KR102157502B1 - 변형된 글리신 옥시다제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 글리신 농도의 측정에 유용한 수단 및 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은, 글리신의 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 특성(예를 들면, 글리신 대한 글리신 옥시다제의 활성, 글리신 옥시다제의 열 안정성 및 글리신 대한 글리신 옥시다제의 기질 특이성)을 개선하도록 적어도 하나의 아미노산 잔기를 돌연변이시킨, 변형된 효소; 및 상기 변형된 효소를 사용하여 시험 샘플 중에 함유된 글리신을 측정함을 포함하는, 글리신의 분석 방법 등을 제공한다.

Description

변형된 글리신 옥시다제{MODIFIED GLYCINE OXIDASE}
본 발명은 변형된 글리신 옥시다제, 변형된 글리신 옥시다제를 사용하여 글리신을 분석하는 방법 등에 관한 것이다.
아미노산은 생체에서 구성요소로서 매우 중요하고 일부 아미노산은 건강 상태의 지표가 될 수 있음이 공지된다. 예를 들면, 혈장에서 글리신의 농도는 비만과 관련이 있다는 것을 시사했다(비특허 문헌 1). 글리신은 다양한 식품 중에 천연적으로 함유될 뿐만 아니라 식품 첨가물로서 사용된다. 따라서, 아미노산, 특히 글리신의 측정은 생체 연구, 건강 영양, 의료 및 식품 제조와 같은 광범위한 분야에서 중요한 의의를 갖는다.
아미노산 분석기, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 LC-MS와 같은 기기를 사용한 분석은 글리신을 포함하는 아미노산을 분석하는 방법으로서 널리 사용된다. 그러나, 이들 기기는 대형이고 고가이고, 기기의 유지 및 조작을 위한 전문 지식 및 숙달을 필요로 하고, 따라서, 도입, 유지 및 이용을 위해 고액의 비용이 필요하다. 또한, 원리상, 각각의 시험편을 순차적으로 분석하는 것이 필요하기 때문에 다수의 시험편을 분석하는데 오랜 시간이 걸린다. 이들 문제를 해결하기 위해, 특정 아미노산에 대한 특정 반응을 촉매하는 효소를 사용하는 아미노산의 분석 방법이 개발되었고, 일부 아미노산을 측정하기 위한 키트가 판매되고 있다. 또한, 효소를 이용하여 전기화학적으로 또는 광학적으로 특정한 아미노산을 측정하기 위한 바이오센서가 실현되었다(예를 들면, 특허 문헌 1, 비특허 문헌 2 내지 4).
글리신에 작용하는 효소로서 글리신 옥시다제가 공지되어 있다(예를 들면, 비특허 문헌 5).
특허 문헌 1: 국제 공보 WO2005/075970
비특허 문헌 1: P. Felig, E. Marliss, G. F. Cahill Jr. (1969) N. Engl. J. Med. 281, 811-816. 비특허 문헌 2: A. Guerrieri, T. R. I. Cataldi, R. Ciriello. (2007) Sens. Actuators B Chem. 126, 424-430. 비특허 문헌 3: H. Olschewski, A. Erlenkotter, C. Zaborosch, G. -C. Chemnitius. (2000) Enzyme Microb. Technol. 26, 537-543. 비특허 문헌 4: H. Endo, Y. Hayashi, Y. Kitani, H. Ren, T. Hayashi, Y. Nagashima. (2008) Anal. Bioanal. Chem. 391, 1255-1261. 비특허 문헌 5: L. Caldinelli, M. Pedotti, L. Motteran, G. Molla, L. Pollegioni (2009) Biochimie 91, 1499-1508. 비특허 문헌 6: S. E. Carpenter, D. J. Merkler (2003) Anal. Biochem. 323, 242-246.
상기 효소를 사용한 상기 언급된 아미노산 측정에서, 아미노산 측정과 관련된 효소의 특성(예를 들면, 효소의 활성, 안정성 및 기질 특이성)이 우수한 것이 바람직하다. 특히 활성에 대해, 혈중 아미노산과 같이, 시험편에서 검출되는 대상의 농도가 낮은 경우, 기질 농도가 낮은 조건 하에서는 높은 활성을 필요로 한다. 글리신-함유 시험편을 분석하는데 글리신 옥시다제를 이용하는 것이 유망하지만, 지금까지 성질이 알려진 글리신 옥시다제는 활성 및 안정성이 낮다(예를 들면, 비특허 문헌 6)는 것이 문제였다. 또한, 많은 종류의 아미노산에 대한 기질 특이성도 조사되지 않았다. 상기 기재된 바와 같이, 글리신의 측정에 실용적으로 이용될 수 있는 효소가 없다. 따라서, 효소를 이용한 글리신의 실용적 측정 방법도 글리신 측정용 키트 및 바이오센서도 실현되지 않았다.
본 발명자들은, 예의 검토한 결과, 글리신 측정과 관련하여 개선된 특성을 갖는 효소의 사용에 의해 글리신 농도만을 측정해야 한다는 점에 착상하였고, 이러한 개선된 특성을 갖는 글리신 옥시다제를 개발하는데 성공하였고, 따라서 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명은 다음과 같다.
[1] 글리신의 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 하나 이상의 특성을 개선하도록 적어도 하나의 아미노산 잔기가 돌연변이되는, 변형된 효소로서, 상기 하나 이상의 특성이 하기:
(a) 글리신에 대한 글리신 옥시다제의 활성;
(b) 글리신 옥시다제의 열 안정성; 및
(c) 글리신에 대한 글리신 옥시다제의 기질 특이성
로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 변형된 효소.
[2] 항목 [1]에 있어서, 상기 돌연변이가 글리신 옥시다제의 아미노산 서열 중의 (a) TTS 모티프 중 제1 트레오닌의 치환, (b) TTS 모티프 중 세린의 치환, (c) HCY 모티프 중 시스테인의 치환, (d) LRP 모티프 중 류신의 치환, (e) GML 모티프 중 메티오닌의 치환, (f) SG 모티프 중 세린의 치환, 및 (g) PGT 모티프 중 글리신의 치환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환인, 변형된 효소.
[3] 항목 [2]에 있어서, 상기 TTS 모티프 중 상기 제1 트레오닌이 알라닌, 세린, 시스테인 또는 글리신으로 치환되는, 변형된 효소.
[4] 항목 [2] 또는 [3]에 있어서, 상기 TTS 모티프 중 세린이 리신으로 치환되는, 변형된 효소.
[5] 항목 [2] 내지 [4] 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 HCY 모티프 중 시스테인이 알라닌, 아스파르트산, 글리신, 히스티딘, 아스파라긴, 트립토판, 티로신 또는 세린으로 치환되는, 변형된 효소.
[6] 항목 [2] 내지 [5] 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 LRP 모티프 중 류신이 이소류신, 발린, 시스테인, 트레오닌 또는 프롤린으로 치환되는, 변형된 효소.
[7] 항목 [2] 내지 [6] 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 GML 모티프 중 메티오닌이 이소류신으로 치환되는, 변형된 효소.
[8] 항목 [2] 내지 [7] 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 SG 모티프 중 세린이 아르기닌으로 치환되는, 변형된 효소.
[9] 항목 [2] 내지 [8] 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 PGT 모티프 중 글리신이 티로신 또는 글루타민으로 치환되는, 변형된 효소.
[10] 항목 [1] 내지 [9] 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 글리신 옥시다제가 바실러스(Bacillus) 속으로부터 유래하는, 변형된 효소.
[11] 항목 [1] 내지 [10] 중 어느 한 항목에 있어서, 하기 (1) 또는 (2)의 단백질인, 변형된 효소:
(1) 서열 번호:2의 아미노산 서열에서 상기 TTS 모티프 중 제1 트레오닌, 상기 TTS 모티프 중 세린, 상기 HCY 모티프 중 시스테인, 상기 LRP 모티프 중 류신, 상기 GML 모티프 중 메티오닌, 상기 SG 모티프 중 세린, 및 상기 PGT 모티프 중 글리신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 하기 (i) 내지 (vii)의 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기들로 치환되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질:
(i) 상기 TTS 모티프 중 제1 트레오닌의 치환의 경우
알라닌, 세린, 시스테인 또는 글리신;
(ii) 상기 TTS 모티프 중 세린의 치환의 경우
리신;
(iii) 상기 HCY 모티프 중 시스테인의 치환의 경우
알라닌, 아스파르트산, 글리신, 히스티딘, 아스파라긴, 트립토판, 티로신 또는 세린;
(iv) 상기 LRP 모티프 중 류신의 치환의 경우
이소류신, 발린, 시스테인, 트레오닌 또는 프롤린;
(v) 상기 GML 모티프 중 메티오닌의 치환의 경우
이소류신;
(vi) 상기 SG 모티프 중 세린의 치환의 경우
아르기닌; 및
(vii) 상기 PGT 모티프 중 글리신의 치환의 경우
티로신 또는 글루타민; 또는
(2) 서열 번호:2의 아미노산 서열에서 상기 TTS 모티프 중 제1 트레오닌, 상기 TTS 모티프 중 세린, 상기 HCY 모티프 중 시스테인, 상기 LRP 모티프 중 류신, 상기 GML 모티프 중 메티오닌, 상기 SG 모티프 중 세린, 및 상기 PGT 모티프 중 글리신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 상기 (i) 내지 (vii)의 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기들로 치환된 아미노산 서열에서 하나 또는 몇몇의 아미노산 잔기의 추가 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하고,
(a) 글리신에 대한 글리신 옥시다제의 활성;
(b) 글리신 옥시다제의 열 안정성; 및
(c) 글리신에 대한 글리신 옥시다제의 기질 특이성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 특성이 개선된 단백질.
[12] 항목 [1] 내지 [11] 중 어느 한 항목의 변형된 효소를 사용하여 시험 샘플에 함유된 글리신을 측정함을 포함하는 글리신의 분석 방법.
[13] 항목 [12]에 있어서, 상기 글리신의 측정을, 항목 [1] 내지 [11] 중 어느 한 항목의 변형된 효소에 추가하여, 4-아미노안티피린 및 페놀, 및 퍼옥시다제를 사용하여 수행하는, 방법.
[14] 항목 [1] 내지 [11] 중 어느 한 항목의 변형된 효소를 사용하여 글리신으로부터 글리옥실산을 형성함을 포함하는 글리옥실산의 제조 방법.
[15] 항목 [1] 내지 [11] 중 어느 한 항목의 변형된 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
[16] 항목 [15]의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
[17] 항목 [16]의 발현 벡터를 포함하는 형질전환체.
[18] 적어도 하나의 아미노산 잔기가 글리신의 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 특성을 개선하도록 돌연변이된 변형된 효소의 제조 방법으로서, 항목 [17]의 형질전환체를 사용하여 상기 변형된 효소를 형성함을 포함하는, 변형된 효소의 제조 방법.
[19] 항목 [1] 내지 [11] 중 어느 한 항목의 변형된 효소를 포함하는 글리신 분석용 키트.
[20] 항목 [19]에 있어서, 반응용 완충 용액 또는 완충 염, 과산화수소 검출 시약, 암모니아 검출 시약 및 글리옥실산 검출 시약 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 글리신 분석용 키트.
[21] (a) 장치 및 (b) 항목 [1] 내지 [11] 중 어느 한 항목의 변형된 효소를 포함하는 글리신 분석용 검출 시스템.
[22] 항목 [21]에 있어서, (c) 반응용 완충 용액 또는 완충 염, 과산화수소 검출 시약, 암모니아 검출 시약 및 글리옥실산 검출 시약 중 적어도 하나를 추가로 포함하고, 상기 장치가 마이크로채널(microchannel) 칩인, 글리신 분석용 검출 시스템.
[23] (a) 검출용 전극 및 (b) 검출용 전극에 고정 또는 배치된 항목 [1] 내지 [11] 중 어느 한 항목의 변형된 효소를 포함하는, 글리신 분석용 효소 센서.
