CN101484463A

CN101484463A - 降解除草剂的酶

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Publication number: CN101484463A
Application number: CNA2007800256603A
Authority: CN
Inventors: C·J·哈特利; S·J·德里安; L·J·布里格斯; M·R·威廉斯; R·J·鲁赛尔; J·G·奥克肖特
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Grains Research and Development Corp
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Grains Research and Development Corp
Priority date: 2006-05-12
Filing date: 2007-05-11
Publication date: 2009-07-15
Also published as: RU2008148945A; WO2007131276A1; CA2651428A1; EP2021359A4; JP2009536819A; ZA200809620B; BRPI0711376A2; AU2007250526A1; EP2021359A1; US20100199363A1

Abstract

本发明涉及一种新型酶以及编码这些酶的多核苷酸，所述酶能降解含胺除草剂如草甘膦和草胺膦。本发明还涉及产生这些酶的转基因植物，其对于含胺除草剂活性具有抗性。另外，本发明提供了依赖于这种新型酶活性的生物修复方法。

Description

降解除草剂的酶

发明领域

本发明涉及新型酶，其能降解含胺除草剂如草甘膦和草胺膦，以及编码这些酶的多核苷酸。本发明还涉及产生这些酶的转基因植物，其对于含胺除草剂活性具有抗性。另外，本发明提供了依赖于这种新型酶的活性的生物修复方法(bioremediation)。

发明背景

有机膦酸盐类化合物(Organophosphonates)特征在于赋予对于化学、热和酶降解具有相对抗性的稳定的碳-磷(C-P)键。天然的有机膦酸盐类化合物在磷的生物地球化学循环中起重要作用，合成的有机膦酸盐类化合物在化学工业中具有各种各样的用途，最主要是作为除草剂如草甘膦(N-膦酰甲基甘氨酸)和草胺膦(Basta^TM)。

草甘膦(N-膦酰甲基甘氨酸)是膦酸酯除草剂，其抑制5-烯醇式丙酮-3-莽草酸(磷酸莽草酸)合酶(EPSPS)，该酶是莽草酸途径的一个成分。植物利用莽草酸途径产生必需的芳族氨基酸和维生素，且草甘膦通过EPSPS特异性破坏磷酸烯醇丙酮酸和3-莽草酸向5-烯醇式丙酮-3-莽草酸的转变。

一旦膦酸酯进入土壤，则主要是微生物活性导致其去除，微生物活性分成两个主要途径：由pho调节子调节的磷酸饥饿依赖性机制，由此微生物利用膦酸酯作为唯一的磷源(Wanner，1994)，磷酸盐非依赖性机制，由此细菌利用膦酸酯作为唯一的碳、氮和磷源(Ternan et al.，1998a；Ternan et al.，1998b；McGrath et al.，1998)。也已经描述了能利用膦酸酯(包括草甘膦)作为磷酸盐唯一来源的真菌分离株，推测可能涉及几种不同途径(可能与在细菌中的情况相似)(Kryskol-Lupicka et al.，1997)。检测的真菌分离株均产生作为草甘膦降解的主要产物的AMPA，提示与细菌GOX(WO 92/00377)相似的真菌酶的参与作用。

对草甘膦除草剂的酶降解或修饰已经产生兴趣，这是由于关于分子在环境中命运的考虑以及作为对用于工程化除草剂耐受植物的系统的额外补充，可通过增加植物中的EPSPS水平或者用赋予对草甘膦的耐受性的修饰的EPSPS置换天然EPSPS而进行。已发现土壤中的草甘膦降解是迅速而广泛的，氨基甲基膦酸酯(AMPA)被鉴别为最常见产物(Wackett等1987)，并且能降解草甘膦的几种单细菌培养物已被描述(综述见Malik et al.，1989)。

因此鉴定了在纯细菌培养物中草甘膦代谢的两种途径(图1)。已经针对黄杆菌(Balthazor and Hallas，1986)、假单胞菌(Jacob等，1988)和Arthrobacter atrocyaneus(Pipke and Amrhein，1988)描述了代谢为AMPA的途径，而草甘膦通过pho调节的C-P裂合酶系统转变为肌氨酸和无机磷酸盐(Pi)的途径已经针对假单胞菌(Shinabarger and Braymer，1986；Kishore andJacob，1987)、产碱菌菌株GL，链霉菌(Objoska et al.，1999)和节杆菌(节杆菌)(Pipke et al.，1988)描述，且针对嗜盐菌VH1(Hayes et al.，2000)和苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)1021(Liu et al.，1991)进行了推测。

Yakoleva等(1998)首先从大肠杆菌中分离并表达了phn操纵子，其编码参与磷酸盐依赖性C-P裂合酶活性的所有基因。White和Metcalf(2004)随后描述了来自施氏假单胞菌(Pseudomomas stutzeri)的两种不同的操纵子-其一是大肠杆菌phn操纵子的同系物，另一是编码参与亚磷酸盐代谢的次磷酸盐-2-酮戊二酸加双氧酶的htx操纵子。然而，这些C-P裂合酶系统均不能裂解草甘膦(White and Metcalf，2004)，与McGrath等(1995)所述的底物特异性膦酰乙酸(phosphonoacetate)水解酶相似。草甘膦耐受性也可以通过使用草甘膦乙酰转移酶(GAT)对草甘膦进行N-乙酰化而赋予，如Castle及其同事(Castle et al.，2004)所揭示，他们也利用三种不同的gat基因的DNA改组技术，使GAT的酶效率改良了四个数量级(Castle et al.，2004；Siehl et al.，2005)。

利用这种微生物除草剂-代谢或修饰酶的野草控制时机已经在Padgette等(1996)和Vasil(1996)中详细描述。

目前可用于降解草甘膦、特别是当其在植物中表达时的酶不具有特别高的活性。因此，需要鉴别可用于降解除草剂如草甘膦的进一步的酶。

发明概述

本发明利用先前未知的草甘膦代谢机制鉴别细菌、另外，本发明人已经分离且鉴定了这种细菌的新型草甘膦-降解基因-酶系统。

一方面，本发明提供了基本上纯化的多肽，其降解草甘膦产生甘氨酸。

另一方面，本发明提供了基本上纯化的多肽，其裂解草甘膦的膦酰甲基C-3碳-氮键。

在一个特别优选的实施方案中，所述多肽包含单氨基酸链。因此，所述多肽不是多酶复合物的一部分，当使用草甘膦作为底物时需要多个反应以产生甘氨酸。

在另一个实施方案中，所述多肽裂解草甘膦产生甘氨酸和氧代膦酸(oxophosphonic acid)(或其离子形式)。

在特别优选的实施方案中，所述多肽是可溶的。因此，所述多肽不是膜结合的。

在另一个实施方案中，草甘膦的裂解基本上不产生乙醛酸。

在另一个实施方案中，草甘膦的裂解基本上不产生肌氨酸。

再一方面，本发明提供了基本上纯化的多肽，其具有比GOX(SEQ IDNO：3)高的裂解草甘膦的效率。

再一方面，本发明提供了基本上纯化的多肽，其具有大于550μmol/min/mg的裂解草甘膦的比活性。

优选地，所述比活性大于600μmol/min/mg、更优选大于700μmol/min/mg，特别优选高于5,000μmol/min/mg。

在一个优选的实施方案中，所述多肽的比活性如实施例3所述确定。

再一方面，本发明提供了基本上纯化的多肽，其包含具有选自下组的氨基酸序列：

i)SEQ ID NO：1，及

ii)与i)至少25％相同的氨基酸序列，

其中所述多肽裂解含胺除草剂。

在一个实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所示序列。

含胺除草剂的例子包括但非限于草甘膦、草胺膦、双丙氨酰膦(bilanafos)和草甘二膦(glyphosine)。在一个优选的实施方案中，所述含胺除草剂是草甘膦或草胺膦。

在一个优选的实施方案中，本发明的多肽可以自节杆菌菌种中纯化。优选地，所述节杆菌菌种是节杆菌TBD。

在一个实施方案中，所述多肽与至少一种其它多肽融合。

所述至少一种其它多肽可例如是增强本发明的多肽的稳定性的多肽，或者有助于融合蛋白纯化的多肽。

再一方面，本发明提供了分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含具有选自下组的序列的核苷酸：

i)SEQ ID NO：2，

ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，

iii)与i)至少25％相同的核苷酸序列，

iv)在低严格条件下与i)杂交的核苷酸序列，

v)与i)-iv)互补的核苷酸序列。

优选地，所述多核苷酸编码裂解含胺除草剂的多肽。更优选地，所述含胺除草剂是草甘膦或草胺膦。

在另一个实施方案中，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO：8或SEQ IDNO：9所示序列的多肽。

在一个优选的实施方案中，所述多核苷酸包含在中等严格条件下与i)杂交的序列。更优选地，所述多核苷酸包含在严格杂交条件下与i)杂交的序列。

另一方面，本发明提供了包含在植物细胞中起作用的启动子的重组多核苷酸，所述的启动子与编码本发明多肽的结构DNA序列可操纵地连接，与在所述细胞中起作用的3’聚腺苷酸化序列可操纵地连接，其中所述启动子与所述结构DNA序列异源，且能表达所述结构DNA序列以增强细胞对于含胺除草剂的抗性。

再一方面，本发明提供了包含本发明多核苷酸的载体。

优选地，所述多核苷酸与启动子可操纵地连接。

另一方面，本发明提供了包含至少一种本发明多核苷酸和/或至少一种本发明载体的宿主细胞。

所述宿主细胞可以是任何类型细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞是植物细胞。

另一方面，本发明提供了裂解草甘膦并产生甘氨酸的重组细胞。

优选地，所述细胞包含本发明的多核苷酸，其中所述细胞非天然包含所述多核苷酸。

另一方面，本发明提供了包含导入的多肽的重组细胞，所述多肽裂解草甘膦产生甘氨酸。

再一方面，本发明提供了包含导入的多肽的重组细胞，所述多肽裂解草甘膦的膦酰甲基C-3碳-氮键。

优选地所述多肽是由所述细胞表达本发明的多核苷酸而产生的。

另一方面，本发明提供了制备本发明的多肽的方法，所述方法包括在使得编码多肽的多核苷酸表达的条件下培养编码所述多肽的本发明的宿主细胞或者编码所述多肽的本发明的载体，以及回收表达的多肽。

本发明还提供了使用本发明的方法产生的多肽。

再一方面，本发明提供了分离的抗体，其特异性结合本发明的多肽。

再一方面，本发明提供了组合物，其包含至少一种本发明的多肽、至少一种本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞、本发明的重组细胞和/或本发明的抗体，及一或多种可接受的载体。

再一方面，本发明提供了裂解含胺除草剂的组合物，所述组合物包含至少一种本发明的多肽及一或多种可接受的载体。

优选地，所述组合物进一步包含金属离子。在一个优选的实施方案中，所述金属离子是二价金属离子。更优选地，所述金属离子选自Mg²⁺、Co²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺，及其组合。还更优选地，所述金属离子选自Mg²⁺、Zn²⁺、Co²⁺，及其组合。

本发明的多肽可用作选择标记以检测重组细胞。因此，本发明还提供了本发明多肽、或者编码所述多肽的多核苷酸作为选择标记在检测和/或选择重组细胞中的应用。

再一方面，本发明提供了检测重组细胞的方法，所述方法包括：

i)将细胞或细胞群与编码本发明多肽的多核苷酸在使得所述细胞摄取所述多核苷酸的条件下接触，及

ii)通过将得自步骤i)的细胞或其后代暴露于含胺除草剂而选择重组细胞。

优选地，所述多核苷酸包含编码本发明多肽的第一个开放读框及不编码本发明多肽的第二个开放读框。

在一个实施方案中，所述第二个开放读框编码多肽。在另一个实施方案中，所述第二个开放读框编码不翻译的多核苷酸。在这两种情况中，优选所述第二个开放读框与合适的启动子可操纵地连接。

优选地，不翻译的多核苷酸编码催化性核酸、dsRNA分子或反义分子。

合适的细胞的例子包括但非限于植物细胞、细菌细胞、真菌细胞或动物细胞。优选地，所述细胞是植物细胞。

优选地，所述含胺除草剂是草甘膦或草胺膦。

再一方面，本发明提供了裂解含胺除草剂的方法，所述方法包括将含胺除草剂与本发明的多肽接触。

在一个实施方案中，所述多肽是由本发明的宿主细胞产生的。

优选地，所述含胺除草剂是草甘膦或草胺膦。

本发明提供的多肽可以在植物中产生，以在宿主植物暴露于含胺除草剂如草甘膦时增强其生长能力。

因此，本发明另一方面提供了包含外源多核苷酸的转基因植物，所述多核苷酸编码至少一种本发明的多肽。

优选地，所述含胺除草剂是草甘膦或草胺膦。

在一个实施方案中，所述多肽至少在转基因植物的气生部分中产生。

优选地，所述多核苷酸被稳定掺入植物的基因组中。

本发明还提供了一种产生对于含胺除草剂的抗性增强的植物的方法，所述方法包括如下步骤：a)向植物细胞的基因组中插入多核苷酸，所述多核苷酸包含：与其可操纵地连接的在植物细胞中起作用导致RNA序列产生的启动子、与其可操纵地连接的导致编码本发明多肽的RNA序列产生的结构DNA序列、在植物细胞中起作用导致在RNA序列的3’末端添加聚腺苷酸核苷酸的3’非翻译区；其中所述启动子与所述结构DNA是异源的且适于导致所述多肽足够的表达，以增强用所述DNA分子转化的植物细胞的含胺除草剂抗性；b)获得转化的植物细胞；及c)从转化的植物细胞再生经遗传转化的对含胺除草剂抗性增强的植物。

再一方面，本发明提供了使用本发明的方法产生的转基因植物。

另一方面，本发明提供了裂解样品中含胺除草剂的方法，所述方法包括将样品暴露于本发明的转基因植物。

优选地，所述样品是土壤。这种土壤可以在田野中。

另一方面，本发明提供了包含外源多核苷酸的转基因非人动物，所述多核苷酸编码至少一种本发明的多肽。

再一方面，本发明提供了分离的菌株节杆菌，其于2006年4月11日保藏于澳大利亚全国测量学院(National Measurement Institute)，保藏号为V06/010960。

