WO2014129523A1 - 新規ｌ－トリプトファン脱水素酵素、ｌ－トリプトファンの測定方法、キットおよび酵素センサ - Google Patents

新規ｌ－トリプトファン脱水素酵素、ｌ－トリプトファンの測定方法、キットおよび酵素センサ Download PDF

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WO2014129523A1
WO2014129523A1 PCT/JP2014/053965 JP2014053965W WO2014129523A1 WO 2014129523 A1 WO2014129523 A1 WO 2014129523A1 JP 2014053965 W JP2014053965 W JP 2014053965W WO 2014129523 A1 WO2014129523 A1 WO 2014129523A1
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WO
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tryptophan
dehydrogenase
amino acid
enzyme
acid sequence
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PCT/JP2014/053965
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浅野　泰久
大亮 松井
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富山県
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/906—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7)
    • G01N2333/90605—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • G01N2333/90611—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1) in general
    • G01N2333/90616—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1) in general with a definite EC number (1.4.1.-)

Definitions

  • the present invention relates to a novel L-amino acid dehydrogenase, a method for measuring L-tryptophan using this novel L-amino acid dehydrogenase, a kit used therefor, and an enzyme sensor. More specifically, the present invention relates to a mutant L-amino acid dehydrogenase having a high dehydrogenase activity for L-tryptophan, a method for measuring L-tryptophan using this mutant enzyme, a kit for measuring L-tryptophan, and an enzyme. It relates to sensors.
  • L-tryptophan is one of the protein-constituting amino acids and is a biosynthetic raw material for various secondary metabolites.
  • tryptophan is metabolized in vivo by the serotonin pathway that produces serotonin, melatonin, and the like, and the kynurenine pathway that produces kynurenine, nicotinamide, and the like. Therefore, fluctuations in tryptophan and its metabolites in the blood can be an indicator of pathological conditions related to these metabolisms. Moreover, since tryptophan is metabolized mainly in the liver, its blood concentration can be one of indicators of liver dysfunction.
  • L-tryptophan has been quantified mainly by an instrumental analytical method involving separation and derivatization by an automatic amino acid analyzer or pre-column derivatization reverse phase high performance liquid chromatography. There is also a method using a coloring reagent that reacts directly with L-tryptophan. In addition, a method for quantifying L-tryptophan using an enzyme is also known.
  • Non-Patent Document 1 As a method using an enzyme, a method using amino acid oxidase for L-tryptophan derived from Copurinus sp. has been reported (Patent Document 1 and Non-Patent Document 1). A method using L-tryptophan tRNA synthetase is also known (Non-patent Document 2). An enzyme sensor using tryptophan 2-monooxygenase is also known (Non-patent Document 3). An analysis method using L-tryptophan oxidase is also known (Patent Document 2). Furthermore, a method using L-tryptophan dehydrogenase (L-tryptophan dehydrogenase) derived from Nostoc punctiform has been reported (Patent Document 3, Non-Patent Document 4).
  • L-tryptophan dehydrogenase L-tryptophan dehydrogenase
  • L-tryptophan has been quantified mainly by an instrumental analysis method centered on HPLC.
  • many instruments used for quantification of amino acids including tryptophan are generally expensive.
  • high resolution is required for application to biological samples, but high-resolution measuring instruments are even more expensive.
  • the amino acid oxidase derived from Hitoyotake used in the methods described in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 has low specificity for L-tryptophan and 7% relative activity for L-phenylalanine. . Moreover, since it has dioxygenase activity in addition to oxidase activity, the reaction does not proceed quantitatively. Therefore, such amino acid oxidase is not suitable for quantification of L-tryptophan in biological samples.
  • Non-Patent Document 2 Since the method described in Non-Patent Document 2 uses a radioisotope element, it cannot be used for general purposes.
  • L-tryptophan 2-monooxygenase used in the enzyme sensor described in Non-Patent Document 3 reacts with L-phenylalanine in addition to L-tryptophan. Therefore, an enzyme electrode using such L-tryptophan 2-monooxygenase cannot provide sufficient accuracy in measuring biological samples.
  • L-tryptophan oxidase used in the method described in Patent Document 2 has poor stability, and it is necessary to add glycerol as a stabilizer.
  • Non-Patent Document 4 describes a part of the synetomin synthesis pathway in cyanobacteria-derived organisms. It is described that it is the enzyme responsible. Since such an enzyme is a leucine dehydrogenase homolog and does not measure all 20 types of amino acids as substrates, it cannot be easily determined as a tryptophan quantification enzyme. Further, as described in Patent Document 3, this L-tryptophan dehydrogenase has poor stability and is deactivated in 48 hours. Therefore, it is not suitable for measurement kits or enzyme sensors. Further, although glycerol is described as a stabilizer, there is a problem that the absorbance is affected when measuring a plasma sample.
  • an object of the present invention is to provide L-tryptophan dehydrogenase having high stability and high activity. Another object of the present invention is to provide a method capable of measuring L-tryptophan simply and with high accuracy in biological samples containing various substances using the L-tryptophan dehydrogenase. Another object of the present invention is to provide a measurement kit and an enzyme sensor that can be used when carrying out the measurement method.
  • the present invention is shown below.
  • the 59th leucine is phenylalanine or proline
  • the 168th aspartic acid is glycine, glutamic acid, leucine or lysine
  • the 234th alanine is aspartic acid, lysine.
  • Phenylalanine, threonine or alanine, and L-tryptophan dehydrogenase having an amino acid sequence in which the 296th isoleucine is replaced with asparagine
  • an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in the region excluding the 59th, 168, 234th and 296th amino acids.
  • L-tryptophan dehydrogenase having an amino acid sequence and having a dehydrogenase activity against L-tryptophan as compared with L-tryptophan dehydrogenase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or higher L-tryptophan Or (3) L-tryptophan having an amino acid sequence having at least 71% sequence identity to the amino acid sequence defined in (1) above and having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • the dehydrogenase activity for L-tryptophan is maintained as compared to the dehydrogenase, or High L-tryptophan dehydrogenase (however, in the amino acid sequence of the L-tryptophan dehydrogenase, the amino acids corresponding to the 59th, 168, 234, and 296th amino acid sequences are not mutated).
  • a method for measuring L-tryptophan comprising: (A) Incubating the L-tryptophan dehydrogenase and the specimen according to [1] in the presence of water and NAD + ; and (B) Dehydrogenating the L-tryptophan dehydrogenase with respect to L-tryptophan. Measuring at least one of the reaction products produced in the reaction solution by the enzyme activity.
  • reaction product measured in step (B) is a deamination product of L-tryptophan.
  • a kit for measuring L-tryptophan comprising the L-tryptophan dehydrogenase and NAD + according to [1].
  • kit according to [8] further comprising at least one of a reaction buffer, a NADH detection reagent, and a deamination product detection agent for L-tryptophan.
  • the novel mutant L-tryptophan dehydrogenase according to the present invention has a very high dehydrogenase activity for L-tryptophan. Therefore, by using this mutant L-tryptophan dehydrogenase, L-tryptophan can be measured accurately, simply and rapidly even in a sample containing many impurities such as other amino acids.
  • the present invention is effective for biological samples such as plasma, serum, and urine, and not only can L-tryptophan be quantified with an absorptiometer or the like, but also an electrode-type enzyme sensor can be provided.
  • FIG. 1 shows the results of alignment analysis of the amino acid sequence of wild-type L-tryptophan dehydrogenase and the amino acid sequence of the mutant L-tryptophan dehydrogenase (L59F / D168G / A234D / I296N) of the present invention.
  • TrpDH Wild type is a wild-type L-tryptophan dehydrogenase derived from Nostoc punctiform ATCC 29133
  • TrpDHL59F / D168G / A234D / I296N is a mutant L-tryptophan dehydrogenase of the present invention. Is shown.
  • FIG. 1 shows the results of alignment analysis of the amino acid sequence of wild-type L-tryptophan dehydrogenase and the amino acid sequence of the mutant L-tryptophan dehydrogenase (L59F / D168G / A234D / I296N) of the present invention.
  • TrpDH Wild type is
  • FIG. 2 shows the results of examining the thermal stability of the wild-type L-tryptophan dehydrogenase purified in the Examples of the present application and the mutant L-tryptophan dehydrogenase of the present invention (L59F / D168G / A234D / I296N). .
  • the vertical axis is specific activity.
  • FIG. 3 shows the results of examining the thermal stability of the wild-type L-tryptophan dehydrogenase purified in the Examples of the present application and the mutant L-tryptophan dehydrogenase of the present invention (L59F / D168G / A234D / I296N). .
  • the vertical axis is relative activity.
  • FIG. 4 shows that the wild-type L-tryptophan dehydrogenase purified in Examples of the present application and the mutant L-tryptophan dehydrogenase of the present invention (L59F / D168G / A234D / I296N) are added with an enzyme stabilizer. The results of examining the stability under no conditions are shown. The vertical axis is specific activity.
  • FIG. 5 shows that for the wild-type L-tryptophan dehydrogenase purified in Examples of the present application and the mutant L-tryptophan dehydrogenase of the present invention (L59F / D168G / A234D / I296N), an enzyme stabilizer was added. The results of examining the stability under no conditions are shown.
  • FIG. 6 shows the results of quantification of L-tryptophan using a wild-type L-tryptophan dehydrogenase without adding glycerol, which is an enzyme stabilizer, in plasma samples to which L-tryptophan was added.
  • FIG. 7 shows the results of quantifying L-tryptophan using a wild-type L-tryptophan dehydrogenase after adding glycerol as an enzyme stabilizer to a plasma sample to which L-tryptophan has been added.
  • FIG. 6 shows the results of quantification of L-tryptophan using a wild-type L-tryptophan dehydrogenase without adding glycerol, which is an enzyme stabilizer, in plasma samples to which L-tryptophan was added.
  • FIG. 7 shows the results of quantifying L-tryptophan using a wild-type L-tryptophan dehydrogenase after adding glycerol as an enzyme stabilizer to a plasma sample to which L-tryptophan has been
  • FIG. 8 shows the results of quantification of L-tryptophan using a mutant L-tryptophan dehydrogenase according to the present invention without adding glycerol, which is an enzyme stabilizer, to a plasma sample to which L-tryptophan has been added. Indicates.
  • FIG. 9 shows the result of quantification of L-tryptophan using a mutant L-tryptophan dehydrogenase according to the present invention without adding glycerol, which is an enzyme stabilizer, to a plasma sample to which L-tryptophan was added. The obtained calibration curve is shown.
  • FIG. 10 is a graph showing measurement results of dehydrogenase activity for various amino acids of the mutant L-tryptophan dehydrogenase according to the present invention.
  • L-tryptophan dehydrogenase is any one of the above (1) to (3).
  • the 59th leucine is phenylalanine or proline
  • the 168th aspartic acid is glycine, glutamic acid, leucine or lysine
  • the 234th alanine is aspartic acid, lysine.
  • Phenylalanine, threonine or alanine, and L-tryptophan dehydrogenase having an amino acid sequence in which the 296th isoleucine is replaced with asparagine
  • an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in the region excluding the 59th, 168, 234th and 296th amino acids.
  • L-tryptophan dehydrogenase (1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is L-tryptophan dehydrogenated produced by Nostoc punctiform, which has been distributed from the American Type Culture Collection (ATCC). It was obtained by cloning a gene encoding an enzyme. This point will be described in detail in Examples.
  • the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is L-tryptophan dehydrogenase having L-tryptophan dehydrogenase activity, as confirmed in the Examples.
  • the L-tryptophan dehydrogenase activity of the protein acts on L-tryptophan in the presence of water and NAD + at pH 11.5 and 37 ° C. to react with L-tryptophan ketoacid (indolepyruvic acid or 3 -(1H-indol-3-yl) -2-oxopropanoic acid) and NADH.
  • L-tryptophan dehydrogenase activity for L-tryptophan is referred to as L-tryptophan dehydrogenase activity.
  • this dehydrogenase activity can be measured by using the measuring reagent and measuring method as described in the below-mentioned Example.
  • L-tryptophan dehydrogenase (1) of the present invention in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, the 59th leucine is substituted with phenylalanine or proline, and the 168th aspartic acid is glycine, glutamic acid, leucine. Or L-tryptophan having an amino acid sequence in which 234th alanine is maintained as alanine or substituted with aspartic acid, lysine, phenylalanine or threonine, and 296th isoleucine is substituted with asparagine It is a dehydrogenase.
  • the protein obtained by substituting the 59th, 168th, 234th or 296th amino acid with the above-mentioned specific amino acid is compared with tryptophan dehydrogenase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, as shown in the Examples. And high stability.
  • the L-tryptophan dehydrogenase (1) and each amino acid of SEQ ID NO: 2 are preferably in the L form.
  • “Stability is higher than that of the amino acid dehydrogenase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2” means that the stability of the target protein is wild-type L-tryptophan dehydrogenase (hereinafter referred to as “wild-type dehydrogenase”). It is relatively high compared to “enzyme”). Specifically, as compared with the wild-type enzyme, it means that the enzyme is stable under the condition where glycerol, which is an enzyme stabilizer, is not added.
  • Protein-constituting amino acids other than L-tryptophan such as L-lysine, L-ornithine, L-arginine, L-tyrosine, L-alanine, L-cysteine, L-aspartic acid, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, Mutant L-tryptophan dehydrogenase according to the present invention for L-isoleucine, L-leucine, L-methionine, L-asparagine, L-proline, L-glutamine, L-serine, L-threonine, L-valine Does not show activity.
  • an enzyme having “(specific) amino acid sequence” means that the amino acid sequence of the enzyme only needs to contain the specified amino acid sequence, and the function of the enzyme is maintained. To do.
  • sequences other than the amino acid sequence specified in the enzyme include a histidine tag, a linker sequence for immobilization, and a cross-linked structure such as an —SS—bond.
  • the “region excluding the 59th, 168th, 234th and 296th amino acids” means L-tryptophan dehydrogenase (1) or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. 1st to 58th, 60th to 167th, 169th to 233th, 235th to 295th, and 297th and subsequent areas.
  • the range of “1 to several” in the “amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added” indicates that L-tryptophan dehydrogenase having a deletion or the like is the above-mentioned L-tryptophan. As long as it has dehydrogenase activity with high substrate specificity, there is no particular limitation.
  • the range of “1 to several” is, for example, 1 or more and 30 or less because the ratio of the L-tryptophan dehydrogenase having oxidase activity with high substrate specificity to L-tryptophan is high.
  • the “sequence identity” in the “amino acid sequence having at least 71% sequence identity to the amino acid sequence defined in (1) above” is not particularly limited as long as it is an enzyme having a dehydrogenase activity with high substrate specificity to the L-tryptophan.
  • the sequence identity of the amino acid sequence is not particularly limited as long as it is 71% or more, preferably 72% or more, 73% or more, 74% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, 85% or more.
  • sequence identity refers to the degree of amino acid identity with respect to each other of two or more amino acid sequences. Therefore, the higher the identity of two amino acid sequences, the higher the identity or similarity of those sequences. Whether or not two kinds of amino acid sequences have identity can be analyzed by direct comparison of the sequences, and specifically, can be analyzed using commercially available sequence analysis software or the like.
  • amino acid sequence of the L-tryptophan dehydrogenase (3) the amino acid at the 59th, 168, 234 or 296th amino acid in the amino acid sequence of the L-tryptophan dehydrogenase (1), which is a criterion for determining sequence identity
  • Corresponding amino acids can be examined by the above-described analysis of sequence identity or homology. Specifically, alignment analysis of the amino acid sequence to be analyzed is performed on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of L-tryptophan dehydrogenase (1) using commercially available sequence analysis software or the like. For example, it is possible to search for an amino acid corresponding to the 59th, 168, 234, or 296th amino acid. Such alignment analysis techniques are widely known to those skilled in the art.
  • the origin of the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention is not particularly limited as long as it belongs to the range specified in (1) to (3) above.
  • the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention may be a recombinant protein produced by various genetic engineering techniques, a synthetic protein produced by chemical synthesis, or shown in SEQ ID NO: 2.
