CN111607573A - 一种具有草甘膦降解活性的氨膦氧化还原酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种具有草甘膦降解能力的氨膦氧化还原酶，并进一步公开所述氨膦氧化还原酶及其编码基因在新型耐草甘膦作物的培育以及草甘膦污染生物降解领域中的应用。本发明所述具有草甘膦降解能力的氨膦氧化还原酶，具有全新的草甘膦分解机制，可以特异性切割草甘膦中磷酰基甲基与甘氨酸连接的C‑N键，进而产生甘氨酸及其它无毒产物，将该酶编码基因导入大肠杆菌细胞能赋予其对草甘膦较高的抗性，该酶及其编码基因无论在草甘膦污染的降解修复还是在基于遗传工程进行抗草甘膦植物的培育研究中，都具有极大的应用潜力。

Description

一种具有草甘膦降解活性的氨膦氧化还原酶及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种具有草甘膦降解能力的氨膦氧化还原酶，并进一步公开所述氨膦氧化还原酶及其编码基因在新型耐草甘膦作物的培育以及草甘膦污染生物降解领域中的应用。
背景技术
草甘膦(商品名为Roundup)又名N-磷酸甲基甘氨酸(N-(phosphonomethyl)glycine，GLP)，是一种靶点为5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的非选择性广谱高效除草剂，其通过抑制EPSPS活性进而阻断植物芳香族氨基酸的合成，最终导致植物死亡。该除草剂缓慢作用特点及韧皮部流动性使其能够充分转运至植物各部位，杀死所有分生组织，因此具有较强稳定的除草效果。草甘膦自1974年商业化后，迅速占领了全球除草剂市场，目前是全球使用量最大的农药，每年的消耗量超过80万吨。但是，草甘膦在杀死杂草的同时，对种植作物也有同样的杀灭作用，这种广谱性特点对草甘膦的应用范围产生了限制。因此，利用遗传工程手段，开发具有草甘膦抗性的转基因作物，并联合运用草甘膦形成高效、便捷的杂草管理系统，是当前最经济且最具效力的杂草防除策略。而转基因抗草甘膦作物新品种的商业化种植，已在全球获得了巨大的经济和社会效益。
培育抗草甘膦转基因作物主要是通过转入对草甘膦抑制作用不敏感的EPSPS酶基因获得的，这些基因主要来源于不同微生物的EPSPS酶编码基因。目前，已广泛应用的EPSPS基因包括源于链霉菌(Streptomyces)的DGT-32-EPSPS(US 2017/0022517 A1)、来源于放射性球菌(einococcus radiodurans R1)的G7-EPSPS(US 9556422 B2、CN101619318B)、源于土壤宏基因组筛选的GR79-EPSPS(CN101429499B)、源于固氮斯氏假单胞菌的G2-EPSPS(CN101570744B、US7893234B2)以及源于植物的经人工改造的EPSPS(WO2017/059045A1)等。此类方法是将草甘膦耐受的EPSPS基因导入植物，表达的EPSPS酶能逃避草甘膦的抑制作用，因此这类抗性基因也被称为逃逸型抗草甘膦基因。此外，来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的草甘膦乙酰转移酶(GAT)，经过优化改造后对草甘膦的催化活性提高了10000倍，也已用于抗除草剂玉米等作物的培育(US20060200874)，而Gat的作用机理是通过乙酰化修饰草甘膦使其解毒，属于“修饰型”的抗除草剂基因。据研究，上述无论是逃逸型或修饰型抗草甘膦基因，在引入植物后培育的抗草甘膦作物所表达的酶均无法实现对草甘膦的降解。近年来，大量的研究也表明，草甘膦在被抗性作物吸收后，依然可转移至根、茎和种子等生长活跃的部位并大量积累，而种子以及农产品中残留的草甘膦，在进入食物链后，依然给人类健康带来较大风险。此外，植物体内残留的草甘膦也可通过根系外排进入土壤，并进而进入水体系统，给生态环境带来风险。
为了解决草甘膦的残留危害问题，人们试图寻找草甘膦降解酶编码基因，进而转入植物培育具有草甘膦降解能力的抗除草剂作物。目前，克隆的草甘膦降解酶有来源于人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi LBAA)的草甘膦氧化还原酶基因gox(US005463175A)，但其活性较低，不能直接用于抗草甘膦作物育种。此外，一些甘氨酸氧化酶GO亦表现出草甘膦分解能力，主要来源包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中的GO，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)中的GO及其突变体(CN103421824B)。这些酶可以氧化切割草甘膦中甘氨酸部分的碳氮键，进而产生氨甲基膦酸和乙醛酸(如图1所示)。可见，草甘膦降解酶及其编码基因在培育新型转基因抗除草剂植物品种和草甘膦污染的生物修复等领域具有重要的应用价值，因此，开发新型的草甘膦降解酶显得尤为迫切和重要。
