CN111041011A

CN111041011A - 一种草甘膦氧化酶突变体及其克隆、表达与应用

Info

Publication number: CN111041011A
Application number: CN201910851757.4A
Authority: CN
Inventors: 刘子铎; 吴高兵; 林拥军; 郭一鸣
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-09-10
Filing date: 2019-09-10
Publication date: 2020-04-21
Anticipated expiration: 2039-09-10
Also published as: CN111041011B

Abstract

本发明属于基因工程及分子生物学技术领域，具体涉及一种经定向进化技术人工改造的可显著提高草甘膦降解性能的草甘膦氧化酶突变体，并进一步公开了该突变体及其编码基因在新型耐草甘膦作物的培育以及草甘膦污染生物降解领域中的应用。本发明所述方案通过DNA改组技术(DNA shuffling)，基于已知的草甘膦氧化酶突变体，构建得到草甘膦氧化酶突变体库，并从大量的突变体中筛选得到了两个对草甘膦催化效率提高的突变体B5R18和B5R26。本发明所述突变体B5R18和B5R26具有很高的的草甘膦降解活性，有效解决了现有草甘膦氧化酶活性低的缺陷，在草甘膦抗性作物培育及草甘膦污染的降解处理等方面具有很大的潜在应用价值。

Description

一种草甘膦氧化酶突变体及其克隆、表达与应用

技术领域

本发明属于基因工程及分子生物学技术领域，具体涉及一种经定向进化技术人工改造的可显著提高草甘膦降解性能的草甘膦氧化酶突变体，并进一步公开了该突变体及其编码基因在新型耐草甘膦作物的培育以及草甘膦污染生物降解领域中的应用。

背景技术

草甘膦(商品名为Roundup)化学名N-磷酸亚甲基甘氨酸(N-(phosphonomethyl)glycine，GLP)，其分子式为C₃H₈NO₅P，相对分子量为169.1，草甘膦与甘氨酸结构类似，属于甘氨酸的衍生物。草甘膦是白色固体，无挥发性，其熔点高(200℃)、稳定性好、在水中溶解度低(1.2％，25℃)。草甘膦是一种非选择性、高效除草剂，在全球应用广泛，也是目前全球使用量最大的农药。草甘膦除草剂通常采用草甘膦的各种盐制剂(如草甘膦异丙胺盐、草甘膦钾盐等)应用，从而提供更加强烈的除草效果。

在生物体内，由于芳香族氨基酸会参与维生素、生物碱和吲哚衍生物等多种物质的合成，并在蛋白质合成、细胞分裂等过程中发挥重要的生物功能。因此，生物体内芳香族氨基酸的减少会严重干扰植物的正常代谢，并进而影响植物的生长发育(向文胜,张文吉etal.2000)。研究表明，莽草酸途径对于植物芳香族氨基酸的生物合成具有极其重要的地位，而这一途径的关键酶是5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)，该酶以PEP和3-磷酸莽草酸(shikimate-3-phosphate，S3P)为底物，催化合成5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸(EPSP)；随后分支酸合成酶催化EPSP形成芳香族氨基酸的前体物分支酸。草甘膦作为PEP的结构类似物，其在进入植物体内后会竞争性结合EPSPS，进而影响了EPSPS与PEP之间的正常结合，从而抑制EPSPS的活性，阻断莽草酸途径，导致次生产物代谢失调，使得植物的生长发育因此受到抑制甚至死亡，最终达到去除杂草的效果。草甘膦在发挥其除草功效的同时，随之带来的确是不得不面对的安全隐患，其中最重要的即是如何解决植物中草甘膦降解的问题。

在自然环境中，草甘膦可以被一些土壤微生物彻底分解。从上世纪八十年代开始，不断有微生物和基因被报道能够降解除草剂草甘膦，而且所报道的基因均来源于微生物，到目前为止尚未发现植物来源的草甘膦降解基因(Duke 2011)。目前已知的降解草甘膦的途径主要分为两种：其一是通过裂解草甘膦分子中的C-P键，将其降解为磷酸盐(Pi)和肌氨酸(sarcosine)；其二则是通过裂解草甘膦分子C-N生成AMPA和乙醛酸(Duke 2011)。草甘膦氧化还原酶(glyphosate oxidoreductase，GOX)和甘氨酸氧化酶(glycine oxidase，GO)都是已报道通过C-N裂解途径的降解型酶。自二十世纪八十年代，Monsanto公司即发现并阐明属于黄素氧化还原蛋白家族的GOX作用机制(Barry and Kishore 1995)，其在有氧条件下可以将草甘膦氧化，与此同时辅因子FAD被还原，形成还原态的FAD及乙醛酸和胺甲基磷酸之间的希夫碱(shiff base)，随后希夫碱水解产生乙醛酸和胺甲基磷酸，而还原态的FAD则被氧气再氧化，同时氧络黄素环作为中间体催化另一分子草甘膦生成乙醛酸和胺甲基磷酸。此外，由于早期发现的野生型GOX对草甘膦的活性并不高，Barry等人对GOX的编码基因进行了体外定向进化以期提高GOX对草甘膦的氧化活性。利用易错PCR方法对该基因进行随机突变，筛选获得一株活性提高10倍的突变体(对草甘膦的Km为2.6mM)。目前，GOX编码基因已经用于一些抗草甘膦的转基因作物的培育，并成功实现商业化，包括油菜(Brassicanapus)、玉米(Zea mays L)、甜菜(Beta vulgaris L.)等。