再一方面，本发明提供了裂解含胺除草剂的组合物，该组合物包含本发明的菌株及一或多种可接受的载体。

再一方面，本发明提供了包含本发明多肽的本发明的宿主细胞、本发明的重组细胞、本发明的转基因植物、本发明的转基因非人动物或者本发明的菌株的提取物。

再一方面，本发明提供了裂解含胺除草剂的组合物，所述组合物包含本发明的提取物及一或多种可接受的载体。

再一方面，本发明提供了裂解含胺除草剂的方法，所述方法包括将含胺除草剂暴露于本发明的菌株和/或本发明的提取物。

本发明还提供了分离的细菌，其产生本发明的多肽。

优选地，所述细菌是Arthrobacter sp。

再一方面，本发明提供了产生本发明多肽的分离的天然存在的细菌在裂解含胺除草剂中的应用。

另一方面，本发明提供了裂解含胺除草剂的聚合的海绵或泡沫，所述泡沫或海绵包含固定于聚合的多孔支持物上的本发明的多肽。

再一方面，本发明提供了裂解含胺除草剂的方法，所述方法包括将含胺除草剂暴露于本发明的海绵或泡沫。

另一方面，本发明提供了从本发明植物中产生的产物。

产物的例子包括但非限于淀粉、油、植物纤维如棉花、麦芽和面粉。

再一方面，本发明提供了本发明植物的部分。例子包括但非限于种子、果实和坚果。

本发明的多肽可以被突变，根据改变的活性如增强的酶活性筛选所得突变体。这种突变可以使用本领域已知的任何技术进行，包括但非限于体外诱变和DNA改组。

因此，本发明另一方面提供了产生裂解含胺除草剂的能力增强的多肽的方法，所述方法包括：

(i)改变本发明的第一多肽的一或多个氨基酸，

(ii)确定得自步骤(i)的改变的多肽的裂解含胺除草剂的能力，及

(iii)选择当与第一多肽对比时裂解含胺除草剂的能力增强的改变的多肽。

本发明还提供了通过本发明的方法产生的多肽。

再一方面，本发明提供了筛选能裂解含胺除草剂的微生物的方法，所述方法包括：

i)在存在含胺除草剂作为唯一氮源的条件下培养候选微生物，及

ii)确定所述微生物是否能生长和/或分裂。

在一个实施方案中，所述微生物是细菌、真菌或原生动物。

在一个优选的实施方案中，所述微生物是重组微生物。另外，优选筛选重组微生物，其中所述重组微生物包含多个不同的外源DNA分子。这种外源DNA分子的例子包括质粒或粘粒基因组DNA文库。

优选地，所述含胺除草剂是草甘膦。

本发明还提供了使用本发明方法分离的微生物。

再一方面，本发明提供了试剂盒，其包含至少一种本发明多肽、至少一种本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞、本发明的重组细胞本发明的抗体、本发明的组合物、至少一种本发明的菌株、至少一种本发明的提取物、至少一种本发明的细菌、至少一种本发明的聚合的海绵或泡沫、至少一种本发明的产物，和/或至少一种本发明植物的部分。

显然，本发明一方面优选的特征和特性可适用于本发明的许多其它方面。

在本说明书中，“包含”或“包括”应理解为包含指定的要素、整数和步骤或者成组的要素、整数和步骤，但是不排除任何其它要素、整数和步骤或者成组的要素、整数和步骤。

本发明在下文通过非限制性实施例及参考附图加以描述。

附图简述

图1.草甘膦代谢途径。I.多酶膜结合的C-P裂合酶系统对C-P键的裂解。II.C₂-N键的裂解产生氨甲基膦酸(AMPA)和乙醛酸。III.GloxA裂解C₃-N键产生甘氨酸和氧膦酸的推定机制。

图2.草甘膦作为底物由GloxA和GOX催化的推定反应的比较(A)，以及得自这些酶反应的HPLC反应模式图(B)。

图3.与编码GOX或GloxA的质粒DNA的DNA：DNA杂交。将消化的质粒和粘粒DNA构建体转移至HybondN⁺膜，然后用gox基因的32^P-放射标记的PCR产物探查。

图4.部分纯化的GloxA和GOX对于草甘膦和亚氨基二乙酸的活性对比。

图5.GloxA的原位(In planta)表达赋予是正常剂量五倍的草甘膦耐受性。为了获得耐受值(Tolerance Score)，在应用除草剂后第8天目测评定植物的叶健康状况、植物半径(plant radius)和开花情况。在相同系统下未处理的对照理想的健康分值为7-8。

序列表说明

SEQ ID NO：1-GloxA的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2-编码GloxA的核苷酸序列。

SEQ ID NO：3-GOX的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4和5-寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：6-为在植物中表达而优化的GloxA编码序列，包括在5’和3’末端添加的克隆位点以及紧邻起始密码子的AACA。

SEQ ID NO：7-为在大肠杆菌中表达而优化的GloxA编码序列。

SEQ ID NO：8-来自扩展短杆菌(Brevibacterium linens)BL2的BOBL。

SEQ ID NO：9-来自金黄节杆菌(Arthobacter aurescens)TC1的GloxD。

发明详述

通用技术

除非特别指出，本文所用所有技术和学术术语均具有本领域技术人员公认的含义(例如细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学领域)。

除非特别指出，本发明中利用的重组蛋白质、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员熟知的标准程序。这些技术在例如如下所述的文献中描述和阐述：J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley andSons(1984)、J.Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbour Laboratory Press(1989)、T.A.Brown(editor)，EssentialMolecular Biology：A Practical Approach，Volumes 1 and 2，IRL Press(1991)、D.M.Glover and B.D.Hames(editors)，DNA Cloning：A Practical Approach，Volumes 1-4，IRL Press(1995 and 1996)、F.M.Ausubel等(editors)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，including all updates until present)、Ed Harlow and David Lane(editors)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，(1988)、J.E.Coligan等(editors)Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons(包括到目前为止的所有更新)，所述文献在此并入本文作参考。

含胺除草剂

含胺除草剂包括当外部应用于植物时对所述植物具有有害作用的具有氨基的任何分子。在一个实施方案中，所述含胺除草剂是有机膦酸酯(organophosphonate)。含胺除草剂的例子包括但非限于草甘膦、草胺膦、双丙氨膦(bilanafos)和草甘二膦(glyphosine)。

如本文所用，术语“草甘膦”通常是指亲代除草剂N-膦酰甲基甘氨酸(也称作草甘膦酸(glyphosate acid))、其离子形式、其盐或酯形式，或者在植物组织中转变为N-膦酰甲基甘氨酸的化合物，或者另外提供离子形式N-膦酰甲基甘氨酸的化合物(也称作草甘膦离子(glyphosate ion))。草甘膦盐包括但非限于碱金属盐，例如钠盐和钾盐；铵盐；C_1-16烷基铵，例如二甲基铵和异丙基铵盐；C_1-16烷醇铵，例如甲醇铵盐；C_1-16烷基锍，例如三甲基锍盐；上述盐的混合物等。所述草甘膦酸分子具有pKa值不同的三个酸位点；因此可以使用一、二和三碱基盐，或者其任何混合物，或者任何以中间水平中和的盐。草甘膦是Roundup^TM(Monsanto Co.)的活性成分。商业草甘膦配方的例子包括但非限于由Monsanto公司以ROUNDUP^TM、ROUNDUP^TMULTRA、ROUNDUP^TM ULTRAMAX、ROUNDUP^TM WEATHERMAX、ROUNDUP^TM CT、ROUNDUP^TM EXTRA、ROUNDUPS BIACTIVE、ROUNDUP^TM BIOFORCE、RODEO^TM、POLARIS^TM、SPARK^TM和ACCORD^TM销售的那些除草剂，所有这些均含有作为其异丙基铵盐的草甘膦；由Monsanto公司以ROUNDUP^TM DRY和RIVAL^TM销售的那些除草剂，其含有作为其铵盐的草甘膦；由Monsanto公司以ROUNDUP^TMGEOFORCE销售的除草剂，其含有作为其钠盐的草甘膦；及由SyngentaCrop Protection以TOUCHDOWN^TM销售的除草剂，其含有作为其三甲基锍盐的草甘膦。草甘膦由于对于莽草酸途径的抑制作用而是植物性毒素，所述途径提供了合成芳族氨基酸的前体。草甘膦抑制在植物中发现的5-烯醇式丙酮-3-膦酸莽草酸合酶(EPSPS)。

如本文所用，“草胺膦”是指2-氨基4-(羟甲基氧膦基)丁酸及其离子形式、酯和盐，特别是铵盐。草胺膦是非选择性系统除草剂，是BASTA^TM、RELY^TM、FINALE^TM、CHALLENGE^TM和LIBERTY^TM的活性成分。草胺膦干扰谷氨酰胺的生物合成途径及氨解毒作用。

如本文所用，“双丙氨膦”是指4-羟基(甲基)膦酰基-L-高丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酸(alanin)及其离子形式、酯和盐。

如本文所用，“草甘二膦”是指N，N-二(膦酰甲基)甘氨酸及其离子形式、酯和盐。

多肽

“基本上纯化的多肽”或者“纯化的多肽”是指从在天然状态与其相关联的一或多种脂质、核酸、其它多肽或其它污染分子中分离的多肽。优选基本上纯化的多肽至少60％、更优选至少75％、及更优选至少90％无与其天然相关的其它成分。本领域技术人员意识到所述纯化的多肽可以是重组产生的多肽。

术语“多肽”和“蛋白质”通常可互换应用，是指可以通过添加非氨基酸基团修饰或者不可修饰的单多肽链。应理解这种多肽链可以与其它多肽或蛋白质或其它分子如辅因子缔合。如本文所用，术语“蛋白质”和“多肽”也包括本发明多肽的变体、突变体、修饰物、类似物和/或衍生物。

本文的“可溶的多肽”不与脂质双层如细胞膜结合。

多肽的相同性百分比％是通过GAP(Needleman and Wunsch，1970)分析(GCG程序)确定，缺口产生罚分(gap creation penalty)＝5，缺口延伸罚分(gap extension penalty)＝0.3。查询长度为至少25个氨基酸，GAP分析排列对比至少25个氨基酸区域的两个序列。更优选地，查询序列长度为至少50个氨基酸，GAP分析排列对比至少50个氨基酸区域的两个序列。更优选地，查询序列长度为至少100个氨基酸，GAP分析排列对比至少100个氨基酸区域的两个序列。甚至更优选地，查询序列长度为至少250个氨基酸，GAP分析排列对比至少250个氨基酸区域的两个序列。特别优选地，GAP分析排列对比全长的两个序列。

如本文所用，“生物活性”片段是本发明多肽的一部分，其保持全长多肽的指定活性，即能裂解含胺除草剂、特别是草甘膦。生物活性片段可以是任何大小，只要保持指定活性即可。优选地，生物活性片段的长度为至少100、更优选至少200、甚至更优选至少350个氨基酸。

关于指定的多肽，优选的实施方案包含相同性百分比％高于上述的那些多肽。因此，根据最小相同性百分比％，优选所述多肽包含与相关命名的SEQ ID NO.至少40％，、更优选至少45％、更优选至少50％、更优选至少55％、更优选至少60％、更优选至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％、更优选至少99.1％、更优选至少99.2％、更优选至少99.3％、更优选至少99.4％、更优选至少99.5％、更优选至少99.6％、更优选至少99.7％、更优选至少99.8％，及还更优选至少99.9％相同的氨基酸序列。

本发明多肽的氨基酸序列突变体可以通过在本发明的核酸中导入合适的核苷酸或者通过体外合成希望的多肽而制备。这种突变体包括例如氨基酸序列内的残基缺失、插入或取代。可以进行缺失、插入和取代组合突变，以使得最终的构建体多肽产物具有希望的特性。

突变体(改变的)多肽可以使用本领域已知的任何技术制备。例如，可以对本发明的多核苷酸进行体外诱变。这种体外诱变技术包括将多核苷酸亚克隆进合适的载体中，将该载体转化进入“突变体”菌株如大肠杆菌E.coliXL-1red(Stratagene)中，使该转化的细菌繁殖适当数目的世代。在另一个实施例中，对本发明的多肽进行如Harayama(1998)所述的DNA改组技术。这些DNA改组技术可包括与本发明相关的基因，如细菌的其它氧化还原酶(例如编码SEQ ID NO：8的多核苷酸)。衍生自突变的/改变的DNA的产物可易于使用本文所述技术筛选，以确定它们是否能裂解含胺除草剂如草甘膦。

在设计氨基酸序列突变体中，突变位点的位置和突变性质根据修饰的特性而决定。突变位点可以单独或系列修饰，例如通过(1)用选择的保守氨基酸取代，然后根据获得的结果更彻底地选择，(2)缺失靶残基，或者(3)在指定位点邻近处插入其它残基。

氨基酸序列缺失通常为大约1-15个残基，更优选大约1-10个残基，通常为大约1-5个连续的残基。

取代突变体是在多肽分子中除去至少一个氨基酸并在这个位置插入不同的残基。最感兴趣的取代突变的位点包括被认为对于其功能重要的位点。其它感兴趣的位点是其中得自不同菌株或物种的特定残基是相同的那些位点。这些位置可以是生物学活性重要的。这些位点、特别是至少三个其它相同保守的位点序列中的那些位点，优选以相对保守的方式取代。这种保守取代示于表1，标题为“举例的取代”。

表1：举例的取代

原始残基	举例的取代
原始残基	举例的取代	Ala(A)	val；leu；ile；gly
Arg(R)	lys	Ala(A)	val；leu；ile；gly
Arg(R)	lys	Asn(N)	gln；his
Asp(D)	glu	Asn(N)	gln；his
Asp(D)	glu	Cys(C)	ser
Gln(Q)	asn；his	Cys(C)	ser
Gln(Q)	asn；his	Glu(E)	asp
Gly(G)	pro，ala	Glu(E)	asp
Gly(G)	pro，ala	His(H)	asn；gln
Ile(I)	leu；val；ala	His(H)	asn；gln
Ile(I)	leu；val；ala	Leu(L)	ile；val；met；ala；phe
Lys(K)	arg	Leu(L)	ile；val；met；ala；phe
Lys(K)	arg	Met(M)	leu；phe
Phe(F)	leu；val；ala	Met(M)	leu；phe
Phe(F)	leu；val；ala	Pro(P)	gly

Ser(S)	thr
Ser(S)	thr	Thr(T)	ser
Trp(W)	tyr	Thr(T)	ser
Trp(W)	tyr	Tyr(Y)	trp；phe
Val(V)	ile；leu；met；phe；ala	Tyr(Y)	trp；phe

另外，如果需要，可以将非天然的氨基酸或氨基酸的化学类似物作为取代或添加导入本发明多肽中。这种氨基酸包括但非限于一般氨基酸的D-异构体、2，4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱氨酸、t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟-氨基酸，设计的氨基酸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸，及一般的氨基酸类似物。

本发明范围内还包括在合成期间或之后不同修饰的本发明多肽，例如通过生物素酰化、苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白酶解、与抗体分子或其它细胞配体连接等。这些修饰可用以增加本发明多肽的稳定性和/或生物活性。

本发明多肽可以多种方式产生，包括天然多肽的产生与回收、重组多肽的产生与回收，及化学合成的多肽。在一个实施方案中，本发明分离的多肽是通过在有效产生多肽的条件下培养能表达多肽的细胞并回收所述多肽而产生的。优选的培养细胞是本发明的重组细胞。有效的培养条件包括但非限于允许多肽产生的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。有效培养基是指在其中可以培养细胞以产生本发明多肽的任何培养基。这种培养基通常包括具有可吸收的碳、氮和磷酸盐来源及合适的盐、矿物质、金属及其它营养素如维生素的液态培养基。本发明的细胞可以在常规发酵生物反应器、摇瓶、实验试管、微滴定器皿和培养皿中培养。培养可以在适于重组细胞的温度、pH和氧含量条件下进行。这种培养条件为本领域技术人员所熟知。

