CN103421824B - 降解除草剂草甘膦的抗性基因及其编码蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及一种高效降解除草剂草甘膦的抗性基因的分离、体外定向进化及功能鉴定，本发明还涉及草甘膦的抗性基因在植物除草剂草甘膦，B3S1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。通过扩增来自海洋细菌蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）的甘氨酸氧化酶编码基因（thiO），对其进行连续两轮随机突变和一轮DNA改组试验，并结合基于T7噬菌体裂解-辣根过氧物酶/邻联茴香胺酶偶联活性筛选技术，获得最终草甘膦氧化酶突变体B3S1。本发明证实了该基因的功能及在降解除草剂草甘膦抗性中应用途径。

Description

降解除草剂草甘膦的抗性基因及其编码蛋白

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种高效降解除草剂草甘膦的抗性基因的分离，同时还涉及一种高效降解除草剂草甘膦的抗性基因在抗草甘膦转基因植物育种中的应用。 

背景技术

草甘膦（glyphosate）是由美国孟山都公司（Monsanto Company,St.Louis,MO）于1970年开发的一种有机磷除草剂。自1974年在美国登记注册（商品名Roundup，中文名农达）以来被广泛应用于农业、城镇、花园、森林等环境下防除杂草，至今已成为全世界使用面积最大的除草剂，其同类产品还有Aquamaster（Monsanto Company,St.Louis MO）和Rodeo（Dow Agrosciences,Indianapolis,IN），主要应用于水生环境下杂草的防除。 

草甘膦作为一种甘氨酸的磷酸亚甲基衍生物，化学名称为N-磷酸亚甲基甘氨酸(N-(phosphonomethyl)glycine,GLP)，其分子式为C₃H₈NO₅P，分子量为169.1。草甘膦纯品系白色无味结晶，无挥发性，熔点为200℃（不降解）。草甘膦为兼性化合物，具有高度极性，难溶于无水乙醇、乙醚、苯等有机溶剂中，在水中的溶解度较低（1.2%，25℃）。在农业生产上，草甘膦被加工成盐类，以提高其水溶解度和植物吸收效果，同时剂型中加入表面活性剂和增效剂等成分，可以提高草甘膦在植物表皮细胞上的渗透性。 

草甘膦通过植物叶片角质层吸收后，在体内经木质部和韧皮部传导至植物的分生组织，从而对植物的细胞分裂、呼吸作用及代谢合成产生干扰作用。草甘膦的作用机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中的关键酶：5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase,EPSPS）。EPSP合酶是细菌、真菌、藻类和植物体内合成芳香族氨基酸及芳香族化合物的关键酶，参与催化将烯醇式丙酮酸部分从磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenol pyruvate，PEP）转移到3-磷酸莽草酸（shikimate-3-phosphate，S3P）的5-羟基上，合成5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸。PEP分子与目标羟基形成共价键结合，形成四面体中间产物，随后释放磷酸根（Pi）生成烯醇式丙酮酸产物。草甘膦作为EPSPS底物之一的PEP的过渡态结构类似物，竞争性地结合到EPSPS的底物结合位点上，形成EPSPS-S3P-Glyphosate复合物，影响了5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸和分支酸的合成，从而抑制了EPSPS的正常生理活性，导致莽草酸代谢途径的反馈抑制，使植物体内积累了大量的莽草酸，由此阻断了芳香族氨基酸的合成。而芳香族氨基酸参与合成微生素、生物碱及吲哚 衍生物等多种次级代谢产物，在细胞分裂、呼吸作用、蛋白质合成中起着重要作用，其合成量不足会严重影响到植物的正常发育代谢。同时EPSPS酶活被抑制，也使得莽草酸途径的碳代谢通量增加，直接影响植物体内其他代谢合成途径的碳通量短缺。 