본 발명의 변형된 효소는, 글리신에 대한 활성을 향상시키기 때문에, 글리신의 신속하고 고감도 측정 및/또는 글리옥실산의 제조에 유용하다. 본 발명의 변형된 효소는 또한 수용액에서 열 안정성이 우수하기 때문에 안정성이 우수하다. 따라서, 본 발명의 변형된 효소는 특히 액상 시약으로 유용하다. 추가로, 본 발명의 변형된 효소는 글리신에 대한 기질 특이성이 우수하기 때문에 글리신을 특이적으로 측정할 수 있다. 본 발명의 분석 방법은, 예를 들면, 생체 연구, 건강 영양, 의료, 식품 제조와 같은 다양한 분야에서 유용하다.
도 1은 글리신에 대한 야생형 글리신 옥시다제의 기질 특이성을 나타낸다. (1) Gly: 1mM 글리신, (2) 25 mix: 표준 아미노산 20종류, 시스틴, 타우린, 시트룰린, 오르니틴 및 α- 아미노부티르산을 각각 1mM 함유하는 혼합 용액, 및 (3) 25 mix - Gly : 25 mix로부터 Gly을 제외한 혼합 용액 (이하 동일)
도 2는 글리신에 대한 돌연변이형 글리신 옥시다제(T42A/C245S/L301V)의 기질 특이성을 보여준다.
도 3은 글리신에 대한 돌연변이형 글리신 옥시다제(T42A/C245S/L301V/G304Q)의 기질 특이성을 보여준다.
도 4는 돌연변이형 글리신 옥시다제(T42A/C245S/L301V)를 사용한 종점(endpoint) 방법에 의해 수득된 흡광도와 반응 용액 중 Gly 농도 사이의 관계를 보여준다.
도 5는 돌연변이형 글리신 옥시다제(T42A/C245S/L301V/G304Q)를 사용한 종점 방법에 의해 수득된 흡광도와 반응 용액 중 Gly 농도 사이의 관계를 보여준다.
본 발명은 변형된 효소를 제공한다. 본 발명의 변형된 효소는 글리신의 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 특성을 개선시키기 위해 글리신 옥시다제에서 적어도 하나의 아미노산 잔기를 돌연변이시킨 효소일 수 있다.
아미노산 잔기의 돌연변이의 예는 치환, 결실, 부가 및 삽입을 포함할 수 있으며, 치환이 바람직하다.
돌연변이되는 아미노산 잔기는, 천연 발생 L-α-아미노산인, L-알라닌(A), L-아스파라긴(N), L-시스테인(C), L-글루타민(Q), L-이소류신(I), L-류신(L), L-메티오닌(M), L-페닐알라닌(F), L-프롤린(P), L-세린(S), L-트레오닌(T), L-트립토판(W), L-티로신(Y), L-발린(V), L-아스파르트산(D), L-글루탐산(E), L-아르기닌(R), L-히스티딘(H), L-리신(K) 또는 글리신(G)이다. 상기 돌연변이가 치환, 부가 또는 삽입인 경우, 치환, 부가 또는 삽입되는 아미노산 잔기는 상기 기재된 돌연변이되는 아미노산 잔기와 동일하다. 이하, L 및 α는 아미노산의 표기에서 때때로 생략된다.
글리신 옥시다제(글리옥시다제: 때때로 GlyOX로 축약됨)는 다음의 반응을 촉매하는 산화환원효소이다(EC 1.4.3.19).
글리신 + H2O + O2 → 글리옥실산 + NH3 + H2O2
본 발명의 변형된 효소가 유래되는 글리신 옥시다제로서 임의의 유기체(예를 들면, 박테리아, 방선균 및 진균과 같은 미생물, 및 곤충, 어류, 동물 및 식물)로부터 유래된 효소가 사용될 수 있다. 글리신 옥시다제의 예는 바실러스(Bacillus) 속 및 이와 관련된 속에 속하는 유기체로부터 유래된 효소를 포함할 수 있다. 바실러스 속과 관련된 속의 예는 게오바실러스(Geobacillus) 속, 패니바실러스(Paenibacillus) 속 및 오세아노바실러스(Oceanobacillus) 속을 포함할 수 있다. 바실러스 속과 관련된 속은, 바실러스 속과 마찬가지로, 바실러스과(Bacillaceae)에 속한다.
바실러스 속 및 이와 관련된 속에 속하는 미생물의 예는 바실러스 애로필루스(Bacillus aerophilus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 마카우엔시스(Bacillus macauensis), 바실러스 푸미루스(Bacillus pumilus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 스패리쿠스(Bacillus sphaericus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 종(Bacillus sp .), 게오바실러스 스테아로서모필루스(Geobacillus stearothermophilus) 및 게오바실러스 카우스토필루스(Geobacillus kaustophilus) 등을 포함할 수 있다.
글리신 옥시다제에 돌연변이가 도입되는 위치는 바람직하게는 글리신 옥시다제의 활성 중심 부근에 위치한 아미노산 잔기이다. 바실러스 서브틸리스로부터 유래된 글리신 옥시다제에 대한 3차원 구조의 분석 결과가 보고되었다(예를 들면, PDB ID: ING3, ING4, 1RYI, 3IF9 참조). 당업자는 바실러스 서브틸리스로부터 유래된 글리신 옥시다제의 아미노산 서열을 또 다른 글리신 옥시다제의 아미노산 서열과 정렬할 수 있으며, 따라서 바실러스 서브틸리스 이외의 유기체로부터 유래된 글리신 옥시다제의 활성 중심 부근에 위치한 아미노산 잔기를 용이하게 특정할 수 있다.
바람직한 양태에서, 글리신의 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 특성을 개선시키는 돌연변이는 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열에서 TTS 모티프 중 제1 트레오닌(T) 및/또는 세린(S)의 치환이다. TTS 모티프는 트레오닌(T)-트레오닌(T)-세린(S)의 연속된 3개의 아미노산 잔기로 구성된다. TTS 모티프의 C 말단의 트레오닌 잔기를 때때로 제1 트레오닌으로 지칭하고, TTS 모티프의 중심 위치의 트레오닌 잔기를 때때로 제2 트레오닌으로 지칭한다. 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열에서 TTS 모티프의 위치는 효소의 유래에 따라 상이할 수 있다. 그러나, 당업자는 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열에서 TTS 모티프의 위치를 적절하게 결정할 수 있으며, 따라서 치환되는 제1 트레오닌(T) 및 세린(S)의 위치를 특정할 수 있다. 일반적으로, 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열에서, TTS 모티프는 위치 42 내지 44의 아미노산 영역 내에 위치하고 제1 트레오닌(T) 및 세린(S)은 각각 위치 42 및 44에 위치한다(예를 들면, 표 1 참조).
표 1. 글리신 옥시다제의 TTS 모티프 중 제1 트레오닌(T)의 위치
Figure 112015093907783-pct00001
또 다른 바람직한 양태에서, 글리신의 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 특성을 개선시키는 돌연변이는 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열에서 HCY 모티프 중 시스테인(C)의 치환이다. HCY 모티프는 히스티딘(H) - 시스테인(C) - 티로신(Y)의 연속된 3개의 아미노산 잔기로 구성된다. 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열에서 HCY 모티프의 위치는 효소의 유래에 따라 상이할 수 있다. 그러나, 당업자는 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열에서 HCY 모티프의 위치를 적절하게 결정할 수 있으며, 따라서 치환되는 시스테인(C)의 위치를 특정할 수 있다. 일반적으로, 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열에서, HCY 모티프는 위치 244 내지 252의 아미노산 영역 내에 위치하고 시스테인(C)은 위치 245 내지 251에 위치한다(예를 들면, 표 2 참조). 본 발명의 변형된 효소는 글리신의 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 특성을 개선시키는 돌연변이로서 HCY 모티프 중 시스테인(C)의 치환 이외에 TTS 모티프 중 제1 트레오닌(T)의 상기 치환을 추가로 가질 수 있다.
표 2. 글리신 옥시다제의 HCY 모티프 중 시스테인(C)의 위치
Figure 112015093907783-pct00002
또 다른 바람직한 양태에서, 글리신의 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 특성을 개선시키는 돌연변이는 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열 중 LRP 모티프에서 류신(L)의 치환이다. LRP 모티프는 류신(L)-아르기닌(R)-프롤린(P)의 연속된 3개의 아미노산 잔기로 구성된다. 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열 중 LRP 모티프의 위치는 효소의 유래에 따라 상이할 수 있다. 그러나, 당업자는 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열 중 LRP 모티프의 위치를 적절하게 결정할 수 있으며, 따라서 치환되는 류신(L)의 위치를 특정할 수 있다. 일반적으로, 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열에서, LRP 모티프는 위치 294 내지 316의 아미노산 영역 내에 위치하며, 류신(L)은 294 내지 314의 위치에 위치한다(예를 들면, 표 3 참조). 본 발명의 변형된 효소는 글리신의 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 특성을 개선시키는 돌연변이로서 LRP 모티프 중 류신(L)의 치환 이외에 TTS 모티프 중 제1 트레오닌(T)의 상기 치환 및/또는 HCY 모티프 중 시스테인(C)의 상기 치환을 추가로 가질 수 있다.
표 3. 글리신 옥시다제의 LRP 모티프 중 류신(Leu)의 위치
Figure 112015093907783-pct00003
또 다른 바람직한 양태에서, 글리신의 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 특성을 개선시키는 돌연변이는 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열의 GML 모티프 중 메티오닌(M)의 치환이다. GML 모티프는 글리신(G)-메티오닌(M)-류신(L)의 연속된 3개의 아미노산 잔기로 구성된다. 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열 중 GML 모티프의 위치는 효소의 유래에 따라 상이할 수 있다. 그러나, 당업자는 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열 중 GML 모티프의 위치를 적절하게 결정할 수 있으며, 따라서 치환되는 메티오닌(M)의 위치를 특정할 수 있다. 일반적으로, 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열에서, GML 모티프는 위치 45 내지 59의 아미노산 영역 내에 위치하고, 메티오닌(M)은 위치 46 내지 58에 위치한다(예를 들면, 표 4 참조). 본 발명의 변형된 효소는 글리신의 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 특성을 개선시키는 돌연변이로서 GML 모티프 중 메티오닌(M)의 치환 이외에 TTS 모티프 중 제1 트레오닌(T) 및 세린(S)의 상기 치환 및/또는 HCY 모티프 중 시스테인(C)의 상기 치환 및/또는 LRP 모티프 중 류신(L)의 상기 치환을 추가로 가질 수 있다.
표 4. 글리신 옥시다제의 GML 모티프 중 메티오닌(M)의 위치
Figure 112015093907783-pct00004
또 다른 바람직한 양태에서, 글리신의 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 특성을 개선시키는 돌연변이는 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열에서의 SG 모티프 중 세린(S)의 치환이다. SG 모티프는 세린(S)-글리신(G)의 연속된 2개의 아미노산 잔기로 구성된다. 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열에서 SG 모티프의 위치는 효소의 유래에 따라 상이할 수 있다. 그러나, 당업자는 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열 중 SG 모티프의 위치를 적절하게 결정할 수 있으며, 따라서 치환되는 세린(S)의 위치를 특정할 수 있다. 일반적으로, 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열에서, SG 모티프는 위치 190 내지 204의 아미노산 영역 내에 위치하고 세린(S)은 위치 190 내지 203에 위치한다(예를 들면, 표 5 참조). 본 발명의 변형된 효소는 글리신의 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 특성을 개선시키는 돌연변이로서 SG 모티프 중 세린(S)의 치환 이외에 TTS 모티프 중 제1 트레오닌(T) 및 세린(S)의 상기 치환 및/또는 HCY 모티프 중 시스테인(C)의 상기 치환 및/또는 LRP 모티프 중 류신(L)의 상기 치환 및/또는 GML 모티프 중 메티오닌(M)의 상기 치환을 추가로 가질 수 있다.