多核苷酸与寡核苷酸

“分离的多核苷酸”，包括DNA、RNA、或其组合、单链或双链、有义或反义方向或者这两种情况的组合、dsRNA或其它情况是指从在天然状态中与其缔合或连接的多核苷酸序列中至少部分分离的多核苷酸。优选地，所述分离的多核苷酸至少60％、优选至少75％、最优选至少90％无与其天然缔合的其它成分。技术人员意识到，分离的多核苷酸可以是存在于例如转基因生物体中的外源多核苷酸，所述转基因生物体非天然包含该多核苷酸。另外，术语“多核苷酸”与“核酸”可互换使用。

多核苷酸的相同性百分比通过GAP(Needleman and Wunsch，1970)分析(GCG程序)确定，缺口产生罚分＝5，缺口延伸罚分＝0.3。除非特别指出，则查询序列长度为至少45个核苷酸，GAP分析排列对比了至少45个核苷酸区域的两个序列。优选地，查询序列长度为至少150个核苷酸，GAP分析排列对比了至少150个核苷酸区域的两个序列。更优选地，查询序列长度为至少300个核苷酸，GAP分析排列对比了至少300个核苷酸区域的两个序列。甚至优选地，GAP分析排列对比了全长的两个序列。

关于指定的多核苷酸，应理解本发明优选的实施方案涵盖了相同性百分比高于上述的那些多核苷酸。因此，在可应用时，根据最小相同性百分比，优选本发明的多核苷酸包含与相关命名的SEQ ID NO.具有40％、更优选至少45％、更优选至少50％、更优选至少55％、更优选至少60％、更优选至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％、更优选至少99.1％、更优选至少99.2％、更优选至少99.3％、更优选至少99.4％、更优选至少99.5％、更优选至少99.6％、更优选至少99.7％、更优选至少99.8％，甚至更优选至少99.9％相同性的序列。

如本文所用，术语“基因”具有其最广泛的含义，包括脱氧核糖核苷酸，其包含结构基因的蛋白质编码区，及包括位于5’和3’末端编码区相邻至少大约2kb的序列。位于编码区的5’末端且存在于mRNA上的序列称作5’非翻译序列。位于编码区3’末端或下游且存在于mRNA上的序列称作3’非翻译序列。术语“基因”涵盖了cDNA及基因的基因组形式。术语“基因”包括编码所有或部分本发明蛋白质的合成或融合的分子及上述任一序列的互补核苷酸序列。

如本文所用，短语“严格条件”是指在此条件下多核苷酸、探针、引物和/或寡核苷酸将与其靶序列杂交而不与其它序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，且在不同情况中是不同的。较长的序列与较短的序列相比在较高温度特异性杂交。通常地，严格条件是在指定离子浓度和pH下选择比特异序列低大约5℃的热解链点(Tm)。Tm是在此温度下50％的与靶序列互补的探针平衡杂交靶序列的温度。由于靶序列通常过量存在，因此在Tm，平衡状态下50％的探针发生结合。通常地，严格条件是盐浓度低于大约1.0M钠离子，通常为大约0.01-1.0M钠离子(或者其它盐)，pH 7.0-8.3，温度为至少大约30℃(对于短探针、引物或寡核苷酸，例如10nt-50nt)及至少大约60℃(对于长探针、引物和寡核苷酸)。严格条件也可以通过加入去稳定剂如甲酰胺而实现。

严格条件为本领域技术人员所已知，可见于Ausubel等(supra)，CurrentProtocols In Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6以及本发明实施例所述。优选地，所述条件是彼此至少大约65％、70％、75％、85％、90％、95％、98％或99％同源的序列保持彼此杂交。严格杂交条件的非限制性例子是在包含6×SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、0.02％ PVP、0.02％ Ficoll、0.02％ BSA和500mg/ml变性的鲑精DNA的高盐缓冲液中在65℃杂交，随后在50℃在0.2×SSC、0.01％ BSA中洗涤一或多次。在另一个实施方案中，提供了在中等严格条件下可以与包含SEQ IDNO：2、6和/或7所示核苷酸序列的核酸分子杂交的核酸序列。中等严格杂交条件的非限制性例子是在55℃在6×SSC、5xDenhardt′s溶液、0.5％ SDS和100mg/ml变性鲑精DNA中杂交，随后在37℃在1×SSC、0.1％ SDS中洗涤一或多次。可以使用的其它中等严格条件为本领域所熟知，见例如Ausubel等(supra)和Kriegler，1990；Gene Transfer And Expression，ALaboratory Manual，Stockton Press，NY所述。在另一个实施方案中，提供了在低严格条件下可以与包含SEQ ID NO：1、6和/或7所示核苷酸序列的核酸分子杂交的核酸序列。低严格杂交条件的非限制性例子是在40℃在35％甲酰胺、5×SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、5mM EDTA、0.02％ PVP、0.02％Ficoll、0.2％ BSA、100mg/ml变性鲑精DNA、10％(wt/vol)硫酸葡聚糖中杂交，随后在50℃在2×SSC、25mM Tris-HCl(pH 7.4)、5mM EDTA和0.1％ SDS中洗涤一或多次。可以使用的其它低严格条件为本领域所熟知，见例如Ausubel等(supra)和Kriegler，1990，Gene Transfer And Expression，ALaboratory Manual，Stockton Press，NY以及本发明实施例所述。

当与天然存在的分子对比时，本发明的多核苷酸可具有一或多个突变，所述突变是核苷酸残基的缺失、插入或取代。突变体可以是天然存在的(即分离自天然来源)或者合成的(例如通过对核酸进行定向诱变而合成)。

本发明的寡核苷酸可以是RNA、DNA或其衍生物。尽管术语多核苷酸与寡核苷酸具有重叠的含义，但是寡核苷酸是通常相对短的单链分子。这种寡核苷酸的最小大小是在寡核苷酸与靶核酸分子上互补序列之间形成稳定杂交体所需的大小。优选地，所述寡核苷酸的长度为至少15个核苷酸、更优选至少18个核苷酸、更优选至少19个核苷酸、更优选至少20个核苷酸，还更优选至少25个核苷酸。

通常地，多核苷酸或寡核苷酸的单体通过磷酸二酯键或其类似物连接形成大小范围在相对较短的单体单位例如12-18个核苷酸至几百个单体单位之间的寡核苷酸。磷酸二酯键的类似物包括：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、硫代磷酰苯胺(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酰酯(phosphoranilidate)、氨基磷酸酯(phosphoroamidate)。

本发明包括可用作例如探针以鉴别核酸分子，或者用作引物以产生核酸分子。用作探针的本发明的寡核苷酸通常与可检测的标记如放射性同位素、酶、生物素、荧光分子或化学发光分子缀合。

探针和/或引物可用于从其它物种克隆本发明多核苷酸的同系物。另外，也可以使用本领域已知的杂交技术筛选这种同源物的基因组或cDNA文库。

重组载体

本发明的一个实施方案包括重组载体，其包含本发明的至少一个分离的多核苷酸分子，插入在能将该多核苷酸分子输送至宿主细胞中的任何载体中。这种载体含有异源多核苷酸序列，即非天然发现与本发明的多核苷酸分子相邻的多核苷酸序列，及优选衍生自所述多核苷酸分子衍生自其中的物种之外的物种。所述载体可以是RNA或DNA，可以是原核或真核生物，通常是转座子(如US 5,792,294所述)、病毒或质粒。

一种类型的重组载体包含与表达载体可操纵地连接的本发明的多核苷酸分子。短语“可操纵地连接”是指多核苷酸分子插入表达载体中，由此当转化进宿主细胞中所述分子能被表达。如本文所用，表达载体是能转化宿主细胞及能使得指定的多核苷酸分子表达的DNA或RNA载体。优选地，所述表达载体也能在宿主细胞中复制。表达载体可以是原核或真核表达载体，通常是病毒或质粒。本发明的表达载体包括在本发明的重组细胞中起作用(即指导基因表达)的任何载体，包括在细菌、真菌、体内寄生虫、节肢动物、动物和植物细胞中。本发明的载体也可以用于在无细胞表达系统中产生所述多肽，这种系统为本领域所熟知。

如本文所用，术语“可操纵地连接”是指两或多个核酸节段(例如DNA)之间的功能关系。通常地，该术语是指转录调节元件与转录序列之间的功能关系。例如，如果启动子刺激或调节编码序列在合适的宿主细胞和/或无细胞表达系统中转录，则该启动子与编码序列如本文所述多核苷酸是可操纵地连接。通常地，与转录序列可操纵地连接的启动子转录调节元件与所述转录序列是物理性连接的，即它们是顺式作用型的(cis-acting)。然而，一些转录调节元件如增强子不需要与其转录被增强子增强的编码序列物理性连接或紧邻。

特别地，本发明的表达载体含有调节序列如转录控制序列、翻译控制序列、复制起源，及与重组细胞相容及控制本发明的多核苷酸分子表达的其它调节序列。特别地，本发明的重组分子包括转录控制序列。转录控制序列是控制转录的起始、延长和终止的序列。特别重要的转录控制序列是控制转录起始的那些序列，如启动子、增强子、操纵子和阻抑物序列。合适的转录控制序列包括可以在本发明的至少一种重组细胞中起作用的任何转录控制序列。本领域技术人员已知许多这种转录控制序列。优选的转录控制序列包括在细菌、酵母、节肢动物、线虫、植物或哺乳动物中起作用的那些序列，例如但非限于tac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、rrnB、λ噬菌体、T7噬菌体、T71ac、T3噬菌体、SP6噬菌体、SP01噬菌体、金属硫蛋白、α-交配因子、毕赤酵母醇氧化酶、α病毒亚基因组启动子(如新培斯病毒亚基因组启动子)、抗生素抗性基因、杆状病毒、玉米夜蛾(Heliothiszea)昆虫病毒、痘苗病毒、疱疹病毒、浣熊痘病毒、其它痘病毒、腺病毒、巨细胞病毒(如立即早期启动子)、猿病毒40、逆转录病毒、肌动蛋白、逆转录长末端重复、劳斯(Rous)肉瘤病毒、热休克蛋白、磷酸盐和硝酸盐转录控制序列，以及能控制原核或真核细胞中基因表达的其它序列。

本发明多肽的编码序列可以通过使用已知技术优化为在特定宿主细胞中最大程度表达。例如，SEQ ID NO：6提供了构建用于在植物细胞中增强表达的编码SEQ ID NO：1的开放读框，而SEQ ID NO：7提供了构建用于在大肠杆菌中增强表达的编码SEQ ID NO：1的开放读框。

宿主细胞

本发明的另一个实施方案包括重组细胞，其包含用本发明的一或多个重组分子转化的宿主细胞或其后代。多核苷酸分子转化进细胞中可以通过可以将多核苷酸分子插入细胞中的任何方法实现。转化技术包括但非限于转染、电穿孔、显微注射、脂质转染、吸附和原生质体融合。重组细胞可以保持单细胞状态，或者可以生长为组织、器官或多细胞生物体。本发明的转化的多核苷酸分子可以保持在染色体之外，或者可以整合进转化的细胞(即重组细胞)的染色体中的一或多个位点，由此保留其被表达的能力。

进行转化的合适宿主细胞包括可以用本发明的多核苷酸转化的任何细胞。本发明的宿主细胞可以是能产生本发明多肽的内源(即天然)细胞，或者可以是在用本发明的至少一种多核苷酸分子转化后能产生这种多肽的细胞。本发明的宿主细胞可以是能产生至少一种本发明的蛋白质的任何细胞，包括细菌、真菌(包括酵母)、寄生虫、线虫、节肢动物、动物和植物细胞。宿主细胞的例子包括沙门氏菌(Salmonella)、埃希氏菌(Escherichia)、芽孢杆菌(Bacillus)、李斯特氏菌(Listeria)、糖酵母(Saccharomyces)、Spodoptera、分枝杆菌(Mycobacteria)、Trichoplusia、BHK(幼仓鼠肾)细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、CV-1细胞、COS(例如COS-7)细胞和Vero细胞。宿主细胞的其它例子是大肠杆菌，包括大肠杆菌K-12衍生物；鼠沙门氏菌(Salmonella typhi)；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，包括减毒菌株；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)；粉纹夜蛾(Trichoplusiani)；及非致瘤性小鼠成肌细胞G8细胞(例如ATCC CRL 1246)。特别优选的宿主细胞是植物细胞。

重组DNA技术可用于改良转化的多核苷酸分子的表达，通过操纵例如宿主细胞内所述多核苷酸分子的拷贝数、转录多核苷酸分子的效率、翻译所得转录体的效率，及翻译后修饰的效率。可用于增加本发明的多核苷酸分子表达的重组技术包括但非限于将多核苷酸分子与高拷贝数的质粒可操纵地连接、将所述多核苷酸分子整合进一或多个宿主细胞染色体中、将载体稳定性序列加入质粒中、取代或修饰转录控制信号(例如启动子、操纵子、增强子)、取代或修饰翻译控制信号(例如核糖体结合位点、Shine-Dalgarno序列)、修饰本发明的多核苷酸分子使其符合宿主细胞的密码子用途，并缺失使转录体不稳定的序列。

转基因植物

如本文所用，术语“植物”作为名词是指完整的植物，但是用作形容词是指存在于、得自、衍生自植物或者与植物相关的任何物质，例如植物器官(例如叶、茎、根、花)、单细胞(例如花粉)、种子、植物细胞等。

用于实践本发明的植物包括单子叶植物和双子叶植物。靶植物包括但非限于如下植物：谷类(小麦、大麦、黑麦、燕麦、水稻、高粱、及相关作物)；甜菜(糖用甜菜和饲用甜菜)；梨果、坚果和软果(苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、树莓和黑莓)；豆科植物(菜豆、扁豆、豌豆、大豆)；油脂植物(oil plant)(油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻、可可豆、落花生)；瓜类植物(cucumber plant)(鱼翅瓜(marrows)、黄瓜、甜瓜)；纤维植物(棉花、亚麻、大麻、黄麻)；柑橘类果实(橙、柠檬、柚子、桔子)；蔬菜(菠菜、莴苣、芦笋、甘蓝、胡萝卜、洋葱、番茄、马铃薯、辣椒)；樟科植物(鳄梨、肉桂、樟脑)；或者植物如玉米、烟草、坚果、咖啡、甘蔗、茶叶、葡萄、啤酒花、草皮、香蕉及天然橡胶植物，以及观赏植物(花、灌木、阔叶树和常绿植物如松树)。优选地，所述植物是被子植物。

本发明的转基因植物包括已经使用重组技术进行遗传修饰使得至少一种本发明的多肽在希望的植物或植物器官中产生的植物及其后代。转基因植物可以通过使用本领域已知的技术产生，如在A.Slater et al.，PlantBiotechnology-The Genetic Manipulation of Plants，Oxford University Press(2003)和P.Christou and H.Klee，Handbook of Plant Biotechnology，JohnWiley and Sons(2004)中描述的那些技术。