草甘膦在自然环境中可以被土壤微生物群落彻底分解，而且对微生物种群影响较小，而化学降解和光解作用对于草甘膦的降解作用十分微弱。草甘膦在土壤中的半衰期差异较大，降解周期可以从数周到数年之久，这主要是由土壤结合能力、微生物种群活力决定的，其次是由于土壤pH、离子浓度等影响。自二十世纪八十年代开始，一些以共代谢方式降解草甘膦的微生物不断被报道。Moore、Shinabarger等分离得到能在草甘膦为唯一磷源的培养基中生长的假单胞菌Pseudomonas sp.PG2982。其后，Talbot等分离得到能分解代谢草甘膦作为磷源的假单胞菌和产碱杆菌（Alcaligenes sp.）。Balthazor等从工业污水处理系统中分离得到草甘膦降解细菌黄杆菌（Flavobacterium sp.）。Pipke等也发现了节杆菌（Arthrobacter sp.）能以草甘膦作为唯一磷源生长，并研究了其对草甘膦、无机磷和有机磷的吸收转运系统。随后又分离出一株能分解草甘膦生成胺甲基膦酸（aminomethylphosphonic acid，AMPA）的黑蓝节杆菌（Arthrobacter atrocyaneus）。放射形土壤杆菌（Agrobacterium radiobacter）也能以草甘膦为唯一碳源生长，并分解草甘膦生成胺甲基膦酸。目前已有多种降解草甘膦基因被报道，其基因种类分布但仍有一定局限性。从降解途径上分类，都为断裂C-N键一类；从来源上分类，都分离自微生物基因组，尚未发现来自植物的草甘膦降解基因(Duke2010)。尽管AMPA对植物生长发育有一定的抑制作用，但植物体内仍能以最低限度地将草甘膦代谢生成AMPA。 

经过深入研究表明，草甘膦的降解途径主要有两种（见图1）：脱羧和脱磷，即氧化还原酶断裂C-N键生成乙醛酸（glyoxylate）和胺甲基膦酸（AMPA）以及C-P裂解酶断裂C-P键生成肌氨酸和无机磷(Duke2010)。上述两种中间代谢产物被进一步代谢生成磷酸、甘氨酸、二氧化碳和水，提供生物体内代谢循环所需的碳源、氮源和磷源。在这两条途径中，第一条途径占草甘膦降解的主导地位，微生物、草甘膦抗性杂草以及抗草甘膦转基因作物中均发现AMPA的积累现象，随后AMPA在C-P裂解酶的作用下进一步降解产生磷酸和甲胺。 

Monsanto公司于上世纪80年代发现了一个能氧化草甘膦生成AMPA中间代谢产物的基因(Barry and Kishore1995)，命名为草甘膦氧化还原酶（glyphosate oxidoreductase,GOX），并首次阐明了GOX的作用机制。草甘膦氧化还原酶催化断裂草甘膦的C-N键，并生成产物AMPA和乙醛酸。在有氧条件下，O₂作为协同底物参与反应，同时一些电子载体如吩嗪硫酸甲酯和泛醌能促进该反应的进行。草甘膦氧化还原酶来自Pseudomonas sp.strain LBAA，该菌是以草甘膦为唯一磷源从土壤中筛选获得，通过在E.coli中构建基因组文库筛选草甘膦降解功能基因的方法获得GOX编码基因。从结构分类上而言，GOX属于利用FAD作为辅因子的黄素氧化还原蛋白家族。GOX的反应机制为：底物草甘膦在酶的活性位点被氧化的同时辅因子FAD被还原，形成还原态FAD、胺甲基膦酸和乙醛酸之间的希夫碱（Shiff base），然后希 夫碱被水解生成相应产物的胺甲基膦酸和乙醛酸。在还原态FAD被O₂再氧化的过程中，氧络黄素环作为中间体催化草甘膦氧化生成AMPA和乙醛酸。由于野生型GOX对草甘膦的亲和性不高（K_m在20～30mM之间），要想提高其对草甘膦氧化反应速率，就可以通过定向进化方法提高其对草甘膦亲和力或最大反应速度V_max，也即提高了对草甘膦的催化效率k_cat/K_m。Barry等利用易错PCR方法，对GOX编码基因进行随机突变，在草甘膦抗性平板上筛选获得了活性提高10倍的突变体v.247（K_m,glyphosate=2.6mM）。但目前还没有单独使用GOX基因的抗草甘膦转基因作物，而一些转基因作物如甜菜（Beta vulgaris L.）、小麦（Triticum aestivum L.）、玉米、油菜、萝卜（Brassica rapa L.）同时包含了GOX和CP4EPSP合酶基因。 

单独转入CP4EPSP合酶基因的植物，由于植物体内缺乏能降解草甘膦的酶类，导致草甘膦残留长期存在并影响敏感组织，加上EPSP合酶在植物体内表达分布不均（主要表达在植物叶片组织中），因此对植物的授粉和繁殖发育产生非常不利的影响和结果。近年来的大量研究发现，植物体内及自然环境中残留的草甘膦农药成分对人类健康仍有一定的潜在毒性，尽管在生物体内及体外实验的遗传毒性、荷尔蒙、酶活性以及致癌性方面尚未取得一致性的研究结论，但也发现了不少草甘膦农药成分的负面影响。所以转入GOX/GAT类的草甘膦降解/修饰基因和CP4EPSP合酶类的靶标基因一起协同作用，提高转基因作物对草甘膦抗性的同时又降低草甘膦在植物体内的残留量，是培育草甘膦抗性转基因作物的理想选择。 