표 5. 글리신 옥시다제의 SG 모티프 중 세린(S)의 위치
Figure 112015093907783-pct00005
또 다른 바람직한 양태에서, 글리신의 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 특성을 개선시키는 돌연변이는 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열에서의 PGT 모티프 중 글리신(G)의 치환이다. PGT 모티프는 프롤린(P)-글리신(G)-트레오닌(T)의 연속된 3개의 아미노산 잔기로 구성된다. 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열 중 PGT 모티프의 위치는 효소의 유래에 따라 상이할 수 있다. 그러나, 당업자는 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열 중 PGT 모티프의 위치를 적절하게 결정할 수 있으며, 따라서 치환되는 글리신(G)의 위치를 특정할 수 있다. 일반적으로, 야생형 글리신 옥시다제의 아미노산 서열에서, PGT 모티프는 위치 303 내지 317의 아미노산 영역 내에 위치하고, 글리신(G)은 위치 304 내지 316에 위치한다(예를 들면, 표 6 참조). 본 발명의 변형된 효소는 글리신의 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 특성을 개선시키는 돌연변이로서 PGT 모티프 중 글리신(G)의 치환 이외에 TTS 모티프 중 제1 트레오닌(T) 및 세린(S)의 상기 치환 및/또는 HCY 모티프 중 시스테인(C)의 상기 치환 및/또는 LRP 모티프 중 류신(L)의 상기 치환 및/또는 GML 모티프 중 메티오닌(M)의 상기 치환 및/또는 SG 모티프 중 세린(S)의 상기 치환을 추가로 가질 수 있다.
표 6. 글리신 옥시다제의 PGT 모티프 중 글리신(G)의 위치
Figure 112015093907783-pct00006
본 발명의 변형된 효소는 상기 언급된 6개의 모티프로부터 선택된 하나 이상의 모티프를 갖는 야생형 효소 내에 돌연변이 또는 돌연변이들을 도입하여 제조할 수 있다. 야생형 효소는 상기 언급된 6개의 모티프로부터 선택된 2개의 모티프, 3개의 모티프, 4개의 모티프, 5개의 모티프 또는 6개의 모티프를 가질 수 있다.
글리신의 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 특성은 다음을 포함할 수 있다:
(a) 글리신에 대한 글리신 옥시다제의 활성;
(b) 글리신 옥시다제의 열 안정성; 및
(c) 글리신에 대한 글리신 옥시다제의 기질 특이성.
본 발명의 변형된 효소는 상기 언급된 특성들 중 하나만을 가질 수 있거나 상기 언급된 특성들 중 2개 또는 3개를 조합하여 가질 수 있다.
TTS 모티프 중 제1 트레오닌(T)의 경우, 특성 (a) 내지 (c)로부터 선택된 적어도 하나의 특성을 개선시키는 돌연변이(단일 돌연변이 단독 또는 다른 돌연변이 또는 돌연변이들과의 조합)의 예는 알라닌(A), 세린(S), 시스테인(C) 또는 글리신(G)으로의 치환을 포함할 수 있다.
TTS 모티프 중 세린(S)의 경우, 특성 (a) 내지 (c)로부터 선택된 적어도 하나의 특성을 개선시키는 돌연변이(단일 돌연변이 단독 또는 다른 돌연변이 또는 돌연변이들과의 조합)의 예는 리신(K)으로의 치환을 포함할 수 있다.
HCY 모티프 중 시스테인(C)의 경우, 특성 (a) 내지 (c)로부터 선택된 적어도 하나의 특성을 개선시키는 돌연변이(단일 돌연변이 단독 또는 다른 돌연변이 또는 돌연변이들과의 조합)의 예는 알라닌(A), 아스파르트산(D), 글리신(G), 히스티딘(H), 아스파라긴(N), 트립토판(W), 티로신(Y) 또는 세린(S)으로의 치환을 포함할 수 있다.
LRP 모티프 중 류신(L)의 경우, 특성 (a) 내지 (c)로부터 선택된 적어도 하나의 특성을 개선시키는 돌연변이(단일 돌연변이 단독 또는 다른 돌연변이 또는 돌연변이들과의 조합)의 예는 이소류신(I), 발린(V), 시스테인(C), 트레오닌(T) 또는 프롤린(P)으로의 치환을 포함할 수 있다.
GML 모티프 중 메티오닌(M)의 경우, 특성 (a) 내지 (c)로부터 선택된 적어도 하나의 특성을 개선시키는 돌연변이(단일 돌연변이 단독 또는 다른 돌연변이 또는 돌연변이들과의 조합)의 예는 이소류신(I)으로의 치환을 포함할 수 있다.
SG 모티프 중 세린(S)의 경우, 특성 (a) 내지 (c)로부터 선택된 적어도 하나의 특성을 개선시키는 돌연변이(단일 돌연변이 단독 또는 다른 돌연변이 또는 돌연변이들과의 조합)의 예는 아르기닌(R)으로의 치환을 포함할 수 있다.
PGT 모티프 중 글리신(G)의 경우, 특성 (a) 내지 (c)로부터 선택된 적어도 하나의 특성을 개선시키는 돌연변이(단일 돌연변이 단독 또는 다른 돌연변이 또는 돌연변이들과의 조합)의 예는 티로신(Y) 또는 글루타민(Q)으로의 치환을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 글리신의 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 특성으로서의 글리신에 대한 글리신 옥시다제의 활성이 개선된다. 글리신에 대한 글리신 옥시다제의 활성의 개선은 글리신에 대한 변형된 효소의 활성이 글리신에 대한 야생형 효소의 활성에 비해 향상된다는 것을 의미한다. 구체적으로는, 글리신에 대한 글리신 옥시다제의 활성의 개선은 소정의 농도(저농도 또는 고농도)의 글리신에 대한 야생형 글리신 옥시다제의 활성을 100으로 간주했을 때 동일한 농도의 글리신에 대한 변형된 글리신 옥시다제의 활성이 100보다 큰 경우에 달성될 수 있다. 이러한 변형 효소는 글리신을 고감도로 신속하게 측정하게 하고, 결과적으로 글리신의 측정에 유용하다. 야생형 효소의 활성에 대한 변형된 효소의 활성의 향상 수준은 바람직하게는 1.3배 이상, 더 바람직하게는 1.5배 이상, 더욱 더 바람직하게는 1.7배 이상, 특히 바람직하게는 2.0배 이상이다. 야생형 효소에 비해 1.3배 이상의 활성이 향상된 본 발명의 변형된 효소에서의 돌연변이의 예는, 활성의 향상에 적합한, (1) TTS 모티프 중 제1 트레오닌(T)의 하기 아미노산 잔기로의 치환, HCY 모티프 중 시스테인(C)의 하기 아미노산 잔기로의 치환 또는 LRP 모티프 중 류신(L)의 하기 아미노산 잔기로의 치환 또는 이들의 조합일 수 있다.
(1) 활성의 향상에 적합한 치환
(1-1) TTS 모티프 중 제1 트레오닌(T)의 치환 후 아미노산 잔기
알라닌(A), 세린(S), 시스테인(C) 또는 글리신(G)
(1-2) TTS 모티프 중 세린(S)의 치환 후 아미노산 잔기
리신(K)
(1-3) HCY 모티프 중 시스테인(C)의 치환 후 아미노산 잔기
세린(S)
(1-4) LRP 모티프 중 류신(L)의 치환 후 아미노산 잔기
이소류신(I), 발린(V), 시스테인(C) 또는 트레오닌(T)
(1-5) PGT 모티프 중 글리신(G)의 경우, 특성 (a) 내지 (c)로부터 선택된 적어도 하나의 특성을 개선시키는 돌연변이(단일 돌연변이 단독 또는 다른 돌연변이 또는 돌연변이들과의 조합)의 예는 글루타민(Q)으로의 치환을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 글리신 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 특성으로서의 글리신 옥시다제의 열 안정성이 개선된다. 글리신 옥시다제의 열 안정성의 개선은 변형된 효소의 열 안정성이 야생형 효소의 열 안정성에 비해 더 향상된다는 것을 의미한다. 구체적으로는, 글리신 옥시다제의 열 안정성의 개선은 효소를 수용액 중에서 소정의 고온(예를 들면, 40℃, 50℃ 또는 60℃ 중의 어느 온도)에서 소정의 시간(예를 들면, 1시간) 동안 처리한 경우 변형된 효소의 잔존 활성이 야생형 효소의 잔존 활성보다 큰 경우에 달성될 수 있다. 수용액 중의 글리신 옥시다제의 열 안정성 시험은 글리신 옥시다제의 안정성(특히 액상 안정성)을 평가하기 위한 가속 시험으로의 의의를 가질 수 있다. 따라서, 수용액 중 변형된 효소의 열 안정성이 높은 경우, 변형된 효소의 안정성(특히 액상 안정성)도 높은 경향이 있다. 액상 안정성이 높은 효소는 장기간 동안 액체 형태로 저장될 수 있으며, 따라서 이러한 변형된 효소는 액상 시약으로서 글리신의 측정에 유용하다. 야생형 효소의 열 안정성에 대한 변형된 효소의 열 안정성의 향상 수준은 바람직하게는 1.1배 이상, 더 바람직하게는 1.2배 이상이다. 야생형 효소에 비해 1.1배 이상 향상된 열 안정성을 갖는 본 발명의 변형된 효소에서의 돌연변이의 예는, (2) 열 안정성의 개선에 적합한, HCY 모티프 중 시스테인(C)의 하기 아미노산 잔기로의 치환일 수 있다.
(2) 열 안정성의 개선에 적합한 치환
(2-1) TTS 모티프 중 제1 트레오닌(T)의 치환 후 아미노산 잔기
알라닌(A), 세린(S) 또는 글리신(G)
(2-2) TTS 모티프 중 세린(S)의 치환 후 아미노산 잔기
리신(K)
(2-3) HCY 모티프 중 시스테인(C)의 치환 후 아미노산 잔기
알라닌(A), 아스파르트산(D), 글리신(G), 히스티딘(H), 아스파라긴(N), 트립토판(W), 티로신(Y) 또는 세린(S)
(2-4) LRP 모티프 중 류신(L)의 치환 후 아미노산 잔기
이소류신(I), 발린(V), 프롤린(P) 또는 시스테인(C)
(2-5) GML 모티프 중 메티오닌(M)의 경우, 특성 (a) 내지 (c)로부터 선택된 적어도 하나의 특성을 개선시키는 돌연변이(단일 돌연변이 단독 또는 다른 돌연변이 또는 돌연변이들과의 조합)의 예는 이소류신(I)으로의 치환을 포함할 수 있다.
(2-6) SG 모티프 중 세린(S)의 경우, 특성 (a) 내지 (c)로부터 선택된 적어도 하나의 특성을 개선시키는 돌연변이(단일 돌연변이 단독 또는 다른 돌연변이 또는 돌연변이들과의 조합)의 예는 아르기닌(R)으로의 치환을 포함할 수 있다.
(2-7) PGT 모티프 중 글리신(G)의 경우, 특성 (a) 내지 (c)로부터 선택된 적어도 하나의 특성을 개선시키는 돌연변이(단일 돌연변이 단독 또는 다른 돌연변이 또는 돌연변이들과의 조합)의 예는 티로신(Y) 또는 글루타민(Q)으로의 치환을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 글리신의 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 특성으로서의 글리신에 대한 글리신 옥시다제의 기질 특이성이 개선된다. 글리신에 대한 글리신 옥시다제의 기질 특이성의 개선은 글리신에 대한 변형된 효소의 반응성이 야생형 효소의 반응성에 비해 더 향상된다는 것을 의미하며, 환언하면, 글리신 이외의 아미노산에 대한 변형된 효소의 반응성이 감소되는 것을 의미한다. 글리신 이외의 아미노산의 예는 글리신 이외의 L-α-아미노산을 포함할 수 있다. 구체적으로는, 글리신 이외의 아미노산의 예는, 단백질을 구성하는, 글리신 이외의 19종의 L-α-아미노산, 및 시스틴, 타우린, 시트룰린, 오르니틴 및 α-아미노부티르산을 포함할 수 있다. 글리신에 대한 글리신 옥시다제의 기질 특이성이 개선된 본 발명의 변형된 효소의 돌연변이는, 예를 들면, TTS 모티프 중 제1 트레오닌(T)의 하기 아미노산 잔기로의 치환, HCY 모티프 중 시스테인(C)의 하기 아미노산 잔기로의 치환, LRP 모티프 중 류신(L)의 하기 아미노산 잔기로의 치환 또는 이들의 조합일 수 있다.