目前已报道方法中，从诸如草甘膦污染环境等特定的环境中分离筛选能够分解草甘膦的菌株，进而克隆得到降解草甘膦的功能基因，是经典的传统草甘膦降解基因发掘策略。但该方法易受实验材料的制约，且必须建立稳定的筛选方法，总体筛选效率较低且费时费力。近年来，随着海量的基因组，尤其是微生物基因组、环境宏基因组数据的积累和生物信息学技术的发展，使得基于数据库挖掘的特定功能基因开发成为可能。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种具有草甘膦降解能力的氨膦氧化还原酶；
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供所述氨膦氧化还原酶及其编码基因在新型耐草甘膦作物的培育以及草甘膦污染生物降解领域中的应用。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种具有草甘膦降解能力的氨膦氧化还原酶，所述氨膦氧化还原酶能够氧化切割草甘膦的N-磷酸甲基与甘氨酸直接的键，产生甘氨酸，实现草甘膦的降解；所述氨膦氧化还原酶包括如SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。
优选的，所述氨膦氧化还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
本发明还公开了一种编码所述氨膦氧化还原酶的基因APOX3，包含如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。
优选的，所述编码氨膦氧化还原酶的基因APOX3，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
本发明还公开了一种含有所述氨膦氧化还原酶编码基因APOX3的表达载体，所述表达载体为重组质粒pGEX-6p-APOX3。
本发明还公开了一种含有所述氨膦氧化还原酶编码基因APOX3的基因细胞系。
本发明还公开了一种含有所述氨膦氧化还原酶编码基因APOX3的重组菌。
本发明还公开了所述的具有草甘膦降解能力的氨膦氧化还原酶在培育能够降解草甘膦转基因植物领域中的应用。
本发明还公开了所述氨膦氧化还原酶编码基因APOX3在培育能够降解草甘膦转基因植物领域中的应用。
本发明还公开了一种培育具有草甘膦降解能力转基因植物的方法，具体包括将所述氨膦氧化还原酶编码基因APOX3转化入目的植物的步骤。
氨膦氧化还原酶是一类根据生物信息学分析推测可能对氨膦类物质具有催化作用的酶，已知氨基膦酸的结构通式为：R-NH-R’-PO(OH)2，常见的此类化合物包括氨甲基膦酸、氨乙基磷酸等，根据草甘膦的化学结构可知，草甘膦也属于氨基膦酸类化合物。但是，目前缺乏对这类酶的实验鉴定和研究，制约了该类酶的应用开发。而本申请方案基于生物信息学预测的APOX是否对特定的氨甲基膦酸具有活性，以及是否对草甘膦具有活性，可能为草甘膦的降解研究提供有价值的全新的酶及基因资源。
本发明所述具有草甘膦降解能力的氨膦氧化还原酶，是通过现有数据库进行筛选潜在的草甘膦降解酶，通过对不同的来自节杆菌属(Arthrobacter)的假定的氨膦氧化还原的编码基因进行了合成，并将合成的基因构建原核表达载体，进而确定了新的对草甘膦具有降解活性的氨膦氧化还原酶APOX3，其降解方式不同于已知的GO或GOX，具有全新的草甘膦分解机制，可以特异性切割草甘膦中磷酰基甲基与甘氨酸连接的C-N键，进而产生甘氨酸及其它无毒产物，将该酶编码基因导入大肠杆菌细胞能赋予其对草甘膦较高的抗性，该酶及其编码基因无论在草甘膦污染的降解修复还是在基于遗传工程进行抗草甘膦植物的培育研究中，都具有极大的应用潜力。
本发明方案通过基因合成获取了一系列草甘膦结构类似物氨基膦酸氧化还原酶编码基因，分别克隆至大肠杆菌DH5α，获取重组大肠杆菌细胞，通过草甘膦压力筛选得到一种能够在含有200mM草甘膦的M9基础盐培养基中生长的重组大肠杆菌，该基因源自伍氏节杆菌属，申请人将该基因命名为APOX3。本发明进一步将APOX3基因克隆到表达载体pGEX-6p-1上，将所得的质粒命名为pGEX-6p-APOX3重组质粒，进而将重组质粒pGEX-6p-APOX3转入大肠杆菌基因克隆和表达宿主Escherichia coli DH5α及蛋白表达宿主Escherichiacoli BL21(DE3)中，分析了APOX3对草甘膦的抗性，结果显示其对草甘膦具有较好的抗性。