  • Obtaining a mutant capable of producing the mutant enzyme of the present invention by giving a mutagen to a specific biological species (for example, a bacterium) having an L-tryptophan dehydrogenase gene homolog comprising the amino acid sequence It may be a protein produced by extracting and purifying the protein produced by the mutant.
  • a nucleic acid (DNA or RNA) encoding the above L-tryptophan dehydrogenase (1), (2) or (3) is prepared and expressed in various ways. By incorporating it into a vector, the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention can be expressed.
  • the 59th, 168th, 234th or 296th amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or the amino acid corresponding to the amino acid is the above (1).
  • the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention can be produced by introducing the nucleic acid encoding the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention thus prepared into an appropriate expression system.
  • An expression system that can be used for producing the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention is not particularly limited.
  • an expression vector that enables expression of a recombinant protein in various biological species is used.
  • expression vectors that can be used it is possible to use various expression vectors that allow protein expression in a host such as microorganisms such as bacteria and fungi (for example, yeasts), plants, insect cells, and mammalian cells.
  • Virus vectors (including phage vectors) or plasmid vectors may be used.
  • the protein of the present invention may be produced using a cell-free protein expression system using rabbit reticulocyte lysate, wheat germ lysate, E. coli lysate or the like.
  • the step of incorporating a nucleic acid encoding the protein of the present invention into a vector can be prepared by a production method including a step of converting, a step of culturing transformed host cells, a step of accumulating the protein encoded by the gene in the culture, and collecting the accumulated protein.
  • a nucleic acid encoding the protein of the present invention, a vector containing the nucleic acid, and a transformant transformed with the vector are one embodiment of the present invention.
  • These nucleic acids, vectors and transformants can be prepared by a person skilled in the art according to conventional methods if the amino acid sequence of the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention is determined.
  • the method for obtaining a nucleic acid encoding the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention is not particularly limited.
  • the L-tryptophan dehydration of the present invention is performed using a nucleic acid encoding the L-tryptophan dehydrogenase gene (SEQ ID NO: 1) isolated from Nostoc punctiform as a material.
  • a nucleic acid encoding an enzyme may be obtained, or the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention or a gene having homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is isolated from various bacteria, and the gene is encoded
  • the nucleic acid encoding the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention may be produced by preparing a nucleic acid to be substituted and substituting the nucleotide sequence corresponding to the 59th, 168th, 234th or 296th amino acid.
  • the nucleic acid encoding the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention has a certain identity with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, or the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1. Based on the known base sequence having information or information on the known amino acid sequence having a certain identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, such as chemical synthesis, genetic engineering technique or mutagenesis, etc. It can produce by this method.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of wild-type L-tryptophan dehydrogenase derived from Nostoc punctiform, which was distributed from a bacterial distribution agency.
  • the enzymes shown in Table 1 are known as enzymes corresponding to such bacterial homologous genes.
  • amino acid sequence of wild-type L-tryptophan dehydrogenase amino acid sequence of mutant enzyme L59F / D168G / A234D / I296N which is L-tryptophan dehydrogenase of the present invention
  • amino acid sequences of known enzymes shown in Table 1 The result of having performed is shown in FIG.
  • the amino acid at the position indicated by the arrow is the amino acid corresponding to the 59th, 168th, 234th or 296th amino acid.
  • the known genes shown in Table 1 are leucine, alanine and isoleucine other than 168 as in the case of the wild-type enzyme.
  • the amino acid sequence of the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention may be designed based on the sequences of these known genes, or may be designed based on the sequence information of other known homologous genes.
  • the nucleic acid encoding the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention specifically includes, for example, a method in which a DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is contacted with a mutagen agent, ultraviolet light Can be carried out by using a method of irradiating, a genetic engineering method or the like.
  • site-directed mutagenesis which is one of genetic engineering techniques, is a technique that can introduce a specific mutation at a specific position, a nucleic acid encoding the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention is produced. Above, it is useful for introducing site-specific mutations into nucleic acids.
  • an appropriate probe or primer is prepared based on the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing in the present specification or the amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 2, and using them, the Nostoc punctiform ( By screening a bacterial cDNA or genomic library containing Nostoc punctiform), a nucleic acid can be prepared as a material for producing a nucleic acid encoding the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention.
  • a cDNA or genomic library can be prepared by a conventional method.
  • a material for producing a nucleic acid encoding the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention can be obtained by PCR.
  • PCR reaction conditions can be set as appropriate. For example, one cycle of a reaction step consisting of 94 ° C. for 30 seconds (denaturation), 55 ° C. for 30 seconds to 1 minute (annealing), and 72 ° C. for 2 minutes (extension) For example, after 30 cycles, a condition of reacting at 72 ° C.
  • the amplified DNA fragment can be used as a material for producing a nucleic acid encoding the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention.
  • the vector obtained by cloning the amplified DNA fragment into an appropriate vector that can be amplified in a host such as E. coli also encodes the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention. It can be used as a material for producing nucleic acids.
  • a base sequence (codon) encoding an amino acid corresponding to the 59th, 168, 234 or 296th amino acid.
  • the above-described operations such as preparation of the probe or primer, construction of the genomic library, screening of the genomic library, and cloning of the target gene are known to those skilled in the art.
  • the nucleic acid encoding the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention can be used in a state inserted in an appropriate vector.
  • the type of vector used in the present invention is not particularly limited.
  • the vector may be a self-replicating vector (for example, a plasmid), or may be integrated into the host cell genome when introduced into the host cell. It may be replicated together with other chromosomes.
  • the vector is an expression vector.
  • elements necessary for transcription for example, a promoter and the like
  • a promoter is a DNA sequence that exhibits transcriptional activity in a host cell, and can be appropriately selected depending on the type of host.
  • Promoters that can operate in bacterial cells include the Geobacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene (Geobacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene), the Bacillus licheniformis ⁇ -amylase gene (Bacillus licheniformis amyliferyltilis amyliformylamylichelylophilis amyliformylamylichelylophilis amyliformylamyliclylophilis amyliformylamylophile).
  • Geobacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene Geobacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene
  • Bacillus licheniformis ⁇ -amylase gene Bacillus licheniformis amyliferyltilis amyliformylamylichelylophilis amyliformylamylichelylophilis amyliformylamylophile.
  • BAN amylase gene Bacillus subtilis alkaline protease gene (Bacillus subtilis alkaline protease gene) or Bacillus pumilus Xylosidase gene (Bacillus pumilus xylosldase gene) promoter or phage lambda PR or PL promoters,, lac E. (E. coli), such as trp or tac promoter and the like.
  • promoters that can operate in mammalian cells include the SV40 promoter, the MT-1 (metallothionein gene) promoter, and the adenovirus 2 major late promoter.
  • promoters operable in insect cells include polyhedrin promoter, P10 promoter, autographa caliornica polyhedrosic basic protein promoter, baculovirus immediate early gene 1 promoter, or baculovirus 39K delayed early gene promoter.
  • promoters operable in yeast host cells include a promoter derived from a yeast glycolytic gene, an alcohol dehydrogenase gene promoter, a TPI1 promoter, an ADH2-4c promoter, and the like.
  • promoters that can operate in filamentous fungal cells include the ADH3 promoter or the tpiA promoter.
  • the nucleic acid encoding the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention may be operably linked to an appropriate terminator as necessary.
  • the vector containing a nucleic acid encoding the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention further has elements such as a polyadenylation signal (eg, derived from SV40 or adenovirus 5E1b region), a transcription enhancer sequence (eg, SV40 enhancer), and the like. It may be.
  • a recombinant vector containing the gene for L-amino acid oxidase may further comprise a DNA sequence that allows the vector to replicate in the host cell, an example of which is the SV40 origin of replication (host cell is a mammalian cell). ).
  • the vector containing a nucleic acid encoding L-tryptophan dehydrogenase of the present invention may further contain a selection marker.
  • Selectable markers include, for example, genes that lack their complement in host cells such as dihydrofolate reductase (DHFR) or Schizosaccharomyces pombe TPI genes, or such as ampicillin, kanamycin, tetracycline, chloramphenicol, Mention may be made of drug resistance genes such as neomycin or hygromycin.
  • Methods for ligating a nucleic acid encoding the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention, a promoter, and optionally a terminator and / or secretory signal sequence, respectively, and inserting them into an appropriate vector are well known to those skilled in the art.
  • the transformant of the present invention can be prepared by introducing a vector containing a nucleic acid encoding the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention into an appropriate host.
  • the host cell into which the vector of the present invention is introduced may be any cell as long as the vector of the present invention is replicated in the cell.
  • Examples of bacterial cells include Gram-positive bacteria such as Bacillus or Streptomyces and Gram-negative bacteria such as E. coli. Transformation of these bacteria may be performed by using competent cells by a protoplast method or other known methods.
  • Examples of mammalian cells include HEK293 cells, HeLa cells, COS cells, BHK cells, CHL cells, or CHO cells. Methods for transforming mammalian cells and expressing DNA sequences introduced into the cells are also known, and for example, electroporation method, calcium phosphate method, lipofection method and the like can be used.
  • yeast cells include cells belonging to Saccharomyces or Schizosaccharomyces, for example, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, etc. It is done.
  • Examples of the method for introducing a recombinant vector into a yeast host include an electroporation method, a spherobuplast method, and a lithium acetate method.
  • filamentous fungi examples include Aspergillus, Neurospora, Fusarium, or Trichoderma.
  • transformation can be performed by integrating the DNA construct into the host chromosome to obtain a recombinant host cell. Integration of the DNA construct into the host chromosome can be performed according to known methods, for example, by homologous recombination or heterologous recombination.
  • the recombinant gene transfer vector and baculovirus are co-introduced into the insect cells to obtain the recombinant virus in the insect cell culture supernatant, and then the recombinant virus is further infected with the insect cells.
  • the protein can be expressed.
  • baculovirus for example, Autographa californica nucleopolyhedrosis virus, which is a virus that infects Coleoptera insects, can be used.
  • Examples of methods for co-introducing a recombinant gene introduction vector into insect cells and the baculovirus for preparing a recombinant virus include the calcium phosphate method and the lipofection method.
  • the above transformant is cultured in an appropriate nutrient medium under conditions that allow replication of the vector of the present invention or conditions that allow expression of the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention.
  • a normal protein isolation and purification method may be used.
  • the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention when expressed in a dissolved state in a cell, the cell is recovered by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher or the like. The cells are disrupted to obtain a cell-free extract.
  • an ordinary protein isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Anion exchange chromatography using a resin such as diethylaminoethyl (DEAE) sepharose, cation exchange chromatography using a resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia), resins such as butyl sepharose and phenyl sepharose Using the hydrophobic chromatography method used, gel filtration method using molecular sieve, affinity chromatography method, chromatofocusing method, electrophoresis method such as isoelectric focusing etc. alone or in combination, the L- Tryptophan dehydrogenase can be obtained as a purified sample.
  • a solvent extraction method ethylaminoethyl (DEAE) sepharose
  • cation exchange chromatography using a resin such as S-Sepharose FF (
  • the method for measuring L-tryptophan according to the present invention is: (A) Incubating the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention and the specimen in the presence of water and NAD + ; and (B) Dehydrogenase activity of the L-tryptophan dehydrogenase on L-tryptophan. A step of measuring at least one of the reaction products produced in the reaction solution.
  • the above-described method of the present invention includes a detection method for determining the presence or absence of L-tryptophan in a sample and a quantification method for measuring the concentration and amount of L-tryptophan in the sample.
  • a detection method for determining the presence or absence of L-tryptophan in a sample and a quantification method for measuring the concentration and amount of L-tryptophan in the sample.
  • the sample to be measured by the method of the present invention is a sample that may contain L-tryptophan, and any sample that should determine the presence or absence of L-tryptophan or that should measure the concentration or amount of L-tryptophan.
  • biological samples such as blood, serum, plasma, homogenate of a part of an organ, urine and the like can be mentioned.
  • the biological sample is appropriately determined depending on what kind of product produced by allowing the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention to act on the biological sample to measure the concentration of L-tryptophan in the biological sample. You can choose.
  • the product is quantified using a color former or a fluorescent agent, it is preferably a colorless aqueous solution, and examples thereof include serum and plasma.
  • a specimen contains various components such as a biological sample and the like contains a substance that impairs accurate measurement, it can be pretreated to remove such components from the specimen.
  • the compound having the same or similar physical properties as the enzyme reaction product or NADH If the sample is contained in the sample, accurate measurement may not be possible. More specifically, since NADH absorbs light having a wavelength of 340 nm, absorbance measurement of light having a wavelength of 340 nm is often used for measuring NADH. Therefore, when the absorbance of NADH is scheduled to be measured and the sample contains a compound having the property of absorbing the wavelength light, it is preferable to remove such compound in advance. In addition to this, if a sample is scheduled to measure color development or fluorescence and contains a compound that affects the enzyme or electron carrier used, it is preferable to remove such compound in advance.
  • the dehydrogenation reaction (oxidation reaction) of L-tryptophan by the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention is shown in the following reaction formula. That is, the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention catalyzes the following reaction.
  • the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention and the specimen are kept warm in the presence of water and NAD + .
  • NAD + as an electron acceptor. Therefore, in the measurement method according to the present invention, the reaction proceeds in the presence of water as a solvent if L-tryptophan dehydrogenase and NAD + are contained in addition to L-tryptophan contained in the sample solution.
  • the water used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it does not inhibit the enzyme reaction, such as ultrapure water, pure water, purified water, distilled water, and ion exchange water. Further, if the sample contains water, the water can be used. The amount of water used can be appropriately adjusted according to the form of the specimen, the concentration of L-tryptophan in the specimen, etc., and may be determined by preliminary experiments.
  • the L-tryptophan concentration measurable by the present invention depends on the L-tryptophan dehydrogenase used, the measurement method used in the step (B) described later, and the like.
  • the concentration of L-tryptophan in the sample is suitably, for example, from 0 mM to 1 mM.
  • NAD + may be present in an equimolar amount or more with L-tryptophan to be measured in the reaction solution. Therefore, the amount of NAD + used can be appropriately adjusted according to the form of the specimen, the concentration of L-tryptophan in the specimen, etc., as with water, and may be determined by preliminary experiments. For example, when a biological sample having a relatively low L-tryptophan concentration of 0 to 1 mM is used as a sample, NAD + in the reaction solution can be set to 1 mM or more and 50 mM or less.
  • L-tryptophan dehydrogenase as a quantification enzyme is limited by the substrate specificity and affinity.
  • L-tryptophan dehydrogenase of Nostoc punctiform shown in Examples described later
  • no activity is detected for protein-constituting amino acids other than tryptophan and D-tryptophan.
  • this characteristic makes it suitable for the measurement of L-tryptophan. Since L-tryptophan dehydrogenase according to the present invention has higher stability and activity than such wild-type L-tryptophan dehydrogenase, it is more suitable for the measurement of L-tryptophan.
  • the Km value of the above wild-type L-tryptophan dehydrogenase with respect to L-tryptophan is 0.0759 mM, and it can be used for a biological sample having a relatively small amount of L-tryptophan (about 0 to 1 mM). . From such a viewpoint, it is appropriate that the amount of the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention mixed in the reaction solution is in the range of about 10 mU / ml to 100 mU / ml.
  • a buffer solution capable of adjusting the pH of the reaction solution to an optimum pH of L-tryptophan dehydrogenase and a pH considering the stability of NADH can be added.
  • a stabilizer for L-tryptophan dehydrogenase can also be added. Examples of the stabilizer for L-tryptophan dehydrogenase include at least one selected from the group consisting of glycerol, sucrose, sorbitol, and trehalose.
  • the pH of the reaction solution can be any pH as long as the stability and solubility of the enzyme used and other reagents allow, when an enzyme is used for NADH determination in addition to L-tryptophan dehydrogenase.
  • the reaction is carried out near the optimum pH of the enzyme.
  • the basicity for example, pH 8.5 or more and 11.5 or less is desirable.
