CN105102620A - 经修饰的甘氨酸氧化酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了可用于测量甘氨酸浓度的手段和方法。具体地，本发明提供了经修饰的酶，其中至少一种氨基酸残基突变以改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性(例如甘氨酸氧化酶对甘氨酸的活性、甘氨酸氧化酶的热稳定性、和甘氨酸氧化酶对甘氨酸的底物特异性)；以及用于分析甘氨酸的方法，其包括使用经修饰的酶测量测试样品中含有的甘氨酸；等等。

Description

经修饰的甘氨酸氧化酶
技术领域
本发明涉及经修饰的甘氨酸氧化酶、使用该经修饰的甘氨酸氧化酶分析甘氨酸的方法等。
发明背景
已知氨基酸作为活体中的组成是非常重要的，并且一些氨基酸可以变为健康状况的指示物。例如，提示了血浆中的甘氨酸浓度与肥胖症有关(非专利文献1)。甘氨酸是各种食物中天然含有的，并且用作食物添加剂。因此，氨基酸(特别是甘氨酸)的测量在一大批领域(诸如生物学调查、健康营养、医学治疗和食物制造)中具有重要的意义。
使用诸如氨基酸分析仪、高效液相层析(HPLC)或LC-MS等仪器的方法广泛用作分析包括甘氨酸在内的氨基酸的方法。然而，这些仪器是大型且昂贵的，并且需要维护和操作仪器的技术知识和熟练程度，如此其引入、维护和利用需要高成本。还有，由于原则上有必要序贯分析每份样本，分析多份样本花费较长的时间。为了解决这些问题，已经开发出使用催化特定氨基酸的特异性反应的酶来分析氨基酸的方法，并且用于测量一些氨基酸的其试剂盒已经是商品化的。还已经实现了利用酶在电化学或光学上测量特定氨基酸的生物传感器(例如专利文献1，非专利文献2至4)。
已知甘氨酸氧化酶是对甘氨酸起作用的酶(例如非专利文献5)。
现有技术参考文献
专利文献
专利文献1：国际公开文本WO2005/075970
非专利文献
非专利文献1：P.Felig,E.Marliss,G.F.CahillJr.(1969)N.Engl.J.Med.281,811-816.
非专利文献2：A.Guerrieri,T.R.I.Cataldi,R.Ciriello.(2007)Sens.ActuatorsBChem.126,424-430.
非专利文献3：H.Olschewski,A.Erlenkotter,C.Zaborosch,G.-C.Chemnitius.(2000)EnzymeMicrob.Technol.26,537-543.
非专利文献4：H.Endo,Y.Hayashi,Y.Kitani,H.Ren,T.Hayashi,Y.Nagashima.(2008)Anal.Bioanal.Chem.391,1255-1261.
非专利文献5：L.Caldinelli,M.Pedotti,L.Motteran,G.Molla,L.Pollegioni(2009)Biochimie91,1499-1508.
非专利文献6：S.E.Carpenter,D.J.Merkler(2003)Anal.Biochem.323,242-246.
发明内容
本发明要解决的问题
在使用酶的前述氨基酸测量中，期望的是与氨基酸测量有关的酶的特性(例如酶的活性、稳定性和底物特异性)是卓越的。特别对于活性，在要在样本中检测的对象(诸如血液中的氨基酸)的浓度较低时，在底物浓度较低的条件下需要高活性。甘氨酸氧化酶的利用对于分析含有甘氨酸的样本是有希望的，但是它已经是有问题的，即迄今为止已经知道其性质的甘氨酸氧化酶在活性和稳定性上较低(例如非专利文献6)。还有，尚未对许多类型的氨基酸调查底物特异性。如上文描述，不可获得能够实际进行甘氨酸测量的酶。如此，尚未实现使用酶的测量甘氨酸的实际方法或用于测量甘氨酸的试剂盒和生物传感器。
用于解决问题的手段
作为一项广泛的研究，本发明人已经想到仅必须通过使用具有与甘氨酸测量有关的改善的特性的酶测量甘氨酸浓度，成功开发出具有此类改善的特性的甘氨酸氧化酶，并且如此完成本发明。
因而，本发明如下：
[1].一种经修饰的酶，其中至少一个氨基酸残基突变以改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶的一种或多种特性，其中所述一种或多种特性选自下组：
(a)所述甘氨酸氧化酶对甘氨酸的活性；
(b)所述甘氨酸氧化酶的热稳定性；和
(c)所述甘氨酸氧化酶对甘氨酸的底物特异性。
[2].[1]的经修饰的酶，其中所述突变是所述甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的一种或多种选自下组的取代：(a)TTS基序中的第一苏氨酸的取代，(b)TTS基序中的丝氨酸的取代，(c)HCY基序中的半胱氨酸的取代，(d)LRP基序中的亮氨酸的取代，(e)GML基序中的甲硫氨酸的取代，(f)SG基序中的丝氨酸的取代，和(g)PGT基序中的甘氨酸的取代。
[3].[2]的经修饰的酶，其中所述TTS基序中的第一苏氨酸被取代为丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸。
[4].[2]或[3]的经修饰的酶，其中所述TTS基序中的丝氨酸被取代为赖氨酸。
[5].[2]-[4]中任一项的经修饰的酶，其中所述HCY基序中的半胱氨酸被取代为丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、天冬酰胺、色氨酸、酪氨酸、或丝氨酸。
[6].[2]-[5]中任一项的经修饰的酶，其中所述LRP基序中的亮氨酸被取代为异亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、或脯氨酸。
[7].[2]-[6]中任一项的经修饰的酶，其中所述GML基序中的甲硫氨酸被取代为异亮氨酸。
[8].[2-7中任一项的经修饰的酶，其中所述SG基序中的丝氨酸被取代为精氨酸。
[9].[2]-[8]中任一项的经修饰的酶，其中所述PGT基序中的甘氨酸被取代为酪氨酸或谷氨酰胺。
[10].[1]-[9]中任一项的经修饰的酶，其中所述甘氨酸氧化酶源自芽孢杆菌属(Bacillus)。
[11].[1]-[10]中任一项的经修饰的酶，其是下述(1)或(2)的蛋白质：
(1)蛋白质，其包含在SEQIDNO:2的氨基酸中具有选自下组的一个或多个氨基酸残基的一个或多个取代的氨基酸序列：TTS基序中的第一苏氨酸、TTS基序中的丝氨酸、HCY基序中的半胱氨酸、LRP基序中的亮氨酸、GML基序中的甲硫氨酸、SG基序中的丝氨酸和PGT基序中的甘氨酸，所述一个或多个氨基酸残基取代为下述(i)-(vii)的一个或多个氨基酸残基：
(i)对于TTS基序中的第一苏氨酸的取代的丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、或甘氨酸；
(ii)对于TTS基序中的丝氨酸的取代的赖氨酸；
(iii)对于HCY基序中的半胱氨酸的取代的丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、天冬酰胺、色氨酸、酪氨酸或丝氨酸；
(iv)对于LRP基序中的亮氨酸的取代的异亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、或脯氨酸；
(v)对于GML基序中的甲硫氨酸的取代的异亮氨酸；
(vi)对于SG基序中的丝氨酸的取代的精氨酸；和
(vii)对于PGT基序中的甘氨酸的取代的酪氨酸或谷氨酰胺；或
(2)蛋白质，其包含在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有选自下组的一个或多个氨基酸残基的一个或多个取代的氨基酸序列中具有氨基酸残基的一个或几个补充突变的氨基酸序列：TTS基序中的第一苏氨酸、TTS基序中的丝氨酸、HCY基序中的半胱氨酸、LRP基序中的亮氨酸、GML基序中的甲硫氨酸、SG基序中的丝氨酸、和PGT基序中的甘氨酸，所述一个或多个氨基酸残基取代为上述(i)-(vii)的一个或多个氨基酸残基，并且具有选自下组的一种或多种改善的特性：
(a)所述甘氨酸氧化酶对甘氨酸的活性；
(b)所述甘氨酸氧化酶的热稳定性；和
(c)所述甘氨酸氧化酶对甘氨酸的底物特异性。
[12].一种用于分析甘氨酸的方法，其包括使用[1]-[11]中任一项的经修饰的酶测量测试样品中含有的甘氨酸。
[13.[12]的方法，其中除[1]-[11]中任一项的经修饰的酶外，使用4-氨基安体比林和酚及过氧化物酶实施甘氨酸的测量。
[14].一种生产乙醛酸的方法，其包括使用[1]-[11]中任一项的经修饰的酶，从甘氨酸形成乙醛酸。
[15].一种多核苷酸，其编码[1]-[11]中任一项的经修饰的酶。
[16].一种表达载体，其包含[15]的多核苷酸。
[17].一种转化体，其包含[16]的表达载体。
[18].一种生产经修饰的酶的方法，其包括使用[17]的转化体形成所述经修饰的酶，在所述经修饰的酶中至少一个氨基酸残基突变以改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶的特性。