本发明方案进一步对筛选到的一个抗性较高的基因(APOX3)进行深入了研究，包括表达纯化APOX3蛋白，以及对APOX3进行生化鉴定，对降解产物进行液质分析鉴定等，使用GST标签亲和层析纯化APOX3蛋白，制备草甘膦降解反应体系，HPLC-MS鉴定反应产物，独特的降解产物甘氨酸被鉴定，该草甘膦降解途径区别于已知的肌氨酸代谢途径，属于一种全新的草甘膦代谢活性；而2,6-DCIP还原藕联法测试APOX3蛋白酶学性质，其草甘膦底物Km值为0.7899mM(±0.1762)，最适温度约30℃，20℃时能保持70％相对活性，4℃时能保持70％以上活性。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为现有技术中报道的草甘膦氧化酶go、gox的作用机制示意图；
图2为本发明的技术流程图；
图3为本发明构建的重组质粒pGEX-6p-APOX3的图谱；
图4为重组大肠杆菌DH5α分别在含有50、100、200mM草甘膦的M9平板上生长情况；
图5为pGEX-6p-APOX3导入Escherichia coli BL21(DE3)诱导蛋白表达SDS-PAGE图；其中，Line 1：诱导前细胞破碎液上清样品；Line 2：诱导后细胞破碎液上清样品；
图6为pGEX-6p-APOX3导入Escherichia coli BL21(DE3)蛋白纯化SDS-PAGE图；
图7为利用2,6-DCIP还原法绘制标准曲线；
图8为APOX3酶Km(Glyphosate)的测定结果；
图9为APOX3酶最适温度的测定结果；
图10为APOX3酶反应降解草甘膦的HPLC-MS鉴定；其中，a：空白对照组草甘膦色谱结果；b：空白对照组草甘膦质谱结果；c：实验组草甘膦色谱结果；d：实验组草甘膦质谱结果；
图11为APOX3酶反应降解草甘膦产生甘氨酸的HPLC-MS鉴定；其中，a：空白对照组甘氨酸色谱结果；b：空白对照组甘氨酸质谱结果；c：实验组甘氨酸色谱结果；d：实验组甘氨酸质谱结果。
具体实施方式
对序列表的说明：
序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的APOX3基因的核苷酸序列，序列全长为1413bp；
序列表SEQ ID NO：2是APOX3基因编码的蛋白质序列，编码471个氨基酸残基。
本发明下述实施例中涉及目的基因pUC57-APOX3由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
如图2所示的工艺路线，本发明所述方案通过如下实施例予以实现及证明。
实施例1草甘膦降解基因APOX3克隆
本发明通过生物信息，检索分析是否有氨基膦酸类化合物代谢的酶，并验证此类酶是否具有对草甘膦降解活性。具体地，我们以aminophosphonate为关键词，检索蛋白分类数据库InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/text/)，反馈的结果是一种假定的氨基膦酸氧化还原酶(Putative aminophosphonate oxidoreductase，登录号为：IPR017715)。该假定的氨基膦酸氧化还原酶(下文缩写为APOX)为FAD(核黄素腺嘌呤二核苷酸)依赖型的氧化还原酶，属于pfam01266基因家族的氧化还原酶，广泛分布于假单胞菌属、节杆菌属等微生物中。在该家族酶中，已获得鉴定的有3-磷酸甘油脱氢酶，肌氨酸氧化酶β亚基及一些氨基酸脱氨氧化酶。
设计引物如下：
正向引物(5’-APOX3-6p)：5’-CGGGATCCATGCATACCACCGT-3’，其中：下划线部分为酶切位点BamHI；
反向引物(3’-APOX3-6P)：5’-CCGCTCGAGTTAGCTATCAAAGC-3’，其中：下划线部分为酶切位点XhoI。
引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
PCR扩增APOX3片段，PCR反应体系见表1。
表1扩增APOX3基因的PCR反应体系
pUC57-APOX3(158ng/μL) 1μL
dNTPs(10mM) 2μL
5×FastPfu Buffer 10μL
正向引物(5’-APOX3-6p,10μM) 1μL
反向引物(3’-APOX3-6P,10μM) 1μL
FastPfu DNA polymerase 1μL
加灭菌双蒸水补足体系至 50μL
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s；30个循环；72℃延伸10min，4℃保存5min结束。
PCR产物采用OMEGA DNA GEL试剂盒，按照说明书直接回收，具体步骤为：收集PCR产物，加入与PCR产物等量的Binding buffer，将混合液加入到2mL吸附管，以12000rpm离心1min，加入500μl洗脱液离心洗脱1min，再加入700μl洗脱液离心洗脱1min，将缓冲液弃去后再离心2min，晾置5min，加入20μL双蒸水洗脱收集DNA。
本发明克隆的草甘膦降解基因APOX3的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，序列全长为1413bp，编码471个氨基酸残基(SEQ ID NO：2)。