(3) 기질 특이성의 개선에 적합한 치환
(3-1) TTS 모티프 중 제1 트레오닌(T)의 치환 후 아미노산 잔기
알라닌(A)
(3-2) HCY 모티프 중 시스테인(C)의 치환 후 아미노산 잔기
세린(S)
(3-3) LRP 모티프 중 류신(L)의 치환 후 아미노산 잔기
발린(V)
본 발명의 변형된 효소는 또한 C-말단 또는 N-말단에서 또 다른 펩타이드 성분(예를 들면, 태그 부분)을 가질 수 있다. 본 발명의 변형된 효소에 부가될 수 있는 다른 펩타이드 성분의 예는 목적 단백질의 정제를 용이하게 하는 펩타이드 성분(예를 들면, 목적 단백질의 정제에 통상적으로 사용되는 히스티딘 태그 및 strep-태그 II와 같은 태그 부분; 글루타티온-S-전이효소 및 말토오스-결합 단백질과 같은 단백질), 목적 단백질의 가용성을 향상시키는 펩타이드 성분(예를 들면, Nus-태그), 차페론(chaperon)으로 작용하는 펩타이드 성분(예를 들면, 촉발 인자), 및 또 다른 기능을 갖는 단백질 또는 단백질 도메인, 또는 이들을 연결하는 링커로서의 펩타이드 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 변형된 효소는 상기 언급된 특성이 유지되는 한 상기 돌연변이(들)를 갖는 글리신 옥시다제의 아미노산 서열에서 하나 또는 몇 개의 아미노산 잔기의 추가 돌연변이(예를 들면, 치환, 결실, 삽입 및 부가)를 가질 수도 있다. 추가 돌연변이의 수는, 예를 들면, 1 내지 100개, 바람직하게는 1 내지 50개, 더 바람직하게는 1 내지 40개, 더욱 더 바람직하게는 1 내지 30개, 가장 바람직하게는 1 내지 20개 또는 1 내지 10개(예를 들면, 1, 2, 3, 4 또는 5개)이다. 당업자는 상기 언급된 특성을 유지하면서 이러한 변형된 효소를 적절하게 제작할 수 있다. 추가 돌연변이 또는 돌연변이들을 갖는 본 발명의 변형된 효소에서, 변형된 효소의 활성의 향상 수준은 야생형 효소의 활성에 비해 바람직하게는 1.3배 이상, 더 바람직하게는 1.5배 이상, 더욱 더 바람직하게는 1.7배 이상, 특히 바람직하게는 2.0배 이상이다. 또한 추가 돌연변이 또는 돌연변이들을 갖는 본 발명의 변형된 효소에서, 변형된 효소의 열 안정성의 향상 수준은 야생성 효소의 열 안정성에 비해 바람직하게는 1.1배 이상, 더 바람직하게는 1.2배 이상이다.
따라서, 본 발명의 변형된 효소는 하기 (i) 또는 (ii)일 수 있다:
(i) 글리신 옥시다제의 아미노산 서열에서 TTS 모티프 중 제 1 트레오닌, TTS 모티프 중 세린, HCY 모티프 중 시스테인, LRP 모티프 중 류신, GML 모티프 중 메티오닌, SG 모티프 중 세린, 및 PGT 모티프 중 글리신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기의 돌연변이 또는 돌연변이들(예를 들면, 치환)을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 글리신의 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 특성이 개선된, 단백질; 또는
(ii) 글리신 옥시다제의 아미노산 서열에서 TTS 모티프 중 제1 트레오닌, TTS 모티프 중 세린, HCY 모티프 중 시스테인, LRP 모티프 중 류신, GML 모티프 중 메티오닌, SG 모티프 중 세린 및 PGT 모티프 중 글리신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 돌연변이들(예를 들면, 치환)을 갖는 아미노산 서열에서 하나 또는 몇 개의 아미노산 잔기의 추가 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 글리신의 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 개선된 특성을 유지하는, 단백질.
본 발명의 변형된 효소는 또한 상기 언급된 돌연변이 또는 돌연변이들 및 추가 돌연변이 또는 돌연변이들을 갖기 때문에 돌연변이 이전에 (야생형) 글리신 옥시다제의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 이상 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 효소일 수 있다. 아미노산 서열 동일성 백분율은 바람직하게는 92% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 더욱 더 바람직하게는 97% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상 또는 99% 이상일 수 있다.
아미노산 서열들 사이의 동일성은, 예를 들면, Karlin 및 Altschul의 알고리즘 BLAST(참조: Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)) 및 Pearson의 FASTA(참조: MethodsEnzymol., 183,63 (1990))를 사용하여 결정될 수 있다. 이 알고리즘 BLAST를 기반으로 BLASTP로 지칭되는 프로그램이 개발되었다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조). 따라서, 아미노산 서열들 사이의 동일성은 이들 프로그램을 디폴트 설정(default setting)으로 사용하여 계산될 수 있다. 또한, 예를 들면, ORF에 인코딩된 전장 폴리펩티드 부분을 사용하고, Lipman-Pearson 방법을 이용하는 제네틱스 코포레이션(Genetyx Corporation)으로부터의 소프트웨어 GENETYX Ver. 7.09를 Unit Size to Compare=2 설정으로 사용하여 백분율로서 유사성을 계산하여 수득된 수치를 아미노산 서열들 사이의 동일성으로 사용할 수 있다. 이들 계산으로부터 유도된 값들 중에서 가장 낮은 값을 아미노산 서열들 사이의 동일성으로 이용할 수 있다.
아미노산 서열에 추가 돌연변이가 도입될 수 있는 아미노산 잔기의 위치는 당업자에게 명백하다. 예를 들면, 아미노산 서열의 정렬을 참고하여 추가 돌연변이를 도입할 수 있다. 구체적으로는, 당업자는 (1) 다수의 상동체의 아미노산 서열(예를 들면, 서열 번호:2로 표시되는 아미노산 서열 및 다른 상동체의 아미노산 서열)을 비교하고, (2) 상대적으로 보존된 영역 및 상대적으로 보존되지 않은 영역을 입증하고, 이후 (3) 상대적으로 보존된 영역 및 상대적으로 보존되지 않은 영역으로부터 각각 기능적으로 중요한 역할을 할 수 있는 영역 및 기능적으로 중요한 역할을 할 수 없는 영역을 예측할 수 있으며, 따라서 구조와 기능 사이의 상관성을 인식할 수 있다. 상기 기재된 바와 같이 글리신 옥시다제에 대한 3차원 구조 분석 결과가 보고되었다. 따라서, 당업자는 3차원 구조 분석 결과를 토대로 하여 상기 언급된 특성의 유지를 가능하게 하도록 추가 돌연변이를 도입할 수 있다. 추가 돌연변이가 도입되는 부위는 TTS 모티프 중 제1 트레오닌, TTS 모티프 중 세린, HCY 모티프 중 시스테인, LRP 모티프 중 류신, GML 모티프 중 메티오닌, SG 모티프 중 세린 및 PGT 모티프 중 글리신 이외의 아미노산 잔기, 바람직하게는 TTS 모티프, TTS 모티프, HCY 모티프, LRP 모티프, GML 모티프, SG 모티프 및 PGT 모티프 중의 아미노산 잔기 이외의 아미노산 잔기일 수 있다.
아미노산 잔기의 추가 돌연변이가 치환인 경우, 이러한 아미노산 잔기의 치환은 보존적 치환일 수 있다. 용어 "보존적 치환"은 소정의 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환하는 것을 나타낸다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 이러한 패밀리의 예는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β 위치에서 분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소류신), 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘), 하이드록실(예를 들면, 알코올성, 페놀성) 그룹을 함유하는 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 세린, 트레오닌, 티로신) 및 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 시스테인, 메티오닌)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 아미노산의 보존적 치환은 아스파르트산 및 글루탐산 사이의 치환, 아르기닌, 리신 및 히스티딘 사이의 치환, 트립토판 및 페닐알라닌 사이의 치환, 페닐알라닌 및 발린 사이의 치환, 류신, 이소류신 및 알라닌 사이의 치환, 및 글리신 및 알라닌 사이의 치환일 수 있다.
본 발명의 변형된 효소는 본 발명의 변형 효소를 발현시키는 본 발명의 형질 전환체 또는 무세포계(cell-free system) 등을 이용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 형질전환체는, 예를 들면, 본 발명의 변형된 효소를 위한 발현 벡터를 제작하고 이 발현 벡터를 숙주 내에 도입하여 제조될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 변형된 효소를 인코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, DNA, RNA)를 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 이외에 프로모터, 터미네이터 및 약물(예를 들면, 테트라사이클린, 암피실린, 카나마이신, 하이그로마이신, 포스피노트리신) 내성 유전자를 인코딩하는 영역과 같은 영역을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는 플라스미드 또는 통합(integrative) 벡터일 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터 또는 무세포계용 벡터일 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 3' 또는 5' 말단에서 본 발명의 변형된 효소에 부가될 수 있는 또 다른 펩타이드 성분을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 다른 펩타이드 성분을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 예는 상기 기재된 바와 같이 목적 단백질의 정제를 용이하게 하는 펩타이드 성분을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 기재된 바와 같이 목적 단백질의 가용성을 개선시키는 펩타이드 성분을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 차페론으로 작용하는 펩타이드 성분을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 또 다른 기능을 갖는 단백질 또는 단백질 도메인 또는 이들을 연결하는 링커로서 펩타이드 성분을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 다른 펩타이드 성분을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 다양한 발현 벡터가 이용가능하다. 따라서, 본 발명의 발현 벡터의 제작을 위해 이러한 발현 벡터를 이용할 수 있다. 예를 들면, 목적 단백질의 정제를 용이하게 하는 펩타이드 성분을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터(예를 들면, pET-15b, pET-51b, pET-41a, pMAL-p5G), 목적 단백질의 가용성을 향상시키는 펩타이드 성분을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터(예를 들면, pET-50b), 차페론으로서 작용하는 펩타이드 성분을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터(pCold TF), 및 또 다른 기능을 가진 단백질 또는 단백질 도메인 또는 이들을 연결하는 링커로서 펩타이드 성분을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 이용할 수 있다. 단백질 발현 후 본 발명의 변형된 효소에 부가된 다른 펩타이드 성분으로부터 본 발명의 변형된 효소를 절단할 수 있게 위해, 본 발명의 발현 벡터는 프로테아제에 의한 절단 부위를 인코딩하는 영역을 본 발명의 변형된 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 다른 펩타이드 성분을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 사이에 포함할 수 있다.
본 발명의 변형된 효소를 발현시키기 위한 숙주로서, 에스케리키아(Escherichia) 속(예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)), 코리네박테리움(Corynebacterium) 속(예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)) 및 바실러스 속(예를 들면, 바실러스 서브틸리스)에 속하는 박테리아로부터의 세포를 포함하는 다양한 원핵 세포, 및 사카로마이세스(Saccharomyces) 속(예를 들면, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)), 피치아(Pichia) 속(예를 들면, 피치아 스티피티스(Pichia stipitis)) 및 아스퍼길러스(Aspergillus) 속(예를 들면, 아스퍼길러스 오리재(Aspergillus oryzae))에 속하는 진균으로부터의 세포를 포함하는 다양한 진핵 세포를 사용할 수 있다. 숙주로서 특정 유전자가 결실된 균주를 사용할 수 있다. 형질전환체의 예는 세포질에 발현 벡터를 보유하는 형질전환체 및 목적 유전자가 게놈 내에 통합된 형질전환체를 포함할 수 있다.