  • reaction solution described above is kept warm.
  • the reaction temperature may be appropriately adjusted.
  • the reaction temperature may be 20 ° C. or higher and 55 ° C. or lower, more preferably 50 ° C. or lower, and further preferably 45 ° C. or lower.
  • reaction time can also be adjusted suitably, it can be made into about 1 minute or more and 10 hours or less, for example.
  • Step B At least one reaction product produced by the action of the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention present in the reaction solution after the above reaction is measured.
  • reaction products include 3- (1H-indol-3-yl) -2-oxopropanoic acid (indolepyruvic acid), which is a deamination product of L-tryptophan, and NAD + NADH, which is a reduced product of
  • the end point method can be used for the measurement, but an initial rate method using the initial rate of the reaction can also be used.
  • NADH produced by conversion of NAD + in the reaction catalyzed by the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention has a maximum absorption at 340 nm, and can be easily measured by measuring the absorbance of light at a wavelength of 340 nm. is there. Since the amount of NADH produced is equimolar with that of L-tryptophan consumed by the reaction stoichiometrically, it is suitable for the measurement of L-tryptophan.
  • a chromogenic electron acceptor As a detection method of NADH, in addition to measuring absorbance at 340 nm, a chromogenic electron acceptor can also be used.
  • the chromophoric electron acceptor include 2- (4-indophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5-phenyl-2H-tetrazolyl chloride (INT), resazurin, ferrocyan compound, and the like. Since these electron carriers emit fluorescence when reduced, they can be easily measured. In this case, a diaphorase that catalyzes electron transfer from NADH can also coexist.
  • NADH oxidase another enzyme that oxidizes NADH can be used as a detection reagent.
  • an enzyme is NADH oxidase.
  • peroxidase it is necessary to use peroxidase as a coloring / fluorescent reagent.
  • peroxidase horseradish peroxidase can be used, for example.
  • a substrate for peroxidase must be added as a coloring reagent. Examples of peroxidase substrates include 2-aminoantipyrine / phenol and ABTS.
  • electrodes can also be used for NADH detection.
  • the aforementioned electron carrier can be used alone or in combination with diaphorase or NADH oxidase.
  • L-tryptophan dehydrogenase, diaphorase, and NADH oxidase can be used in a free state, but can also be directly or indirectly immobilized on an electrode by a known method.
  • the deamination product (indolepyruvic acid) of L-tryptophan can be measured by, for example, HPLC.
  • the deamination product of L-tryptophan takes on a brown color by combining with iron ions contained in iron ammonium citrate and the like. Therefore, the reaction product can be indirectly measured by using ammonium iron citrate as the L-tryptophan deamination product detection agent and measuring the color change.
  • the kit for measuring L-tryptophan according to the present invention is characterized by comprising the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention and NAD + .
  • L-tryptophan dehydrogenase is preferably a mixture with a stabilizer for the enzyme.
  • a stabilizer for the enzyme preferably contains 10 parts by mass or more and 70 parts by mass or less of a stabilizer with respect to 100 parts by mass of the enzyme from the viewpoint that the enzyme can be stably stored for a long period of time.
  • the amount of the stabilizer is preferably in the range of 20 to 60 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the enzyme.
  • the stabilizer is, for example, at least one selected from the group consisting of glycerol, sucrose, sorbitol, and trehalose.
  • NAD + is an electron carrier necessary for reaction by L-tryptophan dehydrogenase.
  • L-tryptophan dehydrogenase is an NAD + dependent enzyme. For this reason, the deamination of the 2-position of L-tryptophan occurs in conjunction with the conversion of NAD + to NADH. Therefore, the converted NADH is stoichiometrically equivalent to the amount of L-tryptophan consumed.
  • the kit of the present invention may further contain a reaction buffer, a NADH detection reagent, and an L-tryptophan deamination product detection agent.
  • the reaction buffer is used to maintain the reaction solution at a pH suitable for the enzyme reaction.
  • Most NAD + -dependent dehydrogenases including L-tryptophan dehydrogenase derived from Nosto punctiform shown in the examples below, show high activity in basic aqueous solutions.
  • the buffer solution to be used has a pH that is more basic than neutral, preferably a buffer solution having a pH of 8.5 or more and 11.5 or less, and more preferably a buffer solution having a pH of 9.0 or more.
  • the NADH detection reagent is required when NADH is detected by color development or fluorescence.
  • a color development reagent capable of receiving electrons directly from NADH such as INT can be used.
  • diaphorase or NADH oxidase it is also possible to carry out a color development reaction in which electrons are indirectly transferred from NADH to a chromogenic substance. Resazurin may be mentioned as a color developing or fluorescent substrate used in combination with diaphorase.
  • NADH oxidase is used as a NADH detection reagent, peroxidase and a chromogenic substrate for peroxidase are required to detect hydrogen peroxide generated by NADH oxidase.
  • the combination of the coloring reagent used in combination with NADH oxidase include a combination of horseradish peroxidase, 2-aminoantipyrine and phenol.
  • the enzyme sensor according to the present invention is an enzyme sensor for measuring L-tryptophan, and is characterized in that the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention is disposed on or near the detection electrode.
  • the L-tryptophan dehydrogenase used in this enzyme sensor is the same as the L-tryptophan dehydrogenase according to the present invention described above.
  • the L-tryptophan dehydrogenase of the present invention is disposed on or near the surface thereof, and is used for the measurement of L-tryptophan.
  • the enzyme sensor of the present invention is capable of directly or indirectly quantitatively detecting NADH produced in an L-tryptophan-dependent manner by L-tryptophan dehydrogenase.
  • an enzyme for detecting NADH such as diaphorase with high sensitivity using a detection electrode can be used in combination with the detection electrode regardless of whether it is immobilized or not.
  • the L-tryptophan dehydrogenase is preferably disposed on the surface of the detection electrode or in the vicinity of the detection electrode together with the enzyme stabilizer.
  • the stabilizer may be at least one selected from the group consisting of glycerol, sucrose, sorbitol, and trehalose.
  • the enzyme sensor of the present invention can be a combination of the above-mentioned enzyme and other proteins that contribute to detection, such as an electron transfer substance or peroxidase, with or without immobilization with the detection electrode.
  • Other configurations can be used as they are, or appropriately modified from the configurations employed in known enzyme sensors.
  • At least a detection electrode part is immersed in a reaction solution containing a specimen, and NADH produced in an L-tryptophan-dependent manner by L-tryptophan dehydrogenase is directly or indirectly electrochemically produced. To detect.
  • the enzyme sensor of the present invention is a combination of a basic structure of a known enzyme electrode and L-tryptophan dehydrogenase, and directly or indirectly immobilizes L-tryptophan dehydrogenase and the above-mentioned NADH detection enzyme. It can be an electrode-type enzyme sensor using an enzyme electrode. Furthermore, an enzyme mediator that facilitates the transfer of electrons between the enzyme, NADH and the electrode may be present near the detection electrode of the enzyme electrode.
  • Example 1 Preparation of the enzyme of the present invention
  • genomic DNA was prepared from cyanobacterial Nostoc punctiform ATCC 29133, and the same strain on the database.
  • PCR using Primer 1 (5′-GGAATTCCATATGCTGCTATTTTGAAACTGTTAG-3 ′) (SEQ ID NO: 10) and Primer 2 (5′-CTTGCTCGAGAGCTGCGATCGCTTTAGAC-3 ′) (SEQ ID NO: 11) designed based on the genome sequence (CP001037) of The L-tryptophan dehydrogenase gene (NpR1275) was amplified.
  • the amplified product was incorporated into pT7Blue vector and subcloning was performed using a competent cell (“E. coli JM109” manufactured by Takara Bio Inc.) as a host. Furthermore, a PCR product was prepared from the subcloned pT7Blue-NpR1275 using primer 2 and primer 3 (5′-CTAGTGAGCTCGATGAGAGGTCCATATGCTGCTATTTG-3 ′) (SEQ ID NO: 12) and introduced with a cleavage sequence of SacI and XhoI. After the treatment, it was ligated with a vector treated with the same restriction enzyme (“pET21 (+)” manufactured by Merck Chemicals) and introduced into a competent cell (“BL21 (DE3)” manufactured by Biodynamics Laboratory).
  • pET21 (+) manufactured by Merck Chemicals
  • Primer 4 (5′-ATATCTAGTTCTAGAGATGAGGGTCCCATTGCTGCCTATTTG-3 ′) (SEQ ID NO: 13) and primer 5 (5′-CTTTTGTGATCCCGATCTC-3 ′) (SEQ ID NO: 14) are used for the creation of the mutant enzyme gene library described below.
  • the L-tryptophan dehydrogenase gene was amplified together with a C-terminal 6-residue histidine tag by PCR.
  • the amplification product is treated with restriction enzymes with XbaI and BamHI, then ligated with pUC19 DNA (Takara Bio) treated with the same restriction enzymes, and introduced into a competent cell (“E. coli JM109” produced by Takara Bio). did.
  • This plasmid can be purified using Bio-Rad Ni-IMAC because a 6-residue histidine tag is introduced into the C-terminus of the expressed protein.
  • the above expression strain [JM109 / pUCNpR1275his] is inoculated into LB medium (500 mL) containing ampicillin, cultured at 37 ° C. for 90 minutes, at 25 ° C. for 60 minutes, and at 15 ° C. for 90 minutes, and then at a final concentration of 0.4 mM. IPTG was added and cultured at 15 ° C. for 20 hours. After centrifuging the culture solution at 6,000 ⁇ g for 5 minutes, the supernatant was removed, and 5 times the amount of 20 mM potassium phosphate buffer was added to the residue to suspend it, and then the cells were disrupted with an ultrasonic homogenizer.
  • the disrupted solution was centrifuged at 20,000 ⁇ g for 30 minutes, and the supernatant was used as a cell-free extract.
  • the cell-free extract is immediately purified using Bio-Rad Ni-IMAC, added with a stabilizer as described below if necessary, dialyzed against 20 mM potassium phosphate buffer containing the stabilizer, and SDS-PAGE. Homogeneous enzyme was obtained.
  • the base sequence of the gene encoding such wild-type enzyme is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of this enzyme is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the PCR reaction conditions were (i) 94 ° C. for 30 seconds, (ii) 94 ° C. for 20 seconds, (iii) 58 ° C. for 30 seconds, (iv) 72 ° C. for 2 minutes, (v) (ii) to ( iv) was performed 29 cycles.
  • the PCR product was subjected to restriction enzyme treatment with XbaI / BamHI and ligated to pUC109 which was similarly treated with restriction enzyme.
  • Genomic DNA was prepared from E. coli (“E. coli JM109” manufactured by Takara Bio Inc.), and the sequence before and after the trpB gene was amplified by PCR using the obtained genomic DNA as a template.
  • primer 6 (5′-GCCGATGCCCTGCTTATAATGCCTTTCAGTA-3 ′) (SEQ ID NO: 15)
  • primer 7 (5′-AACACCCCCTTTGTTCCTTTTCCTTAATATGC-3 ′) (SEQ ID NO: 16) were used.
  • Primer 8 (5′-GTTTTTCTAATGGAACGCTCACGAATCTCTG-3 ′) (SEQ ID NO: 17) and primer 9 (5′-TATTGATTTTACTGGTGTTTAGTTGCGGGGA-3 ′) (SEQ ID NO: 18) were used for amplification of the part 1,000 bp.
  • the composition of the PCR reaction solution was sterilized water 30 ⁇ L, 10 ⁇ PCR buffer 5 ⁇ L, 2 mM dNTP 5 ⁇ L, 100 pmol primer 6 or primer 8 1 ⁇ L, 100 pmol primer 7 or primer 9 1 ⁇ L, template DNA 2 ⁇ L, and KOD Plus 1 ⁇ L.
  • the PCR reaction conditions were (i) 95 ° C.
  • the kanamycin gene was amplified using primer 10 (5′-GAAAGGAACAAAGGGGTGTTATGAGCCCATA-3 ′) (SEQ ID NO: 19) and primer 11 (5′-TAGCGTTCCATTAGAAAAACTCATCGAGCA-3 ′) (SEQ ID NO: 20).
  • PCR was carried out in the same manner as above with the composition of 10 ⁇ L of each of the obtained three PCR products, 7 ⁇ L of sterilized water, 10 ⁇ PCR buffer 5 ⁇ L, 2 mM dNTP 5 ⁇ L, 100 pmol primer 6 1 ⁇ L, 100 pmol primer 9 1 ⁇ L, and KOD Plus 1 ⁇ L. .
  • the following tryptophan-requiring strain was prepared using the obtained PCR product.
  • the gene fragment was introduced into E. coli (“E. coli JM109” manufactured by Takara Bio Inc.) using the electroporation method and transformed.
  • the procedure of the electroporation method is as follows. 1 ⁇ L of the above gene fragment was mixed with 40 ⁇ L of E. coli JM109 and dispensed into an electroporation cuvette (1 mm). Then, after electroporation was performed under conditions of 1,200 V and 129 ⁇ , 1 ml of LB liquid medium was added and kept at 37 ° C. for 1 hour. It apply
  • the obtained colonies were inoculated on M9 agar medium containing kanamycin.
  • a similar colony was inoculated on an M9 agar medium containing kanamycin / tryptophan and cultured at 37 ° C. for 12 hours with shaking.
  • a colony that grew only on a plate containing tryptophan was used as a tryptophan-requiring strain for the following operations.
  • BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) and DNA Sequencer 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)
  • trpB was confirmed by DNA sequencer.
  • the plasmid obtained in (2) above was introduced into the E. coli tryptophan-requiring strain obtained in (3) above by the heat shock method and transformed.
  • the procedure of the heat shock method is as follows. Plasmid (5 ⁇ L) was mixed with E. coli ⁇ trpB (50 ⁇ L) and allowed to stand on ice for 60 minutes. Then, after heat shocking at 42 ° C. for 90 seconds, 1 mL of LB liquid medium was added and incubated at 37 ° C. for 1 hour. The cells were inoculated into M9 liquid medium containing ampicillin, kanamycin, and indolepyruvic acid, and cultured at 37 ° C. for 14 hours.
  • a fast-growing mutant enzyme expression strain (tryptophan-requiring strain) is considered to have a high ability to supply tryptophan from indolepyruvic acid. That is, it is considered that the culture rate of a strain having a tryptophan dehydrogenase mutant enzyme having high activity from indole pyruvate, which is a tryptophan precursor, to tryptophan is high.
  • the 59th leucine was converted to phenylalanine and the 168th aspartic acid was converted to glycine in the tryptophan dehydrogenase genes of many colonies.
  • the 234th alanine was replaced with aspartic acid, and the 296th isoleucine was replaced with asparagine.
  • the obtained base sequence is shown in SEQ ID NO: 3, and the obtained amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • Test Example 1 Measurement of enzyme activity To examine the effect of temperature on the mutant enzyme L59F / D168G / A234D / I296N obtained in Example 1, L-tryptophan dehydrogenase activity was measured at pH 10.5. Specifically, first, each enzyme was incubated at each temperature for 30 minutes. Separately, a reagent for measuring L-tryptophan dehydrogenase activity having the following composition was prepared.
  • L-tryptophan dehydrogenase was added to the above measuring reagent so that the final concentration was 0.1 U, the total amount of the reaction solution (1 mL) was added to a 1 cm quartz cell, and the produced NADH was measured by a change in absorbance at 340 nm. .
  • the L-tryptophan dehydrogenase activity was calculated from the obtained absorbance change based on the following formula.
  • the amount of enzyme that gives 1 micromole of substrate per minute under the above conditions was 1 U. From the change in absorbance obtained, the activity of L-tryptophan dehydrogenase was calculated based on the following formula.
  • Activity value (U / ml) ⁇ OD / min ( ⁇ ODtest ⁇ ODblank) ⁇ Vt ⁇ dilution ratio ⁇ / (6.22 ⁇ 1.0 ⁇ Vs) Vt (mL): total amount 6.22: millimolar molecular extinction coefficient of NADH (cm 2 / micromole) 1.0: Optical path length of the cell (cm) Vs (mL): Enzyme sample liquid volume
  • FIGS. 2 shows the activity on the vertical axis
  • FIG. 3 shows the relative activity when the activity at 25 ° C. is 100% on the vertical axis.
