주었다. 유사하게, 10분 간의 배양 시간을이용한 시간에 따른 표준 곡선은 0 내지 10mg의 조직이 사용된 경우에 선형인 활성율을 나타내었다. 따라서, 2mg의 조직 균질물과 10분 간의 배양 시간이 이용되었다. 이로써, 아세틸 CoA 표준 곡선의 중간 부분에 위치한 아세틸 CoA 값을 수득한다. 시간 및 단백질 의존도에 대한 유사한 실험을 또한 단리된 미토콘드리아 제제에 대해 수행하였다.
MCD 검정을 이용하여, 랫트로부터 수득된 심장 균질물에서 MCD 활성의 실재를 확인하였다(표 1). MCD 활성율은 앞서 관찰된 ACC율보다는 상당히 더 높은 것으로 밝혀졌다[참조: Lopaschuk et al., J. Biol. Chem. 269:25871-25878(1994)]. ACC로부터의 말로닐 CoA 합성이 포스포릴화 조절 하에 있기 때문에, MCD가 포스포릴화 조절 하에 있는지를 결정하는 실험을 또한 수행하였다. 포스포릴화 상태의 효소를 보존시킨 조건 하에서의 조직의 단리는, 생체내에서 관찰된 포스포릴화 상태를 보존하도록 시도하지 않은 조건 하에서 단리된 효소와 비교해서 MCD 활성율을 변화시키지는 못하였다(표 1). 그러나, 심장 균질물을 시험관내에서 알칼리 포스파타아제와 함께 배양하면, MCD 활성이 증가하게 된다. 이는 MCD가 포스포릴화 조절 하에 있으며, 상기 효소를 포스포릴화시키면 효소 활성이 감소된다는 것을 제시해준다.
미정제 균질물, 단리된 미토콘드리아 또는 후-미토콘드리아 상등액을 대상으로 하여, MCD 활성에 대해 검정한다(표 2). 이들 심장 분획 모두에서 측정 가능한 수준의 MCD 활성이 검출되었다. 이들 분획에서 관찰된 MCD 활성 수준이, 앞서 제시된 바와 같이 미토콘드리아내 매트릭스에 국재되는 MCD로 인한 것인지를 결정하기 위하여[참조: Jang, S-H. et al., J. Biol. Chem. 264:3500-3505(1989)], 동일한 분획을 옥틸글루코시드로 처리한다. 옥틸글루코시드를 가한 경우, 미정제 균질물 내의 상대적 MCD 활성 수준이 대략 6배로 증가하였다. 단리된 미토콘드리아 분획에서는, 처리되지 않은 단리된 미토콘드리아 분획과 비교해서 14배 증가된 MCD 활성이 관찰되었다. 이러한 MCD 활성 증가는 미토콘드리아내 막의 가용화로 인해 MCD가 매트릭스로부터 방출될 수 있거나 미토콘드리아외 공간에 노출될 수 있다는 것을 강력하게 제시해준다. 이는 상당 부분의 심장 MCD가 미토콘드리아내 매트릭스에 국재한다는 것을 확인시켜주었다.
호기적으로 관류된 랫트 심장에서의 말로닐 CoA 데카복실라아제 활성
말로닐 CoA 데카복실라아제 활성 (mmol -1 g dry wt -1 min -1 )
조절하(+NaF, +NaPPi) 7176 ±1269(n=5)
조절되지 않음(-NaF, -NaPPi) 7672 ±1311(n=5)
조절되지 않음(-NaF, -NaPPi, +알칼리 포스파타아제) 12433 ±914*(n=4)
값은 4개 이상의 심장의 평균±S.E.이다. 심장 균질물은 NaF 및 NaPPi의 존재 또는 부재하, 및 알칼리 포스파타아제로 처리하거나 처리 없이 MCD 활성에 대해 검정하였다. *은 심장 그룹 간의 유의적 차를 지시해준다.
단리된 1일생 및 7일생의 관류된 래빗트 심장에서의 말로닐 CoA 함량, 아세틸 CoA 카복실라아제 활성 및 팔미테이트 산화율
말로닐 CoA 함량 (mmol -1 g dry wt -1 ) ACC 활성 (mmol -1 mg단백질 -1 min -1 ) 팔미테이트 산화율 (mmol -1 g dry wt -1 min -1 )
1일생(n=5) 108.5±2.5* 0.208±0.057* 4.7±1.0*
7일생(n=5) 3.6±0.25 0.036±0.003 46.7±15.7
값은 평균±S.E.이다. 말로닐 CoA 함량 및 ACC 활성은 앞서 기재된 바와 같이(7) 측정하고, 팔미테이트 산화율은 "방법" 항목에 요약된 바와 같이 결정한다. *은 적당한 그룹 간의 유의적 차를 지시해준다.