草甘膦作为甘氨酸的衍生物，与其结构较为相似，因此甘氨酸氧化酶(GO)能够通过断裂C-N键进而降解草甘膦。GO是一种四聚体黄素氧化酶，每个单体与一分子FAD非共价性地结合(Job,Marcone et al.2002,Job,Molla et al.2002)。与GOX不同的是，GO的催化活性依赖质子转移机制，有一些GO氧化降解草甘膦生成氨甲基磷酸和乙醛酸，同时产生H₂O₂。就序列相似性而言，GO与GOX的氨基酸序列相似性仅18.1％，而与D-氨基酸氧化酶的序列相似性更高，且氧化性质相似。同时，GO具有广泛的底物选择性，其对甘氨酸及甘氨酸的结构类似物均具有一定的氧化活性，进而使这些物质发生脱胺氧化，并生成相应的α-酮酸和过氧化氢。GO作为一类新的草甘膦降解酶的代表，经导入植物后有望实现植物对草甘膦的分解。然而，鉴于天然GO对草甘膦活性较低，限制了这类酶的广泛应用。

2009年，Pedotti等人基于枯草芽孢杆菌甘氨酸氧化酶(BsuGO)的晶体结构，利用理性设计的方法对该酶进行了体外定向改造。通过对11个氨基酸位点分别进行定点饱和突变，并将有益突变叠加，获得一株对草甘膦亲和性提高175倍(Km值达到0.5mM)、催化效率((k_cat/K_m)提高210倍(k_cat/K_m值为126mM^-1.min^-1)的突变体G51S/A54R/H244A(Pedotti，Rosini et al.2009)。这一突变体基因转入紫花苜蓿(Medicago sativa)，成功赋予其草甘膦抗性(Pollegioni,Schonbrunn et al.2011)。

可见，利用基因工程手段对甘氨酸氧化酶进行进化改造，以提高其对除草剂草甘膦的底物特异性和降解活性，对于草甘膦抗性作物的应用和推广具有十分重大的意义。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种草甘膦氧化酶突变体，以解决现有技术中草甘膦氧化酶对草甘膦的降解性能不足的问题；

本发明解决的第二个技术问题在于提供上述草甘膦氧化酶突变体的克隆、表达与应用。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种草甘膦氧化酶突变体，所述突变体包含如SEQ ID No：3(记为突变体B5R18)或SEQ ID No：4(记为突变体B5R26)所示的氨基酸序列。

具体的，所述草甘膦氧化酶突变体B5R18的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示，所述草甘膦氧化酶突变体B5R26的氨基酸序列如SEQ ID No：4所示。

本发明还公开了一种编码所述草甘膦氧化酶突变体的基因，包含如SEQ ID No：1(记为突变体B5R18)或SEQ ID No：2(记为突变体B5R26)所示的核苷酸序列。

具体的，编码所述草甘膦氧化酶突变体B5R18的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，编码所述草甘膦氧化酶突变体B5R26的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。

本发明还公开了一种含有所述草甘膦氧化酶突变体编码基因的表达载体。

本发明还公开了一种含有所述草甘膦氧化酶突变体编码基因的基因细胞系。

本发明还公开了一种含有所述草甘膦氧化酶突变体编码基因的重组菌。

本发明还公开了所述草甘膦氧化酶突变体在培育草甘膦抗性转基因作物或者培育能够降解草甘膦转基因作物领域中的应用。

本发明还公开了一种培育草甘膦抗性转基因作物和/或可降解草甘膦转基因作物的方法，即包括将所述的草甘膦氧化酶突变体转化入目的作物的步骤。

本发明还公开了一种构建草甘膦氧化酶突变体库的方法，包括以已知草甘膦氧化酶为突变模板构建重组质粒的步骤，以及将所得重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞进行基因表达的步骤，以形成草甘膦氧化酶突变体文库。

具体的，所述草甘膦氧化酶包括草甘膦氧化酶突变体B4S4、B4S6、B4S7、B4S9和/或B4S11；形成所述重组质粒的载体为pGEX-6p-1载体。

本发明还公开了按照所述方法构建的草甘膦氧化酶突变体库。

本发明所述方案通过DNA改组技术(DNA shuffling)，基于已知的草甘膦氧化酶突变体，构建得到草甘膦氧化酶突变体库，并从大量的突变体中筛选得到了两个对草甘膦催化效率提高的突变体B5R18和B5R26。