  • the activity of the mutant enzyme L59F / D168G / A234D / I296N increased 10-fold compared to the wild-type enzyme.
  • the wild type enzyme showed a significant decrease in activity at about 40 ° C. or higher, but the mutant enzyme L59F / D168G / A234D / I296N had 50% or more after heat treatment up to about 50 ° C. Maintenance of the activity was observed.
  • Test Example 2 Stability test of enzyme activity In order to examine the stability of the mutant enzyme L59F / D168G / A234D / I296N, the activity was measured over time by keeping at 4 ° C. in the absence of glycerol. The results of measuring the activity over time for each of the wild-type enzyme and the mutant enzyme are shown in FIGS.
  • FIG. 4 shows the specific activity of the mutant enzyme.
  • FIG. 5 shows the relative activity with the vertical axis of FIG. It is clear that the wild-type enzyme is reduced to 20% or less after 24 hours in the absence of glycerol. However, the mutant enzyme maintained an activity of 90% or more even after 24 hours.
  • Test Example 3 Measurement of Enzyme Activity The temperature was fixed at 37 ° C., and the dehydrogenase activity of the wild-type enzyme and the mutant enzyme L59F / D168G / A234D / I296N was measured under the same conditions as in Test Example 1 above. The results are shown in Table 3.
  • Example 2 Preparation of the enzyme of the present invention
  • a single point mutation was introduced into the wild-type enzyme.
  • PCR for mutagenesis was performed.
  • QuikChange (registered trademark) Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) was used for the PCR reaction for preparing the mutant enzyme L59F.
  • composition of the PCR reaction solution was as follows: sterile water (MilliQ) 16.5 ⁇ L, 10 ⁇ reaction buffer 2.5 ⁇ L, 100 ng / ⁇ L template DNA 1.0 ⁇ L, 100 ng / ⁇ L primer 12 (5′-gctttaaagatgcatttcgtcgtcgtcggcgg-3 ′) 21) 1.25 ⁇ L, 100 ng / ⁇ L primer 13 (5′-cccgactgagagagaatgcatcttttaagc-3 ′) (SEQ ID NO: 22) 1.25 ⁇ L, dNTP mix 1.0 ⁇ L, Quik Solution reagent 1.5 ⁇ L, QuikChgL .
  • the PCR reaction conditions were (i) 95 ° C. for 2 minutes, (ii) 95 ° C. for 20 seconds, (iii) 60 ° C. for 10 seconds, (iv) 68 ° C. for 4 minutes, (v) (ii) to ( After iv) was repeated 17 times, (vi) was set at 68 ° C. for 5 minutes.
  • DpnI restriction enzyme
  • PCR reaction for preparing the mutant enzyme D168G includes 1.25 ⁇ L of 100 ng / ⁇ L primer 14 (5′-AGAGCAAAAGACTTGATGGGATGAAGATGTC-3 ′) (SEQ ID NO: 23) and 100 ng / ⁇ L primer 15 (5′- GCAACTTTCATCCCATCAAGTCTTTTGCCTCT-3 ′) (SEQ ID NO: 24) was used for the above treatment (Sample 2).
  • PCR reaction for preparing the mutant enzyme A234D includes 100 ng / ⁇ L primer 16 (5′-TCTTTCTCCTTGCGATCTGGGAGAGATTCT-3 ′) (SEQ ID NO: 25) 1.25 ⁇ L and 100 ng / ⁇ L primer 17 (5′-AGAATTCTCTCCAGATCGCCAAGGAGAAAGAGA-3 ) (SEQ ID NO: 26) The above treatment was performed using 1.25 ⁇ L (sample 3).
  • the PCR reaction for preparing the mutant enzyme I296N includes 1.25 ⁇ L of 100 ng / ⁇ L primer 18 (5′-GTCTCACAGAAATGAATGGTTATGACGAAG-3 ′) (SEQ ID NO: 27) and 100 ng / ⁇ L primer 19 (5′-CTTCGTCATAACCATTCATTCTCTGTGACAC-3 ) (SEQ ID NO: 28) The above treatment was carried out using 1.25 ⁇ L (sample 4).
  • Sample 1 Sample 2
  • Sample 3 Sample 4
  • Sample 4 were used to transform E. coli JM109 and cultivated and purified in the same manner as the wild type enzyme to compare L-tryptophan dehydrogenase activity. did.
  • the results are shown in Table 4.
  • mutant enzyme L59F has increased thermal stability. Furthermore, since the mutant enzyme D168G and the mutant enzyme I296N have a high residual activity after 24 hours, an increase in stability in the absence of glycerol was confirmed. Furthermore, it was confirmed that the mutant enzyme A234D has an increased specific activity. Moreover, in order to investigate the influence of other amino acids on these residues, the following treatment was performed.
  • the other 19 types of amino acid mutations were introduced into each mutation site with respect to the mutant enzyme L59F / D168G / A234D / I296N, and the improvement of the activity of the mutant enzyme was examined.
  • PCR for mutation introduction was performed using the expression plasmid introduced with the mutant enzyme gene as a template.
  • primer 20 (5′-GCTTTAAAAGATGCANSNSCGTCTCAGTCGGGGGC-3 ′) (SEQ ID NO: 29) and primer 21 (5′-GCCCCGACTGAGACGSNNTTGCATCTTTTAAAGC-3 ′) (SEQ ID NO: 30).
  • primer 22 (5′-CAGAGCAAAAGACTTNNSGGGATGAAAGTTGCA-3 ′) (SEQ ID NO: 31) and primer 23 (5′-TGCAACTTTCATCCCSNNAAGTCTTTTGCTCTG-3 ′) (SEQ ID NO: 32) were used. Processing was performed (Sample 6).
  • primer 24 (5′-ATCTTTTCTCCTTGCNNSCTGGGAGGAATCCT-3 ′) (SEQ ID NO: 33) and primer 25 (5′-AAGGATCTCTCCCAGSNNGCAAGGAGAAAAGAT-3 ′) (SEQ ID NO: 34).
  • primer 26 (5′-GTCTCACAGAAAATGNNSGGTTATGACGAAGAA-3 ′) (SEQ ID NO: 35) and the primer 27 (5′-TTCTTCGTCATAAACCSNNCTTTCGTTGTAGAC-3 ′) (SEQ ID NO: 36). (Sample 8).
  • E. coli JM109 was transformed and inoculated on LB ampicillin plates.
  • 300 ⁇ L of LB liquid medium containing 100 ⁇ L / mL ampicillin was dispensed in 96-well deep wells, and the obtained colonies were inoculated into the medium of each well using a colony picker.
  • the culture was performed at 300 rpm and 37 ° C. for 12 hours using a shaker, 20 ⁇ L of IPTG 7.5 mM was added, and shaking culture was performed again at 16 ° C. for 12 hours. After incubation, the cells were collected by centrifugation at 2,500 rpm and 4 ° C. for 20 minutes.
  • Each microbial cell was suspended in 200 ⁇ L of 10 mM KPB (pH 7.0), transferred to a 96-well round bottom plate, and microbial cell disruption (output 3, 30 seconds) was performed with an 8-unit ultrasonic crusher. After centrifugation under the same conditions, the obtained supernatant was used as a cell-free extract.
  • the dehydrogenase activity of 50 ⁇ L of the cell-free extract was measured in the same manner as in Test Example 1 using L-tryptophan as a substrate. Those having a high residual activity after 24 hours were cultured in an LB liquid medium, a plasmid was prepared, and the amino acid at each mutation site was confirmed. In addition, using the cultured and purified mutant enzyme, the dehydrogenase activity was compared after purification and after one week. The results are shown in Table 5.
  • Test Example 4 Enzyme activity measurement The dehydrogenase activity of the mutant enzyme L59F / D168G / A234D / I296N was measured using various concentrations of L-tryptophan aqueous solution. L-tryptophan was added to the prepared aqueous solution so that the final concentration was 0, 25, 50, 75, 100, 125, or 150 ⁇ M to obtain an L-tryptophan aqueous solution.
  • the composition of the measurement reagent and the measurement method were as in Test Example 1 above, and the reaction conditions were 37 ° C. at pH 7.0 in the presence or absence of glycerol.
  • the result of the wild-type enzyme in the absence of glycerol is shown in FIG. 6, the result of the wild-type enzyme in the presence of 20% glycerol is shown in FIG. 7, and the result of the mutant enzyme in the absence of glycerol is shown in FIG.
  • Test Example 5 Measurement of enzyme activity using biological sample
  • the dehydrogenase activity of the mutant enzyme L59F / D168G / A234D / I296N was measured using a human plasma sample to which L-tryptophan was added.
  • L-tryptophan was added to the prepared human plasma so that the final concentrations would be 0, 25, 50, 75, 100, 125, and 150 ⁇ M to obtain plasma samples.
  • the composition of the measurement reagent and the measurement method were as shown in (1) and (2) above, and the reaction conditions were pH 7.0 and 30 ° C. The results are shown in FIG.
  • Test Example 6 Substrate specificity test Regarding the mutant L-tryptophan dehydrogenase (L59F / D168G / A234D / I296N) purified in Example 2 above, based on the activity measurement method of Test Example 1, L- The tryptophan dehydrogenase activity for 18 natural amino acids including tryptophan and D-tryptophan was measured. The results are shown in FIG.
  • the mutant L-tryptophan dehydrogenase (L59F / D168G / A234D / I296N) according to the present invention does not show any dehydrogenase activity with respect to amino acids other than L-tryptophan. Only specific activity was revealed. Therefore, since the mutant L-tryptophan dehydrogenase according to the present invention has very high specificity for L-tryptophan, L-tryptophan can be accurately obtained even in a sample containing other amino acids such as blood by using the enzyme. It becomes possible to measure easily and quickly.

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Abstract

　本発明は、安定性が高く活性の高いＬ－トリプトファン脱水素酵素を提供することを目的とする。また、本発明は、当該Ｌ－トリプトファン脱水素酵素を用い、様々な物質を含む生体試料などにおいてもＬ－トリプトファンを簡便に且つ高い精度で測定できる方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、当該測定方法を実施する際に利用できる測定用キットと酵素センサを提供することも目的とする。本発明に係るＬ－トリプトファン脱水素酵素は、野生型のＬ－トリプトファン脱水素酵素に比べ、特定位置に変異を有することを特徴とする。

Description

新規Ｌ－トリプトファン脱水素酵素、Ｌ－トリプトファンの測定方法、キットおよび酵素センサ
　本発明は、新規Ｌ－アミノ酸脱水素酵素、並びにこの新規Ｌ－アミノ酸脱水素酵素を用いるＬ－トリプトファンの測定方法、それに用いるキットおよび酵素センサに関する。より詳しくは、本発明は、Ｌ－トリプトファンに対する脱水素酵素活性の高い変異型Ｌ－アミノ酸脱水素酵素、並びにこの変異型酵素を利用したＬ－トリプトファンの測定方法、Ｌ－トリプトファン測定用キットおよび酵素センサに関する。
　Ｌ－トリプトファンは、タンパク質構成アミノ酸の一つであり、さまざまな二次代謝産物の生合成原料にもなる。
　例えば、トリプトファンは、生体内でセロトニンやメラトニンなどを生成するセロトニン経路や、キヌレニンやニコチン酸アミドなどを生成するキヌレニン経路によって代謝される。よって、血中におけるトリプトファンやその代謝物の変動は、これらの代謝に関連する病態の指標になり得る。また、トリプトファンは主として肝臓で代謝されるため、その血中濃度は肝機能障害の指標の一つにもなり得る。
　従来、Ｌ－トリプトファンの定量は、主に自動アミノ酸分析装置やプレカラム誘導体化逆相高速液体クロマトグラフィーによる分離と誘導体化を伴う機器分析的手法で行われていた。また、Ｌ－トリプトファンと直接反応する発色試薬を用いる方法もある。その他、酵素を用いたＬ－トリプトファンの定量方法も知られている。
　酵素を用いた方法として、ヒトヨタケ属担子菌（Ｃｏｐｕｒｉｎｕｓ　ｓｐ．）由来のＬ－トリプトファン用アミノ酸オキシダーゼを用いる方法が報告されている（特許文献１および非特許文献１）。Ｌ－トリプトファンｔＲＮＡ合成酵素を用いた方法も知られている（非特許文献２）。また、トリプトファン２－モノオキシゲナーゼを用いた酵素センサも知られている（非特許文献３）。また、Ｌ－トリプトファンオキシダーゼを用いた分析方法も知られている（特許文献２）。さらに、ノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ　ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）由来のＬ－トリプトファン脱水素酵素（Ｌ－トリプトファンデヒドロゲナーゼ）を用いる方法が報告されている（特許文献３、非特許文献４）。
特開２００１－６９９７４号公報 特開２０１２－１９６２０７号公報 特開２０１２－１８３０１８号公報
Biosci. Biotechnol. Biochem. 64, 1468-1493 (2000) Anal. Biochem. 154, 618-623 (1986) Biosen.and Bioelect. 12, 363-371 (1997) J. Am. Chem. Soc., 130, 15260-15261 (2008)