호기적 및 재관류된 다 자란 랫트 심장에서의 말로닐 CoA 함량, 아세틸 CoA 카복실라아제 활성, 심장 작동, 팔미테이트 산화율 및 팔미테이트 산화율/심장 작동
호기적 재관류됨
말로닐 CoA 함량 (mmol·g dry wt -1 ) 31.03±5.15*(n=12) 0.45±0.45(n=12)
ACC 활성 (mmol·mg단백질 -1 min -1 ) 0.369±0.023*(n=12) 0.204±0.018(n=12)
심장 작동 (co·psp·10 -1 ) 54.5±4.1*(n=9) 34.9±6.7(n=9)
팔미테이트 산화율 (mmol·g dry wt -1 min -1 ) 684±66*(n=9) 1125±151(n=9)
팔미테이트 산화율/심장 작동 (mmol·min -1 ·cw -1 ) 3.50±0.19*(n=9) 13.8±4.7(n=9)
값은 지시된 적당한 값의 평균±S.E.이다. 말로닐 CoA 함량, ACC 활성 및 심장 작동은 앞서 기재된 바와 같이(7) 측정하고, 팔미테이트 산화율은 "방법" 항목에 요약된 바와 같이 결정한다. 말로닐 CoA 함량 및 ACC 함량은 기타 측정된 값과 동일한 조건 하에서 관류된 별개의 심장으로부터 유래된 것이다. *은 적당한 그룹 간의 유의적 차를 지시해준다. co=심장 작동, psp=피크 수축압 및 cw=심장작동.
MCD의 물리적 성질을 확인하기 위하여, MCD 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행한다[참조: Kim and Kolattukudy, Arch. Biochem. Biophys. 190:234-246(1978)]. 랫트 심장 및 간 조직에서는, 이러한 항체가 하나 이상의 기타 단백질과 고 친화적으로 교차 반응된다. 이러한 기타 단백질이 카탈라아제인 것으로 밝혀졌기 때문에, 카탈라아제에 대해 지시된 항체를 사용하여 MCD 항체로 상기 결과를 추가로 확인하였다. 상기 언급된 과정을 사용하여 랫트 간 MCD를 부분적으로 정제한다. 이와 같이 부분적으로 정제된 단백질을 비-변성 겔의 두 레인 상에 부하하고 전기영동시킨다. 전기영동 후, 한 레인을 니트로셀룰로오스에 옮긴 다음 MCD 항체로 블롯팅하는 반면, 다른 레인은 추가로 사용하기 위해 물에 저장해 둔다. 비-변성 겔로부터의 웨스턴 블롯에서는(도 1A 참조), MCD 항체가 문헌[참조: Kim and Kolattukudy, Arch. Biochem. Biophys. 190:234-246(1978)]에 지시된 바와 같이 대략 160 내지 190kDa인 하나의 큰 밴드와 반응되었다. 이러한 밴드 위치를 상기 비-변성 겔의 옮기지 않은 레인과 정렬하고, MCD를 함유하는 영역을 상기 겔로부터 추출한다. 이러한 겔 슬라이스로부터의 단백질을 용리시키고(실질적으로 순수한 제제를 생성시키기 위함), MCD 활성에 대해 검정하거나 SDS-PAGE시키며, 니트로셀룰로오스에 옮긴 다음, 항-MCD 항체로 블롯팅한다(도 1A, 레인 2 참조). 이와 같이 용리된 단백질은 다소 큰 MCD 활성을 나타내며, 웨스턴 분석시켰을 때 MCD 항체와 반응되었다. 이어서, 상기 블롯을 스트립핑시키고 항 카탈라아제 항체로 재-프로빙시켜 카탈라아제 단백질(들)에 상응하는 밴드를 확인한다(도 1, 레인 3).이러한 실험 결과, 랫트 간 MCD의 분자량이 대략 45kDa인 것으로 결정되었다. 이 결과는 본래의 효소가 테트라머라는 앞서의 결론과 부합된다[참조: Kim and Kolattukudy, Arch. Biochem. Biophys. 190:234-246(1978)]. 변성된 반-정제된 심장 샘플에 대해 웨스턴 블롯 분석을 또한 수행한다(도 1B 참조). 이들 조건 하에서, 45kDa 밴드가 간과 심장 조직 샘플 모두에서 확인되었다(도 1B, 레인 1 및 2). 샘플을 알칼리 포스파타아제로 처리하고 이들을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석한 경우, 상기 단백질의 분자량 이동이 전혀 없었다.
본 실시예는 대조군 심장에서의 MCD 활성을 명백하게 입증해주고, 지금까지 동정되지 않았던 키나아제에 의해 포스포릴화 및 억제될 수 있는, 대략 45kDa 크기의 MCD의 심장 이소-형태를 동정해 준다.
실시예 2
본 실시예에는, 지방산 산화를 조절하는데 있어서의 MCD의 역할이 기재되어 있다. 앞서의 연구는 심근 지방산 산화가 1일생과 7일생 래빗트 심장 사이에서 현격하게 증가하였다는 것을 입증해주었다[참조: Lopaschuk et al., J. Biol. Chem. 269:25871-25878(1994)]. 표 3에 제시된 바와 같이, 상당한 지방산 산화율 증가가 1일생 심장과 비교해서 7일생 심장에서 관찰되었다. 이는 말로닐 CoA 수준 감소와 ACC 활성 저하를 수반한다. 그러나, 상기 심장에서의 말로닐 CoA 수준을 감소시키기 위해서는, 합성율 감소와 동시에 말로닐 CoA의 분해 또는 대사적 활용이 수반되어야 할 것이다. 따라서, MCD 활성을 1일생 및 7일생 래빗트 심장에서 측정하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 7일생 래빗트 심장에서의 MCD 활성은 1일생 심장과비교해서 상당히 상승되었다. 존재하는 말로닐 CoA의 양 측면에서 보면, 이러한 높은 MCD 활성율은 말로닐 CoA의 신속한 턴오버를 제시해준다. 심장 추출물이 시험관내에서 알칼리 포스파타아제로 탈포스포릴화되는 경우에는, MCD 활성 변화가 전혀 관찰되지 않았다. 이는, 다 자란 랫트 심장과는 달리, MCD 활성이 신생아 래빗트 심장에서 관찰되는 바와 동일한 정도의 포스포릴화 조절 하에 있지 않다는 것을 제시해준다.