草甘膦作为一种甘氨酸结构衍生物，还能被硫胺素合成途径中的甘氨酸氧化酶（glycine oxidase,GO）所氧化分解C-N键。2009年，Mattia Pedotti等利用蛋白质理性设计方法对来自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的甘氨酸氧化酶进行定向改造，对草甘膦的催化氧化效率提高了210倍，Km值达到0.5mM(Pedotti et al.2009)。Mattia Pedotti等人将GO晶体结构与配体草甘膦进行分子对接，然后选择11个残基分别进行饱和突变，针对草甘膦底物进行活性筛选，得到3个催化活性提高的单点突变体G51S、A54R、H244R，将这三个突变位点组合到一个突变体上，由于协同增效作用使得甘氨酸氧化酶对草甘膦氧化催化效率（k_cat/K_m）提高了210倍。这些残基的替换有助于增加草甘膦分子与GO的底物结合性，Ser⁵¹、Arg⁵⁴的侧链基团与草甘膦的磷酸基团因静电相互作用而结合的更加紧密，优化了底物在活性位点的定位构象，His²⁴⁴的突变虽然没有改变转换数，但能显著影响黄素环的还原速度，替换成短链残基Ala后，促进了突变体活性位点的构象重构，协同提高了GO突变体对草甘膦的催化活性。该突变体基因转入紫苜蓿（Medicago sativa）后也获得了草甘膦抗性(Pollegioni et al.2011)。 

与草甘膦氧化还原酶不同的是，GO在氧化草甘膦的时候释放出H₂O₂，这主要是因为GOX氧化机制（如前述）与GO的质子转移机制具有显著不同。尽管二者都属于FAD依赖型黄素氧化还原蛋白家族，但它们的氨基酸序列相似性很低（18.1%），Blast比对结果显示GOX与某些D-氨基酸脱氢酶最为接近，而GO则与单体肌氨酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶相似。甘氨酸作为GO的天然底物，与草甘膦分子结构相比只相差一个亚甲基磷酸结构，同时GO又具 有广泛的底物选择性范围，对具有甘氨酸结构类似的化合物，如肌氨酸、N-甲基甘氨酸以及中性D-氨基酸（D-丙氨酸，D-脯氨酸）都显示出一定的氧化活性，生成相应的α-酮酸、亚胺以及过氧化氢。因此，甘氨酸氧化酶作为定向进化的靶标，有较大的潜力提高其对草甘膦底物的专一催化性能和反应效率，从而得到具有能高效降解草甘膦的草甘膦氧化酶。 

由于细胞内环境和实际应用环境的不同，自然界进化产生的酶类，在催化性能上依然存在许多限制，并没有达到实际应用状态下的最优化表型。在漫长的自然进化中，生物体通过其基因序列的突变、交换、重组等过程来实现适者生存的自然法则。同样，酶分子也在自然选择的压力下不断进化，从原始酶分子开始分化出具有不同功能活性的酶家族(Jensen1976)，在底物选择性/亲和性、热稳定性、pH耐受性等性质方面逐步适应各种生存环境下的筛选压力。而实验室中的进行的蛋白质工程就是人工模拟达尔文进化法则，突破酶分子的天然特性所限，提高其活性、稳定性以及对映选择性，或改变其底物特异性等等，以满足日益增长的工业合成、医药研发、食品加工等应用领域的需要。 