본 발명의 형질전환체는 소정의 배양 장치(예를 들면, 시험관, 플라스크, 발효조(jar fermenter)를 사용하여 이후 기재되는 조성을 갖는 배지에서 배양될 수 있다. 배양 조건은 적절하게 결정될 수 있다. 구체적으로는, 배양 온도는 10 내지 37℃일 수 있고, pH 값은 6.5 내지 7.5일 수 있으며, 배양 기간은 1 내지 100시간일 수 있다. 또한, 용존 산소 농도를 관리하면서 배양을 수행할 수 있다. 이 경우에, 용존 산소 농도(DO 값)는 제어를 위한 지표로서 사용할 수 있다. 환기/교반 조건은 공기 중 산소 농도가 21%인 경우 상대 용존 산소 농도, DO 값이 예를 들면 1 내지 10%, 바람직하게는 3 내지 8% 아래로 되지 않도록 제어될 수 있다. 상기 배양은 배치 배양 또는 유가(fed-batch) 배양일 수 있다. 유가 배양의 경우에, 배양은 또한 당 공급원으로서의 용액과 인산을 함유하는 용액을 배양 배지에 연속적으로 또는 불연속적으로 순차 첨가하여 계속될 수 있다.
형질전환된 숙주는 상기 기재된 바와 같으며, 에스케리키아 콜라이에 대해 상술하는 경우, 숙주는 에스케리키아 콜라이 K12 아종 에스케리키아 콜라이 JM109 균주, DH5α 균주, HB101 균주, BL21(DE3) 균주 등으로부터 선택될 수 있다. 형질전환을 수행하는 방법 및 형질전환체를 선별하는 방법은 문헌[참조: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor press (2001/01/15)] 등에 기재되어 있다. 이하, 형질전환된 에스케리키아 콜라이를 제작하고 이를 사용하여 소정의 효소를 생산하는 방법은 단지 예시로서 구체적으로 설명될 것이다.
이. 콜라이에서 이종 단백질을 생산하는데 사용된 프로모터는 일반적으로 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 프로모터로서 사용될 수 있다. 이의 예는 PhoA, PhoC, T7 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파지의 PR 및 PL 프로모터, 및 T5 프로모터와 같은 강력한 프로모터를 포함할 수 있고, PhoA, PhoC 및 lac 프로모터가 바람직하다. 예를 들면, pUC(예를 들면, pUC19, pUC18), pSTV, pBR(예를 들면, pBR322), pHSG(예를 들면, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398), RSF(예를 들면, RSF1010), pACYC(예를 들면, pACYC177, pACYC184), pMW(예를 들면, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218), pQE(예를 들면, pQE30) 및 이의 유도체를 벡터로서 사용할 수 있다. 다른 벡터로 파지 DNA로부터의 벡터를 또한 사용할 수 있다. 추가로, 프로모터를 포함하고 삽입된 DNA 서열을 발현시킬 수 있는 발현 벡터도 사용될 수 있다. 바람직하게는, 벡터는 pUC, pSTV 또는 pMW일 수 있다.
또한, 전사 종결 서열인 터미네이터는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 하류에서 결찰(ligation)될 수 있다. 이러한 터미네이터의 예는 T7 터미네이터, fd 파지 터미네이터, T4 터미네이터, 테트라사이클린 내성 유전자의 터미네이터 및 에스케리키아 콜라이 trpA 유전자의 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 에스케리키아 콜라이에 도입하기 위한 벡터는 바람직하게는 소위 다중복사 유형이고, 이의 예는 ColE1 유래의 복제 개시점을 갖는 플라스미드, 예를 들면 pUC계 플라스미드, pBR322계 플라스미드 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다. 여기에서 "유도체"는 플라스미드에서 뉴클레오타이드(들)의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가와 같은 변형이 일어나는 것을 의미한다.
형질전환체를 선별하기 위해, 벡터는 바람직하게는 암피실린 내성 유전자와 같은 마커를 갖는다. 강력한 프로모터를 갖는 발현 벡터가 이러한 플라스미드로서 시판되고 있다 (예를 들면, pUC계(다카라 바이오 인코포레이티드(Takara Bio Inc.)로부터 공급됨), pPROK계(클론테크(Clontech)로부터 공급됨), pKK233-2계(클론테크로부터 공급됨)).
수득된 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 에스케리키아 콜라이를 형질전환시키고, 이 에스케리키아 콜라이를 배양하여 본 발명의 변형된 효소를 수득할 수 있다.
에스케리키아 콜라이를 배양하는데 일반적으로 사용되는 배지, 예를 들면, M9 카사미노산 배지 및 LB 배지가 배지로서 사용될 수 있다. 상기 배지는 소정의 탄소원, 질소원 및 보효소(예를 들면, 염산피리독신)를 함유할 수 있다. 구체적으로는, 펩톤, 효모 추출물, NaCl, 포도당, MgSO4, 황산암모늄, 인산이수소칼륨, 황산철, 황산망간 등을 사용할 수 있다. 배양 조건 및 생산 유도 조건은 벡터의 마커 및 프로모터, 및 사용되는 숙주 등의 유형에 따라서 적절하게 선택된다.
다음의 방법에 의해 본 발명의 변형된 효소를 회수할 수 있다. 본 발명의 변형된 효소는 본 발명의 형질전환체를 수집한 후, 미생물의 균체를 파쇄(예를 들면, 초음파처리 또는 균질화) 또는 용해(예를 들면, 라이소자임으로 처리)하여 파쇄 또는 용해 생성물로서 수득될 수 있다. 이러한 파쇄 또는 용해 생성물을 추출, 침전, 여과 및 컬럼 크로마토그래피와 같은 기술에 적용시켜 본 발명의 변형된 효소를 수득될 수 있다.
본 발명은 또한 글리신의 분석 방법을 제공한다. 본 발명의 분석 방법은 본 발명의 변형된 효소를 사용하여 시험 샘플 중에 함유된 글리신을 측정함을 포함할 수 있다.
시험 샘플로는 샘플이 글리신을 함유하는 것으로 의심되는 한 특별히 제한되지 않으며, 이의 예는 생체 샘플(예를 들면, 혈액, 소변, 타액, 눈물 등) 및 식음료 제품(예를 들면, 영양 음료 및 아미노산 음료)을 포함할 수 있다. 시험 샘플 중의 글리신은 저농도(예를 들면, 1mM 미만, 예를 들면, 1μM 이상 1mM 미만의 농도)이거나 고농도(1mM 이상, 예를 들면, 1mM 이상 1M 미만의 농도)일 수 있다.
본 발명의 분석 방법은 본 발명의 변형된 효소를 사용하여 글리신을 측정 할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 상기 방법은 형성된 글리옥실산을 검출할 수 있거나, 글리옥실산의 형성과 함께 부산물로서 생성된 NH3 또는 H2O2를 검출할 수 있다. 대안적으로, 또 다른 반응을 공액시켜 공액(conjugate) 반응 생성물을 검출할 수 있다. 이러한 공액 반응의 예는 하기 공액 반응을 포함할 수 있다.
글리신 산화 반응: 글리신 옥시다제에 의해 촉매된 반응
글리신 + H2O + O2 → 글리옥실산 + NH3 + H2O2
공액 반응: 퍼옥시다제에 의해 촉매된 반응
2H2O2 + 4-아미노안티피린 + 페놀→ 퀴논이민 색소 + 4H2O
상기 공액 반응이 이용되는 경우, 글리신의 측정은 본 발명의 변형된 효소에 추가하여, 4-아미노안티피린 및 페놀, 및 퍼옥시다제를 사용하여 수행할 수 있다. 구체적으로는, 글리신은, 시험 샘플을 수용액(예를 들면, 완충액) 중에서 4-아미노 안티피린 및 페놀, 및 퍼옥시다제와 혼합하고, 이어서 상기 혼합 샘플을 상기 효소 반응에 적용시키고 최종적으로 형성된 퀴논이민 색소의 흡광도(약 500nm)를 검출하여 측정된다. 측정은 정성적으로 또는 정량적으로 수행될 수 있다. 측정은, 전체 기질이 반응될 때 측정을 수행하는 종점 방법 또는 레이팅(rating) 방법(초기 속도 방법)을 토대로 수행될 수 있다. 산화 반응에 필요한 산소량은 미량이고, 필요한 산소량은 반응계 중의 용존 산소에 의해 충당된다. 따라서 일반적으로, 반응계에 산소 또는 산소를 함유하는 기체를 강제로 공급할 필요는 없다.
본 발명의 변형된 효소는 글리신 이외의 아미노산(예를 들면, L-α-아미노산)과 반응하지 않거나 상기 아미노산과의 반응성이 낮다. 따라서, 시험 샘플 중에 글리신 뿐만 아니라 다른 아미노산이 함유되어 있는 경우에도, 시험 샘플 중 글리신의 양은 본 발명의 변형된 효소를 사용하여 구체적으로 평가될 수 있다.
시험 샘플 중 글리신의 양은 본 발명의 변형된 효소를 사용한 과산화수소 전극을 사용하여 특이적으로 평가될 수 있다.
추가로, 본 발명은 (A) 본 발명의 변형된 효소를 포함하는 글리신의 분석 키트를 포함한다.
본 발명의 키트는 (B) 반응용 완충 용액 또는 완충 염, (C) 과산화수소 검출 시약, (D) 암모니아 검출 시약 및 (E) 글리옥실산 검출 시약 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다.
(B) 반응용 완충 용액 또는 완충 염은 목적 효소 반응에 적합한 반응 용액 중의 pH 값을 유지하도록 사용된다.
(C) 과산화수소 검출용 시약은, 과산화수소를, 예를 들면, 발색 또는 형광에 의해 검출하는 경우에 사용된다. 예는 퍼옥시다제와 이의 기질이 될 수 있는 발색제와의 조합을 포함할 수 있다. 구체적인 예는, 이에 제한되지 않지만, 호스래디쉬 퍼옥시다제와 4-아미노안티피린 및 페놀과의 조합을 포함할 수 있다.
(D) 암모니아 검출 시약의 예는 페놀을 차아염소산과 조합한 인도페놀 방법을 포함할 수 있다.
(E) 글리옥실산 검출 시약의 예는 비특허 문헌 6에 기재된 시약의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 장치 및 (b) 본 발명의 변형된 효소를 포함하는, 글리신의 분석을 위한 검출 시스템을 제공한다
본 발명의 변형된 효소는, 사용시 장치에서 공급될 수 있는 마이크로디바이스와 독립적인 단위로 존재할 수 있거나, 미리 장치에 주입되거나 고정되거나 배치될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 변형된 효소는 미리 장치에 주입되거나, 고정되거나 배치된 형태로 제공된다. 상기 변형된 효소는 장치에 직접적으로 또는 간접적으로 고정되거나 배치된다. 예를 들면, 채널을 포함하는 마이크로채널 칩과 같은 마이크로디바이스가 디바이스로서 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명의 글리신 분석용 검출 시스템은 (c) 반응용 완충 용액 또는 완충 염, 과산화수소 검출 시약, 암모니아 검출 시약 및 글리옥실산 검출 시약 중 적어도 하나의 구성요소를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 글리신 분석을 위한 검출 시스템은 구성요소 (c)가 전부 장치 중에 수용된 형태로 또는 구성요소 (c)의 일부가 장치 중에 수용되고 나머지는 장치 중에 수용되지 않는 형태(예를 들면, 상이한 용기에 수용된 형태)로 제공될 수 있다. 이 경우에, 장치 중에 수용되지 않은 구성요소 (c)는 표적 물질이 측정될 때 장치 내로 주입시켜 사용될 수 있다.