“转基因植物”是指含有在相同物种的野生型植物、品种或栽培种中未发现的基因构建体(转基因)的植物。如本文所用，“转基因”具有生物技术领域的标准含义，包括通过重组DNA或RNA技术产生或改变的且已经导入植物细胞中的遗传序列。转基因可包括衍生自植物细胞的遗传序列。通常地，通过人工操纵例如通过转化将转基因导入植物中，但是可以使用本领域公认的任何方法。

在一个优选的实施方案中，转基因植物对于已经导入的每一个基因(转基因)均是纯合的，由此其后代对于希望的表型不分离。所述转基因植物对于导入的转基因也可以是杂合的，例如在从杂交种子中生长的F1后代中。这种植物可提供本领域熟知的优势如杂种优势。

本发明的多核苷酸可以在转基因植物中在发育的所有阶段组成型表达。根据使用的植物或植物器官，所述多肽可以以阶段特异性方式表达。此外，所述多核苷酸可以是组织特异性表达的。

已知或发现导致编码感兴趣的多肽的基因在植物中表达的调节序列可以用于本发明中。调节序列的选择依赖于感兴趣的靶植物和/或靶器官。这种调节序列可以得自植物或植物病毒，或者可以化学合成。这种调节序列为本领域技术人员所熟知。

本领域已经描述了许多适于稳定转染植物细胞或建立转基因植物的载体，例如Pouwels et al.，Cloning Vectors：A Laboratory Manual，1985，supp.1987；Weissbach and Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，1989；and Gelvin et al.，Plant Molecular Biology Manual，Kluwer Academic Publishers，1990所述。通常地，植物表达载体包括例如在5’和3’调节序列的转录控制下的一或多个克隆的植物基因及显性选择标记。这种植物表达载体也可以含有启动子调节区(例如调节区控制的可诱导或组成型表达、环境或发育调节的表达，或者细胞或组织特异性表达)，、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点，和/或聚腺苷酸化信号。

本领域已经描述了许多在植物细胞中具有活性的许多组成型启动子。对于在植物中组成型表达合适的启动子包括但非限于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、Figwort花叶病毒(FMV)35S启动子、甘蔗杆状病毒启动子、鸭跖草黄化斑驳病毒(commelina yellow mottle virus)启动子、来自核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的小亚基的光诱导型启动子、来自水稻胞质磷酸丙糖异构酶启动子、Arabidopsis的腺嘌呤磷酸核糖转移酶启动子、水稻肌动蛋白1基因启动子、甘露碱合酶和章鱼碱合酶启动子、Adh启动子、蔗糖合酶启动子、R基因复合物启动子，及叶绿素α/β结合蛋白基因启动子。这些启动子用于产生在植物中表达的DNA载体，见例如PCT出版物WO8402913所述。所有这些启动子均已经用于产生各种类型的植物可表达的重组DNA载体。

为了在植物的源组织如叶、种子、根或茎中表达，优选本发明中应用的启动子在这些特异组织中具有较高的表达水平。为此，针对组织或细胞特异性或者增强的表达的基因而可以选择许多启动子。文献中报道的这种启动子的例子包括豌豆叶绿体谷氨酰胺合成酶GS2启动子、小麦叶绿体果糖-1，6-二磷酸酶启动子、马铃薯核光合作用ST-LS1启动子、拟南芥(Arabidopsis thaliana)的丝氨酸/苏氨酸激酶启动子和葡糖淀粉酶(CHS)启动子。还报道了在美洲落叶松(Larix laricina)光合作用组织中具有活性的核糖体-1，5-二磷酸羧化酶启动子、松树Cab基因Cab6的启动子、小麦Cab-1基因的启动子、菠菜Cab-1基因的启动子、水稻Cab 1R基因的启动子、玉蜀黍(Zea mays)的丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)启动子、烟草Lhcb1*2基因的启动子、拟南芥Suc2蔗糖-H³⁰共运输启动子，及菠菜类囊体膜蛋白基因的启动子(PsaD、PsaF、PsaE、PC、FNR、AtpC、AtpD、Cab、RbcS)。

本发明中也可以应用叶绿素α/β-结合蛋白的其它启动子，如白芥(Sinapis alba)的LhcB和PsbP基因的启动子。经调节以应答环境、激素、化学制品和/或发育信号的许多植物基因启动子也可用于在植物细胞中表达RNA结合蛋白基因，包括通过如下方式调节的启动子：(1)热；(2)光(例如豌豆RbcS-3A启动子、玉米RbcS启动子)；(3)激素如脱落酸；(4)创伤(例如WunI)；或者(5)化学制品如茉莉酮酸甲酯(methyl jasminate)、水杨酸、类固醇激素、乙醇、Safeners(WO 9706269)，或者也可以有利地应用(6)器官特异性启动子。

为了在植物汇组织如马铃薯植物的块茎、番茄果实或者大豆、油菜、棉花、玉蜀黍、小麦、水稻和大麦的种子中表达，优选本发明应用的启动子在这些特异组织中具有较高的表达水平。本领域已知许多块茎特异性或者增强表达的基因启动子，包括I型patatin启动子、马铃薯块茎ADPGPP基因启动子(大和小亚单位)、蔗糖合酶启动子、主要块茎蛋白包括22kD蛋白质复合物和蛋白酶抑制剂的启动子、颗粒结合型淀粉合酶(GBSS)的启动子，及其它I和II型patatin启动子。其它启动子也可用于在特定组织如在种子和果实中表达蛋白质。可以使用β-大豆伴球蛋白(conglycinin)启动子或其它种子特异性启动子如napin和豆球蛋白启动子。对于玉蜀黍胚乳表达特别优选的启动子是水稻谷蛋白基因启动子，更优选Osgt-1启动子。适于在小麦中表达的启动子的例子包括ADP葡萄糖热合酶(ADPGPP)亚单位、颗粒结合型及其它淀粉合酶、分支酶和去分支酶、胚发生富集蛋白(embryogenesis-abundant protein)、麦醇溶蛋白和麦谷蛋白的启动子。水稻中这种启动子例子包括ADPGPP亚单位、颗粒结合型及其它淀粉合酶、分支酶、去分支酶、蔗糖合酶及谷蛋白的启动子。特别优选的启动子是水稻谷蛋白、Osgt-1基因的启动子。大麦的这种启动子例如包括ADPGPP亚单位、颗粒结合型及其它淀粉合酶、分支酶、去分支酶、蔗糖合酶、大麦醇溶蛋白、胚球蛋白及糊粉特异性蛋白的启动子。

也可以应用根特异性启动子。这种启动子的例子是酸性几丁质酶基因的启动子。在根组织中的表达也可以通过利用已经鉴别的CaMV 35S启动子的根特异性亚结构域实现。

5’非翻译前导序列可以衍生自选择用于表达本发明多核苷酸的异源基因的启动子，且如果需要可以特异性修饰以增加mRNA的翻译。关于优化转基因表达的综述见Koziel等(1996)所述。这种优化的前导序列的例子包括在SEQ ID NO：6中。5’非翻译区也可以得自植物病毒RNA(烟草花叶病毒、烟草蚀纹病毒、玉米矮小花叶病毒、紫花苜蓿花叶病毒等)，得自合适的真核基因、植物基因(小麦和玉米叶绿素a/b结合蛋白基因前导序列)，或者得自合成的基因序列。本发明非限于其中非翻译区衍生自伴随启动子序列的5’非翻译序列的构建体。前导序列也可以衍生自不相关的启动子或编码序列。本发明中应用的前导序列包含玉米Hsp70前导序列(U.S.5,362,865和U.S.5,859,347)及TMV omega元件。

转录的终止通过3’非翻译DNA序列在嵌合载体中与感兴趣的多核苷酸可操纵地连接而实现。重组DNA分子的3’非翻译区含有在植物中起作用的聚腺苷酸化信号，导致在RNA的3’末端添加腺苷酸化核苷酸。3’非翻译区可以得自在植物细胞中表达的不同基因。通常使用胭脂碱合成酶3’非翻译区、来自豌豆小亚单位Rubisco基因的3’非翻译区、来自大豆7S种子贮存蛋白基因的3’非翻译区。含有农杆菌肿瘤诱导(Ti)质粒基因的聚腺苷酸化信号的3’转录的非翻译区也是合适的。

本领域已经描述了将基因直接输送至细胞中的四种方法：(1)化学方法(Graham et al.，1973)；(2)物理方法如微粒轰击(Capecchi，1980)、电穿孔(见例如WO 87/06614、US 5,472,869、5,384,253、WO 92/09696和WO 93/21335)，及基因枪(见例如US 4,945,050和US 5,141,131)；(3)病毒载体(Clapp，1993；Lu et al.，1993；Eglitis et al.，1988)；及(4)受体介导的机制(Curiel et al.，1992；Wagner et al.，1992)。

可以使用加速方法，包括例如微粒轰击等方法。将转化的核酸分子输送至植物细胞的方法的一个例子是微粒轰击。这种方法已经由Yang et al.，Particle Bombardment Technology for Gene Transfer，Oxford Press，Oxford，England(1994)加以综述。非生物粒子(微粒)可以用核酸包被并通过推进力输送至细胞。粒子例如包括钨、金、铂金等粒子。微粒轰击除了是可再生转化单子叶植物的有效方式之外，其特别的优势之处在于既不需要分离原生质体，也不需要对农杆菌感染的易感性。通过加速方法将DNA输送至玉蜀黍细胞中的方法的一个实施方案是基因枪α-粒子输送系统，其可用于通过筛(screen)如不锈钢或Nytex筛推动DNA包被的粒子至悬浮培养的玉米细胞包被的滤膜表面上。适于本发明使用的粒子输送系统是可得自Bio-RadLaboratories的氦加速PDS-1000/He基因枪。

对于轰击而言，可以将悬浮的细胞在滤膜上浓缩。将被轰击的含有细胞的滤膜以合适距离放置于微粒轰击停止板的下面。如果需要，在基因枪与被轰击的细胞之间还可以放置一或多个筛。

或者，可以将不成熟的胚或其它靶细胞排列在固体培养基上。被轰击的细胞以合适距离放置在微粒轰击停止板的下面。如果需要，在加速装置与被轰击的细胞之间还可以放置一或多个筛。通过使用本文所述技术，可以获得接近1000或更多个瞬时表达标记基因的细胞灶。在轰击后48小时表达外源基因产物的灶中细胞的数目通常为1至10个，平均为1-3个。

在轰击转化方法中，可以优化轰击前的培养条件及轰击参数，以产生最大数目的稳定转化体。物理和生物参数对于这种技术均是重要的。物理因素包括DNA/微粒轰击沉淀或者影响巨粒(macro-projectiles)或微粒轰击的射击和速度的那些因素。生物因素包括在轰击之前和立即之后参与细胞处理的所有步骤，靶细胞的渗透调节帮助减轻与轰击相关的创伤，转化DNA的性质如线性DNA或完整超螺旋的质粒。确信轰击前的处理对于成功转化不成熟的胚非常重要。

在另一个实施方案中，可以稳定转化质体。关于在高等植物中转化质体的方法包括用基因枪输送含有选择标记的DNA并通过同源重组将该DNA靶向于质体基因组(U.S.5,451,513、U.S.5,545,818、U.S.5,877,402、U.S.5,932479和WO 99/05265)。

因此，预期可以在小规模研究中调节轰击参数的各个方面，以充分优化条件。特别希望调节物理参数如间隙距离、飞行(flight)距离、组织距离和氦压。也可以通过修改影响受体细胞的生理状态及因此影响转化和整合效率的条件使创伤减少因素最小化。例如，可以调节受体细胞的渗透状态、组织水合作用和传代培养状态或细胞周期以优化转化。根据本发明的揭示，技术人员将获知其它常规调节方法。

农杆菌介导的转移是可广泛应用的系统以将基因导入植物细胞中，因为DNA可以导入完整的植物组织中，从而回避了需要从原生质体中再生完整的植物的过程。使用农杆菌介导的植物整合载体将DNA导入植物细胞中的方法为本领域所熟知(见例如US 5,177,010、US 5,104,310、US 5,004,863、US 5,159,135)。另外，T-DNA的整合是相对精确的过程，导致很少的重排。转移的DNA区域通过边界序列限定，及插入的DNA通常插入植物基因组中。

现代农杆菌转化载体能在大肠杆菌以及农杆菌中复制，使得可以便于处理(Klee et al.，In：Plant DNA Infectious Agents，Hohn and Schell，eds.，Springer-Verlag，New York，pp.179-203(1985))。另外，关于农杆菌介导的基因转移的载体方面的技术进展改良了载体中基因和限制位点的排列，便于构建能表达不同多肽编码基因的载体。所述载体具有常规的多接头区域，两侧是启动子和聚腺苷酸化位点，以指导插入的多肽编码基因的表达且适于本发明的目的。另外，含有有臂和无臂Ti基因的农杆菌可用于转化。在农杆菌介导的转化是有效的那些植物品种中，由于基因转移的易于做到和性质确定而选择这种方法。

使用农杆菌转化方法形成的转基因植物在一个染色体上通常含有一个基因座。这种转基因植物可以称作与加入的基因是半纯合的。更优选的是对于加入的结构基因纯合的转基因植物，即含有两个加入的基因的转基因植物，一个基因在染色体对的每个染色体上相同的基因座。纯合的转基因植物可以通过如下方式获得：有性交配(自交)含有一个加入的基因的独立分离的转基因植物、使产生的一些种子发芽并分析所得植物的感兴趣的基因。

也应理解也可以将两种不同的转基因植物交配产生含有两个独立分离的外源基因的子代。使合适的后代自交可以产生对于这两个外源基因均纯合的植物。也包括与亲本植物回交及与非转基因植物远交，以及无性繁殖。关于通用于不同性状和作物的其它育种方法的描述可见于Fehr，In：Breeding Methods for Cultivar Development，Wilcox J.ed.，American Societyof Agronomy，Madison Wis.(1987)。

植物原生质体的转化可以通过使用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔等方法及组合这些方法而实现。这些系统应用于不同的植物品种依赖于特定植株从原生质体中再生的能力。例如描述了从原生质体中再生谷类植物的方法(Fujimura et al.，1985；Toriyama et al.，1986；Abdullah et al.，1986)。

也可以使用其它细胞转化方法，包括但非限于通过直接DNA转移进花粉中而将DNA导入植物中、通过将DNA直接注入植物的生殖器官中，或者通过将DNA直接注入不成熟胚的细胞中及随后再水合脱水的胚。

本领域熟知从单植物原生质体转化体或者从各种转化的外植体中再生、发育和培养植物的方法(Weissbach et al.，In：Methods for Plant MolecularBiology，Academic Press，San Diego，Calif.，(1988)。这种再生和生长过程通常包括如下步骤：选择转化的细胞、培养这些毒力的细胞使其通过胚发育至生根幼苗的常规阶段。转基因胚和种子类似地再生。之后将所得转基因的生根的嫩芽植于合适的植物生长培养基如土壤中。