随着近年来转基因作物的推广和应用，国外大型生物企业已获得了大量草甘膦抗性基因和转基因作物品种，构筑了严密的知识产权保护体系。而我国在抗除草剂转基因作物方面虽取得一定进展，与发达国家相比仍有巨大差距，因此筛选和改良新型草甘膦降解基因就显得非常有必要了。而关于草甘膦农药成分的毒性研究报道，也越来越多揭露其潜在的生态危险和人类健康风险，利用草甘膦降解基因在解除草甘膦对植物生长的抑制作用，同时降低植物中草甘膦残留量，减少食物链环节中对人类的健康威胁。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种通过体外定向进化和高通量酶活筛选技术分离得到的新型草甘膦氧化酶突变体B3S1。该基因是通过对扩增自蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）1.10559（一个很常用的蜡状芽孢杆菌，可以向菌株保藏单位索取：北京，中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株检索编号1.10559，检索地址：http://www.cgmcc.net/index.php/Contents/search）的甘氨酸氧化酶（thiO，GenBank acession number:KC203486），进行连续两轮随机突变和一轮DNA改组实验，结合基于T7噬菌体裂解-辣根过氧物酶/邻联茴香胺酶偶联活性筛选技术，最终获得催化效率提高326倍的新型草甘膦氧化酶突变体B3S1。该基因的核苷酸序列全长为1100bp，编码369个氨基酸。利用GenBank数据库中的BlastP进行氨基酸序列比对，发现该蛋白质与来自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的甘氨酸氧化酶的氨基酸序列同源性只有31%，与孟山都公司的草甘膦氧化还原酶基因的氨基酸序列同源性只有20%。证明该基因是一个新型草甘膦降解基因。将甘氨酸氧化酶突变体B3S1编码基因连接到载体pGEX-6p-1（购自美国GE Healthcare公司），转化到E.coli BL21（购自美国Invitrogen公司），利用GST亲和层析系统纯化该蛋白，利用辣根过氧物酶/邻联 茴香胺酶偶联法测定其对草甘膦氧化活性，发现该蛋白质对草甘膦的比活力为0.48U/mg，底物亲和力为K_m,glyphosate=0.53mM，转换数k_cat=11.67s^─1，催化效率k_cat/K_m,glyphosate=2.2×10³M^─1·s^─1。说明B3S1有一定的草甘膦抗性，在抗草甘膦转基因方面有潜在的应用价值。 

为了实现上述目的，本发明采用以下技术路线： 

获取腊状芽孢杆菌甘氨酸氧化酶编码基因（thiO）的原始序列。根据GenBank数据库中已报道相关序列设计特异性引物，利用CTAB/NaCl法抽提腊状芽孢杆菌1.10559的基因组DNA(Joseph et al.2002)，以其为模板，进行PCR扩增，得到长度为1.1kb的目的基因（thiO），回收后经BamHI和XhoI双酶切，连接到表达载体pGEX-6p-1上，得到重组质粒pGEX-6p-1-BceGO（图6），测序验证后转入E.coli BL21进行蛋白诱导表达，纯化。其表达的蛋白质为甘氨酸氧化酶（Glycine oxidase,GO），长度为369个氨基酸。为确定该基因具有草甘膦降解活性，所以测定了此酶的相关活性。 

为了提高甘氨酸氧化酶对草甘膦的降解能力，对其进行体外定向进化，其操作过程如下： 

以重组质粒pGEX-6p-1-BceGO（图6）作为第一轮随机突变模板，进行易错PCR反应，获得的随机突变基因片段，连接到pGEX-6p-1载体上，转入大肠杆菌DH5α，构建得到突变文库。挑取克隆子至96孔深孔板液体培养到对数生长期，加入T7噬菌体和IPTG（至终浓度为0.1mM），在37℃条件下振荡培养6h后，吸取上清159μL加入到96孔微孔板中，加入草甘膦至终浓度50mM，以及1μL5unit/mL辣根过氧物酶、20μL0.32mg/mL邻联茴香胺，混匀后放置25℃反应8h。利用酶标仪检测450nm吸光值，选取高于对照组（野生型BceGO）的克隆子，进行下一轮复筛和诱变。经历了14000个克隆子的筛选后，获得了两个单点突变体22D11和23B1，利用定点突变技术(Weiner and Costa1994)将两点合并至一个突变体上，得到一个双点突变体B1R。然后以B1R为模板，进行第二轮随机突变，构建突变文库，继续筛选了16000个突变体后，得到六个活性高于B1R的突变体。以该六个突变体为亲本序列，利用DNA shuffling技术构建重组文库，再次筛选了10000个克隆子后，得到四个突变体，命名为B3S1、B3S4、B3S6和B3S7，分别对其进行酶活测定，实验结果表明，活性最高的突变体为B3S1，鉴于其底物偏爱性已从甘氨酸转变成草甘膦，将该蛋白质命名为草甘膦氧化酶（Glyphosate oxidase）。上述突变体中B3S1具有抗除草剂高活性的草甘膦氧化酶，它的编码序列附在重组质粒pGEX-6p-1-B3S1中，将该质粒pGEX-6p-1-B3S1转化大肠杆菌，得到重组的大肠杆菌B3S1，即Escherichia coli B3S1，将该菌株于2013年6月17日送至中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2013266。 