本发明所述方法进一步通过将所述突变体B5R18和B5R26的编码基因连接到pGEX-6p-1质粒载体上，分别形成重组质粒pGEX-6p-B5R18和pGEX-6p-B5R26，并将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞，通过GST亲和层析系统纯化获得B5R18突变体蛋白和B5R26突变体蛋白，利用邻联茴香胺ODA与辣根过氧化物酶HRP的酶偶联法测定其对草甘膦的氧化活性。本发明构建并筛选的草甘膦氧化酶B5R18对底物草甘膦的k_m＝0.051mM、k_cat＝9.74min^-1、k_cat/k_m＝190.98mM^-1min^-1；草甘膦氧化酶B5R26对草甘膦的k_m＝0.061mM、k_cat＝11.43min^-1、k_cat/k_m＝187.38mM^-1min^-1。可见，本发明所述突变体B5R18和B5R26具有很高的的草甘膦降解活性，有效解决了现有草甘膦氧化酶活性低的缺陷，在草甘膦抗性作物培育及草甘膦污染的降解处理等方面具有很大的潜在应用价值。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为本发明所述突变体基因库构建方法流程图；

图2为重组质粒pGEX-6p-B4S4的质粒图谱；

图3为重组质粒pGEX-6p-B4S6的质粒图谱；

图4为重组质粒pGEX-6p-B4S7的质粒图谱；

图5为重组质粒pGEX-6p-B4S9的质粒图谱；

图6为重组质粒pGEX-6p-B4S11的质粒图谱；

图7为表达载体pGEX-6p-1的质粒图谱；

图8为本发明构建的重组质粒pGEX-6p-B5R18的图谱；

图9为本发明构建的重组质粒pGEX-6p-B5R26的图谱；

图10为本发明构建的突变体B5R18和B5R26的SDS-PAGE检测图。

具体实施方式

前期研究中，我们通过体外定向进化技术，获得了对草甘膦具有降解活性的来自蜡状芽孢杆菌甘氨酸氧化酶(BceGO)的突变体B4S7(详见中国专利CN104450750A以及Int JBiol Macromol，2015，79:965-970中记载方案)，该突变体能够氧化分解草甘膦和甘氨酸，形成甲基磷酸/乙醛酸和H₂O₂。已有研究表明，突变体B4S7对草甘膦的K_m＝0.1mM，k_cat＝3.62min^-1，k_cat/K_m＝36.2mM^-1.min^-1，对甘氨酸的K_m＝50.34mM，k_cat＝2.18min^-1，k_cat/K_m＝0.04mM^-1.min^-1，突变体B4S7对草甘膦的特异性常数(k_cat/K_{m，草甘膦}与k_cat/K_m,_甘氨酸之比)为836(Int J Biol Macromol 79:965-970.)。

本发明下述实施例中涉及的突变体B4S4、B4S6、B4S7，B4S9和B4S11的构建方法详见Zhan,Zhang et al.2013,Yao,Lin et al.2015或者Int J Biol Macromol，2015，79:965-970。

实施例1利用DNA shuffling技术构建突变体文库

本实施例通过对上述前期已获得的突变体B4S4、B4S6、B4S7、B4S9和B4S11进行重组，以构建草甘膦氧化酶突变体库，并筛选对草甘膦亲和力和催化效率有较大提高的突变体。

分别以上述重组质粒pGEX-6p-B4S4、pGEX-6P-B4S6、pGEX-6p-B4S7、pGEX-6p-B4S9和pGEX-6p-B4S11为突变模板(Yao,Lin et al.2015)，参照Stemmer报道的DNA改组方法并运用超声波法处理DNA片段，进行DNA shuffling(Stemmer 1994,Miller,Pislaru etal.2002)，并将形成的重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，实现对蜡状芽孢杆菌甘氨酸氧化酶的进一步改良，从而获得具有更好的草甘膦降解活性的草甘膦氧化酶，并形成突变体文库。

(1)模板基因的扩增

如图1所示的构建路线图，以pGEX-6p-1(购自美国GE Healthcare公司，其质粒图谱见附图7所示)质粒载体进行重组质粒的构建，分别将上述突变体B4S4、B4S6、B4S7、B4S9和B4S11所获得的突变基因片段连接到pGEX-6p-1质粒载体上，分别获得重组质粒pGEX-6p-B4S4、pGEX-6P-B4S6、pGEX-6p-B4S7、pGEX-6p-B4S9和pGEX-6p-B4S11(上述重组质粒的质粒图谱分别见附图2-6所示)。

抽提上述pGEX-6p-B4S4、pGEX-6p-B4S6、pGEX-6p-B4S7、pGEX-6p-B4S9和pGEX-6p-B4S11重组质粒的DNA，分别作为模板，以如下质粒载体pGEX-6p-1的通用引物(6p-F/R)和TaqDNA聚合酶对上述5个突变体基因进行扩增，引物序列为：