　上記のように、Ｌ－トリプトファンは、主にＨＰＬＣを中心とした機器分析的手法により定量が行われてきた。しかし、トリプトファンを含むアミノ酸の定量に用いられる機器は一般的に高価なものが多い。特に生体試料に適用するには高度な分解能が必要となるが、高分解能の測定機器はより一層高価である。
　Ｌ－トリプトファンの測定方法としては、Ｌ－トリプトファンと直接作用する染色剤を用いた方法もあるが、生体試料などを測定対象とした場合、生体試料には様々な化合物が含まれており、類似化合物と反応し得るため、正確な測定が難しいという問題がある。
　特許文献１および非特許文献１に記載の方法で用いられているヒトヨタケ由来のアミノ酸オキシダーゼは、Ｌ－トリプトファンに対する特異性が低く、Ｌ－フェニルアラニンに対しても７％の相対活性を有している。また、オキシダーゼ活性のほかにジオキシゲナーゼ活性も持つため、定量的に反応が進行しない。よって、かかるアミノ酸オキシダーゼは、生体試料などにおけるＬ－トリプトファンの定量には適さない。
　非特許文献２に記載の方法は、放射性同位体元素を使用するものであるため、汎用的に使用することはできない。
　非特許文献３に記載の酵素センサに用いられているＬ－トリプトファン２－モノオキシゲナーゼは、Ｌ－トリプトファン以外にＬ－フェニルアラニンにも反応する。そのため、かかるＬ－トリプトファン２－モノオキシゲナーゼを用いた酵素電極では、生体試料などの測定においては十分な精度が得られない。
　特許文献２に記載の方法で用いられているＬ－トリプトファンオキシダーゼは安定性が悪く、安定化剤であるグリセロールの添加が必要である。
　特許文献３で用いられているＬ－トリプトファン脱水素酵素はノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ　ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）由来のものであり、非特許文献４には、ラン藻由来生物中でｓｃｙｎｅｔｏｍｉｎ合成経路の一部を担っている酵素であると記載されている。かかる酵素はロイシン脱水素酵素ホモログであり、基質として２０種類のアミノ酸全部の測定を行っていないことから、容易にトリプトファン定量用酵素と判断できない。また、特許文献３に記載されているように、このＬ－トリプトファン脱水素酵素は安定性が悪く、４８時間で失活する。そのため、測定用キットや酵素センサに適さない。また、安定化剤としてグリセロールが記載されているが、血漿サンプル測定時に吸光度に影響が生じる問題がある。
　そこで本発明は、安定性が高く活性の高いＬ－トリプトファン脱水素酵素を提供することを目的とする。また、本発明は、当該Ｌ－トリプトファン脱水素酵素を用い、様々な物質を含む生体試料などにおいてもＬ－トリプトファンを簡便に且つ高い精度で測定できる方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、当該測定方法を実施する際に利用できる測定用キットと酵素センサを提供することも目的とする。
　本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した。その結果、ノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ　ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）に由来するＬ－トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列において、第５９番目のロイシン、第１６８番目のアスパラギン酸、第２３４番目のアラニン、第２９６番目のイソロイシンを所定のアミノ酸に置換することにより得られる変異型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素が、グリセロールなどの安定化剤を添加しない条件でも安定であり、野生型酵素よりも高い活性を示すことを見出した。本発明は、係る知見により完成されたものである。
　本発明を以下に示す。
　［１］下記（１）～（３）の何れかのＬ－トリプトファン脱水素酵素。
　（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第５９番目のロイシンがフェニルアラニンまたはプロリンで、第１６８番目のアスパラギン酸がグリシン、グルタミン酸、ロイシンまたはリジンで、第２３４番目のアラニンがアスパラギン酸、リジン、フェニルアラニン、スレオニンまたはアラニンで、第２９６番目のイソロイシンがアスパラギンで置換されたアミノ酸配列を有するＬ－トリプトファン脱水素酵素；
　（２）上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第５９、１６８、２３４および２９６番目のアミノ酸を除く領域中で１または数個のアミノ酸が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有するＬ－トリプトファン脱水素酵素であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＬ－トリプトファン脱水素酵素と比較してＬ－トリプトファンに対する脱水素酵素活性が維持されているか或いは高いＬ－トリプトファン脱水素酵素；または
　（３）上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して少なくとも７１％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＬ－トリプトファン脱水素酵素と比較してＬ－トリプトファンに対する脱水素酵素活性が維持されているか或いは高いＬ－トリプトファン脱水素酵素（ただし、該Ｌ－トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列において上記第５９、１６８、２３４、２９６番目のアミノ酸配列に対応するアミノ酸は変異しないものとする）。
　［２］　上記［１］に記載のＬ－トリプトファン脱水素酵素をコードすることを特徴とする核酸。かかる核酸は、本発明に係るＬ－トリプトファン脱水素酵素の製造に有用である。
　［３］　上記［２］に記載の核酸を含むベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。かかる形質転換体は、本発明に係るＬ－トリプトファン脱水素酵素の製造に有用である。
　［４］　Ｌ－トリプトファンを測定するための方法であって：
　（Ａ）水とＮＡＤ+の存在下、上記［１］に記載のＬ－トリプトファン脱水素酵素と検体とを保温する工程；および
　（Ｂ）上記Ｌ－トリプトファン脱水素酵素のＬ－トリプトファンに対する脱水素酵素活性により反応液中に生成される反応生成物の少なくとも一つを測定する工程
　を含むことを特徴とする方法。
　［５］　工程（Ｂ）において測定する反応生成物がＮＡＤＨである、上記［４］に記載の方法。
　［６］　吸光度計を用いてＮＡＤＨを測定する、上記［５］に記載の方法。
　［７］　工程（Ｂ）において測定する反応生成物がＬ－トリプトファンの脱アミノ化生成物である、上記［４］に記載の方法。
　［８］　上記［１］に記載のＬ－トリプトファン脱水素酵素とＮＡＤ+を含むことを特徴とするＬ－トリプトファンの測定用キット。
　［９］　反応用緩衝液、ＮＡＤＨ検出試薬、およびＬ－トリプトファンの脱アミノ化生成物検出薬の少なくとも一つをさらに含む上記［８］に記載のキット。
　［１０］　Ｌ－トリプトファンの測定用酵素センサであって、検出用電極の表面または近傍に上記［１］に記載のＬ－トリプトファン脱水素酵素が配置されていることを特徴とする酵素センサ。
　本発明に係る新規の変異型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素は、Ｌ－トリプトファンに対する脱水素酵素活性が非常に高い。よって、この変異型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素を用いることにより、ほかのアミノ酸など多くの夾雑物を含む試料においても、Ｌ－トリプトファンを精度良く、簡便、迅速に測定することが可能となる。特に、血漿、血清、尿のような生体試料に対して本発明は有効であり、吸光度計などでＬ－トリプトファンを定量できるのみならず、電極型酵素センサをも提供することが可能である。
図１は、野生型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列と、本発明の変異型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素（Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎ）のアミノ酸配列についてアライメント解析を行った結果を示す。図１において、ＴｒｐＤＨ　Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅは、ノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ　ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）ＡＴＣＣ２９１３３由来の野生型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素、ＴｒｐＤＨＬ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎは、本発明の変異型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素を示している。 図２は、本願実施例において精製した野生型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素と本発明の変異型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素（Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎ）について、熱安定性を調べた結果を示す。縦軸は比活性である。 図３は、本願実施例において精製した野生型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素と本発明の変異型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素（Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎ）について、熱安定性を調べた結果を示す。縦軸は相対活性である。 図４は、本願実施例において精製した野生型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素と本発明の変異型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素（Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎ）について、酵素の安定化剤を添加していない条件での安定性を調べた結果を示す。縦軸は比活性である。 図５は、本願実施例において精製した野生型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素と本発明の変異型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素（Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎ）について、酵素の安定化剤を添加していない条件での安定性を調べた結果を示す。縦軸は相対活性である。 図６は、Ｌ－トリプトファンを添加した血漿サンプルについて、酵素の安定化剤であるグリセロールを添加せずに野生型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素を用いてＬ－トリプトファンを定量した結果を示す。 図７は、Ｌ－トリプトファンを添加した血漿サンプルについて、酵素の安定化剤であるグリセロールを添加し、野生型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素を用いてＬ－トリプトファンを定量した結果を示す。 図８は、Ｌ－トリプトファンを添加した血漿サンプルについて、酵素の安定化剤であるグリセロールを添加せずに、本発明に係る変異型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素を用いてＬ－トリプトファンを定量した結果を示す。 図９は、Ｌ－トリプトファンを添加した血漿サンプルについて、酵素の安定化剤であるグリセロールを添加せずに、本発明に係る変異型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素を用いてＬ－トリプトファンを定量した結果、得られた検量線を示す。 図１０は、本発明に係る変異型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素の様々なアミノ酸に対する脱水素酵素活性の測定結果を示すグラフである。
　＜変異型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素＞
　本発明に係るＬ－トリプトファン脱水素酵素（Ｌ－トリプトファンデヒドロゲナーゼ）は、上記（１）～（３）の何れかのものである。
　（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第５９番目のロイシンがフェニルアラニンまたはプロリンで、第１６８番目のアスパラギン酸がグリシン、グルタミン酸、ロイシンまたはリジンで、第２３４番目のアラニンがアスパラギン酸、リジン、フェニルアラニン、スレオニンまたはアラニンで、第２９６番目のイソロイシンがアスパラギンで置換されたアミノ酸配列を有するＬ－トリプトファン脱水素酵素；
　（２）上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第５９、１６８、２３４および２９６番目のアミノ酸を除く領域中で１または数個のアミノ酸が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有するＬ－トリプトファン脱水素酵素であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＬ－トリプトファン脱水素酵素と比較してＬ－トリプトファンに対する基質特異性が高い脱水素酵素活性を有するＬ－トリプトファン脱水素酵素；または
　（３）上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して少なくとも７１％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＬ－トリプトファン脱水素酵素と比較してＬ－トリプトファンに対する基質特異性が高い脱水素酵素活性を有するＬ－トリプトファン脱水素酵素（ただし、該Ｌ－トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列において上記第５９、１６８、２３４、２９６番目のアミノ酸配列に対応するアミノ酸は変異しないものとする）。
　上記Ｌ－トリプトファン脱水素酵素（１）において、配列番号２に示すアミノ酸配列は、微生物株分与機関Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から分譲されたノストク・パンクチフォルムが生産するＬ－トリプトファン脱水素酵素をコードする遺伝子をクローニングすることにより得られたものである。この点については実施例において詳述する。
　上記配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質は、実施例において確かめられている通り、Ｌ－トリプトファン脱水素酵素活性を有するＬ－トリプトファン脱水素酵素である。該タンパク質が有するＬ－トリプトファン脱水素酵素活性は、例えば、水とＮＡＤ+の存在下、ｐＨ１１．５、３７℃において、Ｌ－トリプトファンに作用してＬ－トリプトファンのケト酸（インドールピルビン酸または３－（１Ｈ－インドール－３－イル）－２－オキソプロパン酸）とＮＡＤＨを生成する活性である。本明細書では、以下、Ｌ－トリプトファンに対する脱水素酵素活性を、Ｌ－トリプトファン脱水素酵素活性という。なお、この脱水素酵素活性は、後記の実施例に記載の測定試薬と測定方法を用いることにより測定することができる。
　本発明の上記Ｌ－トリプトファン脱水素酵素（１）は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第５９番目のロイシンがフェニルアラニンまたはプロリンで置換され、第１６８番目のアスパラギン酸がグリシン、グルタミン酸、ロイシンまたはリジンで置換され、第２３４番目のアラニンがアラニンのまま維持されているか或いはアスパラギン酸、リジン、フェニルアラニンまたはスレオニンで置換され、第２９６番目のイソロイシンがアスパラギンで置換されたアミノ酸配列を有するＬ－トリプトファン脱水素酵素である。上記第５９、１６８、２３４または２９６番目のアミノ酸を上記の特定アミノ酸に置換して得られるタンパク質は、実施例で示される通り、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するトリプトファン脱水素酵素と比較して安定性が高い。上記Ｌ－トリプトファン脱水素酵素（１）および配列番号２の各アミノ酸は、Ｌ体であることが好ましい。
　「配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するアミノ酸脱水素酵素と比較して安定性が高い」とは、対象となるタンパク質の安定性が、野生型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素（以下、「野生型酵素」という）と比較して相対的に高いことをいう。具体的には、野生型酵素と比較して、酵素の安定剤であるグリセロールを添加していない条件で安定であることを意味する。
　Ｌ－トリプトファン以外のタンパク質構成アミノ酸である、Ｌ－リジン、Ｌ－オルニチン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－チロシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－システイン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－プロリン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－バリンに対し、本発明に係る変異型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素は活性を示さない。
　本発明において酵素が「（特定の）アミノ酸配列を有する」とは、その酵素のアミノ酸配列が特定されたアミノ酸配列を含んでいればよく、且つ、その酵素の機能が維持されていることを意味する。その酵素において特定されたアミノ酸配列以外の配列としては、ヒスチジンタグや固定化のためのリンカー配列の他、－Ｓ－Ｓ－結合などの架橋構造などが挙げられる。
　本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素（２）において、「第５９、１６８、２３４および２９６番目のアミノ酸を除く領域」とは、Ｌ－トリプトファン脱水素酵素（１）または配列番号２のアミノ酸配列中、第１～５８番目、第６０～１６７番目、第１６９～２３３番目、２３５～２９５番目および第２９７番目以降の領域をいう。
　また、「１または数個のアミノ酸が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は、欠失等を有するＬ－トリプトファン脱水素酵素が、上記Ｌ－トリプトファンに対する基質特異性が高い脱水素酵素活性を有する限り特に限定されるものではない。前記「１から数個」の範囲は、上記Ｌ－トリプトファンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性を有するＬ－トリプトファン脱水素酵素である割合が高いことから、例えば、１個以上、３０個以下とすることができ、好ましくは１個以上、２０個以下、より好ましくは１個以上、１０個以下、さらに好ましくは１個以上、７個以下、一層好ましくは１個以上、５個以下、特に好ましくは１個以上、３個以下、１個以上、２個以下、１個程度であることができる。
　本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素（３）において、「上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して少なくとも７１％の配列同一性を有するアミノ酸配列」における「配列同一性」は、該アミノ酸配列の同一性を有するＬ－トリプトファン脱水素酵素が、上記Ｌ－トリプトファンに対する基質特異性が高い脱水素酵素活性を有する酵素である限り、特に限定されない。前記アミノ酸配列の配列同一性は７１％以上であれば特に限定されないが、好ましくは７２％以上、７３％以上、７４％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、８５％以上、９０％以上、より一層好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上である。本発明において「配列同一性」という語は、２以上のアミノ酸配列の互いに対するアミノ酸の同一性の程度を指す。従って、ある二つのアミノ酸配列の同一性が高い程、それらの配列の同一性ないし類似性は高い。２種類のアミノ酸配列が同一性を有するか否かは、配列の直接の比較によって解析することが可能であり、具体的には、市販の配列解析ソフトウェア等を用いて解析することができる。
　さらに、本発明において、「ただし、該Ｌ－トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列において上記第５９、１６８、２３４、２９６番目のアミノ酸配列に対応するアミノ酸は変異しないものとする」における「変異」とは、具体的にはアミノ酸の欠失または置換を意味する。つまり、上記Ｌ－トリプトファン脱水素酵素（３）のアミノ酸配列において、配列同一性の判断の基準となる上記（１）のＬ－トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列における第５９、１６８、２３４または２９６番目のアミノ酸に対応するアミノ酸が、上記（１）のＬ－トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列における第５９、１６８、２３４または２９６番目のアミノ酸と同一であることを意味する。