与现有发明相比，申请人获得的草甘膦氧化酶（Glyphosate oxidase）B3S1具有独特表现，该酶对草甘膦的比活力为0.24U/mg，底物亲和力为K_m,glyphosate=0.53mM，转换数k_cat=11.67s^─1，催化效率k_cat/K_m,glyphosate=2.2×10³M^─1·s^─1，说明此酶具有较高活性。最适pH实验表明：在pH8.5时，草甘膦氧化酶B3S1具有最高活性；当pH低于7.0时，B3S1活性很低，其活 性还不到最高活性的20%；当pH在7.6～11.0范围时，B3S1能表现最高活性的80%以上，说明B3S1的pH适应范围为中性偏碱，适应于植物体内活性表达。最适温度实验表明：在0℃时，B3S1酶活保持60%以上；在10～30℃之间保持酶活80%以上；在30℃时，B3S1酶活性达到最大值，因此可以确定该酶最适反应温度为30℃；当温度大于30℃时，B3S1酶活呈下降趋势，大于50℃后酶活开始急剧下降，60℃时下降至最大活性一半左右，说明B3S1在低温和中温条件下都能保持较高活性，适应植物生长环境的温度范围。 

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明分离的草甘膦氧化酶B3S1编码基因的核苷酸序列，序列长度为1110bp。 

序列表SEQ ID NO：2是本发明分离的草甘膦氧化酶B3S1的氨基酸序列，其编码369个氨基酸。 

图1：草甘膦降解途径示意图。 

图2：草甘膦氧化酶体外定向进化流程图。 

图3：草甘膦氧化酶B3S1酶学性质。图中A：最适pH曲线图，横坐标为不同pH反应缓冲液，纵坐标为相对活性；图中B：pH耐受性，横坐标为不同pH反应缓冲液，纵坐标为相对活性；图中C：最适温度曲线图，横坐标为不同温度梯度，纵坐标为相对活性；图中D：温度耐受性横坐标为不同处理温度，纵坐标为相对活性。 

图4：草甘膦氧化酶B3S1酶学动力学示意图。图中A：米氏方程曲线图，横坐标为草甘膦底物浓度值，纵坐标为酶反应速度；图中B：Lineweaver-Burk双倒数图，横坐标为底物浓度倒数值，纵坐标为反应速度倒数值。 

图5：是商品表达载体pGEX-6p-1的图谱。 

图6：本发明的重组质粒pGEX-6p-1-BceGO图谱。 

图7：本发明的重组质粒pGEX-6p-1-B3S1图谱。 

具体实施方式

实施例1腊状芽孢杆菌甘氨酸氧化酶BceGO原始基因的克隆 

根据GenBank已发表的蜡状芽孢杆菌甘氨酸氧化酶基因thiO（GenBank序列号KC203486）设计特异性引物进行PCR扩增腊状芽孢杆菌甘氨酸氧化酶BceGO原始基因。 

所述引物名称及DNA序列如下所示： 

BceGO-F:5’-CGCGGATCCATGTGTAAGAAGTATGATGTAGCGAT-3’ 

BceGO-R:5’-CCGCTCGAGCTAAACTCTCCTAGAAAGCAATGAAT-3’ 

下划线为酶切位点：BamHI和XhoI。 

PCR反应体系见表1。 

表1PCR反应体系 

PCR反应程序为： 

94℃预变性4min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸90sec，共30个循环；72℃延伸10min；15℃保温5min。反应结束后，以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 

PCR产物回收后经测序验证，核苷酸序列全长为1100bp，编码369个氨基酸，属于D-氨基酸氧化酶家族，该编码基因与GenBank报道的Bacillus thuringiensis的GO编码基因序列非常相似，序列一致性高达99%以上，与Bacillus anthracis已报道的GO序列同源性也较高，相似性在92%以上，这也与上述三种芽孢杆菌高度的亲缘关系相一致。而该基因编码的氨基酸序列与芽孢杆菌属内其他甘氨酸氧化酶氨基酸序列表现出较大差异，与Bacillus subtilis GO氨基酸序列同源性只有33%，与Bacillus pumilus GO氨基酸序列同源性有34%,与Bacillus amyloliquefaciens GO氨基酸序列同源性有35%，与Bacillus licheniformis GO氨基酸序列同源性有37%，与Bacillus megaterium GO氨基酸序列同源性有46%。 

实施例2：利用易错PCR构建随机突变体库 

易错PCR反应体系见表2 

表2易错PCR反应体系 

易错PCR反应程序为： 

94℃预变性4min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸90sec，共30个循环；72℃延伸10min；15℃保温5min。反应结束后，以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 

易错PCR产物回收后，经BamHI-XhoI双酶切、酶连到pGEX-6p-1-BamHI-XhoI双切载体上，转入转入大肠杆菌E.coli DH5α，构建得到随机突变文库。随机挑取十个克隆子测序，经序列比对发现每个基因的核苷酸替换数目为1～3个碱基，氨基酸替换数目为1～2个，符合随机突变文库的突变频率要求。突变文库的筛选方法按实施例5操作进行。经过筛选了14000克隆子后，筛选获得了两个对草甘膦氧化活性提高的单点突变体22D11（突变位点：G51R）和23B1（突变位点：D60G）。 