상기 장치의 예는 (1) 샘플과 구성요소 (c)를 혼합하여 혼합 용액을 제조하는 제1 구역, 및 제조된 혼합 용액을 본 발명의 변형된 효소와 접촉시켜 글리신을 검출하는 제2 구역을 포함하는 장치(혼합 단계 및 검출 단계가 상이한 구획에서 수행되는 장치); (2) 샘플과 구성요소 (c)를 본 발명의 변형된 효소와 혼합하여 본 발명의 변형된 효소에 의해 글리신을 검출하는 구역을 포함하는 장치(혼합 단계 및 검출 단계가 동일한 구획에서 수행되는 장치); 및 (3) 샘플 및 구성요소 (c) (및 필요한 경우 본 발명의 변형된 효소)의 혼합을 가능하게 하는 채널, 및 본 발명의 변형된 효소에 의해 글리신을 검출하는 구획을 포함하는 장치(장치의 주입구에 샘플을 주입하는 경우, 채널을 통해 샘플을 전송하여 샘플 등을 자동으로 혼합하고, 수득된 혼합 용액 중 글리신을 검출 구획에서 자동으로 검출하는 장치)를 포함할 수 있다. 자동화의 관점에서, 장치(3), 특히 마이크로채널 장치의 형태인 장치(3)가 바람직하다. 장치(3)에서, 본 발명의 변형된 효소는 채널에 흐르는 전송 용액 중에 제공될 수 있거나 검출 구획에 고정 또는 배치된 형태로 제공될 수 있으며, 바람직하게는 검출 구획에 고정 또는 배치된 형태로 제공된다.
본 발명은 또한 (a) 검출용 전극 및 (b) 검출용 전극 위에 고정 또는 배치된 본 발명의 변형된 효소를 포함하는 글리신 분석용 효소 센서를 제공한다. 본 발명의 변형된 효소는 전극에 직접적으로 또는 간접적으로 고정 또는 배치된다.
상기 언급된 검출용 전극으로, 예를 들면, 과산화수소 검출용 전극을 사용하는 것이 가능하다. 보다 구체적으로는, 효소식 과산화수소 검출용 전극 및 격막식 과산화수소 검출용 전극을 예로서 포함할 수 있다. 이 경우, 글리신 산화 활성에 의해 글리신이 산화될 때 생성되는 과산화수소를 검출하여 글리신의 분석이 가능해진다. 공지된 센서에 이용되는 구성은 바로 또는 상기 구성 이외의 구성으로 적절히 변형시켜 이용될 수 있다.
실시예
본 발명은 다음 실시예를 참조하여 상세하게 설명될 것이지만, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
무세포 합성 시스템을 사용한 GlyOX의 합성 및 GlyOX의 정제
바실러스 서브틸리스 168 균주로부터 유래된 GlyOX의 야생형 유전자 또는 목적 돌연변이 유전자를 주형으로 사용하는 2-단계 PCR 방법에 의해 히스티딘 태그 및 TEV 프로테아제 인식 서열을 N 말단 측에 융합시켜 목적 돌연변이가 도입된 구조체의 직쇄상 DNA를 제작했다. 이 DNA를 주형으로 사용하여 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 무세포 합성 반응 시스템에서 단백질을 합성했다. 1mL의 반응 스케일을 사용하여 6시간 동안 투석 방법에 의해 합성된 생성물의 원심분리 후 수득된 상청액 분획을 Ni 세파로즈 고성능(Ni Sepharose High Performance, GE 헬스케어 재팬(GE Healthcare Japan))에 대한 히스티딘 태그 친화도로 정제하여 용출 분획을 산출했다. 이후, 목적 효소인 것으로 간주되는 단백질의 존재를 SDS-PAGE 및 SYPRO ORANGE 단백질 겔 염색(라이프 테크놀로지스 재팬 리미티드(Life Technologies Japan Ltd.))을 사용한 염색으로 확인했다. 상기 단백질을 브래드퍼드(Bradford) 방법으로 정량한 후 평가했다. 야생형 효소에 대해서도, 상기와 동일한 방식으로 선형 DNA의 제조, 무세포 합성 및 효소의 정제 및 분석을 수행했다. 하기 완충액을 정제에 사용했다.
결합 완충액 : 750mM NaCl, 20mM NaPi, pH 8.0
세척 완충액 : 750mM NaCl, 20mM NaPi, pH 8.0
회수 및 측정 완충액: 300 mM NaCl, 50 mM NaPi, 34 mM EDTA, pH 7.0, 10% D2O, 0.01% NaN3
돌연변이가 다수 회 도입된 돌연변이 GlyOX를 나타내는 경우, 각각의 도입된 돌연변이는 슬래시를 사용하여 표시하고 연속하여 기재했다. 예를 들면, 돌연변이 T42A/C245S는 T42A 및 C245S의 2개의 돌연변이를 갖는 돌연변이형 GlyOX를 의미한다. WT는 야생형을 의미한다.
[실시예 2] 활성의 측정
실시예 1에서 합성된 야생형 GlyOX 및 돌연변이형 GlyOX의 활성을 하기 절차에 의해 평가했다. 우선, 하기 반응 용액 A 및 B를 제조했다.
반응 용액 A : 4mM 페놀, 100mM 인산칼륨, pH8.0
반응 용액 B : 50mM 4-아미노안티피린, 500U/ml 퍼옥시다제
이후, 96웰 마이크로플레이트를 사용하여, 반응 용액 A 49μl, 반응 용액 B 1μL, 2.5mM Gly 또는 100mM Gly 10μl, 초순수 20μl 및 0.5mg/ml GlyOX 20μl를 혼합하여 용액을 제조하고, 25℃에서 상기 용액의 파장 500nm에서의 흡광도의 3분 후 변화를 마이크로플레이트 리더(SpectraMax M2e, 몰레큘라 디바이스 재팬(Molecular Device Japan))를 사용하여 측정했다. 각각의 돌연변이형 GlyOX의 활성은 표 7 및 8에서 야생형 GlyOX의 활성에 대한 비로서 보여준다. 각각의 값은 동일한 샘플에 대해 실험을 3회 수행했을 때의 평균값으로부터 계산했다. 표 7 및 표 8은 직쇄상 DNA를 제작할 때 각각 야생형 유전자 및 목적 돌연변이 유전자를 주형으로 사용하여 합성한 단백질에 대한 결과를 보여준다.
표 7. 야생형에 대한 각각의 돌연변이형 GlyOX의 상대 활성
Figure 112015093907783-pct00007
표 8. 야생형에 대한 각각의 돌연변이형 GlyOX의 상대 활성
Figure 112015093907783-pct00008
[실시예 3] 안정성의 평가
실시예 1에서 합성된 야생형 효소 및 돌연변이형 효소의 안정성을 다음 절차에 의해 평가했다. 0.5mg/ml의 GlyOX를 마이크로튜브에 분배하고 4℃, 40℃, 50℃ 및 60℃에서 1시간 동안 항온처리했다. 이후, 각각의 효소 용액을 실시예 2에서와 동일한 조건하에서 반응시키지만, 단, 100mM Gly 기질 용액을 부가했다. 반응을 개시하고 10분 후 흡광도 변화로부터 활성을 측정했다. 4℃에서 항온처리된 효소 용액의 활성에 대한 비로서 잔존 활성을 수득하여 안정성을 평가했다. 그 결과를 표 9 및 10에서 보여준다. 표 9에서 돌연변이된 L301을 갖는 GlyOX에 대한 각각의 값은 실험이 동일한 샘플에 대해 2회 수행되었을 때의 평균값으로부터 계산되었다. 상기 값 이외의 GlyOX에 대한 각각의 값은 실험이 동일한 샘플에 대해 3회 수행되었을 때의 평균값으로부터 계산되었다. 표 9 및 10은 직쇄상 DNA를 제작할 때 각각 야생형 유전자 및 목적 돌연변이 유전자를 주형으로 사용하여 합성한 단백질에 대한 결과를 보여준다.
표 9. 1시간 동안 가열 후 야생형 및 각각의 돌연변이형 GlyOX의 잔존 활성
Figure 112015093907783-pct00009
표 10. 1시간 동안 가열 후 야생형 및 각각의 돌연변이형 GlyOX의 잔존 활성
Figure 112015093907783-pct00010
[실시예 4] 에스케리키아 콜라이를 사용한 GlyOX 정제 시스템 및 GlyOX의 정제
에스케리키아 콜라이를 사용한 GlyOX 재조합 발현 시스템을 구축했다. 우선, 재조합 발현용 플라스미드를 구축했다. DNA 프라이머 1(TAATTCCATGGCTAAAAGGCATTATGAAGCAGTGGTGATTG: 서열 번호: 3) 및 DNA 프라이머 2(TAATACTCGAGTATCTGAACCGCCTCCTTGCGATC: 서열 번호: 4)를 사용한 표준 PCR 방법에 의해 목적 유전자를 증폭시켰다. 이후, PCR 생성물 및 pET-28a(머크(Merck) KGaA)를 제한 효소 NcoI(다카라 바이오 인코포레이티드(Takara Bio Inc.)) 및 XhoI(다카라 바이오 인코포레이티드)로 분해시켰다. 분해된 PCR 생성물 및 pET-28a를 알칼리성 포스파타제(이. 콜라이 C75)(다카라 바이오 인코포레이티드)로 탈인산처리했다. 이후, QIAquick PCR 정제 키트(퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 제단백(deproteination) 및 불필요한 분해 단편들의 제거를 수행했다. 수득된 생성물들 모두를 Ligation High Ver. 2(도요보 캄파니 리미티드(Toyobo Co., Ltd.))를 사용하여 결찰시켰다. 표준 방법을 사용하여 에스케리키아 콜라이 DH5α 균주를 결찰 생성물로 형질전환시켜 형질전환체를 수득했다. 생성된 DH5α의 형질전환체로부터 플라스미드를 추출하고, 표준 DNA 서열 분석 방법을 사용하여 플라스미드 내로의 목적 유전자의 삽입을 확인했다. 이후 삽입된 목적 유전자를 갖는 플라스미드를 pET-28a-GlyOX로 지칭하고, pET28a-GlyOX로 형질전환된 BL21(DE3)의 형질전환체를 pET28a-GlyOX-BL21(DE3)로 지칭한다.
GlyOX를 다음과 같이 제조했다. 우선, 형질전환체 pET28a-GlyOX-BL21(DE3)을 이의 글리세린 스톡으로부터 25μg/mL의 카나마이신을 함유하는 LB 플레이트에 접종하고 37℃에서 밤새 정치 배양했다. 이후, 25μg/ml의 카나마이신을 함유한 LB 배지 50ml를 배플이 장착된 250ml 용량 플라스크에 넣고, LB 플레이트 위의 단일 콜로니를 상기 플라스크에 접종하고, 배지 중 콜로니를 37℃에서 밤새 선회 진탕으로 배양했다. 이후, 25μg/mL의 카나마이신을 함유하는 LB 배지 2L를 배플이 장착된 5L 용량 플라스크에 넣고, 밤새 배양된 상기 배지를 전량 상기 플라스크에 부가하고, OD660의 값이 0.5 내지 0.6에 도달할 때 IPTG를 최종 농도 0.5mM로 첨가했다. 선회 진탕시키면서 30℃에서 밤새 배양을 계속한 후 미생물 균체를 수집하고, 식염수로 세척하고, 파쇄용 완충액(20mM Tris-HCl, 0.02μM 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드, pH 8.0)에 현탁시키고 초음파 분쇄기(201M, 구보타 코포레이션(Kubota Corporation)으로부터 공급됨)를 사용하여 180W에서 20분 동안 처리했다. 이 파쇄된 미생물 균체 용액을 12,000×g에서 30분 동안 원심분리하고 상청액을 수집했다. 상기 상청액을 세척 완충액(50mM HEPES, 500mM NaCl, 20mM 이미다졸, 0.02μM 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드, pH 7.5)으로 평형화된 Ni Sepharose 6 Fast Flow(GE 헬쓰케어 재팬(GE Healthcare Japan)으로부터 공급됨)에 첨가한 후, 실온에서 5분 동안 온화하게 전도 혼합했다. 이후, Econo-Pac 컬럼(바이오-래드 레보러토리즈 인코포레이티드(Bio-Rad Laboratories Inc.)로부터 공급됨)을 사용하여 자유 낙하에 의해 용액을 제거했다. 세척 완충액으로 세척 후, 목적 단백질인 GlyOX를 용출 완충액(50mM HEPES, 500mM NaCl, 500mM 이미다졸, 0.02μM 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드, pH 7.5)으로 용출했다. GlyOX 용액에서, 한외여과에 의해 용매를 스톡 완충액(50mM 인산칼륨, 0.02μM 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드, pH 8.0)으로 대체하고 농도를 0.5mg/mL로 조정했다.