本领域熟知含有外来、外源基因的植物的发育或再生方法。优选地，将再生的植物自花授粉以提供纯合的转基因植物。或者，将得自再生植物的花粉与农业重要的品系的产种植物(seed-grown plant)杂交。相反，将这些重要品系植物的花粉对再生的植物授粉。使用本领域技术人员熟知的方法培养含有希望的外源核酸的本发明转基因植物。

主要通过使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化双子叶植物及获得转基因植物的方法已经针对棉花(U.S.5,004,863、U.S.5,159,135、U.S.5,518,908)、大豆(U.S.5,569,834，U.S.5,416,011)、芸苔(U.S.5,463,174)、花生(Cheng et al.，1996)和豌豆(Grant et al.，1995)公开。

本领域熟知通过导入外源核酸及从原生质体或不成熟的植物胚中再生植物而转化谷类植物如小麦和大麦以在植物中导入遗传变异的方法，见例如加拿大专利申请No.2,092,588、澳大利亚专利申请No 61781/94、澳大利亚专利No 667939、美国专利No.6,100,447、国际专利申请PCT/US97/10621、美国专利No.5,589,617、美国专利No.6,541,257及专利说明书WO99/14314所述。优选地，转基因小麦或大麦通过根癌农杆菌介导的转化方法产生。具有希望的核酸构建体的载体可以导入组织培养的植物或外植体的再生的小麦细胞中，或者合适的植物系统如原生质体中。

可再生的小麦细胞优选得自不成熟胚的盾片、成熟胚、衍生自这些组织的愈伤组织，或者分生组织。

可以使用如US 20050022261所述方法产生表达本发明多肽的植物，其中本发明的多核苷酸取代编码GOX或EPSPS蛋白的核酸。

可以使用US 20040133940所述方法产生草甘膦抗性小麦，其中EPSPS编码DNA用编码本发明多肽的核酸分子置换。或者，可以使用US20030154517所述方法产生草甘膦，以将编码本发明多肽的基因构建体导入小麦细胞中。

为了证实转基因细胞和植物中转基因的存在，可以使用本领域技术人员已知的方法进行聚合酶链反应(PCR)扩增或Southern印迹分析。根据产物的性质，可以通过多种方式检测转基因的表达产物，包括Western印迹和酶测定法。在不同植物组织中量化蛋白质表达及检测复制的一个特别有益的方式是使用报道基因如GUS。一旦获得转基因植物，则可以使其生长产生具有希望的表型的转基因植物组织或其部分。可以收获所述植物组织或植物的部分，和/或收集种子。种子可以作为生长为具有希望特性的植物组织或植物部分的另外的植物的来源。

可以对使用本文所述方法产生的植物检测其对于除草剂如草甘膦的抗性，使用US 20050022261或US 20060059581所述方法进行。

本发明的转基因植物可包含除了本发明那些之外的其它转基因，其增强植物对于含胺除草剂的耐受性/抗性。例如包括对于草甘膦具有较低亲和性并因此在存在的草甘膦情况中保持其催化活性的细菌EPSPS变体和植物EPSPS变体的表达(美国专利No.5,633,435、5,094,945、4,535,060和6,040,497)，以及也降解草甘膦的GOX的表达(US 5,776,760)。

转基因非人动物

“转基因非人动物”是指除了人之外的动物，其含有在相同物种或品种的野生型动物中未发现的基因构建体(转基因)。“转基因”在本文具有生物技术领域通识的含义，包括通过重组DNA或RNA技术产生或改变的且已经导入动物细胞中的遗传序列。所述转基因可包括衍生自动物细胞的遗传序列。通常地，所述转基因已经通过人工操纵例如通过转化而导入动物中，但也可以应用本领域公认的任何方法。

产生转基因动物的技术为本领域所熟知。关于这方面的一本有用的教科书是Houdebine，Transgenic animals-Generation and Use(HarwoodAcademic，1997)。

可以将异源DNA导入例如哺乳动物的受精卵中。例如，全能或多能干细胞可以通过显微注射、磷酸钙介导的沉淀、脂质体融合、逆转录病毒感染或者其它方式转化，然后将转化的细胞导入胚胎中，使该胚胎发育成转基因动物。在特别优选的方法中，用含有希望的DNA的逆转录病毒感染发育中的胚胎，并从此感染的胚胎中产生转基因动物。然而，在最优选的方法中，将合适的DNA共注射(coinjected)进胚胎的前核或细胞质中，优选在单细胞阶段注射，使该胚胎发育成产生的转基因动物。

另一种用于产生转基因动物的方法包括通过标准方法将核酸显微注射进原核期卵中。然后培养注射的卵，之后移至假孕受体的输卵管中。

转基因动物也可以通过核转移技术产生。使用这种方法，将得自供体动物的成纤维细胞用包含在调节序列控制下感兴趣的结合结构域或结合配体的编码序列的质粒稳定转染。然后将稳定的转染体与去核的卵母细胞融合、培养并移至雌性受体中。

组合物

本发明的组合物可包括“可接受的载体”。这种可接受的载体的例子包括水、盐水、Ringer′s溶液、葡萄糖溶液、Hank′s溶液，及其它生理学平衡的盐水溶液。非水溶液载体如不挥发油、芝麻油、油酸乙酯或者甘油三酯也可以使用。“可接受的载体”的需求性质根据使用的组合物而定。鉴于本文所述的应用及组合物中本发明的成分的性质，技术人员易于确定特定用途的合适的“可接受的载体”。

多肽和/或编码其的表达构建体可用于治疗患者如暴露于含胺除草剂的人和鱼类。因此，本发明的组合物可包括“药物可接受的载体”以产生“药物组合物”。药物可接受的载体为本领域所熟知(见例如Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，Alfonso R.Gennaro，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.，19th Edition(1995))。

本发明的多肽可以于组合物中提供，其增强含胺除草剂的降解速度和/或程度，或者增加多肽的稳定性。例如，所述多肽可以固定于聚氨酯基质(Gordon et al.，1999)上，或者在合适的脂质体中制成胶囊(Petrikovics等2000a and b)。所述多肽也可以掺入包含泡沫的组合物中，如在消防中常用的泡沫(LeJeune et al.，1998)。

本领域技术人员意识到，本发明的多肽可易于用于海绵或泡沫中，如WO 00/64539所揭示，所述文献在此以其全部内容并入作参考。

本发明的一个实施方案是控制释放的配制品，其能将本发明的多肽缓慢释放至动物、植物、动物或植物材料、或者外界环境(包括土壤和水样)中。如本文所用，控制释放的配制品包含于控制释放的运载体中的本发明的组合物。合适的控制释放的运载体包括但非限于生物相容的聚合物、其它聚合基质、胶囊、微胶囊、微粒、推注制品、渗透泵、扩散装置、脂质体、脂质微气泡(lipospheres)和经皮输送系统。优选的控制释放的配制品是生物可降解的(即生物易蚀的(bioerodible))。

本发明优选的控制释放配制品能将本发明的组合物释放进用含胺除草剂特别是草甘膦喷雾的土壤或水中。该配制品优选在大约1-12个月的时间范围内释放。优选的本发明控制释放配制品能有效治疗优选至少大约1个月、更优选至少大约3个月、甚至更优选至少大约6个月、甚至更优选至少大约9个月、甚至更优选至少大约12个月。

为产生有效降解含胺除草剂的组合物所需的本发明的多肽、载体或宿主细胞等的浓度依赖于准备净化的样品的性质、样品中含胺除草剂的浓度、及组合物的配方。所述组合物中所述多肽、载体或宿主细胞的有效浓度可易于由本领域技术人员利用实验而确定。

抗体

本发明还提供了本发明多肽的单克隆抗体或多克隆抗体或其片段。因此，本发明进一步提供了产生本发明多肽的单克隆抗体或多克隆抗体的方法。

术语“特异性结合”是指抗体与本发明的至少一种多肽结合、而与其它已知蛋白质不结合的能力。

如本文所用，术语“表位”是指抗体结合的本发明多肽的区域。表位可以被给予动物以产生该表位的抗体。然而，本发明的抗体优选特异性结合完整多肽的表位区。

如果多克隆抗体是希望的，则用本发明的免疫原性多肽对选择的动物(例如小鼠、兔、山羊、马等)进行免疫接种。收集经免疫接种的动物的血清，根据已知程序进行处理。如果含有多克隆抗体的血清含有其它抗原的抗体，则通过免疫亲和层析法纯化所述多克隆抗体。产生和处理多克隆抗血清的技术为本领域所已知。为了可以产生这种抗体，本发明还提供了半抗原化至另一多肽的本发明多肽或其片段，以在动物中用作免疫原。

本领域技术人员易于产生本发明多肽的单克隆抗体。本领域熟知通过杂交瘤产生单克隆抗体的一般方法。永生化的产生抗体的细胞系可以通过细胞融合法产生，也可以通过其它技术如用致瘤DNA直接转化B淋巴细胞、或者用Epstein-Barr病毒转染而产生。可以针对多种性质筛选产生的单克隆抗体，即针对同种型和表位亲和性筛选。

另一种技术包括筛选噬菌体展示文库，其中例如噬菌体表达其用大量不同的互补决定簇(CDR)包被的表面上的scFv片段。这种技术为本领域所熟知。

对于本发明，除非特别指出，则术语“抗体”包括完整抗体的保留与靶抗原结合活性的片段。这种片段包括Fv、F(ab′)和F(ab′)₂片段，以及单链抗体(scFv)。此外，所述抗体及其片段可以是人源化抗体，例如EP-A-239400所述。

本发明的抗体可以与固体支持物结合和/或于合适容器中与合适的试剂、对照物、说明书等一起包装于试剂盒中。

在一个实施方案中，本发明的抗体是可检测标记的。使得可以直接测量抗体结合的可检测的标记包括放射性标记、荧光团、染料、磁珠、化学发光物、胶粒等。使得可以间接测量抗体结合的标记的例子包括底物可以提供有色或荧光产物的酶。可检测的标记的其它例子包括在加入合适底物后能提供可检测的产物信号的共价结合的酶。用于缀合的合适酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、苹果酸脱氢酶等。在不可商购的情况中，这种抗体-酶缀合物易于通过本领域技术人员已知的技术产生。可检测的标记的其它例子包括生物素，其与抗生物素蛋白或链霉亲和素高亲和性结合；荧光染料(例如藻胆蛋白、藻红蛋白和别藻蓝蛋白；荧光素和德克萨斯红(Texas red))，其用与荧光激活的细胞淘选法一起使用；半抗原等。优选地，所述可检测的标记使得可以在平板光度计中直接测量，例如生物素。这种标记的抗体可用于本领域已知技术中以检测本发明的多肽。

微生物保藏详述

节杆菌.TBD于2006年4月11日保藏在澳大利亚国家测量机构(National Measurement Institute)，51-65 Clarke Street，南墨尔本，Victoria3205，保藏号为V06/010960。

该保藏物根据布达佩斯条约关于微生物的保藏的国际公约进行保藏，用于专利程序中。这保证了培养物在保藏日起30年保持存活。所述微生物可根据布达佩斯条约通过国家测量机构获得，其保证公众能在本专利公开之后永久性并不受限制的获得培养物的子代。

本发明的受让人同意，如果培养的保藏物在适当条件下培养过程中出现死亡、丢失或损坏，将立即应通知而用相同培养物的存活样品进行替换。保存的菌株的可得性不应理解为允许侵犯任何政府根据其专利法授予的专利权而实施本发明。

实施例

实施例1-草甘膦降解细菌的分离

材料和方法

化合物

N-(膦酰甲基)甘氨酸(草甘膦)得自ICN或Sigma。所有其它分析试剂得自Sigma-Aldrich。

培养基

除非另外指出，则无氮源的基本培养基包含M9盐[6g Na₂HPO₄、3gKH₂PO4、1g NaCl]、微量元素包括金属离子和维生素、200μM MgCl₂、200μMCaCl₂和1％葡萄糖作为碳源。

草甘膦降解细菌的分离

检测多种土壤分离株和我们的实验菌株库在液体培养中利用草甘膦作为中唯一氮源的能力。将分离株在合适的温度下在富集营养肉汤(Merck)或Luria肉汤(Sambrook et al.，1989)的液体培养基中培养过夜，然后在含有0.2％(11.8mM)草甘膦作为唯一氮源的基本培养基中稀释至OD_600nm为0.01。在具有Softmax Pro读板器(Molecular Devices)的弹性板(flexiplate)(BDBiosciences)中，通过测量200μL培养物的OD_600nm评定生长情况。

节杆菌TBD的鉴别

从节杆菌TBD中提取的基因组DNA和通用引物用于通过PCR扩增16SrDNA，并对所得1.35kb产物进行测序。

分析方法

使用对如Tomita等(1991)(Column：C18 4.6uM，5 column.MobilePhase：0.2MK₂HPO4、15％乙腈)所述方法加以修改的方法通过HPLC分析进行草甘膦和AMP检测。用对甲苯磺酰氯衍生化分析物，并在240nm波长检测。将1ml反应上清与0.5mL 0.4MNaHPO₄ pH 11.0混合，随后加入200μL对甲苯磺酰氯溶液(于乙腈中的10mg/mL p-甲基苯磺酰氯[Sigma])。在50℃保温5分钟后，将20μL过滤的反应产物注射进HPLC以进行分析。

结果

从肥沃土壤及从我们的实验室杀虫剂降解微生物集合中鉴别了能利用草甘膦作为唯一氮源的一些细菌。发现包含于分离株节杆菌TBD中的降解细菌在液体培养基中能使用草甘膦作为唯一氮源迅速生长为汇合。

全长16SrDNA序列与核糖体数据库(Ribosomal DataBank)(Cole et al.，2005)和BLAST(McGinnis and Madden，2004)的对比示出该细菌分离株与节杆菌菌株c138(Futamata et al.，2005)最相似，在测序的1.35kb 16SrDNA基因上具有99.49％的核苷酸相同性。

对培养上清进行的HPLC分析表明节杆菌TBD在72小时内能除去培养基中70％(8.28mM)的草甘膦。

实施例2-与节杆菌TBD的草甘膦降解活性相关的基因的分离材料和方法

节杆菌TBD的基因组DNA文库的制备与筛选

使用草甘膦作为唯一氮源培养细菌细胞至饱和状态，使用Ausubel等(supra)所述方法从中提取基因组DNA。将基因组DNA用Sau3A1部分消化，并使用BamHI消化的pWEB::TNC(Epicentre)载体产生粘粒文库。将该文库转化进DH10B细胞中，筛选各个质粒使用草甘膦作为唯一氮源在补加了溶液C的基本培养基中赋予生长的能力。