实施例3利用定点诱变技术叠加突变位点 

从第一轮随机突变文库中筛选获得了两个单点突变体22D11（突变位点：G51R）和23B1（突变位点：D60G），利用定点突变技术(Cadwell and Joyce1992)将两点合并至一个突变体上，得到一个双点突变体B1R（G51R/D60G）。利用大肠杆菌密码子偏爱性频率设计突变位点的编码核苷酸(Weiner and Costa1994)，定点突变引物名称及序列为： 

G51R-F:5’-GCTGCTGGTTTACTTCGTGTTCAGGC-3’ 

G51R-R:5’-ACGAAGTAAACCAGCAGCTGCTTTTG-3’ 

下划线为酶切位点：G51R（GGT→CGT） 

定点突变PCR反应体系见表3 

表3定点突变PCR反应体系 

PCR反应程序为： 

97℃预变性2min；95℃变性20sec，54℃退火30sec，72℃延伸160sec，共20个循环；72℃延伸10min；15℃保温5min。反应结束后，以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。扩增得到的目的条带为6kb大小，经PCR产物纯化试剂盒（爱思进生物技术（杭州）有限公司）回收后，使用限制性核酸内切酶DpnI处理8h后转入大肠杆菌DH5α，再挑取克隆子B1R培养后提取质粒，测序验证(Weiner and Costa1994)。突变体酶活测定方法按实施例7操作进行。与上述两个单点突变体活性相比，经酶活测定发现该双点突变体B1R对底物草甘膦的氧化活性提高，于是按实施例2进行易错PCR构建第二轮随机突变文库。 

实施例4利用DNA shuffling技术重组有益突变位点 

对第二轮随机突变文库按实施例5操作筛选了16000个克隆子后，筛选获得了六个对草甘膦氧化活性提高的突变体，以此为模板基因，进行DNA shuffling实验以重组有益突变位点。本实施例所使用的DNA改组方法参照Stemmer报道稍加改进(P.C.Stemmer1994)，将DNaseI部分酶解模板片段改为使用超声波破碎DNA法(Miller et al.2002)。具体步骤如下所述： 

（一）模板基因的扩增 

使用Taq DNA聚合酶扩增筛选得到的不同突变体GO基因，以pGEX-6p-1多克隆位点两端的序列设计通用引物，该通用引物名称及DNA序列如下： 

6P-1F:5’-ATCCTCCAAAATCGGATCTGGAA-3’ 

6P-1R:5’-GGCAGATCGTCAGTCAGTCACG-3’ 

PCR反应体系见表4。 

表4PCR反应体系 

PCR反应程序为： 

94℃预变性4min；94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸90sec，共30个循环；72℃延伸10min；15℃保温5min。反应结束后，以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。产物回收经琼脂糖凝胶电泳检测后，使用NanoDrop1000微量紫外分光光度计测定片段浓度，等量混合后放入60℃温箱6h，烘干水分至浓度达到30～50ng/μL。 

（二）超声波法破碎DNA片段 

本实施例采用超声波法(Miller et al.2002)破碎DNA片段，利用超声波产生的空泡效应、高温热解、机械剪切作用，在水溶液环境下破坏DNA氢键、断裂DNA双螺旋结构。处理条件：功率300W，频率25kHz，超声20sec，间歇10sec，样品体积600μL，全程处理在冰水浴条件下进行，按超声时间10min/次梯度取样，经2.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段大小在200bp以下，确定超声波处理时间。再将破碎后DNA片段以12000r/min离心10min，收集上清。取2μL DNA片段为模板，使用两对引物（编号分别为6P-1F/1R和BceGO-F/R）分别进行PCR扩增，以检测DNA片段是否完全破碎。检测结果为阴性，则进入无引物PCR反应扩增。 

无引物PCR反应体系见表5。 

表5无引物PCR反应体系 

无引物PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，40℃退火30sec，72℃延伸20sec+1sec/循环，共进行70个循环；72℃保温10min。反应结束后，以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测产物大小。 

（三）有引物PCR扩增 

有引物PCR反应体系为见表6： 

表6有引物PCR反应体系 

PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸70sec，共30个循环；72℃保温10min。反应结束后，以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测产物大小。 

（5）构建突变文库： 

纯化后的有引物PCR扩增片段、质粒pGEX-6p-1分别用BamHI和XhoI进行双酶切反应，双酶切反应体系见表7。有引物PCR扩增片段、pGEX-6p-1-BamHI/XhoI载体经双酶切回收后，使用T4DNA Ligase于4℃连接过夜，酶连反应体系见表8。 