[실시예 5] 에스케리키아 콜라이를 사용한 돌연변이형 T42A/C245S/L301V의 제조
돌연변이형 T42A/C245S/L301V를 다음과 같이 제조했다. QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis 키트(애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies)로부터 공급됨)를 사용하고 pET28a-GlyOX를 주형으로 사용하여 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 GlyOX 유전자에 돌연변이를 도입했다. 다수의 돌연변이는 이미 돌연변이를 갖는 플라스미드를 주형으로 사용하여 또 다른 돌연변이를 추가하여 도입되었다. 이미 돌연변이를 갖는 이 플라스미드를 사용하여 실시예 4에 기재된 방법에 따라서 재조합 발현, 정제 및 용매 대체를 수행하여 돌연변이형 T42A/C245S/L301V를 수득했다.
[실시예 6] 에스케리키아 콜라이를 사용한 돌연변이형의 제조
목적 돌연변이형을 다음과 같이 제조했다. QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis 키트(애질런트 테크놀로지스로부터 공급됨)를 사용하고 pET28a-GlyOX를 주형으로 사용하여 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 GlyOX 유전자에 돌연변이를 도입했다. 다수의 돌연변이는 이미 돌연변이를 갖는 플라스미드를 주형으로 사용하여 또 다른 돌연변이를 추가하여 도입되었다. 이미 돌연변이를 갖는 이 플라스미드를 사용하여 하기 기재된 방법에 따라서 재조합 발현, 정제 및 용매 대체를 수행하여 목적 돌연변이형을 수득했다.
GlyOX를 다음과 같이 제조했다. 우선, 형질전환체 pET28a-GlyOX-BL21(DE3)을 이의 글리세린 스톡으로부터 25μg/mL의 카나마이신을 함유하는 LB 플레이트에 접종하고 37℃에서 밤새 정치 배양했다. 이후, 25μg/ml의 카나마이신을 함유한 LB 배지 50ml를 배플이 장착된 250ml 용량 플라스크에 넣고, LB 플레이트 위의 단일 콜로니를 상기 플라스크에 접종하고, 배지 중 콜로니를 37℃에서 밤새 선회 진탕으로 배양했다. 이후, 25μg/mL의 카나마이신을 함유하는 LB 배지 1L를 배플이 장착된 5L 용량 플라스크에 넣고, 밤새 배양된 상기 배지 중 10mL를 상기 플라스크에 부가하고, OD660의 값이 0.5 내지 0.6에 도달할 때 IPTG를 최종 농도 0.5mM로 첨가했다. 선회 진탕시키면서 30℃에서 밤새 배양을 계속한 후 미생물 균체를 수집하고, 식염수로 세척하고, 파쇄용 완충액(20mM Tris-HCl, 0.02μM 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드, pH 8.0)에 현탁시키고 초음파 분쇄기(201M, 구보타 코포레이션으로부터 공급됨)를 사용하여 180W에서 20분 동안 처리했다. 이 파쇄된 미생물 균체 용액을 12,000×g에서 30분 동안 원심분리하고 상청액을 수집했다. 상기 상청액을 세척 완충액(50mM HEPES, 500mM NaCl, 20mM 이미다졸, 0.02μM 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드, pH 7.5)으로 평형화된 HisTRap FF Crude(GE 헬쓰케어 재팬으로부터 공급됨)에 첨가했다. 세척 완충액으로 세척 후, 목적 단백질인 GlyOX를 용출 완충액(50mM HEPES, 500mM NaCl, 500mM 이미다졸, 0.02μM 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드, pH 7.5)으로 용출했다. GlyOX 용액에서, 한외여과에 의해 용매를 스톡 완충액(50mM 인산칼륨, 0.02μM 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드, pH 8.0)으로 대체하고 농도를 0.5mg/mL로 조정했다.
[실시예 7] 활성 측정
야생형 효소 및 실시예 6에서 합성된 돌연변이형 GlyOX 대한 활성을 평가했다. 구체적으로는, 실시예 2에서 보여주는 조성 중, 효소 용액을 실시예 6에서 제조된 GlyOX 용액으로 대체했다. 그 결과를 표 11에서 보여준다.
표 11. 야생형 효소에 대한 각각의 돌연변이형 GlyOX의 상대 활성
Figure 112015093907783-pct00011
[실시예 8] 안정성 평가
야생형 효소 및 실시예 6에서 합성된 돌연변이형 GlyOX 대한 안정성을 평가했다. 구체적으로는, 실시예 3에서 보여주는 조성 중, 효소 용액을 실시예 6에서 제조된 GlyOX 용액으로 대체했다. 그 결과를 표 12에서 보여준다.
표 12. 1시간 동안 가열 후 야생형 및 각각의 돌연변이형 GlyOX의 잔존 활성
Figure 112015093907783-pct00012
[실시예 9] 에스케리키아 콜라이를 사용한 돌연변이형 T42A/C245S/L301V/G304Q의 제조
돌연변이형 T42A/C245S/L301V/G304Q를 실시예 5에서와 동일한 방식으로 제조했다.
[실시예 10] 기질 특이성의 평가
야생형 효소, 돌연변이형 T42A/C245S/L301V 및 돌연변이형 T42A/C245S/L301V/G304Q에 대한 기질 특이성을 평가했다. 구체적으로는, 실시예 2에서 보여주는 조성 중, 효소 용액을 실시예 4, 5 또는 9에서 제조된 GlyOX 용액으로 대체했다. 기질로서, (1) 1mM Gly, (2) 표준 아미노산 20 종류, 시스틴, 타우린, 시트룰린, 오르니틴 및 α-아미노부티르산을 각각 1 mM로 함유하는 혼합 용액 또는 (3) (2)의 아미노산 25 종류의 혼합 용액에서 Gly를 제외하여 수득된 용액을 Gly 용액 대신에 사용했다. 평가를 위해 이들 용액을 사용하여 효소 활성을 측정했다. Try 및 시스틴을 2M HCl 용액에 용해시키고, 이들 외에 다른 아미노산을 0.1M HCl 용액에 용해시켜 100mM 용액을 제조했다. 각 아미노산 용액을 혼합한 후 생성된 혼합 용액을 초순수로 100배 희석하여 혼합 아미노산 용액을 제조했다. 이때, (1) 및 (3)에 혼합되지 않은 아미노산 용액 대신에 2M HCl 용액 및/또는 0.1M HCl 용액을 혼합했다. 활성은 37℃에서 파장 500nm에서의 흡광도 변화(ΔAbs500)를 마이크로플레이트 리더를 사용하여 검출함으로써 수득되었다. 야생형, 돌연변이형 T42A/C245S/L301V 및 돌연변이형 T42A/C245S/L301V/G304Q에 대한 결과를 각각 도 1, 2 및 3에서 보여준다. 상기 (1), (2) 및 (3)의 기질에 대한 조건을 각각 Gly, 25mix 및 25mix-Gly로 표현했다. 야생형, 돌연변이형 T42A/C245S/L301V 및 돌연변이형 T42A/C245S/L301V/G304Q 모두에서 Gly 이외의 아미노산에 대한 촉매 활성은 관찰되지 않았다. Gly이 다른 아미노산과 공존하는 조건하에서, 다른 아미노산(들)로 인한 반응 억제가 야생형 및 돌연변이형 T42A/C245S/L301V/G304Q에서 관찰되었다. 반응을 개시하고 10분 후 야생형의 ΔAbs500 값은 Gly만을 기질로 한 경우의 85%였다. 반응을 개시하고 10분 후 돌연변이형 T42A/C245S/L301V/G304Q의 ΔAbs500 값은 Gly 만을 기질로 한 경우의 52%였다. 돌연변이형 T42A/C245S/L301V에서 반응 억제는 관찰되지 않았고, 이의 성질은 개선되었다.
[실시예 11] Gly 농도-의존적인 흡광도 변화의 확인
돌연변이형 T42A/C245S/L301V 또는 돌연변이형 T42A/C245S/L301V/G304Q를 사용하여 반응 시스템에서 Gly 농도와 종점 방법에 의해 수득된 흡광도 사이의 관계를 확인했다. 우선, 반응 용액(4mM 페놀, 100mM HEPES, pH8.0)을 제조하고, 반응 용액 49μL, 50 mM 4-아미노안티피린 1μL, 500U/mL 퍼옥시다제 1μL, 각 농도의 Gly 수용액 10μl, 초순수 19μL 및 4.0mg/mL GlyOX 20μL를 혼합하여 용액을 제조했다. 10분 후 500nm 파장에서 이 용액의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정했다. 이 실험을 3회 수행하여 평균값을 얻었다. 실시예 5 또는 9에서 제조된 GlyOX 용액을 효소 용액으로 사용했다. 0mM (즉, 초순수), 0.025mM, 0.05mM, 0.1mM, 0.25mM, 0.5mM, 1mM 및 2.5mM의 농도로 제조된 Gly 수용액을 사용했다. 반응 시스템에서 Gly 농도 및 흡광도 사이의 관계는 도 4 또는 5에 나타낸 바와 같이 양호한 긍정적인 상관관계를 나타냈고, 이는 Gly이 본 효소를 사용하여 측정될 수 있음을 나타낸다. 도 4 또는 5에서의 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
[실시예 12] 혈장 중 Gly의 정량적 분석
사람 혈장 중 Gly의 수준을 돌연변이형 T42A/C245S/L301V 또는 돌연변이형 T42A/C245S/L301V/G304Q를 사용하여 정량적으로 분석했다. 반응 및 측정을 큐벳을 사용하여 37℃에서 수행했다. 실시예 11의 반응 용액 C 441μL, 50mM 4-아미노안티피린 9μL, 500U/mL 퍼옥시다제 9μL, 초순수 171μL 및 측정되는 검체로서 각 농도의 Gly 용액 또는 인간 혈장 90μL를 혼합하여 용액(총 용적 720μL)을 제조했다. 4.0mg/mL GlyOX 180μL를 이 용액에 부가하기 전 또는 부가하고 10분 후 파장 500nm 또는 800nm에서의 흡광도(Abs500nm(전), Abs500nm(후), Abs800nm(전), Abs800nm(후))를 측정했다. 실시예 5 또는 9에서 제조된 GlyOX 용액을 효소 용액으로 사용했다. 0M(즉, 초순수), 0.25mM 및 0.5mM의 농도에서 제조된 Gly 수용액을 사용했다.
Abs500nm - Abs800nm의 값을 반응 전후 각 측정 시점에서의 흡광도 값으로 사용했다. 효소의 첨가 전후 흡광도 값의 변화량(ΔAbs)은 [Abs500nm(후) - Abs800nm(후)] - [Abs500nm(전) - Abs800nm(전)]×720/900으로서 수득되었다. Gly 용액이 검체로서 사용될 때 ΔAbs 및 Gly 농도 사이의 관계로부터 표준 곡선을 작성하고, 사람 혈장이 검체로서 사용될 때의 ΔAbs로부터 사람 혈장 중 Gly 농도를 얻었다. 표준 곡선은 각 Gly 농도에서의 실험을 3회 수행했을 때 수득된 평균값을 사용하여 작성되었다. 동일 로트의 사람 혈장 샘플을 6회 분석하여 얻은 값을 아미노산 분석기를 사용하여 얻은 분석 값(332μM)과 비교했다. 이것을 방법 1로 사용했고, 결과를 표 13 및 14에서 보여준다. 또한 예를 들면, 인증 번호 제221AAAMX00010000호의 생체외 진단용 의약품인, DIACOLOR Liquid BTR(도요보 캄파니 리미티드로부터 공급됨)의 첨부 문서에 기재된 바와 같이, 공지된 농도의 분석 대상 성분을 토대로 한 흡광도 값에 대한 검체 중 분석 대상 성분을 토대로 한 흡광도 값의 비로부터 농도를 수득하는 방법(방법 2)이 이용가능하다. 이 방법 2에 의해 수득된 Gly 농도의 결과를 표 13 및 14에서 함께 보여준다. 두 방법 모두를 사용하여 정확성 및 정밀성에서 양호한 결과를 얻었고, 이는 사람 혈장 중 Gly 농도가 돌연변이형 GlyOX를 사용하여 Gly 측정 시스템에 의해 양호한 정확도로 정량적으로 분석될 수 있음을 나타냈다.