[19].一种用于分析甘氨酸的试剂盒，其包含[1]-[11]中任一项的经修饰的酶。
[20].[19]的用于分析甘氨酸的试剂盒，其进一步包含下列至少一种：用于反应的缓冲剂溶液或缓冲剂盐、用于检测过氧化氢的试剂、用于检测氨的试剂和用于检测乙醛酸的试剂。
[21].一种用于分析甘氨酸的检测系统，其包含(a)装置和(b)[1]-[11]中任一项的经修饰的酶。
[22].[21]的用于分析甘氨酸的检测系统，其进一步包含(c)用于反应的缓冲剂溶液或缓冲剂盐、用于检测过氧化氢的试剂、用于检测氨的试剂和用于检测乙醛酸的试剂中的至少一种，且其中所述装置是微通道芯片。
[23].一种用于分析甘氨酸的酶传感器，其包含(a)用于检测的电极和(b)[1]-[11]中任一项的经修饰的酶，所述经修饰的酶是固定或保留在所述用于检测的电极上的。
发明效果
由于本发明的经修饰的酶对甘氨酸的活性得到增强，它可用于甘氨酸的快速且高度灵敏性测量和/或乙醛酸生产。由于本发明的经修饰的酶在水性溶液中的热稳定性上是卓越的，它在稳定性上也是卓越的。因此，本发明的经修饰的酶特别可用作液体试剂。此外，本发明的经修饰的酶可以特异性测量甘氨酸，因为它在对甘氨酸的底物特异性方面是卓越的。本发明的分析方法可用于一大批领域，诸如生物学调查、健康营养、医学治疗和食物制造。
附图简述
图1显示了每种野生型甘氨酸氧化酶对甘氨酸的底物特异性。(1)Gly：1mM甘氨酸，(2)25mix：含有各1mM的标准20种氨基酸、胱氨酸、牛磺酸、瓜氨酸、鸟氨酸和α-氨基丁酸的混合溶液，和(3)25mix-Gly：从25混合物扣除Gly的混合溶液(其在下文应当适用)。
图2显示了针对甘氨酸的突变体甘氨酸氧化酶(T42A/C245S/L301V)的底物特异性。
图3显示了针对甘氨酸的突变体甘氨酸氧化酶(T42A/C245S/L301V/G304Q)的底物特异性。
图4显示了通过使用突变甘氨酸氧化酶(T42A/C245S/L301V)的端点方法获得的吸光度与反应溶液中的Gly浓度之间的关系。
图5显示了通过使用突变甘氨酸氧化酶(T42A/C245S/L301V/G304Q)的端点方法获得的吸光度与反应溶液中的Gly浓度之间的关系。
具体实施方式
本发明提供了经修饰的酶。本发明的经修饰的酶可以是如下的酶，其中甘氨酸氧化酶中的至少一个氨基酸残基突变以改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性。
氨基酸残基的突变的例子可以包括取代、缺失、添加和插入，并且取代是优选的。
要突变的氨基酸残基是L-丙氨酸(A)、L-天冬酰胺(N)、L-半胱氨酸(C)、L-谷氨酰胺(Q)、L-异亮氨酸(I)、L-亮氨酸(L)、L-甲硫氨酸(M)、L-苯丙氨酸(F)、L-脯氨酸(P)、L-丝氨酸(S)、L-苏氨酸(T)、L-色氨酸(W)、L-酪氨酸(Y)、L-缬氨酸(V)、L-天冬氨酸(D)、L-谷氨酸(E)、L-精氨酸(R)、L-组氨酸(H)、L-赖氨酸(K)、或甘氨酸(G)，其是天然存在的L-α-氨基酸。当突变是取代、添加或插入时，要取代、添加或插入的氨基酸残基与要突变的氨基酸残基相同，如上文描述。在下文中，在氨基酸的描述中有时跳过L和α。
甘氨酸氧化酶(gly氧化酶：有时缩写为GlyOX)是催化下述反应的氧化还原酶(EC1.4.3.19)。
甘氨酸+H2O+O2→乙醛酸+NH3+H2O2
源自任何生物体(例如微生物，诸如细菌，放线菌和真菌，以及昆虫，鱼类，动物和植物)的酶可以用作衍生本发明的经修饰的酶的甘氨酸氧化酶。甘氨酸氧化酶的例子可以包括源自属于芽孢杆菌属(Bacillus)及其相关属的生物体的酶。与芽孢杆菌属相关的属的例子可以包括土芽孢杆菌属(Geobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)和海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)。与芽孢杆菌属相关的属属于芽孢杆菌科(Bacillaceae)，其与芽孢杆菌属类似。
属于芽孢杆菌属及其相关属的微生物的例子可以包括嗜气芽孢杆菌(Bacillusaerophilus)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、澳门芽胞杆菌(Bacillusmacauensis)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)、蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、芽孢杆菌物种(Bacillussp.)、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、和嗜热土芽胞杆菌(Geobacilluskaustophilus)。
优选地，在甘氨酸氧化酶中引入突变的位置是与甘氨酸氧化酶的活性中心紧密接近定位的氨基酸残基。已经对源自枯草芽孢杆菌的甘氨酸氧化酶报告了分析三维结构的结果(例如见PDBID:ING3、ING4、1RYI、3IF9)。本领域技术人员可以比对源自枯草芽孢杆菌的甘氨酸氧化酶的氨基酸序列与另一种甘氨酸氧化酶的氨基酸序列，并且如此可以容易地规定与源自除枯草芽孢杆菌外的生物体的甘氨酸氧化酶的活性中心紧密接近定位的氨基酸残基。
在一个优选的实施方案中，改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性的突变是野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中TTS基序中的第一苏氨酸(T)和/或丝氨酸(S)的取代。TTS基序由苏氨酸(T)-苏氨酸(T)-丝氨酸(S)的连续三个氨基酸残基构成。在TTS基序的C端的苏氨酸残基有时称为第一苏氨酸，并且在TTS基序的中心位置处的苏氨酸残基有时称为第二个苏氨酸。野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的TTS基序的位置可以随着酶的起源而不同。然而，本领域技术人员可以适当确定野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的TTS基序的位置，并且如此可以规定要取代的第一苏氨酸(T)和丝氨酸(S)的位置。一般地，在野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中，TTS基序位于42至44位的氨基酸区域内，并且第一苏氨酸(T)和丝氨酸(S)分别位于42和44位(见例如表1)。
表1：甘氨酸氧化酶中的TTS基序中的第一(T)的位置
在另一个优选的实施方案中，改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性的突变是野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的HCY基序中的半胱氨酸(C)取代。HCY基序由组氨酸(H)-半胱氨酸(C)-酪氨酸(Y)的连续三个氨基酸残基构成。野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的HCY基序的位置可以随着酶的起源而不同。然而，本领域技术人员可以适当确定野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的HCY基序的位置，并且如此可以规定要取代的半胱氨酸(C)的位置。一般地，在野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中，HCY基序位于244至252位的氨基酸区域内，并且半胱氨酸(C)位于245至251的位置(参见例如表2)。在HCY基序中的半胱氨酸(C)取代外，本发明的经修饰的酶可以进一步具有TTS基序中的第一苏氨酸(T)的上述取代，作为改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性的突变。
表2：甘氨酸氧化酶中的HCY基序中的半胱氨酸(C)位置
在又一个优选的实施方案中，改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性的突变是野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的LRP基序中的亮氨酸(L)取代。LRP基序由亮氨酸(L)-精氨酸(R)-脯氨酸(P)的连续三个氨基酸残基构成。野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的HCY基序的位置可以随着酶的起源而不同。然而，本领域技术人员可以适当确定野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的LRP基序的位置，并且如此可以规定要取代的亮氨酸(L)的位置。一般地，在野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中，LRP基序位于294至316位的氨基酸区域内，并且亮氨酸(L)位于294至314的位置(参见例如表3)。在LRP基序中的亮氨酸(L)取代外，本发明的经修饰的酶可以进一步具有TTS基序中的第一苏氨酸(T)的上述取代和/或HCY基序中的半胱氨酸(C)的上述取代，作为改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性的突变。