表7双酶切体系 

表8酶连反应体系 

构建含有甘氨酸氧化酶突变组合片段的重组质粒酶连体系，然后电击转化（使用0.2cm电击杯，电压2.5kV）E.coli DH5α高效感受态，涂布于含100μg/ml氨苄青霉素抗性平板，倒置于37℃恒温培养箱。培养12小时后，随机挑取10个克隆子经液体LB培养基过夜培养后，提取重组质粒，经测序验证，获得DNA改组文库(Stemmer1994)。突变文库的筛选方法按实施例5操作进行。对该DNA shuffling文库筛选了10000个克隆子后，筛选获得了四个对 草甘膦氧化活性提高的突变体，按实施例7进行酶活测定以后，发现活性最高突变体为B3S1，于是按实施例7对B3S1的基本酶学性质进行分析。 

实施例5基于96孔板的高通量草甘膦氧化酶突变文库筛选 

将突变库转化子和原始对照菌株（含野生型基因重组质粒pGEX-6p-1-BceGO的E.coli DH5α）接种到96孔深孔板（2.2mL）中，每孔加有（100μg/ml）氨苄抗性液体LB培养基0.6mL，密封后置于37℃、200r/min振荡培养16h，同时点菌于氨苄抗性（100μg/ml）LB平板（与96孔深孔板一一对应编号），37℃温箱培养过夜。然后次日在96孔深孔板中加入含氨苄青霉素（100μg/ml）、IPTG（终浓度0.1mM）、T7噬菌体(Tarahovsky et al.1994)的LB液体培养基200μL，再次密封后置于37℃、200r/min振荡培养6h。每孔彻底裂解后，释放突变重组蛋白于上清中，取160μL裂解上清加入到96孔微孔板，接着依次加入20μL草甘膦底物（草甘膦底物浓度按突变筛选轮数依次递减：50～1mM），20μL3.2mg/mL邻联茴香胺溶液，1μL200U/mL辣根过氧化物酶，置于25℃反应过夜，使用酶标仪扫描96孔微孔板，读取450nm吸光值，记录大于对照组的正突变体，然后再次进入复筛、测序和下一轮突变。 

实施例6突变体B3S1蛋白质表达与纯化 

将突变体B3S1重组质粒pGEX-6p-1-B3S1（图7）电击（使用0.2cm电击杯，电压2.5kV）转化大肠杆菌（E.coli）BL21感受态细胞，37℃恒温培养箱培养过夜，挑取含外源基因的大肠杆菌单菌落接种于10mL含100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基，37℃、220r/min培养过夜，第二天转接于2L含100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基，37℃、220r/min培养大肠杆菌至对数生长阶段，加入0.1M IPTG至终浓度为0.1mM，22℃、160r/min诱导培养过夜。离心收集菌体，加入预冷的50mM焦磷酸钠溶液（pH7.0）洗涤菌体两遍，最后重悬于40mL预冷的50mM焦磷酸钠溶液（pH7.0）中，使用低温超高压连续流细胞破碎仪（4～6℃，1000pa）进行压力破碎，重复破碎两遍，然后细胞破碎液以15000r/min高速离心30min（4℃），收集上清液再次重复15000r/min离心30min（4℃），收集上清进行下一步亲和层析纯化。 

吸取1mL含有GST亲和配基的Sepharose4B（购自美国GE Healthcare公司）加入到洗净的纯化柱里，用50mL50mM焦磷酸钠溶液（pH7.0）洗涤柱材料平衡柱床，然后吸取柱材料与细胞破碎液上清混合于100mL离心瓶中，置于冰上振荡30min，促使GST融合蛋白与带有GST亲和配基的Sepharose4B结合，倒入纯化柱，流出的上清液回收后再次加入纯化柱，反复两次后弃去。然后继续用500mL50mM焦磷酸钠溶液（pH7.0）洗涤柱材料，洗去未结合的蛋白质，流速控制在1mL/min左右。洗涤完毕后，加入500μL含有150U PreScission 蛋白酶的50mM焦磷酸钠溶液（pH7.0），过夜切割亲和吸附于柱材料上的融合蛋白。最后加入50mM焦磷酸钠溶液（pH8.5）洗脱目标蛋白。上述操作均在冰上或4℃环境下进行。使用12%SDS-PAGE对纯化后的蛋白质进行电泳检测其纯度，使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）定量检测纯化蛋白质浓度。 