표 13. 돌연변이형 GlyOX T42A/C245S/L301V를 사용하여 사람 혈장 중 Gly 농도의 분석 결과, 및 아미노산 분석기에 의한 분석 값(332μM)으로부터의 괴리율(gap ratio).
Figure 112015093907783-pct00013
표 14. 돌연변이형 GlyOX T42A/C245S/L301V/G304Q를 사용하여 사람 혈장 중 Gly 농도의 분석 결과, 및 아미노산 분석기에 의한 분석 값(332μM)으로부터의 괴리율.
Figure 112015093907783-pct00014
산업상 이용가능성
본 발명의 변형된 효소는 글리신의 신속한 고감도 측정 및/또는 글리신 옥실레이트의 제조에 유용하다. 본 발명의 변형된 효소는 또한 액체 시약으로 유용하다. 본 발명의 변형된 효소는 추가로 글리신에 특이적인 측정에 유용하다. 본 발명의 분석 방법은 생체 연구, 건강 영양, 의료, 식품 제조 등과 같은 광범위한 분야에서 유용하다.
<110> AJINOMOTO CO., INC. <120> Modified glycine oxidase <130> PAMA-15234 <150> JP2013-073906 <151> 2013-03-29 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1107 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 atgaaaaggc attatgaagc agtggtgatt ggaggcggaa ttatcggttc cgcaattgct 60 tattatttgg caaaggaaaa caaaaacacc gcattgtttg aaagcggaac aatgggcggc 120 agaacgacaa gtgccgctgc cggaatgctg ggcgcccatg ccgaatgcga ggaacgtgac 180 gcgttttttg atttcgctat gcacagtcag cgtctgtaca aaggtcttgg agaagagctt 240 tatgcattat ccggtgtgga tatcaggcag cataacggcg gtatgtttaa gcttgcattt 300 tctgaagaag atgtgctgca gctgagacag atggacgatt tggactctgt cagctggtat 360 tcaaaagaag aggtgttaga aaaagagccg tatgcgtctg gtgacatctt tggtgcatct 420 tttattcagg atgatgtgca tgtggagcct tattttgttt gcaaggcata tgtgaaagca 480 gcaaaaatgc ttggggcgga gatttttgag catacgcccg tcctgcatgt cgaacgtgac 540 ggtgaagccc tgttcatcaa gacccctagc ggagacgtat gggctaatca tgttgtcgtt 600 gccagcgggg tgtggagcgg aatgtttttt aaacagcttg gactgaacaa tgcttttctc 660 cctgtaaaag gggagtgcct gtccgtttgg aatgatgata tcccgctgac aaaaacgctt 720 taccatgatc actgctatat cgtaccgaga aaaagcggaa gactggttgt cggcgcgaca 780 atgaagccgg gggactggag tgaaacaccg gatcttggcg gattggaatc tgttatgaaa 840 aaagcaaaaa cgatgctgcc ggctatacag aatatgaagg tggatcgttt ttgggcggga 900 ctccgtccgg gaacaaagga tggaaaaccg tacatcggca gacatcctga ggacagccgt 960 attttatttg cggctggcca tttcagaaac gggatcctgc ttgctcccgc aacgggcgct 1020 ttgatcagtg atctcatcat gaataaagag gtcaaccaag actggctgca cgcattccga 1080 attgatcgca aggaggcggt tcagata 1107 <210> 2 <211> 369 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 2 Met Lys Arg His Tyr Glu Ala Val Val Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly 1 5 10 15 Ser Ala Ile Ala Tyr Tyr Leu Ala Lys Glu Asn Lys Asn Thr Ala Leu 20 25 30 Phe Glu Ser Gly Thr Met Gly Gly Arg Thr Thr Ser Ala Ala Ala Gly 35 40 45 Met Leu Gly Ala His Ala Glu Cys Glu Glu Arg Asp Ala Phe Phe Asp 50 55 60 Phe Ala Met His Ser Gln Arg Leu Tyr Lys Gly Leu Gly Glu Glu Leu 65 70 75 80 Tyr Ala Leu Ser Gly Val Asp Ile Arg Gln His Asn Gly Gly Met Phe 85 90 95 Lys Leu Ala Phe Ser Glu Glu Asp Val Leu Gln Leu Arg Gln Met Asp 100 105 110 Asp Leu Asp Ser Val Ser Trp Tyr Ser Lys Glu Glu Val Leu Glu Lys 115 120 125 Glu Pro Tyr Ala Ser Gly Asp Ile Phe Gly Ala Ser Phe Ile Gln Asp 130 135 140 Asp Val His Val Glu Pro Tyr Phe Val Cys Lys Ala Tyr Val Lys Ala 145 150 155 160 Ala Lys Met Leu Gly Ala Glu Ile Phe Glu His Thr Pro Val Leu His 165 170 175 Val Glu Arg Asp Gly Glu Ala Leu Phe Ile Lys Thr Pro Ser Gly Asp 180 185 190 Val Trp Ala Asn His Val Val Val Ala Ser Gly Val Trp Ser Gly Met 195 200 205 Phe Phe Lys Gln Leu Gly Leu Asn Asn Ala Phe Leu Pro Val Lys Gly 210 215 220 Glu Cys Leu Ser Val Trp Asn Asp Asp Ile Pro Leu Thr Lys Thr Leu 225 230 235 240 Tyr His Asp His Cys Tyr Ile Val Pro Arg Lys Ser Gly Arg Leu Val 245 250 255 Val Gly Ala Thr Met Lys Pro Gly Asp Trp Ser Glu Thr Pro Asp Leu 260 265 270 Gly Gly Leu Glu Ser Val Met Lys Lys Ala Lys Thr Met Leu Pro Ala 275 280 285 Ile Gln Asn Met Lys Val Asp Arg Phe Trp Ala Gly Leu Arg Pro Gly 290 295 300 Thr Lys Asp Gly Lys Pro Tyr Ile Gly Arg His Pro Glu Asp Ser Arg 305 310 315 320 Ile Leu Phe Ala Ala Gly His Phe Arg Asn Gly Ile Leu Leu Ala Pro 325 330 335 Ala Thr Gly Ala Leu Ile Ser Asp Leu Ile Met Asn Lys Glu Val Asn 340 345 350 Gln Asp Trp Leu His Ala Phe Arg Ile Asp Arg Lys Glu Ala Val Gln 355 360 365 Ile <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplifying a polynucleotide encoding glyoxydase gene <400> 3 taattccatg gctaaaaggc attatgaagc agtggtgatt g 41 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplifying a polynucleotide encoding glyoxydase gene <400> 4 taatactcga gtatctgaac cgcctccttg cgatc 35 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplifying a polynucleotide encoding glyoxydase gene <400> 5 taattgaatt catgaaaagg cattatgaag cagtggtgat tg 42 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplifying a polynucleotide encoding glyoxydase gene <400> 6 taatatctag atcagtggtg gtggtggtgg tgctc 35

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  11. 적어도 하나의 아미노산 잔기가 글리신의 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 1 이상의 특성을 개선시키도록 돌연변이된 변형된 효소로서, 상기 1 이상의 특성은
    (a) 글리신에 대한 글리신 옥시다제의 활성;
    (b) 글리신 옥시다제의 열 안정성; 및
    (c) 글리신에 대한 글리신 옥시다제의 기질 특이성으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며,
    상기 변형된 효소는 하기 (1) 또는 (2)의 단백질인, 변형된 효소:
    (1) 서열 번호:2의 아미노산 서열에서 TTS 모티프 중 제1 트레오닌, TTS 모티프 중 세린, HCY 모티프 중 시스테인, LRP 모티프 중 류신, GML 모티프 중 메티오닌, SG 모티프 중 세린 및 PGT 모티프 중 글리신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 하기 (i) 내지 (vii)의 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기들로 치환되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질:
    (i) 상기 TTS 모티프 중 제1 트레오닌의 치환의 경우
    알라닌, 세린, 시스테인 또는 글리신;
    (ii) 상기 TTS 모티프 중 세린의 치환의 경우
    리신;
    (iii) 상기 HCY 모티프 중 시스테인의 치환의 경우
    알라닌, 아스파르트산, 글리신, 히스티딘, 아스파라긴, 트립토판, 티로신 또는 세린;
    (iv) 상기 LRP 모티프 중 류신의 치환의 경우
    이소류신, 발린, 시스테인, 트레오닌 또는 프롤린;
    (v) 상기 GML 모티프 중 메티오닌의 치환의 경우
    이소류신;
    (vi) 상기 SG 모티프 중 세린의 치환의 경우
    아르기닌; 및
    (vii) 상기 PGT 모티프 중 글리신의 치환의 경우
    티로신 또는 글루타민; 또는
    (2) 서열 번호:2의 아미노산 서열에서 TTS 모티프 중 제1 트레오닌, TTS 모티프 중 세린, HCY 모티프 중 시스테인, LRP 모티프 중 류신, GML 모티프 중 메티오닌, SG 모티프 중 세린, 및 PGT 모티프 중 글리신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 상기 (i) 내지 (vii)의 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기들로 치환된 아미노산 서열에서 하나 또는 몇몇의 아미노산 잔기의 추가 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
  12. 제11항의 변형된 효소를 사용하여 시험 샘플에 함유된 글리신을 측정함을 포함하는 글리신의 분석 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 글리신의 측정을, 글리신의 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 하나 이상의 특성을 개선하도록 적어도 하나의 아미노산 잔기가 돌연변이되는 변형된 효소에 추가하여, 4-아미노안티피린 및 페놀, 및 퍼옥시다제를 사용하여 수행하며, 상기 1 이상의 특성은
    (a) 글리신에 대한 글리신 옥시다제의 활성;
    (b) 글리신 옥시다제의 열 안정성; 및
    (c) 글리신에 대한 글리신 옥시다제의 기질 특이성
    으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  14. 제11항의 변형된 효소를 사용하여 글리신으로부터 글리옥실산을 형성함을 포함하는 글리옥실산의 제조 방법.
  15. 제11항의 변형된 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  16. 제15항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  17. 제16항의 발현 벡터를 포함하는 형질전환체.
  18. 적어도 하나의 아미노산 잔기가 글리신의 측정과 관련된 글리신 옥시다제의 특성을 개선하도록 돌연변이된 변형된 효소의 제조 방법으로서, 제17항의 형질전환체를 사용하여 상기 변형된 효소를 형성함을 포함하는, 변형된 효소의 제조 방법.
  19. 제11항의 변형된 효소를 포함하는 글리신 분석용 키트.
  20. 제19항에 있어서, 반응용 완충 용액 또는 완충 염, 과산화수소 검출 시약, 암모니아 검출 시약 및 글리옥실산 검출 시약 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 글리신 분석용 키트.
  21. (a) 장치 및 (b) 제11항의 변형된 효소를 포함하는 글리신 분석용 검출 시스템.
  22. 제21항에 있어서, (c) 반응용 완충 용액 또는 완충 염, 과산화수소 검출 시약, 암모니아 검출 시약 및 글리옥실산 검출 시약 중 적어도 하나를 추가로 포함하고, 상기 장치가 마이크로채널(microchannel) 칩인, 글리신 분석용 검출 시스템.
  23. (a) 검출용 전극 및 (b) 검출용 전극에 고정 또는 배치된 제11항의 변형된 효소를 포함하는, 글리신 분석용 효소 센서.
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