PCR产物与载体pGEX-6p-1双酶切及重组质粒构建
将获得的PCR产物和质粒载体pGEX-6p-1分别用限制性内切酶BamH I/XhoI(购自宝生物工程大连有限公司)双酶切4h，酶切体系如表2，质粒载体(100μl体系)见表3。
表2酶切体系PCR产物(100μl体系)
PCR产物(100ng/μl) 80μl
Takara Q cut BamH I 2.5μl
Takara Q cut Xho I 2.5μl
10×Q cut buffer 10μl
Add双蒸水至 100μl
表3质粒载体(100μl体系)
pGEX-6p-1(120ng/μl) 80μl
Takara Q cut BamH I 2.5μl
Takara Q cut Xho I 2.5μl
10×Q cut buffer 10μl
Add双蒸水至 100μl
酶切产物的回收使用胶回收试剂盒(购自OMEGA公司)，按照该试剂盒的说明书回收电泳产物，具体步骤为：在紫外灯下将目的条带切下后置于1.5mL的离心管中，每100mg加入100μL Binding buffer，于55℃水浴锅温浴10min，直到凝胶全部融化；将溶胶液加入到2mL吸附管12000rpm，4℃离心1min，加入500μl洗脱液离心洗脱1min，再加入700μl洗脱液离心洗脱1min，将缓冲液弃去后再离心2min，晾置5min，加入20μL双蒸水洗脱收集DNA。
将上述回收的APOX3基因和pGEX-6p-1质粒载体进行连接，10μL连接体系中含有：经上述步骤构建好的含BamH I/Xho I双酶切位点的pGEX-6p-1质粒载体0.06nmol；经BamHI/Xho I双酶切的目的基因0.45nmol；T4 DNA ligase(购自NEB公司)1μL；10×T4 DNAligase buffer 1μL；双蒸水补足体系至10μL，4℃静置酶连过夜。构建的重组质粒pGEX-6p-APOX3的图谱如图3所示，可见，APOX3片段共1413bp，根据序列信息确认通过BamH I/Xho I酶切位点能够正确连接pGEX-6p-1载体，重组载体共6379bp，可通过氨苄青霉素筛选阳性克隆子。
目的片段转化DH5α：取酶连产物10μL与100μL大肠杆菌感受态细胞DH5α混匀，冰浴30分钟；42℃水浴热休克90秒，迅速至冰上冷却10分钟；加入500μL预热液体LB培养基，37℃恢复培养60min；取200μL恢复培养液涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素(Ampicillin，购自北京Transgene公司)的LB平板上，37℃过夜。挑取转化子，接种到液体LB培养基37℃震荡培养，取2ml菌液12000rpm收集菌体，加入100μL苯酚及100μL氯仿异戊醇混匀悬浮，12000rpm离心5分钟，取上清液质粒样品电泳检测后选择阳性转化子送交武汉擎科生物技术有限公司测序验证。
实施例2重组大肠杆菌草甘膦抗性测定
附加草甘膦的M9固体培养基培养：分别制备含有50、100、200mM草甘膦的M9平板(配方：Na2HPO4 6.8g、KH2PO4 3g、NaCl 0.5g、NH4Cl 1g、20mL 1mol/L葡萄糖、2mL 1mol/LMgSO4、100μL 1mol/L CaCl2加双蒸水至1L，灭菌前调pH至7.6，在121℃下高压蒸汽灭菌30min，加入2％琼脂)，121℃高压蒸汽灭菌30min。
使用重组大肠杆菌DH5α，接种至氨苄青霉素(Ampicillin)的抗性LB中，37℃过夜培养，收集菌体并洗涤除去LB培养基，以不同体积灭菌水重悬调整OD600至1.0，取3μL洗涤后菌液滴加至草甘膦M9平板上，每组平板选择不同位置接种3次菌液，待菌液风干后，37℃倒置培养3日。重组大肠杆菌DH5α分别在含有50、100、200mM草甘膦的M9平板上生长情况见图4所示，可见，含有空载pGEX-6p-1的重组菌株对照在添加以上不同浓度草甘膦的M9平板上均受到显著抑制，无法生长，而含有APOX3基因的重组菌株能够在添加50mM草甘膦的M9平板上正常生长，提高草甘膦浓度至100mM及200mM时，该重组菌株生长受到一定程度的抑制，但仍能观察到菌落缓慢生长，培养结果说明引入APOX3基因能够赋予大肠杆菌草甘膦抗性。
实施例3蛋白的表达
将pGEX-6p-APOX3重组质粒转化大肠杆菌蛋白表达宿主BL21(DE3)：取1μL纯化的pGEX-6p-APOX3重组质粒与50μL大肠杆菌感受态细胞DE3混匀，加入到预冷的1mm电转杯(购自Bio Rad公司)中，2.1KV电压电击；迅速加入500μL无抗液体LB培养基，37℃恢复培养60min；涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素(Ampicillin，购自北京Transgene公司)的LB平板上，37℃过夜，阳性转化子验证方案同实施例1。