피가 전혀 흐르지 않는 허혈증 증세(피가 전혀 흐르지 않는 허혈증 증세는 특정 시간 동안 랫트 심장의 모든 부분으로의 혈액 흐림이 중지되는 것으로 정의된다)가 있은지 30분 후에 다 자란 랫트 심장을 재관류시키면, 말로닐 CoA 수준이 현격하게 감소되었다(데이타는 제시되지 않음). 이와 병행해서, ACC 활성 감소 뿐만 아니라 약간의 지방산 산화율 증가가 관찰되었다. 그러나, 심장 작동은 허혈성 심장의 재관류 동안에 상당히 억제되었기 때문에, 단위 작동당 지방산 산화의 큰 증가가 관찰되었다. 호기적, 허혈성 및 재관류된 허혈성 심장에서의 MCD 활성 측정치가 도 3에 그래프로 도시되어 있다. MCD 활성 수준은 허혈증 및/또는 재관류 말기 무렵에 유지되었다. 샘플을 알칼리 포스파타아제로 처리하면, 또한 모든 그룹에서 MCD가 증가하였다.
도 4는 호기적, 허혈성 및 허혈성/재관류된 랫트 심장으로부터 추출된 샘플에서의 MCD 단백질 수준을 도시해준다. MCD 단백질 수준은 재관류 프로토콜 동안에 변하지 않았으며, 상이한 그룹 간의 MCD의 분자량 이동도 나타나지 않았는데, 이는 MCD가 포스포릴화에 의해 번역후 수식되지 않는다는 것을 제시해준다. 또한,완전한 심장 추출물을 웨스턴 분석에 사용한 경우에는, 미토콘드리아로부터의 반-정제된 MCD로 관찰된 것 보다 상당히 더 큰 분자량의 또 다른 단백질이 검출되었다(도 4, 레인 3 내지 8 참조). 아마도, 순수한 미토콘드리아 추출물 대신 세포질성 추출물을 함유하는 샘플이 세포질성 형태의 MCD를 보유할 수도 있을 것이다. 거위 미지선에서는, 세포질성 형태의 MCD가 대략 55kDa인 반면, 미토콘드리아내 형태는 50kDa 분자량 단백질로 번역후 프로세싱된다[참조: Courchesne-Smith et al., Arch. Biochem. Biophys. 298:576-586(1992)]. 웨스턴 블롯 분석은 유사한 프로세싱이 랫트 심장에서 일어날 수 있다는 것을 제시해준다.
실시예 3
본 실시예에서는, 도 3에 도시된 결과를 근거로 하여, 강화된 심근 허혈성 손상을 제공해줄 수 있는 모델이 도 5B에 제안되었다. 허혈증 동안에는, AMPK가 활성화됨으로써 재관류시 ACC가 억제되고, 이로써 말로닐 CoA 합성이 감소된다[참조: Lopaschuk et al., J. Biol. Chem. 269:25871-25878(1994)]. MCD 활성 유지가 존재하는 경우에는, 말로닐 CoA 수준 감소가 상기 심장에서 일어난다. 말로닐 CoA 수준 감소가 일어나면, CPT1은 이의 억제인자의 제거로 인해 보다 활성이 된다. 이로써, 지방산 산화율이 증가하게 되고, 이로 인해 허혈성 손상이 더 강화된다. 이 모델은 MCD가 허혈성 심장의 재관류 동안 손상에 대한 중요한 원인이 되는 한 요인이라는 것을 내포해준다. 그 결과, MCD의 약리학적 변형은 또한, 허혈성 심장 질환을 치료하는데 유익한 한 접근법인 것으로 입증될 수 있다.
따라서, 본 발명은 심장이 심근 말로닐 CoA 수준을 조절하는데 있어서 중요한 MCD의 45kDa 이소-형태를 발현한다는 것을 입증해준다. ACC 활성 감소와 연계한 MCD 활성 증가 또는 유지는 심장에서의 말로닐 CoA 수준 감소와 지방산 산화 증가를 가져다줄 수 있다. 본 발명의 신규한 MCD 조성물 및 검정법을 사용함으로써 약물을 스크리닝하는 것은 이러한 효능있는 화합물을 동정하는데 도움을 줄 것으로 사료된다. 이러한 억제제가 허혈증을 치료하는데 유용한 것으로 여겨진다.