表3：甘氨酸氧化酶中的LRP基序中的亮氨酸(Leu)位置
在又一个优选的实施方案中，改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性的突变是野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的GML基序中的甲硫氨酸(M)取代。GML基序由甘氨酸(G)-甲硫氨酸(M)-亮氨酸(L)的连续三个氨基酸残基构成。野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的GML基序的位置可以随着酶的起源而不同。然而，本领域技术人员可以适当确定野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的GML基序的位置，并且如此可以规定要取代的甲硫氨酸(M)的位置。一般地，在野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中，GML基序位于45至59位的氨基酸区域内，并且甲硫氨酸(M)位于46至58的位置(参见例如表4)。在GML基序中的甲硫氨酸(M)取代外，本发明的经修饰的酶可以进一步具有TTS基序中的第一苏氨酸(T)和丝氨酸(S)的上述取代和/或HCY基序中的半胱氨酸(C)的上述取代和/或LRP基序中的亮氨酸(L)的上述取代，作为改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性的突变。
表4：甘氨酸氧化酶中的GML基序中的甲硫氨酸(M)的位置
在又一个优选的实施方案中，改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性的突变是野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的SG基序中的丝氨酸(S)取代。SG基序由丝氨酸(S)-甘氨酸(G)的连续两个氨基酸残基构成。野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的SG基序的位置可以随着酶的起源而不同。然而，本领域技术人员可以适当确定野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的SG基序的位置，并且如此可以规定要取代的丝氨酸(S)的位置。一般地，在野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中，SG基序位于190至204位的氨基酸区域内，并且丝氨酸(S)位于190至203的位置(参见例如表5)。在SG基序中的丝氨酸(S)取代外，本发明的经修饰的酶可以进一步具有TTS基序中的第一苏氨酸(T)和丝氨酸(S)的上述取代和/或HCY基序中的半胱氨酸(C)的上述取代和/或LRP基序中的亮氨酸(L)的上述取代和/或GML基序中的甲硫氨酸(M)的上述取代，作为改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性的突变。
表5：甘氨酸氧化酶中的SG基序中的丝氨酸(S)的位置
在又一个优选的实施方案中，改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性的突变是野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的PGT基序中的甘氨酸(G)取代。PGT基序由脯氨酸(P)-甘氨酸(G)-苏氨酸(T)的连续三个氨基酸残基构成。野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的PGT基序的位置可以随着酶的起源而不同。然而，本领域技术人员可以适当确定野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的PGT基序的位置，并且如此可以规定要取代的甘氨酸(G)的位置。一般地，在野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中，PGT基序位于303至317位的氨基酸区域内，并且甘氨酸(G)位于304至316的位置(参见例如表6)。在PGT基序中的甘氨酸(G)取代外，本发明的经修饰的酶可以进一步具有TTS基序中的第一苏氨酸(T)和丝氨酸(S)的上述取代和/或HCY基序中的半胱氨酸(C)的上述取代和/或LRP基序中的亮氨酸(L)的上述取代和/或GML基序中的甲硫氨酸(M)的上述取代和/或SG基序中的丝氨酸(S)的上述取代，作为改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性的突变。
表6：甘氨酸氧化酶中的PGT基序在的甘氨酸(G)的位置
可以通过对具有一种或多种自前述6种基序选择的基序的野生型酶引入一种或多种突变产生本发明的经修饰的酶。野生型酶可以具有选自前述6种基序的2种基序、3种基序、4种基序、5种基序或6种基序。
与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶的特性可以包括下列各项：
(a)甘氨酸氧化酶对甘氨酸的活性；
(b)甘氨酸氧化酶的热稳定性；和
(c)甘氨酸氧化酶对甘氨酸的底物特异性。
本发明的经修饰的酶可以仅具有前述特性之一，或者可以具有组合的两种或三种前述特性。
对于TTS基序中的第一苏氨酸(T)，改善至少一种自特性(a)至(c)选择的特性的突变(单独或与另一种/些突变组合的单一突变)的例子可以包括用丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)或甘氨酸(G)取代。
对于TTS基序中的丝氨酸(S)，改善至少一种自特性(a)至(c)选择的特性的突变(单独或与另一种/些突变组合的单一突变)的例子可以包括用赖氨酸(K)取代。
对于HCY基序中的半胱氨酸(C)，改善至少一种自特性(a)至(c)选择的特性的突变(单独或与另一种/些突变组合的单一突变)的例子可以包括用丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、天冬酰胺(N)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)或丝氨酸(S)取代。
对于LRP基序中的亮氨酸(L)，改善至少一种自特性(a)至(c)选择的特性的突变(单独或与另一种/些突变组合的单一突变)的例子可以包括用异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、半胱氨酸(C)、苏氨酸(T)、或脯氨酸(P)取代。
对于GML基序中的甲硫氨酸(M)，改善至少一种自特性(a)至(c)选择的特性的突变(单独或与另一种/些突变组合的单一突变)的例子可以包括用异亮氨酸(I)取代。
对于SG基序中的丝氨酸(S)，改善至少一种自特性(a)至(c)选择的特性的突变(单独或与另一种/些突变组合的单一突变)的例子可以包括用精氨酸(R)取代。
对于PGT基序中的甘氨酸(G)，改善至少一种自特性(a)至(c)选择的特性的突变(单独或与另一种/些突变组合的单一突变)的例子可以包括用酪氨酸(Y)或谷氨酰胺(Q)取代。
在一个实施方案中，改善甘氨酸氧化酶对甘氨酸的活性作为与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶的特性。甘氨酸氧化酶对甘氨酸的活性改善意味着相对于野生型酶对甘氨酸的活性，经修饰的酶对甘氨酸的活性增强。特别地，在下述情况中可以实现甘氨酸氧化酶对甘氨酸的活性的改善：当野生型甘氨酸氧化酶对甘氨酸的活性在预先确定的浓度时(在低或高浓度时)视为100时，在相同浓度时经修饰的甘氨酸氧化酶对甘氨酸的活性高于100。此类经修饰的酶实现以高灵敏性快速测量甘氨酸，因此可用于测量甘氨酸。相对于野生型酶的活性，经修饰的酶的活性的增强水平优选是1.3倍或更多，更优选1.5倍或更多，仍更优选1.7倍或更多，且特别优选2.0倍或更多。相对于野生型酶具有1.3倍或更多的活性增强的本发明的经修饰的酶中的突变的例子可以是(1)TTS基序中的第一苏氨酸(T)被取代为下述氨基酸残基、HCY基序中的半胱氨酸(C)被取代为下述氨基酸残基、或者LRP基序中的亮氨酸(L)被取代为下述氨基酸残基、或其组合，其适合于改善活性。
(1)适合于改善活性的取代
(1-1)在TTS基序中的第一苏氨酸(T)取代后的氨基酸残基
丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)或甘氨酸(G)