选择阳性克隆，然后在37℃振荡生长的10mL培养物中证实使用草甘膦作为唯一氮源赋予生长的能力。培养上清的成分通过HPLC分析以证实草甘膦从培养基中的除去。

编码GloxA的基因的分离

将粘粒pWEB::A112用Eco R1消化，并将产生的6个条带亚克隆进制备的载体pK18中。在载体制备期间，将pK18用EcoR1(NEB)线性化，及根据厂商(Promega)指导用虾碱性磷酸酶去磷酸化。如上述筛选来自粘粒的Eco R1片段的小文库的活性，发现一个9kb的片段赋予大肠杆菌细胞以草甘膦降解活性。然后将这个构建体的剪切片段的鸟枪(shotgun)文库测序，至6倍覆盖标准(AGRF，澳大利亚)。与核苷酸和蛋白质数据库的序列分析和对比使用Vector NTI Advance 9.0(Informax，Invitrogen)和NCBI BLAST(Altschul et al.，1997，2004)进行。

关于GloxA的生物信息分析

使用Vector NTI v.9(Informax Inc.USA；Invitrogen，Australia)和NCBIBlast(Altshul et al，1997)对序列数据和推定的氨基酸序列进行分析、编译、注释及与数据库对比。NCBI Genbank和保守的结构域数据库CDD是用于对比的主要数据库。

结果

编码GloxA的基因的分离

对来自节杆菌TBD的基因组DNA的粘粒文库进行筛选表明仅一个粘粒可赋予利用草甘膦作为唯一氮源生长的能力，将其称作pWEB::A112。对来自这个构建体的6个EcoR1限制酶片段进行筛选，草甘膦-降解活性位于构建体pKWE1C12中的9.5kb EcoR1片段。这个9520bp区域的全部序列表明仅一个推定的蛋白质具有裂解草甘膦的能力，是ORF 9编码的推定的氧化还原酶。

将草甘膦降解蛋白称作GloxA，将gloxA亚克隆进表达载体中并分析草甘膦降解活性，证实表达重组GloxA的细胞能降解草甘膦，静息细胞生物催化测定表明300μmol/分钟/mg/湿细胞重(wet cell mass)的草甘膦降解活性，粗制的酶提取物具有841μmol/分钟/mg总蛋白的活性(表2)。重要的是在这个GloxA分析阶段未检测到作为产物的甘氨酸，推测其已经由大肠杆菌静息细胞中含有的其它酶及粗制酶提取物制品迅速代谢。

表2：金属离子和辅因子对于部分纯化的重组GloxA酶活性的作用。粗比活性基于部分纯化的提取物的整个蛋白质浓度，且仅是一个大约值。

GloxA是具有473个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：1)，分子量为大约52.5kDa，推定的等电点为5.78，在pH7时电荷为大约11.61。其编码序列以SEQ ID NO：2示出。特别地，起始密码子是GTG(编码缬氨酸残基)，其对于细菌基因较平常。起始Val由Met的取代不明显改变该酶的草甘膦降解活性(表3)。

表3：来自由构建体pKWE1C12(GTG-Val起始密码子)和pETGloxA2-4(ATG-Met起始密码子)表达的重组蛋白的粗制酶活性对比

生物信息分析

GloxA的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)与天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(登录号CAA20218)的推定的氧化还原酶呈现56％的氨基酸序列相同性(72％相似性)。推测这个胺氧化酶黄素蛋白催化氨基酸以及伯胺和仲胺的氧化脱胺反应，部分呈现单体肌氨酸氧化酶的底物特异性(

et al.，2004)。胺氧化酶无限定的代谢作用，但是示出对于具有低动力学效率的小胺的广泛底物特异性。

实施例3-GloxA的酶活性

材料和方法

酶测定

如下制备大肠杆菌细胞的粗制酶提取物。收获细胞并将细胞团再悬浮于1mL裂解缓冲液(25mM Tris-Cl pH 7.5，具有1mg/ml溶酶体)中，在冰上通过超声裂解(Branson sonifier，60％工作循环，开30秒、关30秒，重复10次)。通过在5000g离心5分钟收集可溶的成分，使用Biorad蛋白质染料结合测定(BIORAD)测量蛋白质含量。部分纯化的提取物通过使用S-蛋白琼脂糖(Novagen)Talon HIS-标记纯化系统(BD Biosciences)，根据厂商指导从可溶的CFE中纯化S-标记的或HIS-标记的GloxA蛋白而制备。使用在加样缓冲液中的3M MgCl₂或2.5mM咪唑从该柱中洗脱部分纯的GloxA。制备酶反应物，其含有在25mM Tris-Cl pH7.5、1mM FAD、0.1mM MgCl₂中的500μL粗制酶提取物或者250μL部分纯化的酶提取物(～10μg蛋白质裂解物)。在37℃预保温2分钟后，向反应物中加入1mM草甘膦，然后振荡保温10-60分钟。在需要的反应时间之后，如上述用对甲苯磺酰氯衍生化反应物，并通过HPLC分析。所有酶测定均一式三份进行并重复至少两次以证实数据。为了确定明显的动力学参数，在合适的范围内改变底物浓度，使用Kaleidagraph(Synergy Software)或Hyper 1.1(J.S.Easterby)使数据与指数等式总和一致。

结果

与大多数先前文献中报道的结果相反，我们发现通过GloxA从草甘膦中无AMPA产生。甘氨酸是从粗提物和部分纯化的GloxA蛋白中检测到的与草甘膦反应的最丰富的产物。从这个结果及GloxA与其它氧化还原酶黄素蛋白的推定氨基酸序列的同源，我们推断GloxA很可能使用氧化-还原机制裂解草甘膦的膦酰甲基C-3碳-氮键，产生甘氨酸和氧代膦酸。氧代膦酸在反应上清中不可检测到，而是预期其在水溶液条件下快速氧化。

甘氨酸也是在假单胞菌菌株PG2982中发现的草甘膦裂解的终产物，这通过固态NMR分析细菌生长培养物(Kent-Moore et al.，1983；Jacob et al.，1985；Fitzgibbon and Braymer，1990)和假单胞菌菌株LBr(Jacob et al.，1988)而鉴别。也有报道节杆菌菌株GLP-10从草甘膦中产生甘氨酸，但是这通过C-P裂合酶多酶复合物裂解草甘膦中的C-P键而获得，产生肌氨酸及随后转变为甘氨酸(Kishore and Jacob，1987)(见图1)。C-P裂合酶反应由复杂的膜结合的蛋白质系统催化，该系统包含至少4个不同的蛋白质(Metcalf andWanner，1993)，无一呈现与GloxA具有氨基酸相似性。因此，GloxA以无细胞方式将草甘膦裂解为甘氨酸的活性代表草甘膦裂解的一种新机制(图2)。

最大GloxA活性的精确反应条件看起来包含金属离子及可能应用FAD作为辅因子，这基于当不存在这两种成分时的GloxA相对比活性而得出(表2)。

部分纯化的重组GloxA酶的底物范围在表4中提供。显然，GloxA也能裂解草胺膦，其是Basta^TM除草剂。

表4：部分纯化的重组GloxA酶活性的底物范围

表5提供了与降解草甘膦和草胺膦的一些其它已知酶相比，GloxA对于这些化合物的酶活性的对比。在此条件下，当与已知酶对比时，利用GloxA具有较好的草甘膦降解活性。

表5：当在植物中表达时，GloxA使用除草剂底物的表观动力学参数与已知赋予除草剂耐受性的其它酶的对比

Key：^§evGAT/GOX-evolved GAT(shuffling)/GOX(SDM).

¹-Blair-Kerth等(2001)

²-Siehl等(2005)

³-WO 92/00377.

上表2示出在测试的条件下，存在Mg²⁺和FAD导致最高的活性。另外测试了二价金属离子(表6)，在不存在金属离子或FAD的条件下观测到酶活性。当与其它测试条件对比时，在反应中加入Co²⁺导致最大活性。

表6：金属离子对于部分纯化的酶活性的作用

实施例4-GloxA与GOX的对比

材料和方法

DNA：DNA杂交

将基因组DNA、质粒和粘粒构建体用合适的限制酶完全消化，并使用如厂商所述碱性转移方法转移至HybondN⁺尼龙膜(Amersham，now GEBiosciences)上。

放射性标记的探针通过不对称PCR产生，使用30ng模板DNA(pLSGOX)，反应物含有4μL 5X Expand HiFidelity^TM(Roche)缓冲液；12.5pmole反义引物(CGOX1B；ATGGCTGAGAACCACAAAAAAGTAG)(SEQ ID NO：4)；0.1pmole有义引物(CGOX2B；TTAACTTGCCGGACCCGTTTGCTTG)(SEQ ID NO：5)；200μM每种dTTP、dCTP、aGTP；5μM dATP；0.33μM α-³²p-dATP(Amersham)和2U ofExpand HiFidelity DNA聚合酶(Roche)。反应在94℃进行3分钟，随后进行如下30次循环(94℃ 45秒、48℃ 45秒、72℃ 30秒)，最后在72℃延伸5分钟。所得放射性标记的PCR产物使用QIAQuick DNA纯化柱(Qiagen)纯化，在30μL无菌水中洗脱。将膜在含有6x SSC、5x Denhardt’s溶液、0.1％焦磷酸钠(NaPPi)、0.5％ SDS的溶液中在65℃保温(在Hybaid恒温箱中)预杂交2小时，之后向杂交瓶中加入5μL(大约50μCi)放射性标记的探针。然后在65℃(严格条件)或42℃(低严格条件)使杂交继续进行过夜(18小时)。如Ausubel et al(supra)所述进行不同严格性的洗涤。

GOX表达

为了在酶之间直接进行对比，基于US 5,776,760的SEQ ID NO：17产生编码GOX基因的合成的构建体。将所述合成的构建体从pLSGOX(Topgene，Canada)亚克隆进表达载体pET29a(Novagen)的Eco R1位点，产生具有N-末端S-标记的酶。在不同温度和IPTG条件下优化GOX的可溶蛋白质表达，GOX蛋白质表达通过Coomasie-染色的SDS-PAGE分析检测，GOX酶活性如上文针对GloxA所述测定，HPLC活性分析检测草甘膦的去除和AMPA的产生情况。

结果

在获得上述草甘膦降解构建体的全部基因序列之前，分离的DNA与gox基因的同源性通过DNA:DNA杂交法检测。所得southern印迹示出了在标准或非严格条件下所述DNA构建体与gox基因之间无特异性可检测的结合(图3)。

草甘膦氧化还原酶(GOX)是文献报道的以一个酶步骤即可裂解草甘膦的唯一其它酶，据称通过再氧化还原黄素以破坏草甘膦的C2-碳-氮键，产生AMPA和乙醛酸(WO 92/00377；US 5,776,760)，由此从草甘膦中产生AMPA。GOX变体v.247的比活性在US 5,776,760中描述，其比15nmol/分钟/mg的野生型GOX高3-4倍，表示大约60nmol/min/mg的活性。我们关于GloxA最初的粗制酶活性数据提示GloxA比GOX具有更高的比活性(表3，841μmol/分钟/mg)。

需要进行直接对比以证实这个结果，因此以与GloxA变体相同的方式制备了合成的GOX构建体的粗提物，并平行测定这两种酶。在这些条件下，GloxA对于草甘膦的比活性比GOX几乎高2倍(图4)，但是与GOX对于亚氨基二乙酸的活性相似(0.9倍，图4)。WO 92/00377与我们自已的数据之间的活性差异大概涉及几个因素：在我们的情况中所述酶仅部分纯化，及使用的表达系统和条件不同。

这两种酶均呈现对于亚氨基二乙酸显著较高的活性，且均产生甘氨酸和乙醛酸。这与GOX优先裂解C2-碳-氮键及GloxA优先裂解C3-碳-氮键的观点一致，因为这两个裂解反应从亚氨基二乙酸中产生乙醛酸和甘氨酸(见图2)。

实施例5-GloxA与其它同源蛋白质的对比

材料和方法

分别使用BLASTN和BLASTP(Altschul et al.，1997)，将GloxA核苷酸序列和氨基酸序列与非冗余核苷酸和蛋白质NCBI数据库进行对比。然后表达选择的推定的GloxA样同源蛋白质并测定草甘膦降解活性。选择的推定的同系物的核苷酸编码序列是商业合成的(Geneart，GmBH)、克隆及使用Champion pET200D/TOPO.表达系统(Invitrogen)根据厂商指导表达。重组蛋白质表达通过考马斯-染色的SDS-PAGE分析及使用AlphaImager 2200观测和记录系统(Alpha Innotech)通过斑点密度测量法核实及量化。

评定草甘膦降解的酶测定使用可溶的无细胞提取物(部分纯化的蛋白质)于含有100μg全部无细胞蛋白(～10μg酶提取物)、1mM MgCl₂在20mMTris-Cl pH 7.2中的1mM甘氨酸的1ml体积中进行。阴性对照物包括大肠杆菌BL21 Star的无细胞提取物，不含有表达载体，而含有无插入体的pET200D/TOPO。

结果

GloxA先前未被描述，但是与最近从金黄节杆菌TC1的完整基因组注释中预测的推定的氧化还原酶蛋白最相似(86％氨基酸相同性；NCBI登记号no.CP000474.1)，且也共有胺氧化酶蛋白(CDD COG0665)DadA家族的推定的保守蛋白质结构域。

Glox A与非冗余蛋白质数据库中的一些其它蛋白质呈现蛋白质序列相同性。同系物包括从Brevibacterium linens BL2(NCBI登记号No.ZP_00381186)基因组注释中预测的推定的甘氨酸氧化酶蛋白，已经证实其也能裂解草甘膦产生甘氨酸(表7)。

表7：GloxA与和GloxA具有显著氨基酸相同性的蛋白质的对比

名称	来源	NCBI登记号/参考	与GloxA的氨基酸序列相同性百分比	部分纯化的活性[草甘膦降解](μmol/min/mg)
名称	来源	NCBI登记号/参考	与GloxA的氨基酸序列相同性百分比	部分纯化的活性[草甘膦降解](μmol/min/mg)	GloxA	节杆菌TBD	本研究(SEQ ID NO：1)	100	841
GloxD	金黄节杆菌TC1	ABM06986(SEQ ID NO：9)	86	nd	GloxA	节杆菌TBD	本研究(SEQ ID NO：1)	100	841
GloxD	金黄节杆菌TC1	ABM06986(SEQ ID NO：9)	86	nd	GOBL	扩展短杆菌BL2	ZP_00381186(SEQ ID NO：8)	60	480
IdaA	EDTA-降解细菌BNC1	Liu et al..2001	28	0	GOBL	扩展短杆菌BL2	ZP_00381186(SEQ ID NO：8)	60	480

实施例6-GloxA在Arabidopsis中的表达

编码GloxA的DNA已经针对植物表达而进行优化(SEQ ID NO：6)。SEQID NO：6提供的序列包括在5’和3’末端加入克隆位点以及在紧邻起始密码子之前加入AACA。所述编码序列跨越SEQ ID NO：6的16-1432位核苷酸。将编码GloxA的DNA克隆进农杆菌转移载体p277(得自CSIRO PlantIndustry，Canberra，Australia)。这个载体是通过将来自pART7的NotI片段插入pART27中而构建(Gleave，1992)。所述p277载体含有针对植物表达的CaMV 35S启动子和OCS终止子，针对抗生素选择的标记，及为植物转化所需的序列。所述构建体通过PCR合成，并将其直接克隆进p277转移质粒中。