실시예 4
본 실시예에서는, 문헌[참조: Kolattukudy et al., J Biol. Chem 71:150-163(1981)]에 본래 기재된 것과는 실질적으로 상이한, 랫트 간 MCD에 대한 정제 과정을 개발하였다. 부틸 세파로오스와 페닐 세파로오스 컬럼은 소수성 수지이고, 이는 소수성을 기준으로 한 별개의 단백질이다. MCD는 상기 컬럼으로부터 다소 나중에 용리되었기 때문에, 이는 상기 컬럼과 MCD 간의 상호작용이 꽤 강력하다는 것을 제시해준다. Q-세파로오스 컬럼은 강력한 음이온 교환 수지이고, 염 구배가 증가함에 따라 MCD 활성의 두 피크가 상이한 이온 강도에서 분리된다(도 7B). 이들 두 피크에 함유된 MCD는 동일한 역학 특징을 보유하고 있지만, 별개로 분리된다. 본 발명자들의 목표는 특이적 다운 스트림 적용을 위해 충분한 다량의 MCD를 정제하는 것이기 때문에, 본 발명자들은 양 피크로부터 활성 분획 모두를 모아 다음 컬럼 상에서 수행하였다. 이들 분획을 SP-세파로오스 양이온 교환 컬럼에 적용한다. 이러한 경우, MCD는 상기 염 구배에서 비교적 초기에 용리되었는데, 이는 수지와의 상호작용이 약하다는 것을 지시해준다(도 7C). 이와 같은 SP-세파로오스 컬럼과의 약한 상호작용으로 인해, MCD는 이의 음전하를 띤 기질인 말로닐 CoA에 의해 상기수지로부터 용이하게 용리될 수 있다. 이는 아마도 MCD의 형태 및/또는 순 전하를 변형시켜, 이것이 pH 5.5에서 SP-세파로오스 수지와 더 이상 연합하지 못하도록 할 수 있다. 이러한 정제 과정이 도 7에 요약되어 있다.
이와 같이 새로이 고안된 과정으로 인해, 초기 55% 황산암모늄 펠릿으로부터 MCD를 1200배 이상 더 정제할 수 있다(표 4). 본 발명자들의 형광분석 검정이 완전한 세포 추출물로부터의 MCD 활성을 검출하지 못하였기 때문에, 정제 프로필은 단지 미토콘드리아 제제로부터 시작하는 순도 증가를 나타낸다. 이러한 이유로 인해, 본 발명자들은 본 발명자들이 지시한 것 보다 훨씬 더 큰 정도로 실제적으로 정제된 MCD 활성을 지니고 있는 것으로 확신한다. 상기 컬럼으로부터 모은 분획을 SDS-PAGE 분석시키고 민감성 쿠마시 염료로 염색한 경우, 본 발명자들은 52 및 65kDa 분자량의 두 단백질을 검출하였다. 포유류 MCD에 대한 앞서의 연구는 52kDa 단백질이 MCD라고 제시하였다[참조: Dyck et al., Am J Physiology 275:H2122-H2129(1998); Voilley et al., Biochem J Submitted(1999)]. 면역블롯팅 실험은 제2의 단백질(MCD와 함께 정제된다)이 카탈라아제인 것으로 나타났는데, 이는 본 발명자들의 초기의 미토콘드리아 단리물이 또한 퍼옥시좀을 함유하고 있다는 것을 제시해준다.
실시예 5
본 실시예에서는, PCR을 사용하여 랫트 간 cDNA로부터 MCD의 900개 염기쌍 생성물을 증폭시키기 위한, 랫트 섬 MCD cDNA의 클로닝된 서열[참조: Voilley et al., Biochem J Submitted(1999)]을 기준으로 한 올리고누클레오티드를 고안하였다. 이러한 900bp 단편을, 랫트 간 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는데 있어서 프로브로서 사용한다. 완전한 길이(2.2Kb)의 클론을 수득하고, 양 방향으로 서열화하며, 랫트 섬 MCD 서열과 비교한다. 랫트 간 MCD를 암호화하는 cDNA 서열이 도 8에 도시되어 있다. 간 및 섬 형태의 MCD 간의 서열을 비교한 결과, 두 형태가 동일한 것으로 나타났다(도시되지 않음). 잠재적인 포스포릴화 부위가 잠재적인 퍼옥시좀성 표적화 서열(SKL)을 따라 여전히 존재한다(도 8). 아미노산 서열 분석으로부터 획득된 두 펩티드 서열에 번호를 매기고 진하게 밑줄을 친다. 페닐알라닌 하이드록실라아제와 유사한 MCD 테트라머성 구조에 요구되는 단백질-단백질 상호작용에 관계될 수 있는 루이신 지퍼 모티브(leucine zipper motif)를 또한 동정하였다[참조: Hufton et al., Biochem Biophys Acta 1382:293-304(1998)].
실시예 6
본 실시예에서는 랫트 간 MCD를 특징화하였다. 최고 MCD 특이 활성을 나타내는 SP-세파로오스의 친화성 용리액으로부터의 분획을 풀링시키고, 분량화하였다. 제 1 분량을 SDS-PAGE 시켰다. 52kDa 밴드를 겔로부터 절단하고, 엔도Lys C로 분해시키고, HPLC시키고, 적합한 펩티드를 아미노산 N-말단 서열화하였다. 2개의 내부 펩티드의 아미노산 서열을 수득하고, 랫트 간 cDNA 클론으로부터 수득한 cDNA 서열과 비교하여 확인하였다. 제 2 분액을 사용하여 반응속도법 분석을 하였다. MCD 활성을 다양한 농도의 말로닐 CoA에서 측정하여 Km을 결정하였다. 도 9a는 라인비버-버크 플롯(Lineweaver-Burke plot)에 의해 결정하여 두 가지 Km이 존재한다는 것을, 즉, 하나는 약 1 내지 2μM에 있고, 나머지 하나는 30 내지 40μM에 있음을 나타낸다. 이러한 후자 값은 미정제 랫트 간 MCD 제제로부터 수득된 공지된 Km과 유사하다 [Kim and Kolattukudy,Arch Biochem Biophys190:234-246 (1978)]. 간 MCD가 가장 활성을 나타내는 최적 pH를 결정하기 위해 pH 의존 곡선이 또한 작도되었다 (도 9b). 본 발명자들의 형광분석 검정의 경우, 최적 pH는 7 내지 8 이다. 이러한 결과 둘 모두는 랫트 간 MCD에 대해 이용할 수 있는 기존 정보와 유사하다 [Kim and Kolattukudy,Arch Biochem Biophys190:234-246 (1978)].