实施例7草甘膦氧化酶B3S1酶学性质测定 

甘氨酸氧化酶及其突变体的酶活测定方式采用辣根过氧化物酶偶联分析法(Job et al.2002)，利用显色底物邻联茴香胺被HRP、H₂O₂氧化生成3,3'-二甲氧基-4,4'-二亚氨基二苯醌，在OD_450nm具有最大吸收峰，测定产物H₂O₂产量。具体步骤如下： 

（一）甘氨酸氧化酶酶活测定方法： 

甘氨酸氧化酶酶活测定反应体系（200μL）：158μL50mM焦磷酸钠溶液，20μL100mM底物（底物分别是甘氨酸和草甘膦），20μL3.2mg/L邻联茴香胺溶液，1μL200U/mL辣根过氧化物酶，1μL纯化的甘氨酸氧化酶，25℃反应60min后，利用全波长酶标仪测定OD_450nm吸光值，代入标准曲线计算酶活力。一个酶活单位（Unit）定义为：在pH8.5，25℃条件下，每分钟转化1μmoL底物或生成1μmoL H₂O₂所需的酶量即为一个酶活力单位。 

（二）甘氨酸氧化酶酶学动力学性质的测定： 

利用50mM焦磷酸钠溶液（pH8.5）将1M底物梯度稀释至不同浓度（甘氨酸0.5～950mM；草甘膦10～950mM）。依次取20μL不同浓度底物加入到反应体系中，20μL3.2mg/L邻联茴香胺溶液，1μL200U/mL辣根过氧化物酶，1μL纯化的甘氨酸氧化酶，加入50mM焦磷酸钠溶液（pH8.5）定容至200μL。25℃反应60min后，测定OD_450nm吸光值，输入软件GraphPad Prism5.0，通过双倒数作图法计算米氏常数K_m和最大反应速度V_max，再将Bradford法(Bradford1976)测得的蛋白质浓度（[E]）代入公式k_cat=V_max/[E]计算催化常数k_cat。 

（三）甘氨酸氧化酶最适pH和最适反应温度的测定： 

最适pH：配制不同pH的缓冲液（pH4.0～8.0缓冲液为0.2mM Na₂HPO₄-0.1mM柠檬酸缓冲液；pH8.0～11.0缓冲液由50mM焦磷酸钠溶液调节pH配制），按前述酶活测定方法配制反应体系，25℃反应60min后，利用全波长酶标仪测定OD_450nm吸光值。以最高酶活定义为100%，计算不同pH缓冲液体系中的相对酶活，以研究不同pH反应条件对酶活力的影响，并确定甘氨酸氧化酶的最适pH。 

最适温度测定：在最适反应pH条件下（50mM焦磷酸钠溶液，pH8.5），将反应体系置于不同温度梯度，反应60min后，利用全波长酶标仪测定OD_450nm吸光值。以最高酶活定义为100%，计算不同温度反应体系中的相对酶活，以研究不同温度对酶活力的影响，并确定甘氨酸氧化酶的最适温度。 

（四）甘氨酸氧化酶pH稳定性和热稳定性的测定： 

pH稳定性测定：在不同pH值（pH4.0～11.0）的缓冲液（pH4.0～8.0缓冲液为0.2mM Na₂HPO₄-0.1mM柠檬酸缓冲液；pH8.0～11.0缓冲液由50mM焦磷酸钠溶液调节pH配制）中，0℃处理酶液6h，按前述酶活测定方法配制反应体系，于最适温度下反应60min后，利用全波长酶标仪测定OD_450nm吸光值。以最高酶活定义为100%，计算不同pH缓冲液处理酶液后的反应体系相对酶活，以研究甘氨酸氧化酶的pH稳定性。 

热稳定性测定：在不同温度下（0℃～70℃）处理酶液1h，于最适条件下反应60min后，利用全波长酶标仪测定OD_450nm吸光值。以最高酶活定义为100%，计算不同温度处理酶液后的反应体系相对酶活，以研究甘氨酸氧化酶的热稳定性。 

参考文献 

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13.Tarahovsky Y,Ivanitsky G,Khusainov A.Lysis of Escherichia coli cells induced by bacteriophage T4.FEMS Microbiol Lett,1994,122:195-199. 

14.Weiner M,Costa G.Rapid PCR site-directed mutagenesis.Genome Res,1994,4:131-136. 

Claims (4)

1.一种分离的草甘膦氧化酶B3S1基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.一种分离的草甘膦氧化酶B3S1编码蛋白，其蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

3.权利要求1所述的基因在抗草甘膦转基因植物中的应用。

4.权利要求2所述的编码蛋白在抗草甘膦转基因植物中的应用。