将鉴定正确的重组大肠杆菌接种于10ml含100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基，再按1％体积比的接种量转接至10mL氨苄LB液体培养基中，37℃培养5-6h，至OD600达到0.6-0.8，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度至0.1mM，于18℃，180rpm下培养16h诱导目的蛋白；12000rpm、4℃离心收集菌体，使用Lysis buffer(配方：25mM Tris-ClpH 7.0，双蒸水定容至1L)重悬清洗菌体两次，再用2mL Lysisi buffer重悬，超声波细胞破碎仪(购自宁波新芝公司型号：JY92-IIDN)破碎细胞，将细胞破碎液于4℃、12000rpm离心10min，收集上清。
本实施例中采用SDS-PAGE法检测目的蛋白的可溶性表达，SDS-PAGE配方包括：
浓缩胶(5％聚丙烯酰胺)，配方如下：
Figure BDA0002448565830000101
Figure BDA0002448565830000111
分离胶(12％聚丙烯酰胺)，配方如下：
Figure BDA0002448565830000112
取20μL细胞破碎液，加入4μL 5×蛋白上样缓冲液(6mL、1mol/L Tris-HCl，pH8.8，20mL10％SDS，50mL50％甘油，5mLβ-巯基乙醇，1mL1％溴酚蓝，双蒸水定容至100mL)，沸水浴10min后取10μL样品电泳检测。pGEX-6p-APOX3导入Escherichia coli BL21(DE3)诱导蛋白表达SDS-PAGE图如图5所示，目的蛋白APOX3酶在大肠杆菌中以可溶性形式表达，添加诱导剂IPTG诱导后表达量显著提高，APOX3基因编码471个氨基酸，酶分子大小为52.5kDa，含GST标签和目的蛋白的融合蛋白，申请人将此融合蛋白命名为GST-APOX3，其大小约为78kDa，由图中可见融合蛋白条带符合预测结果，且条带明亮，符合进一步蛋白纯化要求。
实施例4蛋白纯化
GST标签亲和层析纯化，具体步骤如下：取重组大肠杆菌DE3，接种于10mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃摇床培养12h后，转接至新鲜制备的1L氨苄LB液体培养基，37℃摇床培养6h至OD600达到0.6-0.8时，加入0.1mM终浓度IPTG，将培养基转入18℃摇床低温诱导蛋白16h。蛋白诱导完成后收集DE3菌体，以Lysis buffer(25mM Tris-Cl、0.3MNaCl pH7.5)冲洗菌体2次，最终以50mL Lysis buffer重悬收集菌体。高压细胞破碎仪(Thermo French Cell Press)破碎细胞后，12000rpm、4℃离心收集上清液，取1mL GST柱材料(购自美国GE Healthcare公司)除尽乙醇，加入上清液置于冰上120rpm结合30-60min，转入层析柱后，以1.5L Wash buffer(25mM Tris-Cl、0.3M NaCl pH7.5)冲洗除去杂蛋白，洗涤完成后，加入600μL含有3C蛋白酶(150U)的25mM Tris-Cl(pH 7.5)缓冲液，酶切16h，使3C蛋白酶充分切除融合蛋白的GST标签，释放出无标签的APOX3蛋白。收集APOX3蛋白，SDS-PAGE法验证纯化蛋白浓度及纯度，方案同实施例3。所得APOX3纯蛋白液以50％终浓度甘油混匀后，-80℃保存备用。pGEX-6p-APOX3导入Escherichia coli BL21(DE3)蛋白纯化SDS-PAGE结果如图6所示，可见，未检测到GST-APOX3融合蛋白条带，融合蛋白的GST标签已被充分切割，洗脱得到大小为52.5kDa的APOX3纯蛋白，条带明亮且大小与预期相符，无明显的杂蛋白条带。
实施例5目的蛋白活性的检测
APOX3为FAD依赖型氧化还原酶，其草甘膦降解活性测定参照现有文献所报道的2,6-DCIP还原法进行定量。具体步骤如下：
(1)2,6-DCIP标准曲线绘制：配制2mM的2,6-DCIP标准溶液，分别取20个1.5mL离心管，加入适量Tris-Cl缓冲液，使20个离心管中的2,6-DCIP终浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20mM每一浓度设置3组重复。静置5min后各取160μL于96孔板中测定OD600值，取平均值绘制标准曲线，绘制的标准曲线见图7所示；