본 발명자들의 초기 실험은 심장 MCD가 인산화 조절을 받는다는 것을 나타내었다 [Dycket al., Am J Physiology275:H2122-H2129 (1998)]. 본 발명의 정제된 간 MCD와 광범위한 키나아제 및 포스파타아제를 사용한 경우, 본 발명자들은 알칼리 포스파타아제를 MCD 활성의 잠재적인 조절인자로서 확인할 수 있을 뿐이었다 (표 5). 알칼리 포스파타아제를 사용하여 MCD를 탈인산화시키고 활성화시킨 후, 다양한 키나아제를 사용하여 효소를 비활성화시키려는 유사한 실험을 수행하였다. 이러한 모든 실험은 성공적인 것으로 입증되었다. 시험된 키나아제와 포스파타아제는 카제인 II, 사이클릭 AMP 의존성 단백질 키나아제인 단백질 키나아제 C, 5'AMP-활성화되는 단백질 키나아제, 단백질 포스파타아제 2A 및 단백질 포스파아제 2C 이었다.
SP-세파로오스 컬럼의 친화성 용리액으로부터의 또 다른 그룹의 풀링된 분획을 SDS-PAGE 시키고, 쿠마시 염색시키고, 52kDa 밴드를 겔로부터 절단하였다. 단백질을 겔 단편으로부터 용리시키고, 래빗트내로 주입시켜서 MCD 항체를 생성시켰다. 유사하게는, S-세파로오스 컬럼의 친화성 용리액으로부터의 또 다른 분획을겔 분리 단계를 거치지 않고 래빗트내로 주입시켰다. 이러한 과정은 본 발명자들이 변성된 MCD 단백질과 변성되지 않은 MCD 단백질 둘 모두에 대해 생성된 항체를 수득하는 것을 보장할 수 있었다. 랫트 간 미토콘드리아를 사용하는 웨스턴 블롯 분석은 둘 모두의 항체가 분자량이 52kDa인 단백질을 인식함을 밝혀내었다 (도 10a). 변성되지 않은 MCD(MCD240)을 사용하여 생성시킨 항체도 카탈라아제를 인식하였고, 변성된 MCD(MCD239)에 대해 생성된 항체는 MCD에 대해 더욱 특이적인 것으로 여겨졌다 (도 10a). MCD240은 분자량이 52kDa인 단백질을 면역침전시킬 수 있었지만, MCD 활성은 이러한 면역침전물에서 검출될 수 없었다.
정제된 MCD에 대해 생성시킨 항체가 실제로 용액 중에서 MCD를 인식할 수 있는 지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 면역-억제 실험을 수행하였다 (도 10b). 정제된 랫트 간 MCD 활성을 방법편에 기술된 형광분석 MCD 검정을 이용하여 측정하였다. 정제된 MCD를 MCD239, MCD240 또는 적합한 면역전 혈청과 함께 예비 인큐베이션시켰다. 30분 후, 혼합물을 MCD 활성에 대해 측정하고, 동일한 기간 동안 혈청없이 예비 인큐베이션된 MCD의 퍼센트로서 표현하였다. 도 10b는 MCD240만이 MCD 활성을 억제시킬 수 있다는 것을 나타낸다. MCD240이 MCD 활성을 억제시키므로, 결과는 MCD240이 MCD를 면역침전시킬 수는 있지만 침전된 펠릿에서 MCD 활성을 나타내지 못하는 이유를 설명해주는 것으로 여겨질 것이다.
실시예 7
본 실시예에서는, 웨스턴 블롯 분석 및 MCD240 항체를 사용하여, 다양한 래트 조직 중의 MCD 분포를 결정하였다. 시험된 모든 조직은 비교적 높은 수준의MCD 단백질을 발현시켰다. 간 및 심장과 같은 산화성 조직은 높은 수준의 MCD 단백질을 발현시키며, 이는 MCD가 지방산 산화를 조절하는 데에 있어서 소정의 역할을 할 수 있다는 개념을 뒷받침한다 [Dycket al., Am J Physiology275:H2122-H2129 (1998)]. 이러한 실험은 세정제 가용화된 전체 조직 균질물을 사용하여 전체 MCD 수준을 측정하였다. 이는 세포 국재도를 기초로 하여 MCD 단백질의 손실을 방지하였다.