(1-2)在TTS基序中的丝氨酸(S)取代后的氨基酸残基
赖氨酸(K)
(1-3)在HCY基序中的半胱氨酸(C)取代后的氨基酸残基
丝氨酸(S)
(1-4)在LRP基序中的亮氨酸(L)取代后的氨基酸残基
异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、半胱氨酸(C)、或苏氨酸(T)
(1-5)对于PGT基序中的甘氨酸(G)，改善至少一种自特性(a)至(c)选择的特性的突变(单独或与另一种/些突变组合的单一突变)的例子可以包括用谷氨酰胺(Q)的取代。
在另一个实施方案中，改善甘氨酸氧化酶的热稳定性作为与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性。甘氨酸氧化酶的热稳定性的改善意指相对于野生型酶的热稳定性进一步增强经修饰的酶的热稳定性。特别地，可以在下述情况中实现甘氨酸氧化酶的热稳定性的改善：在于预先确定的高温(例如40℃、50℃或60℃的任何温度)的水性溶液中将酶处理预先确定的时间段(例如1小时)时，经修饰的酶的剩余活性高于野生型酶的剩余活性。水性溶液中的甘氨酸氧化酶的热稳定性测试可以具有作为用于评估甘氨酸氧化酶的稳定性(特别是液体稳定性)的加速测试的意义。因此，当经修饰的酶在水性溶液中的热稳定性较高时，经修饰的酶的稳定性(特别是液体稳定性)也趋向于较高。显示高液体稳定性的酶可以以液体形式贮存较长的时间段，如此，此类经修饰的酶可用作测量甘氨酸的液体试剂。相对于野生型酶的热稳定性，经修饰的酶的热稳定性的增强水平优选是1.1倍或更多，且更优选1.2倍或更多。相对于野生型酶具有1.1倍或更多倍增强的热稳定性的本发明的经修饰的酶中的突变的例子可以是(2)HCY基序中的半管氨酸(C)被取代为下述氨基酸残基，其适合于热稳定性的改善。
(2)适合于改善热稳定性的取代
(2-1)在TTS基序中的第一苏氨酸(T)取代后的氨基酸残基
丙氨酸(A)、丝氨酸(S)或甘氨酸(G)
(2-2)在TTS基序中的丝氨酸(S)取代后的氨基酸残基
赖氨酸(K)
(2-3)在HCY基序中的半胱氨酸(C)取代后的氨基酸残基
丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、天冬酰胺(N)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)或丝氨酸(S)
(2-4)在LRP基序中的亮氨酸(L)取代后的氨基酸残基
异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、脯氨酸(P)、或半胱氨酸(C)
(2-5)对于GML基序中的甲硫氨酸(M)，改善至少一种自特性(a)至(c)选择的特性的突变(单独或与另一种/些突变组合的单一突变)的例子可以包括用异亮氨酸(I)取代。
(2-6)对于SG基序中的丝氨酸(S)，改善至少一种自特性(a)至(c)选择的特性的突变(单独或与另一种/些突变组合的单一突变)的例子可以包括用精氨酸(R)取代。
(2-7)对于PGT基序中的甘氨酸(G)，改善至少一种自特性(a)至(c)选择的特性的突变(单独或与另一种/些突变组合的单一突变)的例子可以包括用酪氨酸(Y)或谷氨酰胺(Q)取代。
在又一个实施方案中，改善甘氨酸氧化酶对甘氨酸的底物特异性作为与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性。甘氨酸氧化酶对甘氨酸的底物特异性的改善意味着与野生型酶的反应性相比进一步增强经修饰的酶对甘氨酸的反应性，换言之，意味着经修饰的酶对除甘氨酸外的氨基酸的反应性降低。除甘氨酸外的氨基酸的例子可以包括除甘氨酸外的L-α-氨基酸。特别地，除甘氨酸外的氨基酸的例子可以包括除甘氨酸外的19种L-α-氨基酸、和胱氨酸、牛磺酸、瓜氨酸、鸟氨酸和α-氨基丁酸，其构成蛋白质。例如，甘氨酸氧化酶对甘氨酸的底物特异性已经得到改善的本发明的经修饰的酶的突变可以是TTS基序中的第一苏氨酸(T)被取代为下述氨基酸残基、HCY基序中的半胱氨酸(C)被取代为下述氨基酸残基、LRP基序中的亮氨酸(L)被取代为下述氨基酸残基、或其组合。
(3)适合于改善底物特异性的取代
(3-1)在TTS基序中的第一苏氨酸(T)取代后的氨基酸残基
丙氨酸(A)
(3-2)在HCY基序中的半胱氨酸(C)取代后的氨基酸残基
丝氨酸(S)
(3-3)在LRP基序中的亮氨酸(L)取代后的氨基酸残基
缬氨酸(V)
本发明的经修饰的酶还可以具有C端或N端的另一种肽组分(例如肽模块)。可以对本发明的经修饰的酶添加的另一肽组分的例子可以包括使目的蛋白的纯化变得容易的肽组分(例如标签模块，诸如组氨酸标签和strep-标签II；通常用于纯化目的蛋白质的蛋白质，诸如谷胱甘肽-S-转移酶和麦芽糖结合蛋白)、增强目的蛋白质的溶解度的肽组分(例如Nus-标签)、起蛋白伴侣作用的肽组分(例如触发因子)、和作为具有另一种功能的蛋白质或蛋白质域的肽组分或连接它们的接头。
本发明的经修饰的酶在具有上述突变的甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中还可以具有一个或几个氨基酸残基的补充突变(例如取代、缺失、插入和添加)，只要前述特性得到保留。例如，补充突变的数目是1至100，优选1至50，更优选1至40，仍更优选1至30，且最优选1至20或1至10(例如1、2、3、4或5)。本领域技术人员可以适当生成保留前述特性的此类经修饰的酶。在具有一个或多个补充突变的本发明的经修饰的酶中，相对于野生型酶的活性，经修饰的酶的活性的增强水平优选是1.3倍或更多，更优选1.5倍或更多，仍更优选1.7倍或更多，且特别优选2.0倍或更多。也在具有一个或多个补充突变的本发明的经修饰的酶中，相对于野生型酶的热稳定性，经修饰的酶的热稳定性的增强水平优选是1.1倍或更多，且更优选1.2倍或更多。
因此，本发明的经修饰的酶可以是下述(i)或(ii)：
(i)蛋白质，其包含具有甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的一个或多个选自下组的氨基酸残基的一种或多种突变(例如取代)的氨基酸序列并且具有改善的与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性：TTS基序中的第一苏氨酸、TTS基序中的丝氨酸、HCY基序中的半胱氨酸、LRP基序中的亮氨酸、GML基序中的甲硫氨酸、SG基序中的丝氨酸、和PGT基序中的甘氨酸；或
(ii)蛋白质，其包含具有氨基酸序列中的一个或几个氨基酸残基的补充突变的氨基酸序列并且保留改善的与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性，所述氨基酸序列具有甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的一个或多个选自下组的氨基酸的一种或多种突变(例如取代)：TTS基序中的第一苏氨酸、TTS基序中的丝氨酸、HCY基序中的半胱氨酸、LRP基序中的亮氨酸、GML基序中的甲硫氨酸、SG基序中的丝氨酸、和PGT基序中的甘氨酸。
本发明的经修饰的酶也可以是由于具有一个或多个前述突变和一个或多个补充突变两者而与其突变前的(野生型)甘氨酸氧化酶的氨基酸序列具有至少90％或更多序列同一性的氨基酸序列的。氨基酸序列同一性的百分比可以优选是92％或更多，更优选95％或更多，仍更优选97％或更多，且最优选98％或更多或99％或更多。
例如，可以使用Karlin和Altschul(Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993))的算法BLAST及Pearson(MethodsEnzymol.,183,63(1990))的FASTA测定氨基酸序列间的同一性。称为BLASTP的程序已经基于此算法BLAST开发(seehttp://www.ncbi.nlm.nih.gov)。如此，可以使用具有缺省设置的这些程序计算氨基酸序列间的同一性。还有，例如可以使用数值作为氨基酸序列间的同一性，所述数值通过使用ORF中编码的全长多肽部分并使用采用Lipman-Pearson法的来自GenetyxCorporation的软件GENETYXVer.7.09以百分比计算相似性获得，该软件GENETYXVer.7.09具有比较＝2的单元大小设置。可以采用从这些计算推出的数值间的最低值作为氨基酸序列间的同一性。
可以在氨基酸序列中引入补充突变的氨基酸残基的位置对于本领域技术人员来说是明显的。例如，可以参考氨基酸序列比对引入补充突变。特别地，本领域技术人员可以(1)比较多个同系物的氨基酸序列(例如以SEQIDNO:2表示的氨基酸序列和另一同系物的氨基酸序列)，(2)证明相对保守的区域和相对不保守的区域，然后(3)分别从相对保守的区域和相对不保守的区域预测能够发挥功能上重要作用的区域和不能发挥功能上重要作用的区域，如此识别结构和功能之间的关联性。已经对甘氨酸氧化酶报告了三维结构的分析结果，如上文描述的。如此，本领域技术人员可以基于三维结构的分析结果引入补充突变以实现前述特性的保留。引入补充突变的位点可以是除TTS基序中的第一苏氨酸、TTS基序中的丝氨酸、HCY基序中的半胱氨酸、LRP基序中的亮氨酸、GML基序中的甲硫氨酸、SG基序中的丝氨酸和PGT基序中的甘氨酸外的氨基酸残基，且优选是除TTS基序、TTS基序、HCY基序、LRP基序、GML基序、SG基序和PGT基序中的氨基酸残基外的氨基酸残基。