　上記Ｌ－トリプトファン脱水素酵素（３）のアミノ酸配列において、配列同一性の判断の基準となる上記Ｌ－トリプトファン脱水素酵素（１）のアミノ酸配列における第５９、１６８、２３４または２９６番目のアミノ酸に対応するアミノ酸は、上述した配列同一性ないし相同性の解析により調べることができる。具体的には、市販の配列解析ソフトウェア等を用いて、配列番号２に示されるアミノ酸配列または上記Ｌ－トリプトファン脱水素酵素（１）のアミノ酸配列に対して解析対象のアミノ酸配列のアライメント解析を行えば、上記第５９、１６８、２３４または２９６番目のアミノ酸に対応するアミノ酸を検索することが可能である。このようなアライメント解析の手法は当業者に広く知られている。
　本発明の上記Ｌ－トリプトファン脱水素酵素は、上記（１）から（３）に規定される範囲に属するものである限りその由来は特に限定されるものではない。例えば、本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素は、各種遺伝子工学的技術により製造した組換えタンパク質であってもよいし、化学合成により製造した合成タンパク質であってもよく、或いは配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＬ－トリプトファン脱水素酵素の遺伝子ホモログを有する特定の生物種（例えば、細菌）に変異原を与えることにより本発明の変異型酵素を産生し得る変異体を獲得して、該変異体が産生するタンパク質を抽出および精製することによって製造したタンパク質であってもよい。
　遺伝子工学技術により本発明の組換えタンパク質を製造する場合には、上記Ｌ－トリプトファン脱水素酵素（１）、（２）または（３）をコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を作製し、各種発現ベクターに組み込むことにより、本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素を発現させることができる。本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を作製するに当たり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における第５９、１６８、２３４もしくは２９６番目のアミノ酸または該アミノ酸に相応するアミノ酸を上記（１）に記載の所定のアミノ酸に置換するため、或いは上記Ｌ－トリプトファン脱水素酵素（２）のアミノ酸配列においてアミノ酸の欠失、置換および／または付加を施すため、或いは上記Ｌ－トリプトファン脱水素酵素（３）のアミノ酸配列において配列番号２のアミノ酸配列と所定の同一性を有するタンパク質をコードする核酸を準備するためには、例えば、エラープローンＰＣＲ法、ＤＮＡシャッフリング法、各種部位特異的変異導入法などにより、任意の塩基の欠失、置換および／または挿入を行うことができる。このようにして作製した本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を適当な発現系に導入することにより、本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素を製造することができる。
　本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素を製造するために利用可能な発現系としては、特に限定させるものではないが、例えば各種生物種（ホスト）において組換えタンパク質の発現を可能とする発現ベクターを利用することができる。利用可能な発現ベクターとしては、細菌や真菌類（例えば、酵母類）などの微生物、植物、昆虫細胞、哺乳類細胞などのホストにおいてタンパク質の発現を可能とする各種発現ベクターを用いることが可能であり、ウイルスベクター（ファージベクターを含む）でもプラスミドベクターであってもよい。或いは、ウサギ網状赤血球ライセート、小麦胚芽ライセート、大腸菌ライセート等を用いた無細胞タンパク質発現系を用いて、本発明のタンパク質を製造してもよい。
　特定の生物種をホストとして用いた発現系で本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素を発現させる場合には、上記本発明のタンパク質をコードする核酸をベクターに組み込む工程、当該ベクターによって宿主細胞を形質転換する工程、形質転換させた宿主細胞を培養する工程、培養物中に前記遺伝子がコードするタンパク質を蓄積し、蓄積したタンパク質を収集する工程を含む、製造方法により調製することができる。
　本発明のタンパク質をコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターにより形質転換された形質転換体は本発明の一態様である。これら核酸、ベクターおよび形質転換体は、本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列が決定されれば、当業者であれば常法に従って調製可能である。
　本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸の取得方法は特に限定されない。例えば、後記の実施例に記載の通り、ノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ　ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）から単離したＬ－トリプトファン脱水素酵素遺伝子（配列番号１）をコードする核酸を材料として本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を取得してもよいし、或いは本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素ないし配列番号２に記載のアミノ酸配列と相同性を有する遺伝子を各種細菌から単離し、該遺伝子をコードする核酸を調製して、上記第５９、１６８、２３４または２９６番目のアミノ酸に対応する塩基配列の置換を行って、本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を製造してもよい。また、本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸は、配列番号１に記載の塩基配列もしくは配列番号２に記載のアミノ酸配列、または配列番号１に記載の塩基配列と一定の同一性を有する公知の塩基配列もしくは配列番号２に記載のアミノ酸配列と一定の同一性を有する公知のアミノ酸配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法または突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
　配列番号２に示されるアミノ酸配列は、菌分譲機関から分譲されたノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ　ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）由来の野生型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列であるが、当該Ｌ－トリプトファン脱水素酵素には一定の相同性を示す遺伝子が多数知られている。例えば、かかる細菌由来の相同遺伝子に対応する酵素として、表１に示すものが知られている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　野生型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列、本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素である変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎのアミノ酸配列、並びに表１に示す既知酵素のアミノ酸配列についてアライメント解析を行った結果を図１に示す。図１において、矢印で示される位置のアミノ酸が上記第５９、１６８、２３４または２９６番目のアミノ酸に対応するアミノ酸である。図１に示される通り、上記野生型酵素と同様に表１に示される既知遺伝子は１６８以外、ロイシン、アラニン、イソロイシンである。本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列は、これら既知遺伝子の配列に基づいて設計してもよいし、その他公知のホモログ遺伝子の配列情報に基づいて設計してもよい。
　本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸は、具体的には、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。また、遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから、本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を製造する上で、核酸に部位特異的な変異を導入するために有用である。
　例えば、本明細書中の配列表の配列番号１に記載した塩基配列または配列番号２に示すアミノ酸配列の情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いてノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ　ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）を含む細菌のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を製造するための材料となる核酸を準備することができる。ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーは、常法により作製することができる。
　また、ＰＣＲ法により本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を製造するための材料を取得することもできる。例えば、ノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ　ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）株を含む細菌のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒～１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。増幅されたＤＮＡ断片は、本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を製造するための材料として用いることができる。さらに、増幅されたＤＮＡ断片を、次いで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることにより得られたベクターも本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を製造するための材料として用いることができる。
　上述の通り準備した、本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を製造するための材料において、上記第５９、１６８、２３４または２９６番目のアミノ酸に対応するアミノ酸をコードする塩基配列（コドン）に各種変異導入法を用いて塩基の置換を施し、本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸、または該核酸を含むベクターを製造することができる。なお、上記したプローブまたはプライマーの調製、ゲノムライブラリーの構築、ゲノムライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知である。
　本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸は適当なベクター中に挿入した状態で使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて上記核酸には、転写に必要な要素（例えば、プロモータ等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
　細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、ゲオバチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ　ａｍｙｌａｓｅ　ｇｅｎｅ）、バチルス・リケニホルミスα－アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　ａｌｐｈａ－ａｍｙｌａｓｅ　ｇｅｎｅ）、バチルス・アミロリケファチエンス・ＢＡＮアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　ＢＡＮ　ａｍｙｌａｓｅ　ｇｅｎｅ）、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｇｅｎｅ）もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕｓ　ｘｙｌｏｓｌｄａｓｅ　ｇｅｎｅ）のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰＲもしくはＰＬプロモータ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃ、ｔｒｐもしくはｔａｃプロモータなどが挙げられる。
　哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ－１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ２－４ｃプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
　また、上記ベクターにおいて、本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸は、必要に応じて、適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を含むベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）などの要素を有していてもよい。Ｌ－アミノ酸オキシダーゼの遺伝子を含む組換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
　本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を含むベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシンもしくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
　さらに、本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を含むベクターを適当な宿主に導入することによって、本発明の形質転換体を作製することができる。本発明のベクターを導入される宿主細胞は、細胞内で本発明のベクターが複製されるものであれば任意の細胞でもよい。さらに、本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素を発現する形質転換体を作製する場合には、ベクターの複製に加えて、言うまでもなく本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素の発現が可能となる任意の細胞である。このような宿主細胞の例としては、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
　細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌や大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法やその他の公知方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
　酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、またはシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）等が挙げられる。酵母宿主への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブプラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
　他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
　昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。
　バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
　昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
　組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法やリポフェクション法等を挙げることができる。
　上記の形質転換体は、本発明のベクターの複製を可能にする条件下、或いは本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素を発現させた場合、形質転換体の培養物（形質転換体および培養培地を含む）から、本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素を単離精製するには、通常のタンパク質の単離精製法を用いればよい。例えば、本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等の樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（ファルマシア社製）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素を精製標品として得ることができる。
　＜Ｌ－トリプトファンの定量方法＞
　本発明に係るＬ－トリプトファンの測定方法は：
　（Ａ）水とＮＡＤ+の存在下、上記本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素と検体とを保温する工程；および
　（Ｂ）上記Ｌ－トリプトファン脱水素酵素のＬ－トリプトファンに対する脱水素酵素活性により反応液中に生成される反応生成物の少なくとも一つを測定する工程
　を含むことを特徴とする。
　上記本発明方法には、検体中におけるＬ－トリプトファンの有無を判断するための検出方法と、検体中におけるＬ－トリプトファンの濃度や量を測定する定量方法などが含まれるものとする。以下、本発明方法を実施の順番に従って説明する。
　酵素反応工程（工程Ａ）
　本発明方法での測定対象となる検体は、Ｌ－トリプトファンを含む可能性のある試料であり、Ｌ－トリプトファンの有無を判断すべきものや、Ｌ－トリプトファンの濃度や量を測定すべきものであれば特に制限されない。例えば、血液、血清、血漿、臓器の一部のホモジェネート、尿などの生体試料を挙げることができる。さらに、例えば、生体試料に本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素を作用させて生じる、いかなる生成物を定量することで生体試料中のＬ－トリプトファンの濃度を測定するのか等により、生体試料は適宜選択することができる。例えば、発色剤や蛍光剤を利用して上記生成物を定量する場合には無色の水溶液であることが好ましく、血清や血漿などが例として挙げられる。
　生体試料などのように検体が様々な成分を含むものであり、その中に正確な測定を損なうものが含まれる場合には、検体からその様な成分を除去するよう前処理することもできる。
　例えば、後述するように、Ｌ－トリプトファン由来の酵素反応生成物やＮＡＤＨを測定することにより間接的にＬ－トリプトファンを測定する場合、当該酵素反応生成物やＮＡＤＨと同一または類似の物性を有する化合物が検体に含まれていると、正確な測定ができない場合がある。より具体的には、ＮＡＤＨは３４０ｎｍの波長光をよく吸収することから、ＮＡＤＨの測定には、３４０ｎｍの波長光の吸光度測定がよく用いられる。よって、ＮＡＤＨの吸光度を測定する予定であり且つ検体中に当該波長光を吸収する性質をもつ化合物が含まれている場合には、かかる化合物を事前に除去しておくことが好ましい。この他、発色や蛍光を測定する予定であり且つ用いる酵素や電子伝達体に影響を与える化合物が検体中に含まれている場合には、かかる化合物を事前に除去しておくことが好ましい。
　本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素によるＬ－トリプトファン（Ｌ－Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）の脱水素反応（酸化反応）を以下の反応式に示す。即ち、本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素は、下記反応を触媒する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　本工程では、水とＮＡＤ+の存在下、上記本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素と検体とを保温する。前記反応式に示すように、本発明に係る酵素反応においては、ＮＡＤ+を電子受容体としＬ－トリプトファンのα位の脱アミノ化が進行する。従って本発明における測定方法では、溶媒である水の存在下、試料溶液に含まれるＬ－トリプトファンの他、Ｌ－トリプトファン脱水素酵素とＮＡＤ+が含まれていれば上記反応は進行する。