간 MCD의 하위세포성 국재도를 결정하기 위해, 본 발명자들은 2가지 별도의 방법을 이용하여 랫트 간암 McArdle RH-7777 세포에 대해 이중 표지화 면역세포화학을 수행하였다. 첫째로, MCD 또는 미토콘드리아 매트릭스 특이적 단백질인 Hsp 60 [Stuartet al., Trends Biochem Sci19:87-92 (1994)]에 대해 유도된 항체를 사용하였다. 형광 및 공초점 분석 둘 모두는 MCD가 Hsp60과 공동-국재되어 있음을 나타내었다 (도 11b, 1-3). 미토콘드리아 특이적 염료 (MitoTracker Red CMXRos)와 MCD 항체를 사용하는 유사한 실험은 이러한 결과를 확인해주었다 (도 11b, 4-6). MCD가 미토콘드리아 이외의 그 밖의 소기관에 국재되어 있는 지는 불명확하였다. 그러나, 많은 간 MCD가 미토콘드리아성임은 분명하다.
실시예 8
본 실시예에서는, MCD 발현과 활성을 지방산 대사의 변화가 이미 특징화되어 있는 3가지 동물 모델에서 측정하였다. 이러한 모델 중 둘은 간 지방산 생합성이 억제(6주령된 스트렙토조토신 당뇨병 랫트)되거나 상승(JCR:LA-비만 인슐린 내성 랫트)된 당뇨병 모델이다. 표 6은 다양한 랫트 모델에서의 혈장 글루코오스와 지방사 수준 둘 모두에서 관찰된 변화를 나타낸다. 지방산의 혈청 수준은 야윈 대조군과 비교하여 6주령되 스트렙토조토신 당뇨병 랫트의 경우 3배 증가하였고, JCR:LA-비만 랫트(Cp/Cp)의 경우 1.75배 증가하였다. 유사하게는, 6주령된 스트렙토조토신 당뇨병 랫트의 경우, 혈청 글루코오스 수준은 대조표준 보다 2.2배 증가하였다. 이와 대조적으로, 혈청 중 글루코오스 수준은 야윈 대조표준과 비교하여 Cp/Cp 랫트의 경우 변화가 없었다. 혈청 중의 글루코오스와 지방산 수준의 이러한 변화는 이러한 동물들의 병리생리학과 일치한다 [Russellet al., Metabolism43:538-543 (1994); Topping and Targ,Horm Res6:129-137 (1975); MatheDiabete Metab21:106-111 (1995)].
MCD 활성은 대조 랫트와 비교하여 6주령된 스트렙토조토신 당뇨병 동물의 경우 약 2배 증가한 (도 12) 반면 MCD 활성은 Cp/Cp 랫트에서는 변화가 없었다 (도 13). 활성의 변화가 MCD의 탈인산화 및/또는 효소의 상대적 풍부도의 증가로 인한 것인 지를 결정하기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 본 발명의 MCD 항체를 사용하여 수행하였다. MCD 단백질의 수준은 대조 간에 비해 6주령된 스트렙토조토신 당뇨병 랫트 간에서 약 2배 증가한 반면, Cp/Cp 랫트의 간에서의 MCD의 수준의 변화는 관찰되지 않았다 (도 13). 카탈라아제 항체를 대조표준으로서 사용하여 유사한 양의 단백질이 모든 레인에서 로딩되고 이동됨을 입증하였다. 그러나, 웨스턴 블롯 분석은 Cp/Cp 랫트에서의 MCD 단백질의 수준의 임의의 변화를 밝혀내지 못한다 (도 13). 이는 Cp/Cp 랫트의 MCD 활성에서 관찰된 변화가 단백질의 양이 아니라 효소의 인산화 상태의 변화에 기인할 수 있음을 제시한다.
인산화 조절 및 증간된 MCD 단백질 수준 둘 모두는 당뇨병 래트 간에서 MCD 활성을 조절하는 것과 관련된 것으로 여겨진다. 6주령된 스트렙토조토신과 Cp/Cp 랫트 둘 모두로부터의 간 MCD를 알칼리 포스파타아제로 처리한 경우, 본 발명자들은 모든 그룹에 대해 효소의 증가된 활성을 입증하였다 (표 5). 간 MCD의 알칼리 포스파타아제 처리는 약 11,000 내지 15,000 nmol/g dry wt-1/min-1의 MCD 효소 활성을 지속적으로 생성시키는 것으로 여겨지며, 이는 알칼리 포스파타아제 처리가 최대 활성 효소를 생성시키기에 충분함을 나타낸다. 스트렙토조토신 당뇨병 동물만이 최고 MCD 활성을 지니며, 이는 아마도 MCD 단백질 발현의 2배 증가로 인한 것이다.
간에서의 지방산 생합성과 산화를 변화시키기 위한 또 다른 잘 정립된 프로토콜은 랫트를 절식시키고, 먹이재섭취시키는 것이다 [Porter and Swenson,Mol Cell Biochem53:307-325 (1983); Clarkeet al., J Nutr120:218-224 (1990); Witterset al., Arch Biochem Biophys308:413-419 (1994)]. 표 6은 글루코오스의 현저한 감소 및 이때의 혈청 지방산 수준의 감소를 나타낸다. 유사하게는, MCD 활성은 48시간의 절식 기간 동안에도 증가하였다 (도 14a). 랫트가 48시간 동안 먹이를 섭취시키지 않은 후 72시간 동안 재섭취시킨 경우, MCD 활성이 감소하였다 (도 14a). MCD 활성의 수준은 동일한 절식 또는 재섭취 프로토콜을 거치지 않은 대조 랫트의 수준에 근접하기 시작한다 (도 14a). MCD 활성이 이러한 다양한 영양 상태 동안 변화한다고 하더라도, MCD 단백질의 수준은 현저하게 변화하지 않았다 (도 12와 비교하여). 다시 한번, 이것은 MCD의 활성이 번역후 조절, 가장 그럴듯하게는 인산화에 의해 번역후 조절을 받는다는 것을 제시한다.