在氨基酸残基的补充突变是取代时，氨基酸残基的此类取代可以是保守取代。术语“保守取代”指用具有相似侧链的氨基酸残基取代给定的氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基的家族是本领域中公知的。此类家族的例子可以包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、在β位处具有分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)、具有含有羟基(例如具有含有羟基(例如醇、酚)基团的侧链的氨基酸(例如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)、和具有含硫的侧链的氨基酸(例如半胱氨酸、甲硫氨酸)。优选地，氨基酸的保守取代可以是天冬氨酸和谷氨酸之间的取代，精氨酸、赖氨酸和组氨酸之间的取代，色氨酸和苯丙氨酸之间的取代，苯丙氨酸和缬氨酸之间的取代，亮氨酸、异亮氨酸和丙氨酸之间的取代，以及甘氨酸和丙氨酸之间的取代。
可以使用本发明的转化体(其表达本发明的经修饰的酶)、无细胞系统等制备本发明的经修饰的酶。例如，可以通过生成用本发明的经修饰的酶的表达载体，并将此表达载体导入宿主中来生成本发明的转化体。
本发明的表达载体包含编码本发明的经修饰的酶的本发明的多核苷酸(例如DNA、RNA)。在本发明的多核苷酸外，本发明的表达载体可以进一步包含区域，诸如编码启动子、终止子和药物(例如四环素、氨苄青霉素、卡那霉素、潮霉素、膦丝菌素)抗性基因的区域。本发明的表达载体可以是质粒或整合型载体。本发明的表达载体也可以是病毒载体或用于无细胞系统的载体。本发明的表达载体可以进一步包含在本发明的多核苷酸的3’或5’端侧的编码另一种可以对本发明的经修饰的酶添加的肽组分的多核苷酸。编码另一种肽组分的多核苷酸的例子可以包括编码如上文描述的使目的蛋白的纯化变得容易的肽组分的多核苷酸、编码如上文描述的增强目的蛋白的溶解度的肽组分的多核苷酸、编码起蛋白伴侣作用的肽组分的多核苷酸、和编码作为具有另一种功能的蛋白质或蛋白质域的肽组分或连接它们的接头的多核苷酸。包含编码另一种肽组分的多核苷酸的各种表达载体是可用的。因此，可以利用此类表达载体来生成本发明的表达载体。例如，可以利用包括编码使目的蛋白的纯化变得容易的肽组分的多核苷酸的表达载体(例如pET-15b、pET-51b、pET-41a、pMAL-p5G)、包含编码增强目的蛋白的溶解度的肽组分的多核苷酸的表达载体(例如pET-50b)、包含编码起蛋白伴侣作用的肽组分的多核苷酸的表达载体(pColdTF)、和包含编码作为具有另一种功能的蛋白质或蛋白质域的肽组分或连接它们的接头的多核苷酸的表达载体。为了能够在蛋白质表达后从对其添加的另一种肽组分切割出本发明的经修饰的酶，本发明的表达载体可以包含编码在编码本发明的经修饰的酶的多核苷酸和编码另一种肽组分的多核苷酸之间的蛋白酶切割位点的区域。
可以使用多种原核细胞和多个真核细胞作为宿主来表达本发明的经修饰的酶，所述原核细胞包括来自属于埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌(Escherichiacoli))、棒杆菌属(Corynebacterium)(例如谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum))和芽孢杆菌属(Bacillus)(例如枯草芽孢杆菌)的细菌的细胞，所述真核细胞包括来自属于酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))、毕赤酵母(Pichia)(例如树干毕赤酵母(Pichiastipitis))和曲霉属(Aspergillus)(例如米曲霉(Aspergillusoryzae))的真菌的细胞。可以使用已经缺失了某种基因的菌株作为宿主。转化体的例子可以包括载体保留于其胞质内的转化体和目的基因整合入其基因组中的转化体。
可以使用给定的培养容器(例如试管、烧瓶、发酵缸(jarfermenter))在具有随后描述的组成的培养基中培养本发明的转化体。可以适当确定培养条件。具体地，培养温度可以是10至37℃，pH值可以是6.5至7.5，并且培养期可以是1至100小时。也可以在管理溶解氧浓度的情况中实施培养。在此情况中，可以使用溶解氧浓度(DO值)作为控制的指标。可以控制通风/搅拌条件，从而在空气中的氧气浓度是21％时相对溶解氧浓度DO值不低于例如1至10％，且优选不低于3至8％。培养可以是分批培养或补料-分批培养。在补料-分批培养的情况中，也可以通过对培养基连续或不连续序贯添加作为糖来源的溶液和含有磷酸的溶液继续培养。
要转化的宿主是如上文描述的，并且详细描述了大肠杆菌，宿主可以选自大肠杆菌K12亚种大肠杆菌JM109菌株、DH5α菌株、HB101菌株、BL21(DE3)菌株等。实施转化的方法和选择转化体的方法已经记载于MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition,ColdSpringHarborpress(2001/01/15)等。在下文中，仅举例而言会明确描述生成经转化的大肠杆菌并使用此菌生成预先确定的酶的方法。
一般可以使用用于在大肠杆菌中生成外来蛋白质的启动子作为用于表达本发明的多核苷酸的启动子。其例子可以包括有力的启动子，诸如PhoA、PhoC、T7启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、lambda噬菌体的PR和PL启动子、和T5启动子，并且PhoA、PhoC和lac启动子是优选的。例如，pUC(例如pUC19、pUC18)、pSTV、pBR(例如pBR322)、pHSG(例如pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398)、RSF(例如RSF1010)、pACYC(例如pACYC177、pACYC184)、pMW(例如pMW119、pMW118、pMW219、pMW218)、pQE(例如pQE30)及其衍生物可以用作载体。来自噬菌体DNA的载体也可以用作另一种载体。此外，也可以使用包含启动子并且可以表达插入DNA序列的表达载体。优选地，载体可以是pUC、pSTV、或pMW。
还有，可以在本发明的多核苷酸下游连接作为转录终止序列的终止子。此类终止子的例子可以包括T7终止子、fd噬菌体终止子、T4终止子、四环素抗性基因的终止子、和大肠杆菌trpA基因的终止子。
优选地，用于将本发明的多核苷酸导入大肠杆菌中的载体是所谓的多拷贝类型，并且其例子可以包括具有来自ColE1的复制起点的质粒，诸如基于pUC的质粒、基于pBR322的质粒或其衍生物。在这里，“衍生物”意指那些已经对质粒给予核苷酸的修饰(诸如取代、缺失、插入和/或添加)的。
为了选择转化体，载体优选具有标志物，诸如氨苄青霉素抗性基因。具有有力启动子的表达载体以此类质粒(例如基于pUC的(从TakaraBioInc.供应)、基于pPROK的(从Clontech供应)、基于pKK233-2的(从Clontech供应))商品化。
可以通过使用本发明的所得表达载体转化大肠杆菌并培养此大肠杆菌获得本发明的经修饰的酶。
可以使用一般用于培养大肠杆菌的培养基(诸如M9/酪蛋白氨基酸培养基和LB培养基)作为培养基。培养基可以含有预先确定的碳源、氮源、和辅酶(例如盐酸吡哆醇)。具体地，可以使用蛋白胨、酵母提取物、NaCl、葡萄糖、MgSO4、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸铁、硫酸锰等。根据载体中的标志物和启动子的类型和要使用的宿主等，适当选择培养条件和生产诱导条件。
可以通过下述方法回收本发明的经修饰的酶。可以通过收集本发明的转化体，随后粉碎(例如超声处理或匀浆化)或裂解(例如用溶酶体处理)微生物细胞以经粉碎或裂解的产物获得本发明的经修饰的酶。可以通过使此类经粉碎或裂解的产物经受诸如提取、沉淀、过滤和柱层析等技术获得本发明的经修饰的酶。
本发明还提供了分析甘氨酸的方法。本发明的分析方法可以包括使用本发明的经修饰的酶测量测试样品中含有的甘氨酸。
测试样品没有特别限制，只要怀疑样品含有甘氨酸，并且其例子可以包括生物样品(例如血液、尿液、唾液、泪液等)及食物和饮料(例如营养饮料和氨基酸饮料)。测试样品中的甘氨酸可以为低浓度(例如小于1mM，诸如1μM以上且小于1mM的浓度)或高浓度(1mM以上，诸如1mM以上且小于1M的浓度)。