使用三亲交配法实现农杆菌菌株GV3101的转化。这种方法包括将根癌农杆菌GV3101、携带辅助质粒RK2013的大肠杆菌及携带希望的重组p277质粒的大肠杆菌在非选择性LB平板上共同划线培养。在28℃保温过夜后，获得混合的培养物，收集该混合培养物并加以稀释，于LB平板上划线培养以选择携带p277重组质粒的根癌农杆菌GV3101。

Arabidopsis植物通过标准方法在23℃每天18小时光照条件下培养。Arabidopsis植物的转化通过浸花转化法(floral dipping)进行。将植物生长至3-5周龄，此时植物具有代表不同发育节段的花的许多花茎。使转化的根癌农杆菌GV3101的过夜培养物成团状，再悬浮于含有增湿剂Silwet-77的5％蔗糖溶液中。将花浸入细菌悬浮液中，使用扫拂动作将其彻底浸湿。将植物包装在塑料膜中，在室温于实验台上放置过夜，之后解除包装并置于植物生长箱中，维持在21℃。重复浸蘸1-2周，以增加转化的种子的数目。在浸蘸3-4周后收集种子，对于每个生态型在种子包膜中干燥适当时间，然后灭菌并于含有选择性抗生素和抗真菌剂的Noble琼脂平板上发芽。

将阳性转化体移植进Arasystem罐(Betatech)中，在Aracon系统套筒(sleeves)内生长至成熟，小心收集种子。转化的Arabidopsis植物(T1代)通过PCR和逆转录酶PCR(RT-PCR)筛选，以证实重组基因的存在与表达。从用所述构建体转化的植物的叶中提取物基因组DNA，使用Extract-N-AmpPlant PCR和Extract-N-Amp Reagent试剂盒(Sigma)进行。使用特异于GloxA编码序列的引物对提取物进行PCR。对于RT-PCR，随机选择大约8个用所述构建体转化的植物进行分析。将这些植物的叶速冻并使用研钵和研杵于液氮中研磨。使用RNeasy Plant试剂盒(Qiagen)分离RNA。使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)从所述RNA中制备cDNA。使用1μl cDNA、重组Taq聚合酶(Invitrogen)、54℃的退火温度及GloxA特异性引物进行PCR。将每种25μl PCR反应物的3μl反应物在1.2％琼脂糖凝胶上观测。使用AppliedBiosystems 7000实时PCR系统进行定量PCR，拟南芥管家基因araPTB(TAIR登记号AT3G01150)作为参考基因。选择的卡那霉素抗性T2和T3植物表达GloxA mRNA，表达水平比参考基因高30-100倍(表8)。

表8：拟南芥植物中GloxA表达的定量RT-PCR分析

样品名称

dCt(GloxArt-araPTB)

2^dCt(差异倍数)

L-er(野生型拟南芥)	-5.03±0.144	比PTB低32.7x
L-er(野生型拟南芥)	-5.03±0.144	比PTB低32.7x	GloxA T2 #3	5.86±0.142	比PTB高58.1x
GloxA T2 #4	5.50±0.175	比PTB高45.3x	GloxA T2 #3	5.86±0.142	比PTB高58.1x
GloxA T2 #4	5.50±0.175	比PTB高45.3x	GloxA T2 #5	5.64±0.082	比PTB高49.9x
GloxA T2 #6	6.29±0.145	比PTB高78.2x	GloxA T2 #5	5.64±0.082	比PTB高49.9x
GloxA T2 #6	6.29±0.145	比PTB高78.2x	GloxA T2 #7	6.81±0.124	比PTB高112.2x
GloxA T2 #8	5.94±0.184	比PTB高61.4x	GloxA T2 #7	6.81±0.124	比PTB高112.2x
GloxA T2 #8	5.94±0.184	比PTB高61.4x	GloxA T3 #2e	1.77±0.136	比PTB高3.4x

^*Key：Ct-循环阈值；dCT-循环阈值差异(靶GloxA-参考araPTB).

T1秧苗可以移植及栽培，通过两个世代获得种子以最后分离纯合T3种子。然后筛选T2和T3植物的草甘膦抗性的增加，基本上使用如Jander等(2003)所述方法进行，但是使用拟南芥变种Landsberg而非Columbia，且处理剂量范围是2.5-25kg a.i.ha^-1。在图5中示出的分值是5倍预期I₁₀₀剂量(12.5kga.i.ha^-1)。

也可以分析T1-T3阶段的转基因植物的叶，通过提取总植物蛋白(例如使用Pierce P-PER植物蛋白提取试剂盒)及使用Western印迹抗体检测系统和酶提取测定评定植物细胞中GloxA蛋白表达。对于Western印迹分析，首先将植物提取物在20mM Tris-Cl pH 7.2中稀释10倍，然后通过BioradProtein Dye(Biorad)量化。将等量的植物蛋白加样于10％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶的每个孔中，通过电泳分离。然后使用Mini-Blot装置(例如Biorad)根据厂商指导将蛋白质印迹于硝化纤维膜上。根据Western Breeze化学发光检测试剂盒(Invitrogen)指导进行免疫检测，使用针对纯化的重组GloxA蛋白制备的初级抗体进行(例如纯化的多克隆兔IgG，Institute of Veterinary andMedical Science，Adelaide，Australia)。在表达GloxA的转基因Arabidopsis的叶细胞中检测GloxA蛋白(图5)，水平接近0.8ng/ug总蛋白质。

对转基因植物蛋白质提取物也针对GloxA活性进行了测定，这通过组合100μg总蛋白(从Western印迹数据估计80ng GloxA)及25mM Tris-ClpH7.2、0.1mM MgCl₂进行。在37℃预保温2分钟之后，向反应中加入1mM草甘膦，然后进一步振荡保温60-120分钟。在需要的反应时间之后，如上述用对甲苯磺酰氯衍生化反应，通过HPLC分析。所有酶测定均一式三份进行并重复至少2次以证实数据。在表达GloxA mRNA(基于qPCR数据)和蛋白质(基于Western印迹数据)的T2植物的叶中可以检测到明显的活性。

表9：表达GloxA的拟南芥植物细胞中的GloxA活性

样品 GloxA活性

(μmol/min/mg)

L-er(野生型拟南芥) 0

A.thaliana GloxA T2#3蛋白质提取物 77.8

A.thaliana GloxA T2#4蛋白质提取物 79.1

A.thaliana GloxA T2#5蛋白质提取物 78.5

用纯化的GloxA-E2 spiked L-er 413.8

纯化的GloxA-E2(阳性对照) 497.5

实施例7-表达GloxA的转基因玉米的产生

可以构建嵌合基因，其包含相对玉米遍在蛋白启动子(EP 342 926)呈有义方向的编码SEQ ID NO：1的cDNA，位于cDNA片段的5’末端的所述启动子，及位于cDNA片段3’末端的10kD玉米蛋白。这个基因的cDNA片段可以通过使用合适的寡核苷酸引物对cDNA克隆进行聚合酶链反应(PCR)而产生。克隆位点(分别为PciI和SmaI)可以掺入用于扩增cDNA的寡核苷酸中，以当插入消化的载体pML103(ATCC登录号97366)中时提供DNA片段的正确方向。然后在标准PCR反应中进行扩增。扩增的DNA用合适的限制酶PciI和SmaI消化，在琼脂糖凝胶上分级分离。从凝胶中分离合适的条带，与质粒pML 103组合。来自pML 103的DNA节段含有使用标准技术用玉米遍在蛋白启动子置换的玉米27kD玉米蛋白基因的1.05kbSalI-NcoI启动子片段，及载体pGem9Zf(+)(Promega)中玉米10kD玉米基因的3’末端的0.96kb SmaI-SalI片段。载体和插入的DNA可以使用标准程序在15℃连接过夜。然后将连接的DNA用于转化大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene)。细菌转化体可以通过限制性消化质粒DNA及使用二脱氧链终止方法分析限制的核苷酸序列而筛选。所得质粒构建体包含5’至3’方向的编码玉米遍在蛋白玉米蛋白启动子的嵌合基因，编码GloxA的cDNA及10kD玉米蛋白3’区域。

然后通过如下程序将上述嵌合基因导入玉米细胞中。从玉米自交系H99与LH132的杂交获得的发育中颖果中切割未成熟的玉米胚。在自花授粉后10-11天，当其长度达到1.0-1.5mm时，分离该胚。然后将该胚以茎轴(axis-side)向下放置，与琼脂糖固化的N6培养基(Chu et al.，1975)接触。将胚在黑暗中在27℃保持。易碎的胚发生愈伤组织由具有体细胞原胚未分化的细胞块与从这些未成熟胚的盾片中增殖的胚柄结构上的胚状体组成。分离自原始外植体中的胚发生愈伤组织可以在N6培养基上培养，及在这个培养基上每2-3周传代培养。

粒子轰击方法(Klein et al.，1987)可用于将基因转移至愈伤组织培养细胞。根据这种方法，使用如下技术将金粒(直径1μm)用DNA包被。将10μg质粒DNA加入50μL金粒悬浮液(60mg/mL)中。向粒子中加入氯化钙(50μL的2.5M溶液)和不含亚精胺的碱(20μL的1.0M溶液)。在加入这些溶液期间涡旋该悬浮液。10分钟后，将该试管短暂离心(15,000rpm离心5秒钟)，除去上清。将粒子再悬浮于200μL完全乙醇中，再次离心及除去上清。再次进行乙醇漂洗，及将粒子再悬浮于终体积30μL乙醇中。可以将等分的(5μL)DNA-包被的金粒置于Kapton^TM flying disc(Bio-Rad Labs)的中心。然后用Biolistic^TM PDS-1000/He(Bio-Rad Instruments，Hercules Calif.)将该粒子加速进入玉米组织中，使用氦压1000psi、间隔距离为0.5cm，飞行距离为1.0cm。

对于轰击而言，将胚发生组织置于琼脂糖固化的N6培养基上的滤纸上。将该组织排列成薄层(thin lawn)，覆盖直径为大约5cm的圆形区域。将含有组织的培养皿置于PDS-1000/He室中，与停止筛(stopping screen)距离大约8cm。然后抽出室内空气至28英寸汞柱真空状态。使用破裂膜利用氦冲击波给大载体(macrocarrier)加速，所述破裂膜当射击管内He压力达到1000psi时破裂。

在轰击7天后，将组织移至含有草甘膦(2mg/L)的N6培养基中。2周之后，将组织移至含有草甘膦的新鲜N6培养基中。6周之后，在含有补加草甘膦的培养基的一些平板上可以鉴别出直径为大约1cm的活跃生长的愈伤组织。当在选择性培养基上传代培养时，这些愈伤组织可以继续生长。

通过首先将组织簇移至N6培养基，可以从转基因的愈伤组织中再生植物。2周后，可以将组织移至再生培养基中(Fromm et al.，1990)。

实施例8-表达GloxA的转基因大豆的产生

一种表达盒可用于在转化的大豆中快速酶的表达，所述表达盒由花椰菜花叶病毒35S启动子(Odell et al.，1985)和编码肾豆(Phaseolus vulgaris)的种子贮藏蛋白菜豆蛋白β亚基的基因的转录终止子组成。

可以使用适当的寡核苷酸引物通过聚合酶链反应(PCR)产生编码本发明酶的cDNA片段。可以在寡核苷酸中掺入克隆位点以当插入表达载体中时提供DNA片段的正确方向。然后如上述进行扩增，分离的片段插入携带表达盒的pUC18载体中。

然后将大豆胚用所述表达载体转化。为了诱导体细胞胚，可以将从无菌表面切下的3-5mm长度的子叶、大豆栽培种A2872的不成熟的种子在26℃在合适的琼脂培养基上在光亮或黑暗中培养6-10周。然后切离产生次生胚状体的体细胞胚，置于合适的液体培养基中。在重复选择繁殖为早期球状胚阶段的体细胞胚之后，如下所述保持悬浮。

大豆胚发生悬浮液可以在于35mL液体培养基中在26℃在150rpm旋转摇动器上保持，用荧光灯以16:8小时白天/黑夜光照。每2周将培养物传代培养一次，通过将大约35mg的组织接种于35mL液体培养基中而进行。

然后，可以通过基因枪轰击方法(U.S.4,945,050)转化大豆胚发生悬浮培养物。DuPont Biolistic^TM PDS1000/HE仪器(氦循环(helium retrofit))可用于进行这些转化。

可用于促进大豆转化的选择标记基因是嵌合基因，由花椰菜花叶病毒35S启动子、质粒pJR225(来自大肠杆菌)的潮霉素磷酸转移酶基因及根癌农杆菌的Ti质粒的T-DNA的胭脂碱合酶基因的3’区域组成。该表达盒可以作为限制片段分离。然后可以将这个片段插入携带标记基因的载体的唯一限制位点中。

向50μL的60mg/mL1μm金粒悬浮液中按顺序加入如下材料：5μLDNA(1μg/μL)、20μl亚精胺(0.1M)和50μL CaCl₂(2.5M)。然后将该粒子制品搅拌3分钟，在微型离心机上旋转10秒钟，除去上清。将DNA包被的粒子在400μL 70％乙醇中洗涤一次，并再悬浮于40μL无水乙醇中。可以对DNA/粒子悬浮液进行超声处理3次，每次1秒钟。然后将5μLDNA包被的金粒加样于每个大载体盘(macro carrier disk)中。

将大约300-400mg的2周龄的悬浮培养物置于空的60×15mm培养皿中，用移液管从组织中除去剩余的液体。对于每个转化实验，通常轰击大约5-10个平板的组织。膜破裂压设为1100psi，室内保持28英寸(inches)汞柱真空状态。将组织置于与保留筛大约3.5英寸的位置，轰击三次。在轰击之后，将组织分成两半，如上述置于液体培养基中及培养。

在轰击后5-7天，用新鲜培养基更换所述液体培养基，在轰击后11-12天，用含有50mg/mL潮霉素的新鲜培养基更换原有培养基。这种选择性培养基可以每周更新一次。在轰击后7-8周，可以观测到从未转化的坏死胚发生组织中生长出幼年(green)转化的组织。取出分离的幼年组织，接种于各个培养瓶中以产生新的无性繁殖的转化的胚发生悬浮培养物。每个新的品系可以作为独立的转化事件进行处理。然后可以将这些悬浮液传代培养及作为不成熟胚保持，或者通过使各个体细胞胚成熟和发芽再生为完整植物。

检测植物暴露于草甘膦时的生长能力。

实施例9-表达GloxA的转基因棉花的产生

为了在棉花中产生GloxA，可以将本发明的编码序列与地三叶草矮化病毒启动子(S7；WO 96/06932)可操纵地连接。将嵌合基因与选择标记基因可操纵地连接并导入T-DNA载体中。使用农杆菌介导的转化技术转化棉花植物。通过将候选的转化体暴露于草甘膦而鉴别转基因的棉花品系。