6P-1F：5’-ATCCTCCAAAATCGGATCTGGAA-3’；

6P-1R：5’-GGCAGATCGTCAGTCAGTCACG-3’。

具体PCR反应体系见下表1。

表1PCR反应体系

10×PCR buffer	5μL
		10mM dNTPs	1μL
10μM引物6P-1F(正向引物)	1μL
		10μM引物6P-1R(反向引物)	1μL
模板(不同突变体GO基因)	1μL
		Taq DNA聚合酶	1μL
添加无菌ddH2O至总体积	50μL

PCR反应程序：

预变性：94℃、4min，94℃、30sec(变性)，52℃、30sec(退火)，72℃、90sec(延伸)，共30个循环；72℃、10min，15℃、5min。反应结束之后，用1％的琼脂糖凝胶回收纯化所扩增的片段，使用NanoDrop 1000微量紫外分光光度计测定各片段浓度，将各片段等量混合，37℃下使水分蒸发，将样品浓缩至浓度为30ng/μL以上。

(二)利用超声波处理DNA片段

超声波能够产生较强的机械剪切作用，导致DNA结构断裂。另外，超声波作用时产生的空泡效应和高温，都能将水溶液环境下的DNA的氢键破坏，从而导致DNA双螺旋结构的断裂。因此，本实施例采用超声波法(Miller,Pislaru et al.2002)进行DNA片段的破碎处理。

处理条件为：设置功率为600W，频率25kHz，将600μL的样品至于冰上，冰浴条件下进行超声波处理，每超声处理15s间歇8s。每10min取一次样，利用2％的琼脂糖凝胶电泳检测其大小，直到片段处理至大小为100-200bp。随后，以该小片段为模板，进行无引物PCR反应，反应程序见表2。

表2无引物PCR反应体系

10×PCR buffer	5μL
		10mM dNTPs	1μL
DNA片段(100-200bp)	42μL
		Taq DNA聚合酶	2μL
总体积	50μL

无引物PCR反应程序：94℃、3min(预变性)，94℃、30sec(变性)，40℃、30sec(退火)，72℃、20sec+1sec/循环(延伸)，共70个循环；72℃保温10min；15℃、5min。PCR反应完成之后，利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测产物大小。

(三)有引物PCR

以无引物PCR的产物为模板，利用甘氨酸氧化酶基因特异性引物(Zhan,Zhang etal.2013)：

BceGO-F：5’-CGCGGATCCATGTGTAAGAAGTATGATGTAGCGAT-3’；

ceGO-R：5’-CCGCTCGAGCTAAACTCTCCTAGAAAGCAATGAAT-3’；进行PCR扩增反应，以获得突变的基因片段，反应体系见表3。

表3有引物PCR反应体系

10×PCR buffer	5μL
		10mM dNTPs	1μL
10μM BceGO-F	1μL
		10μM BceGO-R	1μL
模板(无引物PCR产物)	5μL
		Taq DNA聚合酶	1μL
添加无菌ddH2O至总体积	50μL

PCR反应条件为：94℃、3min(预变性)，94℃、30sec(变性)，59℃、30sec(退火)，72℃、70sec(延伸)，共30个循环；72℃保温10min；15℃、5min。反应完成后，利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的大小。

(四)DNA shuffling突变文库的构建

将上述步骤(三)有引物PCR反应所得的片段纯化后，用BamHI和XhoI进行双酶切(双酶切体系如下表4)，酶切产物回收后与经BamHI和XhoI双酶切所形成的pGEX-6p-1载体在4℃进行酶连反应过夜(酶连反应体系如表5)。

表4双酶切体系

10×K buffer	10μL
		BamHI(5U/μL)	4μL
XhoI(5U/μL)	4μL
		有引物PCR扩增片段	60μL
添加无菌ddH<sub>2</sub>O至总体积	100μL

表5酶连反应体系

10×Ligation Buffer	1μL
		有引物PCR扩增双酶切片段	7μL
pGEX-6p-1-BamHI/XhoI载体	1μL
		T4 DNA ligase(5U/μL)	1μL
总体积	10μL

取1μL酶连产物与E.coli DH5α感受态混合，点击转化，加入600μL SOB培养基(配制方法：胰蛋白胨20g，酵母粉5g，量取10mL 250mmol/L KCl溶液、5mL、2mol/L的MgCl₂溶液，加入900mL、ddH₂O搅拌溶解后，调节pH至7.0，加ddH₂O定容至1L，分装后121℃下高压蒸汽灭菌30min。)于37℃复苏1h。随后，将复苏后的菌液涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB固体平板，37℃倒置培养12h至长出肉眼可见的单克隆。随机挑取10个克隆子检测插入率，并送测序公司进行测序验证，获得DNA shuffling突变文库。