本发明的分析方法没有特别限制，只要可以使用本发明的经修饰的酶测量甘氨酸。方法可以检测形成的乙醛酸，或者可以检测与乙醛酸形成一起作为副产物生成的NH3或H2O2。或者，可以偶联另一种反应以检测共轭反应(conjugatereaction)的产物。此类共轭反应的例子可以包括下述共轭反应。
甘氨酸氧化反应：由甘氨酸氧化酶催化的反应
甘氨酸+H2O+O2→乙醛酸+NH3+H2O2
共轭反应：由过氧化物酶催化的反应
2H2O2+4-氨基安体比林(Aminoantipyrine)+酚→醌亚胺(Quinoneimine)染料+4H2O
在利用上述共轭反应时，在本发明的经修饰的酶外，可以使用4-氨基安体比林和酚及过氧化物酶实施甘氨酸的测量。具体地，如下测量甘氨酸，即混合测试样品与4-氨基安体比林和酚及水性溶液(例如缓冲液)中的过氧化物酶，然后使混合的样品经受上述酶促反应，最终检测形成的醌亚胺染料的吸光度(约500nm)。可以定性或定量实施测量。测量可以基于在使全部底物起反应前一直实施测量的端点方法或者基于评级法(ratingmethod)(起始速率法(initialratemethod))实施。氧化反应需要的氧气量非常小，并且需要的氧气量被反应系统中的溶解氧覆盖。如此，一般地，没有必要对反应系统强制供应氧气或含有氧气的气体。
本发明的经修饰的酶与除甘氨酸外的氨基酸(例如L-α-氨基酸)不起反应或者与其具有低反应性。因此，即使在测试样品中不仅含有甘氨酸而且还含有其它氨基酸时，可以通过使用本发明的经修饰的酶特异性评估测试样品中的甘氨酸的量。
可以使用本发明的经修饰的酶通过使用过氧化氢电极特异性评估测试样品中的甘氨酸的量。
此外，本发明包括用于分析甘氨酸的试剂盒，其包含(A)本发明的经修饰的酶。
本发明的试剂盒可以进一步包含下列至少一项：(B)用于反应的缓冲溶液或缓冲盐，(C)用于检测过氧化氢的试剂，(D)用于检测氨的试剂，和(E)用于检测乙醛酸的试剂。
(B)使用用于反应的缓冲溶液或缓冲盐来保持适合于目的酶促反应的反应溶液中的pH值。
(C)在例如通过颜色显现或荧光检测到过氧化氢时使用用于检测过氧化氢的试剂。例子可以包括过氧化物酶与可以变为其底物的颜色产生剂的组合。具体的例子可以包括但不限于辣根过氧化物酶与4-氨基安体比林和酚的组合。
(D)用于检测氨的试剂的例子可以包括组合酚与次氯酸的吲哚酚法。
(E)用于检测乙醛酸的试剂的例子可以包括非专利文献6中描述的试剂的组合。
本发明还提供了用于分析甘氨酸的检测系统，其包含(a)装置和(b)本发明的经修饰的酶。
本发明的经修饰的酶可以作为独立于能够在使用后的装置中被供应的微装置的单元存在，或者可以先前在装置中注射，对装置固定化或保留于装置上。优选地，以先前在装置中注射、对装置固定化或保留于装置上的形式提供本发明的经修饰的酶。将经修饰的酶直接或间接固定化于装置或保留于装置上。例如，适当地，可以使用微装置(诸如包含通道的微通道芯片)作为装置。
用于分析本发明的甘氨酸的检测系统可以进一步包含(c)用于反应的缓冲溶液或缓冲盐、用于检测过氧化氢的试剂、用于检测氨的试剂、和用于检测乙醛酸的试剂中的至少一种组分。用于分析本发明的甘氨酸的检测系统可以以组分(c)已经完全容纳于装置中的形式，或者以组分(c)已经部分容纳于装置中并且剩余部分尚未容纳于装置中的形式(例如在不同容器中容纳的形式)提供。在此情况中，在测量靶物质时，未容纳于装置中的组分(c)可以通过将其注射入装置中使用。
装置的例子可以包括(1)装置，其包含通过混合样品与组分(c)制备混合溶液的第一部分和通过使制备的混合溶液于本发明的经修饰的酶接触来检测甘氨酸的第二部分(在不同部分中实施混合步骤和检测步骤的装置)；(2)装置，其包含用于混合样品和组分(c)与本发明的经修饰的酶以通过本发明的经修饰的酶检测甘氨酸的部分(在同一部分中实施混合步骤和检测步骤的装置)；及(3)装置，其包含使样品和组分(c)(以及在有必要时本发明的经修饰的酶)能够混合的通道和通过本发明的经修饰的酶检测甘氨酸的部分(装置，其中在注射的入口中注射样品时，将样品送过通道以自动混合样品等，并且在检测部分中自动检测所得的混合溶液中的甘氨酸)。装置(3)(特别是微通道装置形式的装置(3))就自动化而言是优选的。在装置(3)中，本发明的经修饰的酶可以在通道中运行的发送溶液中提供或者可以以对检测部分固定化或保留的形式提供，并且优选以对检测部分固定化或保留的形式提供。
本发明还提供了用于分析甘氨酸的酶传感器，其包含(a)检测电极和(b)固定化或保留于检测电极上的本发明的经修饰的酶。本发明的经修饰的酶直接或间接固定化或保留于电极上。
例如，有可能使用用于检测过氧化氢的电极作为前述检测电极。更具体地，例子可以包括用于检测过氧化氢的酶电极和用于检测过氧化氢的分开膜电极。在此情况中，可能通过检测在甘氨酸被甘氨酸氧化活性氧化时生成的过氧化氢分析甘氨酸。已知传感器中采用的构造可以直接利用或者通过适当修饰作为与上文描述的那些构造不同的构造利用。
实施例
本发明会参考以下实施例详细描述，但是本发明不限于此。
[实施例1]使用无细胞合成系统合成GlyOX并纯化GlyOX
使用源自枯草芽孢杆菌168菌株的GlyOX的野生型基因或作为模板以制备具有引入的目的突变的构建体的线性DNA的目的突变体基因通过2步PCR法将组氨酸标签和TEV蛋白酶识别序列与N端侧融合。使用此DNA作为模板在源自大肠杆菌的无细胞合成反应系统中合成蛋白质。用对NiSepharoseHighPerformance(GEHealthcareJapan)的组氨酸标签亲和力纯化上清液级份以产生洗脱级份，所述上清液级份在离心通过使用1mL反应规模将透析法进行6小时合成的产物后获得。随后，通过SDS-PAGE和使用SYPROORANGE蛋白质凝胶染剂(LifeTechnologiesJapanLtd.)染色鉴定可认为目的酶的蛋白质的存在。通过Bradford法量化蛋白质，随后进行评估。对于野生型酶，以与上文相同的方式实施线性DNA的制备、无细胞合成、和酶的纯化和分析。使用下述缓冲液进行纯化。
结合缓冲液：750mMNaCl，20mMNaPi，pH8.0
清洗缓冲液：750mMNaCl，20mMNaPi，pH8.0
回收和测量缓冲液：300mMNaCl，50mMNaPi，34mMEDTA，pH7.0，10％D2O，0.01％NaN3
在表示具有多个引入的突变的突变体GlyOX时，每个引入的突变使用斜线区分并且连续描述。例如，突变体T42A/C245S表示具有T42A和C245S的两种突变的突变体GlyOX。WT表示是野生型。
[实施例2]活性的测量
通过下述规程评估实施例1中合成的野生型GlyOX和突变体GlyOX的活性。首先，制备下述反应溶液A和B。
反应溶液A：4mM酚，100mM磷酸钾，pH8.0
反应溶液B：50mM4-氨基安体比林，500U/mL过氧化物酶
随后，使用96孔微量板，混合49μL反应溶液A，1μL反应溶液B，10μL2.5mMGly或100mMGly，20μL超纯水，和20μL0.5mg/mLGlyOX以制备溶液，并且使用微板读板仪(SpectraMaxM2e,MolecularDeviceJapan)测量于25℃在3分钟后溶液的500nm波长的吸光度的变化。每种突变体GlyOX的活性在表7和8中以相对于野生型GlyOX的活性的比率显示。在实验针对相同样品进行三次时，从均值数值计算每个数值。表7和8显示了在制备线性DNA时分别使用野生型基因和目的突变体基因作为模板合成的蛋白质的结果。
表7：相对于野生型，每种突变体GlyOX的相对活性
表8：相对于野生型的每种突变体GlyOX的相对活性
[实施例3]稳定性的评估
通过下述规程评估实施例1中合成的野生型酶和突变体酶的稳定性。将0.5mg/mLGlyOX在微管中分配，并且于4℃，40℃，50℃和60℃温育1小时。随后，在与实施例2中相同的条件下使每种酶溶液起反应，只是添加100mMGly底物溶液。从开始反应后10分钟的吸光度变化测定活性。通过以相对于在4℃温育的酶溶液的活性的比率获得剩余活性评估稳定性。表9和10中显示了结果。从对相同样品将实验进行两次时的均值数值计算表9中的具有突变L301的GlyOX的每个数值。从对相同样品将实验进行三次时的均值数值计算除上文描述的那些GlyOX外的GlyOX的每个数值。表9和10显示了在制备线性DNA时分别使用野生型基因和目的突变体基因作为模板合成的蛋白质的结果。
表9：在加热1小时后野生型和每种突变体GlyOX的剩余活性。
表10：在加热1小时后野生型和每种突变体GlyOX的剩余活性。
[实施例4]使用大肠杆菌的用于GlyOX的表达系统和GlyOX的纯化