实施例10-表达GloxA的转基因小麦的产生

为了在小麦中产生GloxA，将包含SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的多核苷酸亚克隆进pPlex载体(Schunmann et al.，2003)中，由此地三叶草矮化病毒启动子能驱动小麦细胞中基因转录。

根据Pellegrineschi等(2002)所述方法对栽培种Bobwhite 26的小麦胚进行转化。为了证实产生的植物含有所述构建体，使用FastDNA试剂盒(BIO101 Inc.，Vista，California，USA)根据厂商指导对从植物叶中提取的基因组DNA进行PCR分析。将DNA在100μl无菌去离子水中洗脱，并将1μl用于PCR中。

检测植物暴露于草甘膦时的生长能力。

实施例11-表达GloxA的转基因油菜的产生

在5cm栽培罐中建立欧洲油菜(Brassica napus)的秧苗。将其在24℃、16/8小时光照周期条件下于生长室中生长。2.5周后，将其移至15cm栽培罐中，在15/10℃白天/夜间温度、16/小时光照周期条件下于生长室中生长。

在即将抽苔之前或者在抽苔过程中但是在开花之前，从植物中取4个末端节间段，将其在70％v/v乙醇中表面灭菌1分钟，在2％w/v次氯酸钠中灭菌20分钟，及用无菌去离子水漂洗3次。在灭菌之前，可以将附着叶的茎在潮湿的塑料袋中冷却直至72小时。将6-7个茎段切成5mm圆片，保持底端方向。

将表达SEQ ID NO：6的农杆菌在24℃于旋转器上在含有50mg/l卡那霉素、24mg/l氯霉素和100mg/l壮观霉素的2mls Luria肉汤中生长过夜。制备大约9 x 10⁸个细胞/ml的1:10稀释液。在660μm读数光密度证实该结果。用1.0ml农杆菌接种茎盘(外植体)，从该外植体中吸出过量液体。

将外植体向下置于含有1/10x标准MS盐、维生素B5、3％蔗糖、0.8％琼脂、pH 5.7、1.0mg/l 6-苄基腺嘌呤(BA)的培养平板的底部。在平板上铺一层含有MS盐、维生素B5、3％蔗糖、pH 5.7、4.0mg/l p-氯苯氧基乙酸、0.005mg/i激动素的1.5ml培养基，并用无菌滤纸覆盖。

在2-3天共培养之后，将外植体移至含有MS盐、维生素B5、3％蔗糖、0.8％琼脂、pH 5.7、1mg/l BA、500mg/l羧苄青霉素、50mg/l头孢噻肟、200mg/l卡那霉素或者175mg/l庆大霉素的深培养平板中进行选择。每个平板放置7个外植体。3周后，将其移至新鲜培养基中，每个平板5个外植体。将该外植体在生长室中在25℃持续光照(Cool White)下培养。

检测植物暴露于草甘膦时的生长能力。

实施例12-表达GloxA的转基因大麦的产生

为了在大麦中产生GloxA，将包含SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的多核苷酸亚克隆进pPlex载体(Schunmann et al.，2003)中，由此地三叶草矮化病毒启动子能驱动大麦细胞中基因转录。

根据Pellegrineschi等(2002)所述方法对大麦胚进行转化。为了证实产生的植物含有所述构建体，使用FastDNA

试剂盒(BIO 101 Inc.，Vista，California，USA)根据厂商指导对从植物叶中提取的基因组DNA进行PCR分析。将DNA在100μl无菌去离子水中洗脱，并将1μl用于PCR中。

检测植物暴露于草甘膦时的生长能力。

本发明技术人员意识到在不偏离经充分描述的本发明精神和范围的前提下，可以对如特异实施方案所示的本发明进行多种改动和/或修改。因此，本发明的实施方案只是举例说明了本发明而无限制之意。

本文论述和引用所有出版物均以其全部内容并入本文作参考。

本申请要求US 60/747,151的优先权，其全部内容并入本文作参考。

本说明书中包含的关于文献、文章、材料、装置、商品等的所有论述均只是针对本发明的目的而论。不应因为其在本发明优先权日之前存在而理解为任何或所有这些构成现有技术的一部分或者是本领域中的常识。

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序列表

<110>联邦科学技术研究组织(Commonwealth Scientific and Industrial Organisation)

粮食研究发展公司(Grains Research and Development Corporation)

<120>Enzymes for degrading herbicides

<130>505440

<150>60/747,151

<151>2006-05-12

<160>9

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>472

<212>PRT

<213>Arthrobacter sp.TBD

<400>1

<210>2

<211>1419

<212>DNA

<213>Arthrobacter sp.TBD

<400>2

<210>3

<211>430

<212>PRT

<213>Pseudomonas sp.LBAA

<400>3

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Oligonucleotide primer

<400>4

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Oligonucleotide primer

<400>5

<210>6

<211>1445

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>GloxA coding sequence optimized for expression in plants，

includes added cloning sites at 5’and 3’ends as well as AACA

just before start codon

<400>6

<210>7

<211>1419

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>GloxA coding sequence optimized for expression in E.coli

<400>7

<210>8

<211>473

<212>PRT

<213>Brevibacterium linens BL2

<400>8

<210>9

<211>472

<212>PRT

<213>Arthrobacter aurescens TC1

<400>9

Claims

1.一种基本上纯化的多肽，其裂解草甘膦产生甘氨酸。

2.一种基本上纯化的多肽，其裂解草甘膦的膦酰甲基C-3碳-氮键。

3.权利要求1或2的多肽，其包含单氨基酸链。

4.权利要求1-3任一项的多肽，其中所述多肽是可溶的。

5.权利要求1-4任一项的多肽，其中草甘膦的裂解基本上不产生乙醛酸。

6.权利要求1-5任一项的多肽，其中草甘膦的裂解基本上不产生肌氨酸。

7.一种基本上纯化的多肽，其具有比GOX(SEQ ID NO：3)高的裂解草甘膦的效率。

8.一种基本上纯化的多肽，其具有大于550μmol/min/mg的裂解草甘膦的比活性。

9.一种基本上纯化的多肽，其包含选自下组的序列：

i)SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，

ii)与i)至少25％相同的氨基酸序列，

其中所述多肽裂解含胺除草剂。

10.权利要求9的多肽，其中所述含胺除草剂是草甘膦或草胺膦。

11.权利要求9或10的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：1至少60％相同的氨基酸序列。

12.权利要求9或10的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：1至少90％相同的氨基酸序列。

13.权利要求1-12任一项的多肽，其中所述多肽可以纯化自节杆菌菌种。

14.权利要求13的多肽，其中所述节杆菌菌种是节杆菌TBD(Arthrobacter sp.TBD)。

15.权利要求1-14任一项的多肽，其与至少一种其它多肽融合。

16.一种分离的多核苷酸，其包含具有选自下组的序列的核苷酸：

i)SEQ ID NO：2，

ii)编码权利要求1-15任一项的多肽的核苷酸序列，

iii)与i)至少25％相同的核苷酸序列，

iv)在低严格条件下与i)杂交的核苷酸序列，

v)与i)-iv)互补的核苷酸序列。

17.权利要求16的多核苷酸，其编码裂解含胺除草剂的多肽。

18.权利要求17的多核苷酸，其中所述含胺除草剂是草甘膦或草胺膦。

19.权利要求16-18任一项的多核苷酸，其包含在严格条件下与i)杂交的序列。

20.一种重组多核苷酸，包含在植物细胞中起作用的启动子，所述启动子与编码权利要求1-15任一项的多肽的结构DNA序列可操纵地连接，所述结构DNA序列与在所述细胞中起作用的3’聚腺苷酸化序列可操纵地连接，其中所述启动子与所述结构DNA序列是异源的且能表达所述结构DNA序列，以增强细胞对于含胺除草剂的抗性。

21.包含权利要求16-20任一项的多核苷酸的载体。

22.权利要求21的载体，其中所述多核苷酸与启动子可操纵地连接。

23.包含至少一种权利要求16-20任一项的多核苷酸和/或至少一种权利要求21或22的载体的宿主细胞。

24.权利要求23的宿主细胞，其是植物细胞。

25.一种重组细胞，其裂解草甘膦并产生甘氨酸。

26.一种包含导入的多肽的重组细胞，所述多肽裂解草甘膦的膦酰甲基C-3碳-氮键。

27.一种制备权利要求1-15任一项的多肽的方法，所述方法包括在使得编码所述多肽的多核苷酸表达的条件下培养编码所述多肽的权利要求23的宿主细胞或者编码所述多肽的权利要求22的载体，并回收表达的多肽。

28.使用权利要求27的方法产生的多肽。

29.一种特异性结合权利要求1-15任一项的多肽的分离的抗体。

30.一种组合物，其包含至少一种权利要求1-15任一项的多肽、至少一种权利要求16-20任一项的多核苷酸、权利要求21或22的载体、权利要求23或24的宿主细胞、权利要求25或26的重组细胞和/或权利要求29的抗体，及一或多种可接受的载体。

31.一种裂解含胺除草剂的组合物，所述组合物包含至少一种权利要求1-15任一项的多肽及一或多种可接受的载体。

32.权利要求30或31的组合物，其进一步包含金属离子。

33.权利要求32的组合物，其中所述金属离子是Co²⁺、Zn²⁺和/或Mg²⁺。

34.权利要求1-15任一项的多肽或者编码所述多肽的多核苷酸作为选择标记在检测和/或选择重组细胞中的应用。

35.一种检测重组细胞的方法，所述方法包括：

i)将细胞或细胞群与编码权利要求1-15任一项的多肽的多核苷酸在使得所述多核苷酸被所述细胞摄取的条件下接触，及

ii)通过将得自步骤i)的细胞或其子代细胞暴露于含胺除草剂，从而选择重组细胞。

36.权利要求35的方法，其中所述多核苷酸包含编码权利要求1-15任一项的多肽的第一个开放读框，及不编码权利要求1-15任一项的多肽的第二个开放读框。

37.权利要求36的方法，其中所述第二个开放读框编码多肽。

38.权利要求36的方法，其中所述第二个开放读框编码不翻译的多核苷酸。

39.权利要求38的方法，其中所述不翻译的多核苷酸编码催化性核酸、dsRNA分子或反义分子。

40.权利要求35-39任一项的方法，其中所述细胞是植物细胞、细菌细胞、真菌细胞或动物细胞。

41.权利要求40的方法，其中所述细胞是植物细胞。

42.权利要求35-41任一项的方法，其中所述含胺除草剂是草甘膦或草胺膦。

43.一种裂解含胺除草剂的方法，所述方法包括将所述含胺除草剂与权利要求1-15任一项的多肽接触。

44.权利要求43的方法，其中所述多肽是由权利要求23或24的宿主细胞产生的。

45.一种包含外源多核苷酸的转基因植物，所述多核苷酸编码至少一种权利要求1-15任一项的多肽。

46.权利要求45的转基因植物，其中所述多肽至少在所述转基因植物的气生部分中产生。

47.权利要求45或46的转基因植物，其中所述多核苷酸被稳定掺入所述植物的基因组中。

48.一种产生对于含胺除草剂的抗性增强的植物的方法，所述方法包括如下步骤：a)向植物细胞的基因组中插入如下多核苷酸，所述多核苷酸包含：在植物细胞中起作用导致RNA序列产生的启动子，所述启动子可操纵地连接至以下结构DNA序列；导致编码权利要求1-15任一项的多肽的RNA序列产生的结构DNA序列，所述结构DNA序列可操纵地连接至以下3’非翻译区；3′非翻译区，其在植物细胞中起作用导致在所述RNA序列的3’末端添加聚腺苷酸化核苷酸；其中所述启动子与所述结构DNA是异源的且适于引起所述多肽的足够表达，以增强用所述DNA分子转化的植物细胞对于含胺除草剂的抗性；b)获得转化的植物细胞；c)从所述转化的植物细胞再生经遗传转化的植物，其对于含胺除草剂的抗性增强。

49.使用权利要求48的方法产生的转基因植物。

50.一种裂解样品中含胺除草剂的方法，所述方法包括将所述样品暴露于权利要求45-47或49任一项的转基因植物。

51.权利要求50的方法，其中所述样品是土壤。

52.一种包含外源多核苷酸的转基因非人动物，所述多核苷酸编码至少一种权利要求1-15任一项的多肽。

53.一种分离的节杆菌菌株，于2006年4月11日保藏在澳大利亚全国测量学院，保藏号为V06/010960。

54.一种裂解含胺除草剂的组合物，所述组合物包含权利要求53的菌株及一或多种可接受的载体。

55.以下物质的提取物：权利要求23或24的宿主细胞、权利要求25或26的重组细胞、权利要求45-47或49任一项的转基因植物、权利要求52的转基因非人动物、或者权利要求53的菌株，其包含权利要求1-15任一项的多肽。

56.一种裂解含胺除草剂的组合物，所述组合物包含权利要求55的提取物及一或多种可接受的载体。

57.一种裂解含胺除草剂的方法，所述方法包括将含胺除草剂暴露于权利要求53的菌株和/或权利要求55的提取物。

58.一种分离的细菌，其产生权利要求1-15任一项的多肽。

59.权利要求58的细菌，其是节杆菌。

60.一种产生权利要求1-15任一项的多肽的分离的天然存在的细菌在裂解含胺除草剂中的应用。

61.一种用于裂解含胺除草剂的聚合的海绵或泡沫，所述泡沫或海绵包含固定于聚合的多孔支持物上的权利要求1-15任一项的多肽。

62.一种裂解含胺除草剂的方法，所述方法包括将含胺除草剂暴露于权利要求61的海绵或泡沫。

63.一种从权利要求45-47或49任一项的植物中产生的产品。

64.权利要求45-47或49任一项的植物的部分。

65.权利要求64的植物的部分，其是种子。

66.一种产生具有增强的裂解含胺除草剂能力的多肽的方法，所述方法包括：

(i)改变权利要求1-15任一项的第一多肽的一或多个氨基酸，

(ii)确定得自步骤(i)的改变的多肽裂解含胺除草剂的能力，及

(iii)选择当与该第一多肽对比时具有增强的裂解含胺除草剂能力的改变的多肽。

67.通过权利要求66的方法产生的多肽。

68.一种筛选能裂解含胺除草剂的微生物的方法，所述方法包括：

ii)确定所述微生物是否能生长和/或分裂。

69.一种试剂盒，其包含至少一种权利要求1-15、28或67任一项的多肽、至少一种权利要求16-20任一项的多核苷酸、权利要求21或22的载体、权利要求23或24的宿主细胞、权利要求25或26的重组细胞、权利要求29的抗体、权利要求30-33、54或56任一项的组合物、至少一种权利要求53的菌株、至少一种权利要求55的提取物、至少一种权利要求58或59的细菌、至少一种权利要求61的聚合的海绵或泡沫、至少一种权利要求63的产品，和/或至少一种权利要求64或65的部分。