实施例2突变体的筛选

本实施例方法参照(Zhan,Zhang et al.2013)等报道的筛选方法。

用灭菌的牙签挑取对照菌(含重组质粒pGEX-6p-B4S7的大肠杆菌E.coli DH5α)与突变库中的克隆子接种到含600μL液体LB培养基(添加氨苄青霉素至浓度为100μg/ml)的96深孔板中，同时将每孔的菌在氨苄抗性平板上备份保存。密封好96深孔板，37℃、200rpm振荡培养16h后，每孔加入含氨苄青霉素(100μg/ml)、IPTG(终浓度0.1mM)和T7噬菌体(Tarahovsky，Ivanitsky et al.1994)的LB液体培养基200μL，28℃、200rpm振荡培养6h，使蛋白诱导表达并被噬菌体裂解而释放；吸取裂解后的159μL粗酶液(裂解后的上清，含目标蛋白)加入96微孔板中，并加入20μL底物草甘膦(5mM)、20μL、3.2mg/mL邻联茴香胺溶液以及1μL、200U/mL辣根过氧化物酶，25℃条件下反应8h；随后利用全波长酶标仪扫描96微孔板，读取450nm处的吸光度值，挑出吸光值大于对照菌的突变体，降低草甘膦浓度进行复筛及验证，将最终获得的正突变体送上海生工生物工程股份有限公司测序公司测序并用于酶学性质分析。经筛选初步得到两个突变体，分别记为突变体B5R18和B5R26，测序分析其突变位点，结果如表6所示。

表6突变体中的氨基酸替换位点

所述草甘膦氧化酶突变体B5R18的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示，其编码的基因具有如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列；可见，B5R18含有如下突变：D103Y，D121G，S122P，R238K，K367R，T368R；

所述草甘膦氧化酶突变体B5R26的氨基酸序列如SEQ ID No：4所示，其编码的基因具有如SEQ ID No：2所示的核苷酸序列；可见，B5R26含有如下突变：S122P，H164R，Q346R，E357G，K367R，T368R。

可见，所述草甘膦氧化酶突变体B5R18和B5R26的基因全长均为1110bp，编码369个氨基酸。

实施例3突变体蛋白表达与纯化

分别将含突变体B5R18和B5R26基因的重组质粒pGEX-6p-B5R18(质粒图谱见附图8所示)、pGEX-6p-B5R26(质粒图谱见附图9所示)与E.coli BL21(DE3)感受态细胞混合，电击转化，涂布于氨苄青霉素抗性平板(氨苄青霉素浓度100μg/mL)，37℃培养过夜至长出肉眼可见的单克隆。挑取单克隆接种至20mL液体LB培养基(含氨苄青霉素100μg/mL)，37℃、200rpm振荡培养过夜。按1％的量转接菌液至2L新鲜液体LB培养基(含氨苄青霉素100μg/mL)，37℃、200rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG，22℃、160rpm诱导培养12h使蛋白表达。离心收集菌体，并用50mM焦磷酸钠缓冲液(pH 7.0)洗涤两次，然后将菌体重悬于40mL预冷的50mM焦磷酸钠缓冲液(pH＝7.0，由十水焦磷酸钠溶于灭菌双蒸水配置而成)。利用高压细胞破碎仪在低温条件下(4-6℃)进行细胞破碎。随后，利用高速冷冻离心机于4℃，12000rpm离心30min，收集上清液用于目标蛋白质纯化。

取1mL含GST融合蛋白亲和配基的Sepharose 4B(购自美国GE Healthcare公司)，加入到清洗干净的纯化柱中，用50mM预冷的焦磷酸钠缓冲液(pH 7.0)洗涤柱材料平衡柱床。将平衡后的柱材料加入到细胞破碎离心后的上清(粗酶液)中，混合，在冰上轻轻振荡30min使其与含有GST标签的蛋白(购自美国GE Healthcare公司)充分结合。随后，在4℃条件下将柱材料与粗酶液混合物倒入纯化柱，流出的粗酶液重新加入纯化柱，反复两次促使GST融合蛋白与柱材料充分结合。用预冷的50mM焦磷酸钠缓冲液(pH 7.0)洗涤柱材料以除去杂蛋白及未结合的蛋白，缓冲液流速控制在约1mL/min。洗涤完成后，加入600μL含有PreScission蛋白酶(150U)的50mM焦磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，放置过夜，使PreScission蛋白酶充分切割GST标签，释放无标签的目标蛋白。加入50mM焦磷酸钠缓冲液(pH8.5)洗脱目标蛋白。利用12％SDS-PAGE电泳检测纯化后蛋白的纯度，SDS-PAGE检测谱图如图10所示，其中，泳道1为蛋白标准，泳道2、3分别为B5R18和B5R26。用Bradford试剂(上海生工生物工程股份有限公司)检测纯化后蛋白的浓度。