使用大肠杆菌构建用于GlyOX的重组表达系统。首先，构建用于重组表达的质粒。通过使用DNA引物1(TAATTCCATGGCTAAAAGGCATTATGAAGCAGTGGTGATTG:SEQIDNO:3)和DNA引物2(TAATACTCGAGTATCTGAACCGCCTCCTTGCGATC:SEQIDNO:4)的标准PCR方法扩增目的基因。随后，用限制酶NcoI(TakaraBioInc.)和XhoI(TakaraBioInc.)消化PCR产物和pET-28a(MerckKGaA)。将经消化的PCR产物和pET-28a用碱性磷酸酶(大肠杆菌C75)(TakaraBioInc.)进行脱磷酸化。随后，使用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)实施去蛋白质化(deproteination)和不必要消化片段的除去。使用LigationHighVer.2(ToyoboCo.,Ltd.)连接这两种所得的产物。使用标准方法用连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株以获得转化体。从所得的DH5α转化体提取质粒，并且使用DNA序列的标准分析方法鉴定目的基因对质粒的插入。在下文中，具有插入目的基因的此质粒称为pET-28a-GlyOX，并且用pET28a-GlyOX转化的BL21(DE3)转化体称为pET28a-GlyOX-BL21(DE3)。
如下制备GlyOX。首先，来自其甘油储液的转化体pET28a-GlyOX-BL21(DE3)接种至含有25μg/mL卡那霉素的LB板，并且于37℃静态培养过夜。随后，将50mL含有25μg/mL卡那霉素的LB培养基置于具有挡板的250mL体积烧瓶中，对其接种LB板上的单一菌落，并且于37℃在旋转摇动的情况下培养培养基中的菌落过夜。然后，将2L含有25μg/mL卡那霉素的LB培养基置于具有挡板的5L体积烧瓶中，将培养过夜的上述培养基完全添加至烧瓶，并且在OD660的数值达到0.5至0.6时添加终浓度0.5mM的IPTG。于30℃在旋转摇动的情况中继续培养过夜，然后收集微生物细胞，用盐水清洗，在破坏缓冲液(20mMTris-HCl，0.02μM黄素腺嘌呤二核苷酸，pH8.0)中悬浮，并于180W使用超声破坏装置(201M，从KubotaCorporation供应)处理20分钟。以12,000×g将经破坏的微生物细胞的此溶液离心30分钟，并收集上清液。将上清液添加至用清洗缓冲液(50mMHEPES，500mMNaCl，20mM咪唑，0.02μM黄素腺嘌呤二核苷酸，pH7.5)平衡的NiSepharose6FastFlow(suppliedfromGEHealthcareJapan)，然后，于室温通过倒置温和混合5分钟。随后，使用Econo-Pac柱(从Bio-RadLaboratoriesInc.供应)通过自由降落除去溶液。在用清洗缓冲液清洗后，用洗脱缓冲液(50mMHEPES，500mMNaCl，500mM咪唑，0.02μM黄素腺嘌呤二核苷酸，pH7.5)洗脱作为目的蛋白的GlyOX。在GlyOX溶液中，通过超滤用储液缓冲液(50mM磷酸钾，0.02μM黄素腺嘌呤二核苷酸，pH8.0)更换溶剂，并将浓度调节至0.5mg/mL。
[实施例5]使用大肠杆菌制备突变体T42A/C245S/L301V
如下制备突变体T42A/C245S/L301V。使用QuikChangeLightning定点诱变试剂盒(从AgilentTechnologies供应)并使用pET28a-GlyOX作为模板依照产品所附的方案将突变引入GlyOX基因中。使用已经具有突变的质粒作为模板通过添加另一种突变引入多种突变。使用已经具有突变的此质粒通过根据实施例4中描述的方法实施重组表达、纯化和溶剂替换获得突变体T42A/C245S/L301V。
[实施例6]使用大肠杆菌制备突变体
如下制备目的突变体。使用QuikChangeLightning定点诱变试剂盒(从AgilentTechnologies供应)并使用pET28a-GlyOX作为模板依照产品所附的方案将突变引入GlyOX基因中。使用已经具有突变的质粒作为模板通过添加另一种突变引入多种突变。使用已经具有突变的此质粒通过根据下文描述的方法实施重组表达、纯化和溶剂替换获得目的突变体。
如下制备GlyOX。首先，来自其甘油储液的转化体pET28a-GlyOX-BL21(DE3)接种至含有25μg/mL卡那霉素的LB板，并且于37℃静态培养过夜。随后，将50mL含有25μg/mL卡那霉素的LB培养基置于具有挡板的250mL体积烧瓶中，对其接种LB板上的单一菌落，并且于37℃在旋转摇动的情况下培养培养基中的菌落过夜。然后，将1L含有25μg/mL卡那霉素的LB培养基置于具有挡板的5L体积烧瓶中，将10mL培养过夜的上述培养基添加至烧瓶，并且在OD660的数值达到0.5至0.6时添加终浓度0.5mM的IPTG。于30℃在旋转摇动的情况中继续培养过夜，然后收集微生物细胞，用盐水清洗，在破坏缓冲液(20mMTris-HCl，0.02μM黄素腺嘌呤二核苷酸，pH8.0)中悬浮，并于180W使用超声破坏装置(201M，从KubotaCorporation供应)处理20分钟。以12,000×g将经破坏的微生物细胞的此溶液离心30分钟，并收集上清液。将上清液添加至用清洗缓冲液(50mMHEPES，500mMNaCl，20mM咪唑，0.02μM黄素腺嘌呤二核苷酸，pH7.5)平衡的HisTRapFFCrude(从GEHealthcareJapan供应)。在用清洗缓冲液清洗后，用洗脱缓冲液(50mMHEPES，500mMNaCl，500mM咪唑，0.02μM黄素腺嘌呤二核苷酸，pH7.5)洗脱作为目的蛋白的GlyOX。在GlyOX溶液中，通过超滤用储液缓冲液(50mM磷酸钾，0.02μM黄素腺嘌呤二核苷酸，pH8.0)更换溶剂，并将浓度调节至0.5mg/mL。
[实施例7]活性的测量
对实施例6中合成的野生型酶和突变体GlyOX评估活性。具体地，在实施例2中显示的组成中，用实施例6中制备的GlyOX溶液替换酶溶液。表11中显示了结果。
表11：相对于野生型酶，每种突变体GlyOX的相对活性
*反应溶液中的Gly浓度
[实施例8]稳定性的评估
对实施例6中合成的野生型酶和突变体GlyOX评估稳定性。具体地，在实施例3中显示的组成中，用实施例6中制备的GlyOX溶液替换酶溶液。表12中显示了结果。
表12：在加热1小时后野生型和每种突变体GlyOX的剩余活性。
[实施例9]使用大肠杆菌制备突变体T42A/C245S/L301V/G304Q
以与实施例5中相同的方式制备突变体T42A/C245S/L301V/G304Q。
[实施例10]底物特异性的评估
对野生型酶、突变体T42A/C245S/L301V和突变体T42A/C245S/L301V/G304Q评估底物特异性。具体地，在实施例2中显示的组成中，用实施例4、5或9中制备的GlyOX溶液替换酶溶液。作为底物，使用(1)1mMGly，(2)含有各1mM的20种标准氨基酸，和胱氨酸，牛磺酸，瓜氨酸，鸟氨酸和α-氨基丁酸的混合溶液，或(3)通过从(2)25种氨基酸的混合溶液扣除Gly获得的溶液替换Gly溶液。使用这些溶液，测量酶促活性以进行评估。在2MHCl溶液中溶解Try和胱氨酸，并且在0.1MHCl溶液中溶解除它们之外的氨基酸以制备100mM溶液。混合相应的氨基酸溶液，然后用超纯水以100倍稀释所得的混合溶液以制备混合的氨基酸溶液。在此情况上，混合2MHCl溶液和/或0.1MHCl溶液替换不要在(1)和(3)中混合的氨基酸溶液。通过使用微板读板仪于37℃检测500nm波长的吸光度变化(ΔAbs500)获得活性。在图1、2和3中分别显示了野生型、突变体T42A/C245S/L301V和突变体T42A/C245S/L301V/G304Q的结果。用于上述(1)、(2)和(3)的底物的条件分别以Gly，25mix和25mix-Gly表示。在野生型、突变体T42A/C245S/L301V和突变体T42A/C245S/L301V/G304Q中都没有观察到针对除Gly外的氨基酸的催化活性。在Gly与其它氨基酸共存的条件下，在野生型和突变体T42A/C245S/L301V/G304Q中观察到由于其它氨基酸所致的反应抑制。开始反应后10分钟的野生型的ΔAbs500值是在单独的Gly是底物时的85％。开始反应后10分钟的突变体T42A/C245S/L301V/G304Q的ΔAbs500值是在单独的Gly是底物时的52％。在突变体T42A/C245S/L301V中没有观察到反应抑制，所述突变体T42A/C245S/L301V的性质是改善的。
[实施例11]确认以Gly浓度依赖性方式的吸光度变化
使用突变体T42A/C245S/L301V或突变体T42A/C245S/L301V/G304Q确认反应系统中的Gly浓度和通过端点方法获得的吸光度之间的关系。首先，制备反应溶液(4mM酚，100mMHEPES，pH8.0)，并通过混合49μL反应溶液，1μL50mM4-氨基安体比林，1μL500U/mL过氧化物酶，10μL每个浓度的Gly水性溶液，19μL超纯水和20μL4.0mg/mLGlyOX制备溶液。使用微板读板仪测量10分钟后此溶液的500nm波长的吸光度。将此实验实施三次，并且获得均值数值。使用实施例5或9中制备的GlyOX溶液作为酶溶液。使用在0mM(即超纯水)、0.025mM、0.05mM、0.1mM、0.25mM、0.5mM、1mM和2.5mM的浓度制备的Gly水性溶液。如图4或5中显示，反应系统中的Gly浓度和吸光度之间的关系展现出良好的正相关，这指示可以使用目前的酶测量Gly。图4或5中的误差棒表示标准差。
[实施例12]对血浆中的Gly的定量分析