(2)Km(Glyphosate)测定：反应体系包含：系列浓度梯度的草甘膦溶液(0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、50.0mM，pH7.0)、0.2mM 2,6-DCIP、3mM PMS、APOX3酶3μg，Tris-Cl缓冲液(25mM pH7.5)补足反应体系至200μL，37℃反应1h后测定OD600，以2,6-DCIP还原量衡量草甘膦消耗量，计算酶反应相对速度，Km(Glyphosate)测试结果如图8所示；
(3)最适温度测定：200μL反应体系包含：20mM草甘膦、3mM PMS、0.2mM 2,6-DCIP、APOX3酶3μg；分别置入0、10、20、30、40、50、60℃水浴锅，每组设3个重复体系，反应1h后取160μL反应液测定OD600值。以温度为横坐标，以相对活性为纵坐标作图，得到最适温度测定曲线，测试结果见图9所示。
实施例6APOX3酶反应产物HPLC-MS检测
(1)样品制备及处理
空白对照组：50mM草甘膦(Sigma Aldrich，纯度高于99％)、Tris-Cl缓冲液(25mMpH7.5)。实验组：50mM草甘膦、Tris-Cl缓冲液(25mM pH7.5)、10μgAPOX3酶，30℃最适温度下反应1h后，加入适量盐酸沉淀蛋白质，样品过0.45μm有机相滤膜后直接进样测试。
(2)仪器条件
Thermo scientific Q Exactive Ultimate 3000UPLC超高效液相色谱-串联质谱仪。
色谱条件：色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(2.1×50mm，1.8μm)；流速：0.2ml/min；柱温：15℃；进样体积：10μL；检测波长：210/254nm；流动相：A相为乙腈，B相为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱程序：0min，1％A；4min，1％A；8min，10％A；12min，10％A；14min，20％A；15min，20％A；15.01min，1％A；22min，1％A。
质谱条件：电离方式：ESI+/-ms；喷雾电压：3200V；毛细管温度：300℃；鞘气压力：40Psi；辅助气流速：15L/min；最大喷雾电流：100A；探针加热器温度：350℃；S-Lens离子传输透镜水平：50。
所述APOX3酶HPLC-MS反应产物定性测试结果如附图10、附图11所示，其中，底物草甘膦的降解情况见附图10，草甘膦荷质比168.00，搜索色谱峰面积结果：空白对照组中草甘膦峰面积为3.3*107(见附图10中a、b)，实验组中草甘膦峰面积约为3.1*107(见附图10中c、d)，草甘膦色谱峰面积降低，确认底物草甘膦由APOX3催化降解，计算得降解率约5.7％。在质谱结果中对对可能的降解产物进行检索，发现了独特的草甘膦降解产物甘氨酸，甘氨酸通常为草甘膦C-P裂解途径中的次级代谢产物，由肌氨酸进一步降解生成，而反应组中并未发现肌氨酸，甘氨酸检测结果如附图11，甘氨酸荷质比76.04，色谱结果显示空白对照组中甘氨酸背景峰面积为5.4*107(见附图11中a、b)，实验组中甘氨酸峰面积为1.8*108(见附图11中c、d)，实验组中甘氨酸含量显著提高，因此可以确定甘氨酸为APOX3草甘膦裂解反应的直接产物之一，这代表APOX3介导了一种全新的草甘膦C-N裂解代谢途径。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110>
<120> 一种具有草甘膦降解活性的氨膦氧化还原酶及其应用
<130> PI20B0205CN
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1413
<212> DNA
<213> APOX3
<400> 1
atgcatacca ccgtttttga acgtaatgtt ccgcagcctg cagttgttgc acgtagcctg 60
gaaggtgcag ttcatcgtcc gttttggatt gatgatctgg gtcctgatgt tacccgttat 120
ccgcagttag aaggtgatgc aagcgcagca ctggttattg ttggtggtgg ttataccggt 180
ctgtggaccg cactgcgtgc aaaagaacgt gaaccggaac gtagcgttat tctgctggaa 240
ggcgaacgta ttgcatgggc agcaagcggt cgtaatggtg gtttttgtga agcaagtctg 300
acccatggtt atgaaaatgg taaaagccgt tggcctcaag aaattgaaac cctggaacgt 360
ctgggtttag aaaatctgga acgtatgcaa gaggccattg aacgttatgg tatggattgt 420