实施例4酶学动力学测定及酶学性质分析

本实施例中甘氨酸氧化酶及其突变体的酶活测定采用辣根过氧化物酶偶联法(Job,Marcone et al.2002)，通过测定反应所释放的H₂O₂量反映酶活性。以邻联茴香胺作为显色底物，草甘膦被甘氨酸氧化酶氧化分解，产生的H₂O₂被辣根过氧化物酶氧化释放氧气将邻联茴香胺氧化显示橙红色，在450nm处具有吸收峰，测定OD₄₅₀吸光值，代入标准曲线从而计算酶活性。

(一)草甘膦氧化酶酶活测定方法

将25℃、最适pH条件下转化1μmoL底物(含甘氨酸或氧气)或生成1μmoL产物H₂O₂所需的甘氨酸氧化酶的酶量定义为一个酶活力单位(unit)。

酶活反应体系(200μL)包含：20μL、50mM底物(分别为甘氨酸和草甘膦)，20μL、0.32mg/mL邻联茴香胺溶液，1μL、5U/mL辣根过氧化物酶，一定量的纯化的甘氨酸氧化酶，用50mM焦磷酸钠缓冲液(pH8.5)补充至体积为200μL。在25℃恒温条件下反应1h，测定OD_450nm吸光值，计算酶活力。

(二)酶学动力学性质测定

反应体系同甘氨酸氧化酶酶活测定方法，底物设为一系列浓度梯度，反应结束后，将酶标仪测得的450nm吸光度值输入软件GraphPad Prism 6.0(为共享软件)，通过标准曲线换算得到k_m和v_max再代入蛋白浓度计算出催化常数k_cat。

具体测试项目和结果见下表7所示。

表7 B5R18和B5R26性能测试结果

由上表数据可知，与已有的研究相比，本实施例所筛选的草甘膦氧化酶突变体B5R18和B5R26对草甘膦具有更优的亲和力(1/K_m值反映)和更大的催化效率(k_cat/K_m值反映)，说明这两个草甘膦氧化酶可以在草甘膦浓度很低时发挥作用。而草甘膦在田间施用浓度较低，较高的亲和力才能使得草甘膦氧化酶高效结合草甘膦并进行催化降解。本实施例得到的两个突变体B5R18和B5R26是目前报道的对草甘膦亲和力最高(1/K_m值反映)、催化性能最好的两个草甘膦氧化酶(k_cat/K_m值反映)，其编码基因导入DNA可培育能够降解草甘膦的作物，具有极大的应用潜力。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种草甘膦氧化酶突变体及其克隆、表达与应用