使用突变体T42A/C245S/L301V或突变体T42A/C245S/L301V/G304Q定量分析人血浆中的Gly水平。使用小杯于37℃实施反应和测量。通过混合441μL实施例11中的反应溶液C，9μL50mM4-氨基安体比林，9μL500U/mL过氧化物酶，171μL超纯水，和90μL每种浓度的Gly溶液或作为要测量的样本的人血浆(总体积720μL)制备溶液。在对此溶液添加180μL4.0mg/mLGlyOX之前或之后10分钟测量500nm或800nm波长的吸光度(Abs500nm(之前)、Abs500nm(之后)、Abs800nm(之前)、Abs800nm(之后))。使用实施例5或9中制备的GlyOX溶液作为酶溶液。使用0M(即超纯水)、0.25mM和0.5mM浓度制备的Gly水性溶液。
使用Abs500nm-Abs800nm的数值作为反应之前和之后的每次测量点时的吸光度值。在添加酶之前和之后的吸光度值的变化量(ΔAbs)以[Abs500nm(之后)-Abs800nm(之后)]-[Abs500nm(之前)-Abs800nm(之前)]×720/900获得。在使用Gly溶液作为样本时，从ΔAbs和Gly浓度之间的关系产生标准曲线，并且在使用人血浆作为样本时，从ΔAbs获得人血浆中的Gly浓度。使用在将每个Gly浓度的实验实施三次时获得的均值数值产生标准曲线。比较通过将同一批次中的人血浆样品分析6次获得的数值与使用氨基酸分析仪获得的分析数值(332μM)。这用作方法1，并且结果显示于表13和14中。还有，例如如DIACOLORLiquidBTR(suppliedfromToyoboCo.,Ltd.)(具有标识号No.221AAAMX00010000的体外诊断用药物)的包装插页中描述，从基于样本中进行分析的组分的吸光度值与基于已知浓度的进行分析的组分的吸光度值的比率获得浓度的方法(方法2)是可用的。通过此方法2获得的Gly浓度的结果一起显示于表13和14中。使用这两种方法都获得在正确性和确立(elaboration)上良好的结果，这显示了可以使用突变体GlyOX通过使用Gly测量系统以良好的准确性定量分析人血浆中的Gly浓度。
表13：使用突变体GlyOXT42A/C245S/L301V得到的人血浆中的Gly浓度的分析结果，以及与通过氨基酸分析仪得到的分析结果(332μM)的差异比率(gapratio)。
甘氨酸浓度(μM)
表14：使用突变体GlyOXT42A/C245S/L301V/G304Q得到的人血浆中的Gly浓度的分析结果，以及与通过氨基酸分析仪得到的分析结果(332μM)的差异比率。
甘氨酸浓度(μM)
工业应用性
本发明的经修饰的酶可用于甘氨酸的快速且高度灵敏的测量和/或乙醛酸(glycineoxylate)的生产。本发明的经修饰的酶也可用作液体试剂。本发明的经修饰的酶进一步可用于对甘氨酸特异性的测量。本发明的分析方法可用于一大批领域，诸如生物学调查、健康营养、食品制造等。

Claims (23)

1.一种经修饰的酶，其中至少一个氨基酸残基突变以改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶的一种或多种特性，其中所述一种或多种特性选自下组：
(a)所述甘氨酸氧化酶对甘氨酸的活性；
(b)所述甘氨酸氧化酶的热稳定性；和
(c)所述甘氨酸氧化酶对甘氨酸的底物特异性。
2.根据权利要求1的经修饰的酶，其中所述突变是所述甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的一种或多种选自下组的取代：(a)TTS基序中的第一苏氨酸的取代，(b)TTS基序中的丝氨酸的取代，(c)HCY基序中的半胱氨酸的取代，(d)LRP基序中的亮氨酸的取代，(e)GML基序中的甲硫氨酸的取代，(f)SG基序中的丝氨酸的取代，和(g)PGT基序中的甘氨酸的取代。
3.根据权利要求2的经修饰的酶，其中所述TTS基序中的第一苏氨酸被取代为丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸。
4.根据权利要求2或3的经修饰的酶，其中所述TTS基序中的丝氨酸被取代为赖氨酸。
5.根据权利要求2-4中任一项的经修饰的酶，其中所述HCY基序中的半胱氨酸被取代为丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、天冬酰胺、色氨酸、酪氨酸、或丝氨酸。
6.根据权利要求2-5中任一项的经修饰的酶，其中所述LRP基序中的亮氨酸被取代为异亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、或脯氨酸。
7.根据权利要求2-6中任一项的经修饰的酶，其中所述GML基序中的甲硫氨酸被取代为异亮氨酸。
8.根据权利要求2-7中任一项的经修饰的酶，其中所述SG基序中的丝氨酸被取代为精氨酸。
9.根据权利要求2-8中任一项的经修饰的酶，其中所述PGT基序中的甘氨酸被取代为酪氨酸或谷氨酰胺。
10.根据权利要求1-9中任一项的经修饰的酶，其中所述甘氨酸氧化酶源自芽孢杆菌属(Bacillus)。
11.根据权利要求1-10中任一项的经修饰的酶，其是下述(1)或(2)的蛋白质：
(1)蛋白质，其包含在SEQIDNO:2的氨基酸中具有选自下组的一个或多个氨基酸残基的一个或多个取代的氨基酸序列：TTS基序中的第一苏氨酸、TTS基序中的丝氨酸、HCY基序中的半胱氨酸、LRP基序中的亮氨酸、GML基序中的甲硫氨酸、SG基序中的丝氨酸和PGT基序中的甘氨酸，所述一个或多个氨基酸残基取代为下述(i)-(vii)的一个或多个氨基酸残基：
(i)对于TTS基序中的第一苏氨酸的取代丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、或甘氨酸；
(ii)对于TTS基序中的丝氨酸的取代的赖氨酸；
(iii)对于HCY基序中的半胱氨酸的取代的丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、天冬酰胺、色氨酸、酪氨酸或丝氨酸；
(iv)对于LRP基序中的亮氨酸的取代的异亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、或脯氨酸；
(v)对于GML基序中的甲硫氨酸的取代的异亮氨酸；
(vi)对于SG基序中的丝氨酸的取代的精氨酸；和
(vii)对于PGT基序中的甘氨酸的取代的酪氨酸或谷氨酰胺；或
(2)蛋白质，其包含在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有选自下组的一个或多个氨基酸残基的一个或多个取代的氨基酸序列中具有氨基酸残基的一个或几个补充突变的氨基酸序列：TTS基序中的第一苏氨酸、TTS基序中的丝氨酸、HCY基序中的半胱氨酸、LRP基序中的亮氨酸、GML基序中的甲硫氨酸、SG基序中的丝氨酸、和PGT基序中的甘氨酸，所述一个或多个氨基酸残基取代为上述(i)-(vii)的一个或多个氨基酸残基，并且具有选自下组的一种或多种改善的特性：
(a)所述甘氨酸氧化酶对甘氨酸的活性；
(b)所述甘氨酸氧化酶的热稳定性；和
(c)所述甘氨酸氧化酶对甘氨酸的底物特异性。
12.一种用于分析甘氨酸的方法，其包括使用根据权利要求1-11中任一项的经修饰的酶测量测试样品中含有的甘氨酸。
13.根据权利要求12的方法，其中除根据权利要求1-11中任一项的经修饰的酶外，使用4-氨基安体比林和酚及过氧化物酶实施甘氨酸的测量。
14.一种生产乙醛酸的方法，其包括使用根据权利要求1-11中任一项的经修饰的酶，从甘氨酸形成乙醛酸。
15.一种多核苷酸，其编码权利要求1-11中任一项的经修饰的酶。
16.一种表达载体，其包含根据权利要求15的多核苷酸。
17.一种转化体，其包含根据权利要求16的表达载体。
18.一种生产经修饰的酶的方法，其包括使用根据权利要求17的转化体形成所述经修饰的酶，在所述经修饰的酶中至少一个氨基酸残基突变以改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶的特性。
19.一种用于分析甘氨酸的试剂盒，其包含根据权利要求1-11中任一项的经修饰的酶。
20.根据权利要求19的用于分析甘氨酸的试剂盒，其进一步包含下列至少一种：用于反应的缓冲剂溶液或缓冲剂盐、用于检测过氧化氢的试剂、用于检测氨的试剂和用于检测乙醛酸的试剂。
21.一种用于分析甘氨酸的检测系统，其包含(a)装置和(b)根据权利要求1-11中任一项的经修饰的酶。
22.根据权利要求21的用于分析甘氨酸的检测系统，其进一步包含(c)用于反应的缓冲剂溶液或缓冲剂盐、用于检测过氧化氢的试剂、用于检测氨的试剂和用于检测乙醛酸的试剂中的至少一种，且其中所述装置是微通道芯片。
23.一种用于分析甘氨酸的酶传感器，其包含(a)用于检测的电极和(b)根据权利要求1-11中任一项的经修饰的酶，所述经修饰的酶是固定或保留在所述用于检测的电极上的。
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