gaatgggaac gtaccggtga actgaatgtt gcagttgaac cgcatcagct ggaatggctg 480
gccgaagaaa gcggtggtca tgttctgaat cgtgaagcaa cccgtgcaga agttaatagc 540
ccgacctttc tgggtagcgt ttggctgaaa gatagcgttg caatggttca tccgtataaa 600
ctggcaaccg aactggcacg tgttgttaca gaactgggtg ttaccattca tgaaggcacc 660
cgtgttcgtg aactggttga tgtggatggt ggtgttgatg ttgttaccga tcgtggcacc 720
gttcgtgcag gtcaggttgt tctgggcacc aatgtttttc cgagcctgct gaaacgtaat 780
gcactgatga ccgttccggt gtatgattat gccctgatga cagaaccgct gagccaagaa 840
cagctggaag caattggttg gaccaatcgt caaggtattg gtgatatggc aaaccagttt 900
cactattatc gtatcaccca ggataatcgc attctgtttg gtggctatga tgcactgtat 960
ttttggggtc gtcgtgttga tgaaggtcat gaatatcagc cggaaacctg ggaacgcctg 1020
gcaagccact tttttaccac ctttccgcag cttgaaggcg tgaaatttac ccataaatgg 1080
gcaggtccga ttgatagcag cacccagttt tgtgcatttt ttggcaccgc acgtaaagat 1140
cgtgttgcat atgccgcagg ttttaccggt ttaggtgttg gtgcaaccgc atttgcagca 1200
gatgtgctgc tggatctgct gagcggtgca gataccgaac gtacccgtgt tgaaatggtt 1260
cgtaaacgtc cgctgccgtt tccgcctgaa ccgtttgcaa gcgttggtat taatctgacc 1320
cgttggagca tggatcgtgc agatcataat gaaggtaaac gcaactttat tctgaaagca 1380
ctggatgcag ttggtctggg ctttgatagc taa 1413
<210> 2
<211> 471
<212> PRT
<213> APOX3
<400> 2
Met His Thr Thr Val Phe Glu Arg Asn Val Pro Gln Pro Ala Val Val
1 5 10 15
Ala Arg Ser Leu Glu Gly Ala Val His Arg Pro Phe Trp Ile Asp Asp
20 25 30
Leu Gly Pro Asp Val Thr Arg Tyr Pro Gln Leu Glu Gly Asp Ala Ser
35 40 45
Ala Ala Leu Val Ile Val Gly Gly Gly Tyr Thr Gly Leu Trp Thr Ala
50 55 60
Leu Arg Ala Lys Glu Arg Glu Pro Glu Arg Ser Val Ile Leu Leu Glu
65 70 75 80
Gly Glu Arg Ile Ala Trp Ala Ala Ser Gly Arg Asn Gly Gly Phe Cys
85 90 95
Glu Ala Ser Leu Thr His Gly Tyr Glu Asn Gly Lys Ser Arg Trp Pro
100 105 110
Gln Glu Ile Glu Thr Leu Glu Arg Leu Gly Leu Glu Asn Leu Glu Arg
115 120 125
Met Gln Glu Ala Ile Glu Arg Tyr Gly Met Asp Cys Glu Trp Glu Arg
130 135 140
Thr Gly Glu Leu Asn Val Ala Val Glu Pro His Gln Leu Glu Trp Leu
145 150 155 160
Ala Glu Glu Ser Gly Gly His Val Leu Asn Arg Glu Ala Thr Arg Ala
165 170 175
Glu Val Asn Ser Pro Thr Phe Leu Gly Ser Val Trp Leu Lys Asp Ser
180 185 190