　本発明方法で用いる水は、超純水、純水、精製水、蒸留水、イオン交換水など、上記酵素反応を阻害しないものであれば特に制限されない。また、検体が水を含むものであれば、その水を利用することができる。水の使用量は、検体の形態や検体中のＬ－トリプトファン濃度などにより適宜調整することができ、また、予備実験により決定してもよい。
　本発明により測定可能なＬ－トリプトファン濃度は、使用するＬ－トリプトファン脱水素酵素や、後述する工程（Ｂ）で用いる測定方法などに依存する。例えば後述の実施例に従いノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ　ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）菌由来の変異型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素を用い、３４０ｎｍの吸収によりＮＡＤＨを検出し、エンドポイント法でＬ－トリプトファンを定量する場合、実施例に示す通り本酵素には基質阻害が確認されるため、試料中のＬ－トリプトファン濃度としては、例えば、０ｍＭ以上、１ｍＭ以下が適当である。この範囲より高濃度の検体につき測定する場合には、適量の水を加えて反応溶液中のＬ－トリプトファン濃度をこの範囲に調整することが好ましい。
　ＮＡＤ+は、上記反応式のとおり、反応液中、測定すべきＬ－トリプトファンと等モル以上存在すればよい。よって、ＮＡＤ+の使用量も、水と同様に、検体の形態や検体中のＬ－トリプトファン濃度などにより適宜調整することができ、また、予備実験により決定してもよい。例えば、測定すべきＬ－トリプトファンの濃度が０～１ｍＭと比較的少ない生体試料などを検体とする場合などでは、反応液におけるＮＡＤ+を１ｍＭ以上、５０ｍＭ以下とすることができる。
　上記Ｌ－トリプトファン脱水素酵素は、基質特異性と親和性により、定量用酵素としての利用が制限される。例えば、後述の実施例に示すノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ　ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）のＬ－トリプトファン脱水素酵素の場合、トリプトファン以外のタンパク質構成アミノ酸とＤ－トリプトファンに対しては、活性が検出されない。一方、かかる特性により、Ｌ－トリプトファンの測定に適している。本発明に係るＬ－トリプトファン脱水素酵素は、かかる野生型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素に比べて安定性や活性が高いため、さらにＬ－トリプトファンの測定に適するものである。また、上記野生型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素のＬ－トリプトファンに対するＫｍ値は０．０７５９ｍＭであり、Ｌ－トリプトファン量が比較的少ない（０～１ｍＭ程度）生体試料などを対象としても使用可能である。このような観点から、反応液における本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素の混合量は、１０ｍＵ／ｍｌ以上、１００ｍＵ／ｍｌ以下程度の範囲とすることが適当である。
　さらに、Ｌ－トリプトファン脱水素酵素およびＮＡＤ+に加えて、好ましくは、反応液のｐＨをＬ－トリプトファン脱水素酵素の至適ｐＨやＮＡＤＨの安定性を考慮したｐＨに調整することができる緩衝液を添加することができる。さらに、Ｌ－トリプトファン脱水素酵素の安定化剤を添加することもできる。Ｌ－トリプトファン脱水素酵素の安定化剤としては、例えば、グリセロール、スクロース、ソルビトールおよびトレハロースから成る群から選ばれる少なくとも１種を挙げることができる。
　反応液のｐＨは、Ｌ－トリプトファン脱水素酵素に加えてＮＡＤＨの定量に酵素を用いる場合には、使用する酵素とその他の試薬の安定性、可溶性が許す範囲においていずれのｐＨでも可能であるが、好ましくはその酵素の至適ｐＨ付近で反応を行うことが望ましい。特に上述のノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ　ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）由来の変異型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素を用いる場合は、塩基性、例えばｐＨ８．５以上、１１．５以下が望ましい。
　本工程（Ａ）では、以上で説明した反応液を保温する。反応温度は適宜調整すればよいが、例えば、２０℃以上、５５℃以下とすることができ、５０℃以下がより好ましく、４５℃以下がさらに好ましい。反応時間も適宜調整できるが、例えば、１分間以上、１０時間以下程度とすることができる。
　測定工程（工程Ｂ）
　本工程（Ｂ）では、上記反応後の反応液中に存在する本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素の作用による反応生成物の少なくとも一種を測定する。かかる反応生成物としては、上記反応式のとおり、Ｌ－トリプトファンの脱アミノ化生成物である３－（１Ｈ－インドール－３－イル）－２－オキソプロパン酸（インドールピルビン酸）や、ＮＡＤ+の還元化物であるＮＡＤＨを挙げることができる。
　本発明においては、測定にはエンドポイント法を用いることができるが、この他に反応の初速度を用いる初速度法を用いることもできる。
　本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素によって触媒される反応でＮＡＤ+が変換されて生じるＮＡＤＨは、３４０ｎｍに極大吸収をもつことから、３４０ｎｍの波長光の吸光度測定により容易に測定する事が可能である。ＮＡＤＨの産生量は、化学量論的に反応によって消費されたＬ－トリプトファンと等モル量であることから、Ｌ－トリプトファンの測定に適している。
　ＮＡＤＨの検出法としては、３４０ｎｍの吸光度を測定するほか、発色性の電子受容体を用いることもできる。発色性電子受容体としては、２－（４－ｉｎｄｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－ｐｈｅｎｙｌ－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＩＮＴ）、レサズリン、フェロシアン化合物等を例として挙げることができる。これらの電子伝達体は、還元されることにより蛍光などを発するため、容易に測定することが可能である。またこの際、ＮＡＤＨからの電子伝達を触媒するジアホラーゼを共存させることもできる。
　また、ＮＡＤＨの検出法として、ＮＡＤＨを酸化する別の酵素を検出用試薬として用いることができる。かかる酵素としては、ＮＡＤＨオキシダーゼを挙げることができる。この場合、更に発色・蛍光試薬としてペルオキシダーゼを用いる必要がある。ペルオキシダーゼの例としては、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼを用いることができる。更に発色試薬としてペルオキシダーゼの基質を加えなければならない。ペルオキシダーゼの基質としては、２－アミノアンチピリン・フェノールやＡＢＴＳを挙げることができる。
　さらに、ＮＡＤＨの検出に電極を使用することもできる。検出には、前述の電子伝達体を単独で使用するか、ジアホラーゼやＮＡＤＨオキシダーゼと組み合わせることもできる。また、Ｌ－トリプトファン脱水素酵素、ジアホラーゼ，ＮＡＤＨオキシダーゼは、遊離の状態で使用する事もできるが、公知の方法により直接あるいは間接的に電極へ固定化することもできる。
　また、Ｌ－トリプトファンの脱アミノ化生成物（インドールピルビン酸）は、例えばＨＰＬＣなどにより測定することができる。その他、Ｌ－トリプトファンの脱アミノ化生成物は、クエン酸鉄アンモニウムなどに含まれる鉄イオンと結合して褐色の色調を帯びる。よって、Ｌ－トリプトファンの脱アミノ化生成物検出薬としてクエン酸鉄アンモニウムを用い、色調の変化を測定することにより、間接的に反応生成物を測定することができる。
　＜Ｌ－トリプトファンの測定用キット＞
　本発明に係るＬ－トリプトファンの測定用キットは、上記本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素とＮＡＤ+を含むことを特徴とする。
　本発明のキットにおいては、Ｌ－トリプトファン脱水素酵素は、当該酵素の安定化剤との混合物であることが好ましい。かかる混合物は、例えば、酵素１００質量部に対して、１０質量部以上、７０質量部以下の安定化剤を含むことが、酵素を長期間安定に保存できるという観点から好ましい。安定化剤の量は、好ましくは、酵素１００質量部に対して、２０質量部以上、６０質量部以下の範囲である。安定化剤は、例えば、グリセロール、スクロース、ソルビトールおよびトレハロースから成る群から選ばれる少なくとも１種である。
　ＮＡＤ+は、Ｌ－トリプトファン脱水素酵素による反応に必要な電子伝達体である。Ｌ－トリプトファン脱水素酵素は、ＮＡＤ+に依存する酵素である。このため、Ｌ－トリプトファンの２位の脱アミノ化は、ＮＡＤ+のＮＡＤＨへの変換と共役して起こる。従って、変換されて生じるＮＡＤＨは、消費されたＬ－トリプトファン量と化学量論的に等量である。
　本発明のキットは、さらに反応用緩衝液、ＮＡＤＨ検出試薬、およびＬ－トリプトファンの脱アミノ化生成物検出薬を含んでいてもよい。
　反応用緩衝液は、反応液を酵素反応に適したｐＨに維持するために用いられる。後述の実施例に示すノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ　ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）由来のＬ－トリプトファン脱水素酵素を含め、ほとんどのＮＡＤ+依存型脱水素酵素は、塩基性水溶液で高い活性を示す。このため使用する緩衝液は、中性より塩基性側のｐＨであることが望まれ、ｐＨ８．５以上、１１．５以下の緩衝液が好ましく、ｐＨ９．０以上の緩衝液がより好ましい。
　ＮＡＤＨ検出試薬は、ＮＡＤＨの検出を発色もしくは蛍光によって行う場合に必要となる。発色で検出を行う場合、例えばＩＮＴなどＮＡＤＨから直接電子を受け取ることができる発色試薬を用いることができる。また、ジアホラーゼやＮＡＤＨオキシダーゼを用いることにより間接的にＮＡＤＨから発色性物質へ電子を伝達させた発色反応を行うこともできる。ジアホラーゼと併用する発色もしくは蛍光性基質としては、レサズリンを挙げることができる。ＮＡＤＨオキシダーゼをＮＡＤＨ検出試薬として用いる場合、ＮＡＤＨオキシダーゼにより生じる過酸化水素を検出するため、ペルオキシダーゼおよびペルオキシダーゼに対する発色基質が必要となる。ＮＡＤＨオキシダーゼと併用する発色試薬の組み合わせとしては、西洋わさびペルオキシダーゼと２－アミノアンチピリン・フェノールの組み合わせを挙げることができる。
　＜酵素センサ＞
　本発明に係る酵素センサは、Ｌ－トリプトファンの測定用酵素センサであって、検出用電極の表面または近傍に本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素が配置されていることを特徴とする。この酵素センサで用いるＬ－トリプトファン脱水素酵素は、上記の本発明に係るＬ－トリプトファン脱水素酵素と同様である。
　本発明の酵素センサは、本発明のＬ－トリプトファン脱水素酵素がその表面または近傍に配置されているものであり、Ｌ－トリプトファンの測定に用いるものである。本発明の酵素センサは、Ｌ－トリプトファン脱水素酵素によりＬ－トリプトファン依存的に生成するＮＡＤＨを直接または間接的に定量的に検出できるものである。例えば、Ｌ－トリプトファン脱水素酵素に加え、ジアホラーゼなどのＮＡＤＨを検出用電極で感度良く検出するための酵素を、上記検出用電極と固定化の有無にかかわらず併用することもできる。前記Ｌ－トリプトファン脱水素酵素は、前記酵素の安定化剤と共に検出用電極の表面または検出用電極の近傍に配置されることが好ましい。前記安定化剤は、グリセロール、スクロース、ソルビトール及びトレハロースから成る群から選ばれる少なくとも１種であることができる。
　加えて、本発明の酵素センサは、上記酵素以外に、電子伝達物質やペルオキシダーゼなど検出に寄与する他のタンパク質を、上記検出用電極と固定化の有無に関わらず併用したものであることもできる。それ以外の構成は、公知の酵素センサで採用されている構成をそのまま、または適宜改変して利用することができる。
　本発明の酵素センサは、検体を含有する反応液に少なくとも検出用電極部分を浸漬し、Ｌ－トリプトファン脱水素酵素によりＬ－トリプトファン依存的に生産されるＮＡＤＨを直接あるいは間接的に電気化学的に検出する。
　本発明における酵素センサは、公知の酵素電極の基本的な構成にＬ－トリプトファン脱水素酵素を組み合わせたものであり、直接もしくは間接的にＬ－トリプトファン脱水素酵素および前述のＮＡＤＨ検出用酵素を固定化した酵素電極を用いる電極型酵素センサであることができる。さらに、この酵素電極の検出用電極付近に酵素，ＮＡＤＨと電極の間の電子の授受を容易にする電気化学メディエーターを存在させたものであることもできる。
　本願は、２０１３年２月２２日に出願された日本国特許出願第２０１３－３３７０６号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１３年２月２２日に出願された日本国特許出願第２０１３－３３７０６号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
　実施例１：　本発明酵素の調製
　（１）　天然型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素の調製
　シアノバクテリアであるノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ　ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）ＡＴＣＣ　２９１３３よりゲノムＤＮＡを調製し、データベース上にある同株のゲノムシーケンス（ＣＰ００１０３７）をもとに設計したプライマー１（５’－ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＴＧＣＴＡＴＴＴＧＡＡＡＣＴＧＴＴＡＧ－３’）（配列番号１０）およびプライマー２（５’－ＣＴＴＧＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＴＴＡＧＡＣ－３’）（配列番号１１）を用いたＰＣＲによりＬ－トリプトファン脱水素酵素遺伝子（ＮｐＲ１２７５）を増幅した。増幅産物をｐＴ７Ｂｌｕｅ　ｖｅｃｔｏｒに組み込み、コンピテントセル（タカラバイオ社製「Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９」）を宿主としてサブクローニングを行った。さらに、サブクローニングされたｐＴ７Ｂｌｕｅ－ＮｐＲ１２７５よりプライマー２およびプライマー３（５’－ＣＴＡＧＴＧＡＧＣＴＣＧＡＴＧＡＧＡＧＧＴＣＣＡＴＡＴＧＣＴＧＣＴＡＴＴＧ-３’）（配列番号１２）を用い、ＳａｃＩおよびＸｈｏＩの切断配列を導入したＰＣＲ産物を作製し、同制限酵素で処理したのち、同様の制限酵素で処理したベクター（メルクケミカルズ社製「ｐＥＴ２１（＋）」）とライゲーションし、コンピテントセル（バイオダイナミクス研究所社製「ＢＬ２１（ＤＥ３）」）に導入した。以下に記載の変異型酵素遺伝子ライブラリー作成のために、プライマー４（５’-ＡＴＡＴＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＡＴＧＡＧＡＧＧＴＣＣＡＴＡＴＧＣＴＧＣＴＡＴＴＴＧ－３’）（配列番号１３）とプライマー５（５’－ＣＴＴＴＧＴＴＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＴＣＴＣ－３’）（配列番号１４）を用いたＰＣＲによりＬ－トリプトファン脱水素酵素遺伝子をＣ末端の６残基のヒスチジンタグと共に増幅した。増幅産物は、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで制限酵素処理したのち、同様の制限酵素で処理したｐＵＣ１９　ＤＮＡ（タカラバイオ社製）とライゲーションし、コンピテントセル（タカラバイオ社製「Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９」）に導入した。このプラスミドは、発現されるタンパク質のＣ末端に６残基のヒスチジンタグが導入されるため、Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｎｉ－ＩＭＡＣを用いた精製が可能である。
　上記発現株［ＪＭ１０９／ｐＵＣＮｐＲ１２７５ｈｉｓ］を、アンピシリンを含むＬＢ培地（５００ｍＬ）に植菌後、３７℃で９０分、２５℃で６０分、１５℃で９０分培養したのち、終濃度０．４ｍＭのＩＰＴＧを加えて１５℃で２０時間培養した。培養液を６，０００×ｇで５分間遠心分離後、上清を取り除き、残渣に対し５倍量の２０ｍＭリン酸カリウムバッファーを加えて懸濁後、超音波ホモジナイザーにて細胞を破砕した。この破砕液を２０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液は、直ちにＢｉｏ－Ｒａｄ　Ｎｉ－ＩＭＡＣを用いて精製し、必要に応じて後述の安定化剤を加え、同様に安定化剤を含む２０ｍＭリン酸カリウムバッファーで透析し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ的に均一な酵素を得た。かかる野生型酵素をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。さらに、この酵素のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
　（２）　Ｌ－トリプトファン脱水素酵素の変異型酵素遺伝子ライブラリーの調製
　上記で構築したＬ－トリプトファン脱水素酵素遺伝子が導入された発現用プラスミドを鋳型として、変異導入のためのＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液の組成は、滅菌水２４．５μＬ、１００ｐｇ／μＬプライマー４　０．５μＬ、１００ｐｇ／μＬプライマー５　０．５μＬ、５００ｎｇ／ｍＬｐＵＣＮｐＲ１２７５ｈｉｓ　０．５μＬ、１０ｍＭｄＡＴＰ　１．０μＬ、１０ｍＭｄＧＴＰ　１．０μＬ、１０ｍＭ　ｄＴＴＰ　５．０μＬ、１０ｍＭ　ｄＣＴＰ　５．０μＬ、１０×ＰＣＲ緩衝液（－ＭｇＳＯ4）５．０μＬ、２５ｍＭ　ＭｇＳＯ4　１．０μＬ、５ｍＭ　ＭｎＣｌ2　４．０μＬ、Ｄｒｅａｍ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）１．０μＬとした。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９４℃で３０秒間、（ｉｉ）９４℃で２０秒間、（ｉｉｉ）５８℃で３０秒間、（ｉｖ）７２℃で２分間、（ｖ）（ｉｉ）～（ｉｖ）を２９サイクル行った。ＰＣＲ産物をＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで制限酵素処理し、同様に制限酵素処理を行ったｐＵＣ１０９にライゲーションした。
　（３）　Ｌ－トリプトファン要求株の調製
　大腸菌（タカラバイオ社製「Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９」）よりゲノムＤＮＡを調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型としてｔｒｐＢ遺伝子の前後配列をＰＣＲにより増幅した。ｔｒｐＢ遺伝子前部１０００ｂｐの増幅のために、プライマー６（５’－ＧＣＣＧＡＴＧＣＣＴＧＣＴＴＡＴＴＡＡＴＧＣＴＴＴＣＡＧＴＡ－３’）（配列番号１５）とプライマー７（５’－ＡＡＣＡＣＣＣＣＴＴＴＧＴＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＡＡＴＡＴＧＣ－３’）（配列番号１６）を用い、ｔｒｐＢ遺伝子前部１,０００ｂｐの増幅のために、プライマー８（５’－ＧＴＴＴＴＴＣＴＡＡＴＧＧＡＡＣＧＣＴＡＣＧＡＡＴＣＴＣＴＧ－３’）（配列番号１７）とプライマー９（５’－ＴＡＴＴＧＡＴＴＴＴＡＣＴＧＧＴＧＴＴＡＴＧＴＴＧＣＧＧＧＡ－３’）（配列番号１８）を用いた。ＰＣＲ反応液の組成は、滅菌水３０μＬ、１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ　５μＬ、２ｍＭ　ｄＮＴＰ　５μＬ、１００ｐｍｏｌプライマー６またはプライマー８　１μＬ、１００ｐｍｏｌプライマー７またはプライマー９　１μＬ、鋳型ＤＮＡ２μＬおよびＫＯＤ　Ｐｌｕｓ　１μＬとした。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９５℃で２分間、（ｉｉ）９５℃で２０秒間、（ｉｉｉ）５５℃で３０秒間、（ｉｖ）６５℃で４分間、（ｖ）（ｉｉ）～（ｉｖ）を３０回繰返した後、（ｖｉ）６５℃で５分間とした。同様にプライマー１０（５’－ＧＡＡＡＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＧＧＴＧＴＴＡＴＧＡＧＣＣＡＴＡ－３’）（配列番号１９）とプライマー１１（５’－ＴＡＧＣＧＴＴＣＣＡＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＧＡＧＣＡ－３’）（配列番号２０）を用いて、カナマイシン遺伝子を増幅した。得られた上記３つのＰＣＲ産物各々１０μＬと滅菌水７μＬ、１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　５μＬ、２ｍＭ　ｄＮＴＰ　５μＬ、１００ｐｍｏｌプライマー６　１μＬ、１００ｐｍｏｌプライマー９　１μＬおよびＫＯＤ　Ｐｌｕｓ　１μＬの組成で、上記と同様のＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を用いて、以下のトリプトファン要求株を作製した。
　大腸菌（タカラバイオ社製「Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９」）にエレクトロポレーション法を用いて、上記遺伝子断片を導入し、形質転換した。エレクトロポレーション法の手順は以下の通りである。大腸菌ＪＭ１０９　４０μＬに対し、上記遺伝子断片１μＬを混合し、エレクトロポレーション用キュベット（１ｍｍ）に分注した。その後、１,２００Ｖ、１２９Ωの条件でエレクトロポレーションを行った後、ＬＢ液体培地を１ｍｌ添加し、３７℃で１時間保温した。カナマイシン入りのプレートに塗布し、３７℃で、１６時間培養を行った。