<130> PI19B0344CN

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1110

<212> DNA

<213> B5R18

<400> 1

atgtgtaaga agtatgatgt agcgataatt ggtggtggtg taattggtag ttcagttgcg 60

cattttctag cagaaagagg acataaagta gcgattgtgg agaagcaaag tattgcatcg 120

gaagcttcaa aagcagctgc tggtttactt cgtgttcagg cagaatggga tgcgtatagc 180

ccgctattcg aacttgctag agagagccga gctatatttc cgcaacttgc agcagtttta 240

cgtgaaaaga cgggtgttga tattggatat gaagaaaaag gaatttatcg tattgctcaa 300

aatgaatatg agaaggaaag aattcttcac attatggatt ggcagcagaa agcaggtgaa 360

ggtccttatt ttctaacggg agaccatgtg cgggaaagag agccatatct atccgaatct 420

attataggag cagtatatta tccgaaagac ggtcatgtta ttgcaccaga gcttacgaaa 480

gcattcgcac attctgcagc gatttctggt gctgatatat atgaacagac agaagtattt 540

gatatccgta ttgaaaataa taaagtgact ggagttatta cgagtgaagg tattgtcaca 600

tgtgagaaag tcgttattgc aggaggttca tggagcacga agttactcag ttattttcac 660

cgcgattggg gtacatatcc agttaaagga gaagtggttg cggtaagaag taaaaaacaa 720

cttttaaaag cacctatctc tcaagaaaga ttttacatta ctccaaagcg cggtggacgt 780

tacataattg gggcaacaat gaagccacat acgttcaata aaactgtgca gccagaaagt 840

ataacttctt tattagagcg tgcttataca atattgccag ctttaaaaga agcagaatgg 900

gaaagcacgt gggcaggact aagaccacaa tcgaatcatg aggctcctta tatgggagag 960

catgaagaaa taaaaggttt atatacttgc acgggccatt atcgaaacgg tattttatta 1020

agtcctattt ctggccaata tatggctgat ttaatagaag gaaagcagga gaatcatttg 1080

ctagattcat tgctttctag gagagtttag 1110

<210> 2

<211> 1110

<212> DNA

<213> B5R26

<400> 2

atgtgtaaga agtatgatgt agcgataatt ggtggtggtg taattggtag ttcagttgca 60

cattttctag cagaaagagg acataaagta gcgattgtgg agaagcaaag tatcgcatcg 120

gaagcttcaa aagcagctgc tggtttactt cgtgttcagg cagaatggga tgcgtatagc 180

ccgctatttg aacttgctag agaaagccga gctatatttc cgcagcttgc agcagtttta 240

cgtgaaaaga cgggtgttga tattggatat gaagaaaaag gaatttatcg tattgctcaa 300

aatgaagatg agaaggaaag aattcttcac attatggatt ggcagcagaa agcaggtgaa 360

gatccttatt ttctaacggg agaccacgtg cgggaaagag agccatatct atccgaatct 420

attataggag cagtatatta tccgaaagac ggtcatgtta ttgcaccaga gcttacgaaa 480

gcattcgcac gttctgcagc gatctccggt gccgatatat atgaacagac agaagtattt 540

gatatccgta ttgaaaataa taaagtgact ggagttatta caagtgaagg tattgtcaca 600

tgtgagaaag tcgttattgc aggaggttca tggagcacga agttactcag ttattttcac 660

cgcgattggg gtacatatcc agttaaagga gaagtggttg cggtaagaag tagaaaacaa 720

cttttaaaag cacctatctc tcaagaaaga ttttacatta ctccaaagcg cggtggacgt 780

tacataattg gggcaacaat gaagccacat acgttcaata aaactgtgca gccagaaagt 840

ataacttctt tattagagcg tgcttataca atattgccag ctttaaaaga agcagaatgg 900

gaaagcacgt gggcaggact aagaccacaa tcgaatcatg aagctcctta tatgggagag 960

catgaagaaa taaaaggttt atatacttgc acgggccatt atcgaaacgg tattttatta 1020

agtcctattt ctggccgata tatggctgat ttaatagaag gaaagcaagg gaatcatctg 1080

ctagattcat tgctttctag gagagtttag 1110

<210> 3

<211> 369

<212> PRT

<213> B5R18

<400> 3

Met Cys Lys Lys Tyr Asp Val Ala Ile Ile Gly Gly Gly Val Ile Gly

1 5 10 15

Ser Ser Val Ala His Phe Leu Ala Glu Arg Gly His Lys Val Ala Ile

20 25 30

Val Glu Lys Gln Ser Ile Ala Ser Glu Ala Ser Lys Ala Ala Ala Gly

35 40 45

Leu Leu Arg Val Gln Ala Glu Trp Asp Ala Tyr Ser Pro Leu Phe Glu

50 55 60

Leu Ala Arg Glu Ser Arg Ala Ile Phe Pro Gln Leu Ala Ala Val Leu

65 70 75 80

Arg Glu Lys Thr Gly Val Asp Ile Gly Tyr Glu Glu Lys Gly Ile Tyr

85 90 95

Arg Ile Ala Gln Asn Glu Tyr Glu Lys Glu Arg Ile Leu His Ile Met

100 105 110

Asp Trp Gln Gln Lys Ala Gly Glu Gly Pro Tyr Phe Leu Thr Gly Asp

115 120 125

His Val Arg Glu Arg Glu Pro Tyr Leu Ser Glu Ser Ile Ile Gly Ala

130 135 140

Val Tyr Tyr Pro Lys Asp Gly His Val Ile Ala Pro Glu Leu Thr Lys

145 150 155 160

Ala Phe Ala His Ser Ala Ala Ile Ser Gly Ala Asp Ile Tyr Glu Gln

165 170 175

Thr Glu Val Phe Asp Ile Arg Ile Glu Asn Asn Lys Val Thr Gly Val

180 185 190

Ile Thr Ser Glu Gly Ile Val Thr Cys Glu Lys Val Val Ile Aal Gly

195 200 205

Gly Ser Trp Ser Thr Lys Leu Leu Ser Tyr Phe His Arg Asp Trp Gly

210 215 220

Thr Tyr Pro Val Lys Gly Glu Val Val Ala Val Arg Ser Lys Lys Gln

225 230 235 240

Leu Leu Lys Ala Pro Ile Ser Gln Glu Arg Phe Tyr Ile Thr Pro Lys

245 250 255

Arg Gly Gly Arg Tyr Ile Ile Gly Ala Thr Met Lys Pro His Thr Phe

260 265 270

Asn Lys Thr Val Gln Pro Glu Ser Ile Thr Ser Leu Leu Glu Arg Ala

275 280 285

Tyr Thr Ile Leu Pro Ala Leu Lys Glu Ala Glu Trp Glu Ser Thr Trp

290 295 300

Ala Gly Leu Arg Pro Gln Ser Asn His Glu Ala Pro Tyr Met Gly Glu

305 310 315 320

His Glu Glu Ile Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Thr Gly His Tyr Arg Asn