Val Ala Met Val His Pro Tyr Lys Leu Ala Thr Glu Leu Ala Arg Val
195 200 205
Val Thr Glu Leu Gly Val Thr Ile His Glu Gly Thr Arg Val Arg Glu
210 215 220
Leu Val Asp Val Asp Gly Gly Val Asp Val Val Thr Asp Arg Gly Thr
225 230 235 240
Val Arg Ala Gly Gln Val Val Leu Gly Thr Asn Val Phe Pro Ser Leu
245 250 255
Leu Lys Arg Asn Ala Leu Met Thr Val Pro Val Tyr Asp Tyr Ala Leu
260 265 270
Met Thr Glu Pro Leu Ser Gln Glu Gln Leu Glu Ala Ile Gly Trp Thr
275 280 285
Asn Arg Gln Gly Ile Gly Asp Met Ala Asn Gln Phe His Tyr Tyr Arg
290 295 300
Ile Thr Gln Asp Asn Arg Ile Leu Phe Gly Gly Tyr Asp Ala Leu Tyr
305 310 315 320
Phe Trp Gly Arg Arg Val Asp Glu Gly His Glu Tyr Gln Pro Glu Thr
325 330 335
Trp Glu Arg Leu Ala Ser His Phe Phe Thr Thr Phe Pro Gln Leu Glu
340 345 350
Gly Val Lys Phe Thr His Lys Trp Ala Gly Pro Ile Asp Ser Ser Thr
355 360 365
Gln Phe Cys Ala Phe Phe Gly Thr Ala Arg Lys Asp Arg Val Ala Tyr
370 375 380
Ala Ala Gly Phe Thr Gly Leu Gly Val Gly Ala Thr Ala Phe Ala Ala
385 390 395 400
Asp Val Leu Leu Asp Leu Leu Ser Gly Ala Asp Thr Glu Arg Thr Arg
405 410 415
Val Glu Met Val Arg Lys Arg Pro Leu Pro Phe Pro Pro Glu Pro Phe
420 425 430
Ala Ser Val Gly Ile Asn Leu Thr Arg Trp Ser Met Asp Arg Ala Asp
435 440 445
His Asn Glu Gly Lys Arg Asn Phe Ile Leu Lys Ala Leu Asp Ala Val
450 455 460
Gly Leu Gly Phe Asp Ser *
465 470

Claims (10)

1.一种具有草甘膦降解能力的氨膦氧化还原酶，其特征在于，所述氨膦氧化还原酶能够氧化切割草甘膦的N-磷酸甲基与甘氨酸直接的键，产生甘氨酸，实现草甘膦的降解；所述氨膦氧化还原酶包括如SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述具有草甘膦降解能力的氨膦氧化还原酶，其特征在于，所述氨膦氧化还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
3.一种编码权利要求1或2所述氨膦氧化还原酶的基因APOX3，其特征在于，包含如SEQID No：1所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述编码氨膦氧化还原酶的基因APOX3，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
5.一种含有权利要求3或4所述氨膦氧化还原酶编码基因APOX3的表达载体，其特征在于，所述表达载体为重组质粒pGEX-6p-APOX3。
6.一种含有权利要求3或4所述氨膦氧化还原酶编码基因APOX3的基因细胞系。
7.一种含有权利要求3或4所述氨膦氧化还原酶编码基因APOX3的重组菌。
8.权利要求1或2所述的具有草甘膦降解能力的氨膦氧化还原酶在培育能够降解草甘膦转基因植物领域中的应用。
9.权利要求3或4所述氨膦氧化还原酶编码基因APOX3在培育能够降解草甘膦转基因植物领域中的应用。
10.一种培育具有草甘膦降解能力转基因植物的方法，其特征在于，包括将权利要求3或4所述氨膦氧化还原酶编码基因APOX3转化入目的植物的步骤。
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