실시예 9
랫트 췌장 β-세포 cDNA의 클로닝을 축중 올리고누클레오티드를 사용하여 2단계 방법으로 수행하였다. INS 세포 mRNA에 대해 시험된 선택된 쌍 중 하나는 거위 cDNA과 비교하여 추정된 580bp의 예상 크기의 하나의 생성물을 생성시켰다 (도 15). 이러한 단편의 서열화는 거위 누클레오티드 서열과 67% 동일성을 나타내었고, 블라스트 서버(blast server)에서 이용가능한 임의의 다른 서열과 매칭을 나타내지 않았다. 그 후, 이러한 단편을 프로브로서 사용하여 INS-1 세포 cDNA 라이브러리를 스크리닝하였다. 4개의 생체내-절제된 클론 중에서, 하나만이 293 세포내로의 형질감염 후에 실질적인 MCD 활성을 나타내었다. 293 세포는 형질감염되지 않은 조건 하에서 또는 β-갈락토시다아제 유전자에 의한 형질감염 후에 효소를 검출 가능한 수준으로 발현시키지 않았다. 2020bp의 이러한 클론의 서열화는 491 잔기의 아미노산 서열 및 약 52KDa의 추정 단백질에 상응하는 1473 염기의 오픈 리딩 프레임을 밝혀내었다. 3' 비-코딩 영역의 말단에 폴리아데닐화 신호를 지닌 폴리-A 테일이 또한 존재하였다. 다양한 포유류 조직으로부터 정제된 MCD 효소(들)을 이용한 종래의 실험은 약 170KDa의 전체 분자량을 평가하였으며, 이는 효소가 생체내에서 다량체화될 수 있음을 제시한다. 추론된 랫트 단백질 서열은 39번 아미노산인 메티오닌으로부터 끝까지 거위 서열과 69% 동일성을 나타낸다. 이러한 메티오닌을 둘러싸는 누클레오티드 서열 (AGCGCCATGG; SEQ ID NO:8)은 코자크(Kozak)컨센서스 부위 (GCCA/GCCATGG; SEQ ID NO:9)와 잘 맞추어지며, 이는 이 서열이 번역 개신 부위일 수 있음을 제시한다. 동일한 리딩 프레임 중의 38 아미노산의 서열은 이러한 메티오닌의 N-말단 측면에 존재한다. 메티오닌으로 출발하는 이러한 서열의 최초 아미노산(MRGL)은 거위 서열과 동일하다. 그러나, 이러한 서열의 나머지 부분은 아미노산 5 내지 38에 걸쳐 거위 서열과 상동성을 비교적 거의 나타내지 않는다. 랫트 단백질의 이러한 부분은 미토콘드리아 표적 서열의 특징을 지니는데, 이는 이것이 양 하전되고(8개 아르기닌) 히드록실화된 아미노산이 풍부하고 산성 아미노산이 없기 때문이다. 따라서, 이것은 거대한 MCD 전구체에 속하는 절단가능한 NH2-말단 표적화 서열인 것으로 여겨진다. 프레서열(presequence) 중의 공통적인 절단 부위 (R/K-R-A-X-S-S/T: SEQ ID NO:10)는 Met39 주변에 존재하지 않는다. 그러나, 와이. 가벨(Y. Gavel)에 의해 규정된 또 다른 절단-부위 모티프(PRLCSG; SEQ ID NO:11)가 위치 31 주변에 존재하는 것으로 추정되며, 이는 프레서열이 매트릭스 프로테아제에 의해 제거될 수 있고, β(INS) 세포 MCD가 적어도 부분적으로 미토콘드리아 매트릭스 효소임을 제시한다. 웹 PSORT 및 PROSITE 프로그램으로 수행된 랫트 MCD의 모티프 분석은 흥미로운 특징을 밝혀내었다. NH2-미토콘드리아 매트릭스 표적화 서열 이외에, 효소의 C-말단 부분은 SKL 시그니처(signature)를 특징으로 하는 퍼옥시좀 표적화 모티프로 종결된다. 잠재적인 단백질 키나아제 C와 카제인 키나아제 II 인산화 부위 (각각, 3 및 7)는 단백질을 따라 존재한다. 따라서, MCD는 (탈)인산화 반응에 의해 조절될 수 있는데,이는 키나아제 둘 모두가 미토콘드리아에 존재하기 때문이다. 랫트 MCD는 지질 앵커 중의 하나에 의해 개질된 잠재적인 막 결합 단백질로서 MCD를 배제시킨 아실화 부위(N-미리스토일화, 글리코실포스파티딜이노시톨, 이소프레닐화, 파네실화)를 함유하지 않는다.