325 330 335

Gly Ile Leu Leu Ser Pro Ile Ser Gly Gln Tyr Met Ala Asp Leu Ile

340 345 350

Glu Gly Lys Gln Glu Asn His Leu Leu Asp Ser Leu Leu Ser Arg Arg

355 360 365

Val

369

<210> 4

<211> 369

<212> PRT

<213> B5R26

<400> 4

Met Cys Lys Lys Tyr Asp Val Ala Ile Ile Gly Gly Gly Val Ile Gly

1 5 10 15

Ser Ser Val Ala His Phe Leu Ala Glu Arg Gly His Lys Val Ala Ile

20 25 30

Val Glu Lys Gln Ser Ile Ala Ser Glu Ala Ser Lys Ala Ala Ala Gly

35 40 45

Leu Leu Arg Val Gln Ala Glu Trp Asp Ala Tyr Ser Pro Leu Phe Glu

50 55 60

Leu Ala Arg Glu Ser Arg Ala Ile Phe Pro Gln Leu Ala Ala Val Leu

65 70 75 80

Arg Glu Lys Thr Gly Val Asp Ile Gly Tyr Glu Glu Lys Gly Ile Tyr

85 90 95

Arg Ile Ala Gln Asn Glu Asp Glu Lys Glu Arg Ile Leu His Ile Met

100 105 110

Asp Trp Gln Gln Lys Ala Gly Glu Asp Pro Tyr Phe Leu Thr Gly Asp

115 120 125

His Val Arg Glu Arg Glu Pro Tyr Leu Ser Glu Ser Ile Ile Gly Ala

130 135 140

Val Tyr Tyr Pro Lys Asp Gly His Val Ile Ala Pro Glu Leu Thr Lys

145 150 155 160

Ala Phe Ala Arg Ser Ala Ala Ile Ser Gly Ala Asp Ile Tyr Glu Gln

165 170 175

Thr Glu Val Phe Asp Ile Arg Ile Glu Asn Asn Lys Val Thr Gly Val

180 185 190

Ile Thr Ser Glu Gly Ile Val Thr Cys Glu Lys Val Val Ile Aal Gly

195 200 205

Gly Ser Trp Ser Thr Lys Leu Leu Ser Tyr Phe His Arg Asp Trp Gly

210 215 220

Thr Tyr Pro Val Lys Gly Glu Val Val Ala Val Arg Ser Arg Lys Gln

225 230 235 240

Leu Leu Lys Ala Pro Ile Ser Gln Glu Arg Phe Tyr Ile Thr Pro Lys

245 250 255

Arg Gly Gly Arg Tyr Ile Ile Gly Ala Thr Met Lys Pro His Thr Phe

260 265 270

Asn Lys Thr Val Gln Pro Glu Ser Ile Thr Ser Leu Leu Glu Arg Ala

275 280 285

Tyr Thr Ile Leu Pro Ala Leu Lys Glu Ala Glu Trp Glu Ser Thr Trp

290 295 300

Ala Gly Leu Arg Pro Gln Ser Asn His Glu Ala Pro Tyr Met Gly Glu

305 310 315 320

His Glu Glu Ile Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Thr Gly His Tyr Arg Asn

325 330 335

Gly Ile Leu Leu Ser Pro Ile Ser Gly Arg Tyr Met Ala Asp Leu Ile

340 345 350

Glu Gly Lys Gln Gly Asn His Leu Leu Asp Ser Leu Leu Ser Arg Arg

355 360 365

Val

369

Claims

1.一种草甘膦氧化酶突变体，其特征在于，所述突变体包含如SEQ ID No：3或SEQ IDNo：4所示的氨基酸序列。

2.一种编码权利要求1所述草甘膦氧化酶突变体的基因，其特征在于，包含如SEQ IDNo：1或SEQ ID No：2所示的核苷酸序列。

3.一种含有权利要求2所述草甘膦氧化酶突变体编码基因的表达载体。

4.一种含有权利要求2所述草甘膦氧化酶突变体编码基因的基因细胞系。

5.一种含有权利要求2所述草甘膦氧化酶突变体编码基因的重组菌。

6.权利要求1所述草甘膦氧化酶突变体在培育草甘膦抗性转基因作物或者培育能够降解草甘膦转基因作物领域中的应用。

7.一种培育草甘膦抗性转基因作物和/或可降解草甘膦转基因作物的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的草甘膦氧化酶突变体转化入目的作物的步骤。

8.一种构建草甘膦氧化酶突变体库的方法，其特征在于，包括以已知草甘膦氧化酶为突变模板构建重组质粒的步骤，以及将所得重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞进行基因表达的步骤，以形成草甘膦氧化酶突变体文库。

9.根据权利要求8所述构建草甘膦氧化酶突变体库的方法，其特征在于，所述草甘膦氧化酶包括草甘膦氧化酶突变体B4S4、B4S6、B4S7、B4S9和/或B4S11；形成所述重组质粒的载体为pGEX-6p-1载体。

10.按照权利要求8或9所述方法构建的草甘膦氧化酶突变体库。