　得られたコロニーをカナマイシン入りＭ９寒天培地に植菌した。同様のコロニーをカナマイシン・トリプトファン入りＭ９寒天培地に植菌し、各々３７℃で、１２時間振盪培養した。トリプトファンの入ったプレートのみに生えたコロニーをトリプトファン要求株として、以下の操作に用いた。ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）およびＤＮＡシーケンサー３１０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、ＤＮＡシーケンサーにより、ｔｒｐＢの欠落を確認した。
　（４）　形質転換
　上記（２）で得られたプラスミドを、上記（３）で得られた大腸菌トリプトファン要求株にヒートショック法により導入し、形質転換した。ヒートショック法の手順は以下の通りである。大腸菌ΔｔｒｐＢ５０μＬに対し、プラスミド５μＬを混合し、６０分間、氷上静置した。その後、４２℃で９０秒間のヒートショックを行った後、ＬＢ液体培地を１ｍＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。アンピシリン・カナマイシン・インドールピルビン酸入りのＭ９液体培地に植菌し、３７℃で１４時間培養した。
　上記培養系において、生育の早い変異型酵素発現株（トリプトファン要求株）は、インドールピルビン酸からトリプトファンの供給能力が高いと考えられる。即ち、トリプトファンの前駆体であるインドールピルビン酸からトリプトファンへの活性が高いトリプトファン脱水素酵素変異型酵素を有する菌株の培養速度が速いと考えられる。
　同様の培地を用いて３回継代培養を行った後に、アンピシリン・カナマイシン入りＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で１６時間培養した。
　得られたコロニーをランダムに選び、ＤＮＡシーケンサーを用いてＤＮＡ配列を解読した結果、多くのコロニーのトリプトファン脱水素酵素遺伝子において、第５９番目のロイシンがフェニルアラニンに、第１６８番目のアスパラギン酸がグリシンに、第２３４番目のアラニンがアスパラギン酸に、第２９６番目のイソロイシンがアスパラギンに置換されていた。得られた塩基配列を配列番号３に、得られたアミノ酸配列を配列番号４に示す。
　試験例１：　酵素活性測定
　上記実施例１で得られた変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎについて温度の影響を調べるために、ｐＨ１０．５において、Ｌ－トリプトファン脱水素酵素活性を測定した。具体的には、先ず、各々の酵素を各温度で３０分間保温した。別途、以下の組成のＬ－トリプトファン脱水素酵素活性測定用試薬を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　上記測定用試薬にＬ－トリプトファン脱水素酵素を最終濃度が０．１Ｕになるように添加し、反応液の全量（１ｍＬ）を１ｃｍ石英セルに加え、生成したＮＡＤＨを３４０ｎｍの吸光度変化により測定した。得られた吸光度変化により、下記計算式に基づきＬ－トリプトファン脱水素酵素活性を算出した。尚、上記条件で１分間に１マイクロモルの基質を与える酵素量を１Ｕとした。得られた吸光度変化より、下記計算式に基づきＬ－トリプトファン脱水素酵素の活性を算出した。
　　活性値（Ｕ／ｍｌ）＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤｔｅｓｔ－ΔＯＤｂｌａｎｋ）×Ｖｔ×希釈倍率｝／（６．２２×１．０×Ｖｓ）
　Ｖｔ（ｍＬ）：　全量
　６．２２：　ＮＡＤＨのミリモル分子吸光係数（ｃｍ2／ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）
　１．０：　セルの光路長（ｃｍ）
　Ｖｓ（ｍＬ）：　酵素サンプル液量
　野生型酵素と変異型酵素のそれぞれについて、温度による影響を図２と図３に示す。図２は縦軸に活性を、図３は縦軸を２５℃の各々の活性を１００％とした時の相対活性を示す。
　図２に示される通り、変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎは野生型酵素と比較して、活性が１０倍上昇した。また、図３に示される通り、野生型酵素では４０℃付近以上で活性の著しい減少が見られたが、変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎでは、５０℃付近まで熱処理後も５０％以上の活性の維持が見られた。
　試験例２：　酵素活性の安定性試験
　変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎについて安定性を調べるために、４℃でグリセロールを添加していない条件で保持し、経時的に活性を測定した。野生型酵素と変異型酵素のそれぞれについて、経時的に活性を測定した結果を、図４と図５に示す。
　図４に示される通り、変異型酵素は比活性が１０倍上昇していることが明らかである。図５は図４の縦軸の０時間目を１００％とした相対活性を示している。野生型酵素は、２４時間後にはグリセロールの無い条件では、２０％以下に減少していることが明らかである。しかし、変異型酵素は、２４時間後も９０％以上の活性を維持していた。
　試験例３：　酵素活性測定
　温度を３７℃に固定し、上記試験例１と同様の条件で、野生型酵素と変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎの脱水素酵素活性を測定した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　野生型酵素と変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎの活性を比較した結果、表３に示すように、約１０倍の活性の上昇が見られた。
　実施例２：　本発明酵素の調製
　上記に得られた変異型酵素の各変異箇所の効果を調査するために、野生型酵素に各々一点変異を導入した。上記で構築した野生型酵素遺伝子が導入された発現用プラスミドを鋳型として、変異導入のためのＰＣＲを行った。変異型酵素Ｌ５９Ｆ調製のためのＰＣＲ反応には、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた。ＰＣＲ反応液の組成は、滅菌水（ＭｉｌｌｉＱ）１６．５μＬ、１０×ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ　２．５μＬ、１００ｎｇ／μＬ鋳型ＤＮＡ　１．０μＬ、１００ｎｇ／μＬプライマー１２（５’－ｇｃｔｔｔａａａａｇａｔｇｃａｔｔｔｃｇｔｃｔｃａｇｔｃｇｇｇ－３’）（配列番号２１）１．２５μＬ、１００ｎｇ／μＬプライマー１３（５’－ｃｃｃｇａｃｔｇａｇａｃｇａａａｔｇｃａｔｃｔｔｔｔａａａｇｃ－３’）（配列番号２２）１．２５μＬ、ｄＮＴＰ　ｍｉｘ　１．０μＬ、Ｑｕｉｋ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ　１．５μＬ、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　Ｅｎｚｙｍｅ　１．０μＬとした。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９５℃で２分間、（ｉｉ）９５℃で２０秒間、（ｉｉｉ）６０℃で１０秒間、（ｉｖ）６８℃で４分間、（ｖ）（ｉｉ）～（ｉｖ）を１７回繰り返した後、（ｖｉ）６８℃で５分間とした。ＰＣＲ産物に、２．０μＬの制限酵素（ＤｐｎＩ）を加え３７℃で５分間放置した（サンプル１）。同様にして、変異型酵素Ｄ１６８Ｇ調製のためのＰＣＲ反応には、１００ｎｇ／μＬプライマー１４（５’－ＡＧＡＧＣＡＡＡＡＧＡＣＴＴＧＡＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＴＴＧＣ－３’）（配列番号２３）１．２５μＬと、１００ｎｇ／μＬプライマー１５（５’－ＧＣＡＡＣＴＴＴＣＡＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＴＣＴＴＴＴＧＣＴＣＴ－３’）（配列番号２４）１．２５μＬを用いて、上記の処理を行った（サンプル２）。変異型酵素Ａ２３４Ｄ調製のためのＰＣＲ反応には、１００ｎｇ／μＬプライマー１６（５’－ＴＣＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＧＣＧＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＴ－３’）（配列番号２５）１．２５μＬと、１００ｎｇ／μＬプライマー１７（５’－ＡＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＣＡＧＡＴＣＧＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＧＡ－３’）（配列番号２６）１．２５μＬを用いて、上記の処理を行った（サンプル３）。変異型酵素Ｉ２９６Ｎ調製のためのＰＣＲ反応には、１００ｎｇ／μＬプライマー１８（５’－ＧＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡＡＴＧＡＡＴＧＧＴＴＡＴＧＡＣＧＡＡＧ－３’）（配列番号２７）１．２５μＬと、１００ｎｇ／μＬプライマー１９（５’－ＣＴＴＣＧＴＣＡＴＡＡＣＣＡＴＴＣＡＴＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＡＣ－３’）（配列番号２８）１．２５μＬを用いて、上記の処理を行った（サンプル４）。
　サンプル１、サンプル２、サンプル３、およびサンプル４を用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、野生型酵素と同様に培養、精製した変異型酵素を用いて、Ｌ－トリプトファン脱水素酵素活性の比較をした。その結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　表４に示されるように、野生型酵素と比較した際に、変異型酵素Ｌ５９Ｆは熱安定性が上昇していることが確認された。さらに、変異型酵素Ｄ１６８Ｇと変異型酵素Ｉ２９６Ｎは、２４時間後の残存活性が高いことから、グリセロールの無い条件での安定性の上昇が確認された。さらに、変異型酵素Ａ２３４Ｄは、比活性が上昇していることが確認された。また、これらの残基における他のアミノ酸の影響を調べるために、以下の処理を行った。
　変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎに対して、各々の変異箇所に他の１９種類のアミノ酸変異を導入し、変異型酵素の活性の向上を調べた。変異型酵素遺伝子が導入された発現用プラスミドを鋳型として、変異導入のためのＰＣＲを行った。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、鋳型ＤＮＡとして変異型酵素遺伝子を用いて、上記同様の手法を用いて行った。５９番目のロイシンの変異導入には、プライマー２０（５’－ＧＣＴＴＴＡＡＡＡＧＡＴＧＣＡＮＮＳＣＧＴＣＴＣＡＧＴＣＧＧＧＧＣ－３’）（配列番号２９）とプライマー２１（５’－ＧＣＣＣＣＧＡＣＴＧＡＧＡＣＧＳＮＮＴＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＡＡＧＣ－３’）（配列番号３０）を用いて、上記の処理を行った（サンプル５）。１６８番目のアスパラギン酸の変異導入には、プライマー２２（５’－ＣＡＧＡＧＣＡＡＡＡＧＡＣＴＴＮＮＳＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＴＴＧＣＡ－３’）（配列番号３１）とプライマー２３（５’－ＴＧＣＡＡＣＴＴＴＣＡＴＣＣＣＳＮＮＡＡＧＴＣＴＴＴＴＧＣＴＣＴＧ－３’）（配列番号３２）を用いて、上記の処理を行った（サンプル６）。２３４番目のアラニンの変異導入には、プライマー２４（５’－ＡＴＣＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＧＣＮＮＳＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＴＣＣＴＴ－３’）（配列番号３３）とプライマー２５（５’－ＡＡＧＧＡＴＴＣＣＴＣＣＣＡＧＳＮＮＧＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＧＡＴ－３’）（配列番号３４）を用いて、上記の処理を行った（サンプル７）。２９６番目の変異導入には、プライマー２６（５’－ＧＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡＡＴＧＮＮＳＧＧＴＴＡＴＧＡＣＧＡＡＧＡＡ－３’）（配列番号３５）とプライマー２７（５’－ＴＴＣＴＴＣＧＴＣＡＴＡＡＣＣＳＮＮＣＡＴＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＡＣ－３’）（配列番号３６）を用いて、上記の処理を行った（サンプル８）。
　サンプル５、サンプル６、サンプル７、およびサンプル８を用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢアンピシリンプレートに植菌した。９６穴ディープウェルに１００μＬ／ｍＬのアンピシリン入りのＬＢ液体培地を３００μＬずつ分注し、コロニーピッカーを用いて、得られたコロニーを各ウェルの培地に植菌した。植菌後、振盪機を用いて、３００ｒｐｍ、３７℃で１２時間培養後、ＩＰＴＧ７．５ｍＭを２０μＬ添加し、再度１６℃で１２時間の振盪培養を行った。培養後、２，５００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離することにより集菌を行った。各々の菌体を、１０ｍＭ　ＫＰＢ（ｐＨ７．０）２００μＬに懸濁し、９６穴丸底プレートに移し替え、８連超音波破砕機により菌体破砕（ｏｕｔｐｕｔ３，３０秒間）を行った。同様の条件で遠心分離後、得られた上清を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液５０μＬの脱水素酵素活性を、上記試験例１と同様にして、Ｌ－トリプトファンを基質として活性を測定した。２４時間後の残存活性が高いものをＬＢ液体培地で培養し、プラスミドを調製し、各々の変異箇所のアミノ酸を確認した。また、培養、精製した変異型酵素を用いて、精製後と一週間後の脱水素酵素活性の比較をした。その結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 　表５に示されるように、５９番目のロイシンがプロリンに変異されても、変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎと同様に、残存活性が高いことが確認された。さらに、１６８番目のアスパラギン酸において、リジン、ロイシンおよびグルタミン酸に変異されても、変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎと同様に、残存活性が高いことが確認された。さらに、２３４番目のアラニンにおいて、フェニルアラニン、スレオニンおよびリジンに変異されても、変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎと同様に、残存活性が高いことが確認された。
　試験例４：　酵素活性測定
　上記変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎについて、様々な濃度のＬ－トリプトファンの水溶液を用いて、脱水素酵素活性の測定を行った。調製した水溶液に、最終濃度０、２５、５０、７５、１００、１２５または１５０μＭとなるようにＬ－トリプトファンを添加し、Ｌ－トリプトファン水溶液とした。測定試薬の組成と測定方法は、上記試験例１の通りであり、反応条件はグリセロールの存在下または不存在下、ｐＨ７．０で３７℃とした。グリセロール不存在下での野生型酵素の結果を図６に、２０％グリセロール存在下での野生型酵素の結果を図７に、グリセロール不存在下での変異型酵素の結果を図８に示す。
　図６に示されるように、野生型酵素（グリセロール無し）を用いた際には、熱に対する安定性が低いこともあり、各時間のエンドポイントを用いた検量線にばらつきが生じた。また、二日後同様に測定した際には、活性が失われ、測定できない結果となった。さらに、図７に示されるように、野生型酵素（２０％グリセロール）を用いた際には、グリセロールの影響で、ベースラインの上昇が見られた。図８に示されるように、上記変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎを用いた際には、各時間のエンドポイントを用いた検量線にばらつきが生じず、グリセロールを添加していないため、ベースラインの上昇なども見られなかった。
　試験例５：　生体サンプルを用いた酵素活性測定
　上記変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎについて、Ｌ－トリプトファンを添加したヒト血漿サンプルを用いて脱水素酵素活性の測定を行った。調製したヒト血漿に、最終濃度０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０μＭとなるようにＬ－トリプトファンを添加し血漿サンプルとした。測定試薬の組成及び測定方法は、上記（１）及び（２）に示す通りであり、反応条件はｐＨ７．０、３０℃とした。結果を図９に示す。
　変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎにおいては、図９に示される通り、Ｌ－トリプトファン対して脱水素酵素活性が検出され、直線的な検量線を描くことが可能であった。
　上記試験例により、本発明による変異型酵素を用いれば、臨床サンプルのＬ－トリプトファンを正確に検出又は定量できることが示された。
　試験例６：　基質特異性試験
　上記実施例２において精製した本発明に係る変異型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素（Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎ）について、試験例１の活性測定法に基づき、Ｌ－トリプトファンを含む１８種の天然アミノ酸とＤ－トリプトファンに対するトリプトファン脱水素酵素活性の測定を行った。結果を図１０に示す。
　図１０のとおり、本発明に係る変異型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素（Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎ）は、Ｌ－トリプトファン以外のアミノ酸に対して脱水素酵素活性を全く示さず、Ｌ－トリプトファンにのみ特異的に活性を示すことが明らかとなった。従って、本発明に係る変異型Ｌ－トリプトファン脱水素酵素はＬ－トリプトファンに対する特異性が極めて高いので、当該酵素を用いれば、血液など他のアミノ酸を含む試料においても、Ｌ－トリプトファンを精度良く、簡便、迅速に測定することが可能となる。

Claims (10)

  1. 　下記（１）～（３）の何れかのＬ－トリプトファン脱水素酵素。
    　（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第５９番目のロイシンがフェニルアラニンまたはプロリンで、第１６８番目のアスパラギン酸がグリシン、グルタミン酸、ロイシンまたはリジンで、第２３４番目のアラニンがアスパラギン酸、リジン、フェニルアラニン、スレオニンまたはアラニンで、第２９６番目のイソロイシンがアスパラギンで置換されたアミノ酸配列を有するＬ－トリプトファン脱水素酵素；
    　（２）上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第５９、１６８、２３４および２９６番目のアミノ酸を除く領域中で１または数個のアミノ酸が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有するＬ－トリプトファン脱水素酵素であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＬ－トリプトファン脱水素酵素と比較してＬ－トリプトファンに対する脱水素酵素活性が維持されているか或いは高いＬ－トリプトファン脱水素酵素；または
    　（３）上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して少なくとも７１％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＬ－トリプトファン脱水素酵素と比較してＬ－トリプトファンに対する脱水素酵素活性が維持されているか或いは高いＬ－トリプトファン脱水素酵素（ただし、該Ｌ－トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列において上記第５９、１６８、２３４、２９６番目のアミノ酸配列に対応するアミノ酸は変異しないものとする）。
  2. 　請求項１に記載のＬ－トリプトファン脱水素酵素をコードすることを特徴とする核酸。
  3. 　請求項２に記載の核酸を含むベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
  4. 　Ｌ－トリプトファンを測定するための方法であって：
    　（Ａ）水とＮＡＤ+の存在下、請求項１に記載のＬ－トリプトファン脱水素酵素と検体とを保温する工程；および
    　（Ｂ）上記Ｌ－トリプトファン脱水素酵素のＬ－トリプトファンに対する脱水素酵素活性により反応液中に生成される反応生成物の少なくとも一つを測定する工程
    　を含むことを特徴とする方法。
  5. 　工程（Ｂ）において測定する反応生成物がＮＡＤＨである、請求項４に記載の方法。
  6. 　吸光度計を用いてＮＡＤＨを測定する、請求項５に記載の方法。
  7. 　工程（Ｂ）において測定する反応生成物がＬ－トリプトファンの脱アミノ化生成物である、請求項４に記載の方法。
  8. 　請求項１に記載のＬ－トリプトファン脱水素酵素とＮＡＤ+を含むことを特徴とするＬ－トリプトファンの測定用キット。
  9. 　反応用緩衝液、ＮＡＤＨ検出試薬、およびＬ－トリプトファンの脱アミノ化生成物検出薬の少なくとも一つをさらに含む請求項８に記載のキット。
  10. 　Ｌ－トリプトファンの測定用酵素センサであって、検出用電極の表面または近傍に請求項１に記載のＬ－トリプトファン脱水素酵素が配置されていることを特徴とする酵素センサ。
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