실시예 10
MCD mRNA의 조직 분포를 노던 블롯 분석에 의해 조사하고, 반정량적 RT-PCR 실험에 의해 보완하였다 (도 16). 약 2.2kb의 mRNA가 모든 시험된 랫트 조직에 존재하고, 간, 신장, 심장 및 지방 조직에서 비교적 고수준으로 발현된다. 수득된 확산 신호는 MCD 전사체가 18S-리보솜 RNA와 함께 이동한다는 사실에 기인한다. 이러한 국재적 분포를 확인하기 위해, 본 발명자들은 동일한 조직 및 분류된 췌장 α-세포 및 β-세포에 대해 RT-PCR을 수행하였다. 25주기의 PCR 후, 조직 중의 상대 신호는 밴드 강도가 약하다는 것을 제외하고는 35 주기의 신호와 유사하였다. 동일한 샘플에 대한 β-액틴 대조 PCR로 인해 비교가 가능해졌다. 역전사되지 않은 물질의 대조 PCR은 RNA 제제의 게놈 DNA 오염을 배제시키는 신호를 나타내지 않았다. 따라서, RT-PCR 결과는 노던 블롯 분석을 확인해주며, MCD mRNA가 샘 조직의 α-세포와 β-세포에서도 β(INS) 세포의 정도와 유사한 정도로 발현됨을 추가로 나타낸다.
실시예 11
활성 효소의 존재를 조직 추출물에서 측정하였다. 결과는 간, 심장 및 췌장 β-(INS)-세포에서의 고수준으로부터 뇌와 비장에서의 낮은 활성 뿐만 아니라 십이지장 형질감염되지 않은 293 세포와 RSV-βgal로 형질감염된 293 세포에서의 검출 불가능한 MCD 활성까지 광범위한 활성을 나타낸다. MCD mRNA의 조직 분포 (도 15)는 효소 활성 측정법과 밀접하게 상호관련되지 않았다. 이러한 차이는 MCD 유전자의 번역 조절에 있어서의 조직간의 차이에 의해 설명될 수 있다. 고려할 만한 또 다른 가능성은 MCD가 공유적 개질(들)에 의해 조절되는 알로스테릭 효소이고, 효소가 다양한 조직에서 상이하게 인산화된다는 것이다. 이러한 고려와 일치하게, 랫트 MCD 서열은 다수의 잠재적인 인산화 부위를 나타내며, 활성 검정을 수행하기 전에 조적 추출물을 알칼리 포스파타아제 처리하면 높은 MCD 활성을 생성시켰다.
서열목록

Claims (25)

  1. a) i) 말로닐 CoA 데카복실라아제를 포함하는 정제된 제제, ii) 기질 및 iii) 시험 화합물을 제공하는 단계;
    b) 말로닐 CoA 데카복실라아제가 기질에 작용하여 생성물을 생성할 수 있도록 해주는 조건 하에서 말로닐 CoA 데카복실라아제와 기질을 혼합하는 단계로서, 혼합이 시험 화합물의 존재 및 부재 하에서 수행되는 단계;
    c) 시험 화합물의 존재 및 부재 하에서 생성된 생성물의 양을 직접적으로 또는 간접적으로 측정하는 단계를 포함하여 화합물을 스크리닝하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 기질이 말로닐 CoA임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 제제가 심장 조직으로부터 정제됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 생성물이 아세틸 CoA를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 아세틸 CoA가 직접적으로 측정됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 아세틸 CoA가 지시약의 양을 검출함으로써 간접적으로 측정됨을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 지시약이 시트레이트를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 시트레이트가 표지됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 시트레이트가 방사성표지됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 방사성표지된 시트레이트가 [14C]시트레이트임을 특징으로 하는 방법.
  11. a) i) 말로닐 CoA 데카복실라아제 상동체, ii) 기질 및 iii) 시험 화합물을 제공하는 단계;
    b) 말로닐 CoA 데카복실라아제 상동체가 기질에 작용하여 생성물을 생성할 수 있도록 해주는 조건 하에서 말로닐 CoA 데카복실라아제 상동체와 기질을 혼합하는 단계로서, 혼합이 시험 화합물의 존재 및 부재 하에서 수행되는 단계;
    c) 시험 화합물의 존재 및 부재 하에서 생성된 생성물의 양을 직접적으로 또는 간접적으로 측정하는 단계를 포함하여 화합물을 스크리닝하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 기질이 말로닐 CoA임을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 상동체가 심장 조직으로부터 정제된 말로닐 CoA 데카복실라아제와 하나의 아미노산 치환물 만큼 다름을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 11항에 있어서, 생성물이 아세틸 CoA를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 아세틸 CoA가 직접적으로 측정됨을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 14항에 있어서, 아세틸 CoA가 지시약의 양을 검출함으로써 간접적으로 측정됨을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 지시약이 시트레이트를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 시트레이트가 표지됨을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 시트레이트가 방사성표지됨을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 방사성표지된 시트레이트가 [14C]시트레이트임을 특징으로 하는 방법.
  21. a) SEQ ID NO:1의 누클레오티드 서열을 갖는 심장 MCD;
    b) SEQ ID NO:2의 누클레오티드 서열을 갖는 간 MCD;
    c) SEQ ID NO:3의 누클레오티드 서열을 갖는 췌장 MCD로 구성된 군으로부터 선택된 올리고누클레오티드 서열을 갖는 단리되고 정제된 DNA를 포함하는 조성물.
  22. 제 21항의 DNA로부터 전사된 RNA.
  23. 제 22항의 RNA로부터 번역된 단백질.
  24. 제 23항의 단백질로부터 생성된 항체.
  25. 제 21항의 DNA를 포함하는 발현 구성물.
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