CN113481126A

CN113481126A - 除草剂敌稗特异性降解菌株及降解酰胺酶基因和应用

Info

Publication number: CN113481126A
Application number: CN202110820163.4A
Authority: CN
Inventors: 张龙; 宋嫚; 李峰; 刘远; 王光利
Original assignee: Huaibei Normal University
Current assignee: Huaibei Normal University
Priority date: 2021-07-20
Filing date: 2021-07-20
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2041-07-20
Also published as: CN113481126B; CN115960928A

Abstract

本发明公开了特异性高效降解敌稗的菌株及其降解酰胺酶基因。一株敌稗降解菌株Bosea sp.P5，菌种保藏号为CCTCC M 2021603。特异性降解敌稗的酰胺酶基因，核苷酸序列为SEQ ID NO.1。利用该基因构建的工程菌株能高效表达特异性降解敌稗的酰胺酶。生产的酶制剂可用于酰胺类除草剂敌稗残留的去除。

Description

除草剂敌稗特异性降解菌株及降解酰胺酶基因和应用

技术领域

本发明属于应用环境微生物领域，涉及除草剂敌稗特异性降解菌株及降解酰胺酶基因和应用。

背景技术

据统计，我国化学农药防治的面积已经超过28亿公顷/次，全国每年的农药使用量在30万吨左右(原药)。然而，我国农药的利用率只有20-30％，其余残留全部进入农作物、土壤、水体等生态环境，对生态环境造成严重破坏。

敌稗(Propanil)是酰胺类除草剂中的一种，是目前防除稻田稗草的一种良好除草剂。由于其具有杀草效力高、选择性强、杀草范围广泛、使用方便等优点，自1958年发现以来，迅速成为全世界使用最广泛的除草剂之一。迄今，世界上已有20多个国家进行了敌稗的大规模生产和使用。在美国，敌稗位列其20大常用除草剂首列。

敌稗为高等毒性农药，其水溶性高(225mg/L)，易从稻田土壤中随雨水或灌溉水流失。因此，敌稗在环境中的残留对水生生态系统有很大风险，是一种潜在的地下水污染物。敌稗对许多水生生物毒性巨大。同时，其对哺乳动物也有一定的毒性，还具有一定的致癌风险。研究发现，敌稗的对鱼和哺乳动物的毒性要显著高于其代谢产物3,4-二氯苯胺。在农药的急性中毒事件中，敌稗是引起高铁血红蛋白血症的重要原因。另外，研究表明敌稗还可以破坏免疫系统。近年来，敌稗在全世界很多地区地表水、甚至饮用水中不断地被检测到。敌稗造成的环境污染问题已日益引起人们重视。

生物降解被认为是环境中敌稗消除的主要方式，其中微生物的降解作用至关重要，是敌稗降解的主力军。微生物数量巨大、种类繁多、功能强大，对有机物的降解具有非常大的潜力，几乎所有有毒有害的环境异生物均能被微生物所分解、利用，而且干净彻底、无二次污染。环境污染物的微生物修复是一种公认的安全、有效、廉价的方法，具有广阔的应用前景。而微生物修复除草剂残留污染的本质是微生物产生的酶对除草剂的降解作用，从微生物中提取的降解酶系来消除除草剂残留在国外已有成功的先例，降解酶的来源可以通过从降解菌中提取，也可以采用基因工程手段构建高效表达菌株来获得。敌稗降解酶基因的获得在酰胺类除草剂污染的修复领域有巨大的应用潜力。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供能特异性高效降解除草剂敌稗的菌株。

本发明的另一目的是提供从该降解菌株中克隆到的特异性降解敌稗的酰胺酶基因。

本发明的又一目的是提供该菌株、基因或基因编码蛋白的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一株敌稗降解菌株P5，分类命名为Bosea sp.，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2021603，保藏日期为2021年5月24日，保藏地址为中国-武汉，武汉大学。

由本发明所述的敌稗降解菌株制备的菌剂。

本发明所述的降解菌株或所述的菌剂在降解除草剂敌稗中的应用。

特异性降解敌稗的酰胺酶基因，核苷酸序列为SEQ ID NO.1。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1,437bp，G+C含量为70.9％，编码478个氨基酸，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。

本发明所述的酰胺酶基因编码的酰胺酶蛋白质，氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。

含所述的酰胺酶基因的重组质粒。

作为本发明的一种优选方式，酰胺酶基因片段与酶切好的pET-29a(+)进行酶连，获得含有特异性降解敌稗的酰胺酶基因的pET-29a(+)重组质粒。

含本发明所述的重组质粒的基因工程菌。

所述的基因工程菌为含本发明所述的重组质粒的重组微生物E.coli BL21(DE3)。

本发明所述的酰胺酶基因在降解土壤、水体或农作物的敌稗残留方面的应用。

本发明所述的酰胺酶蛋白质在去除农作物、土壤、水体的敌稗残留方面的应用。

有益效果

1.本发明利用鸟枪法技术成功的从菌株P5(CCTCC M 2021603)中克隆出特异性降解敌稗的酰胺酶基因。

2.该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1,437bp，G+C含量为70.9％，编码478个氨基酸。

3.通过PCR技术扩增末端含NdeⅠ和HindⅢ酶切位点的完整的特异性降解敌稗的酰胺酶基因片段，将它连接到大肠杆菌高效表达载体pET-29a(+)(购自Novegen公司)的NdeⅠ和HindⅢ酶切位点上，转化至表达宿主菌株E.coli BL21(DE3)(购自invitrogen公司)，进行IPTG诱导表达。本发明对表达产物做了酶活性测定，能高效的降解敌稗。

4.利用该基因构建的工程菌株能高效表达特异性降解敌稗的酰胺酶，生产的酶制剂可用于土壤、水体和农作物残留的敌稗的降解或去除。

附图说明

图1菌株P5在固体培养基上的菌落图(A)和电镜图(B)。

图2菌株P5的16S rRNA基因系统发育分析

图3菌株P5降解除草剂敌稗的紫外检测图(A)；菌株P5有外加碳源和无外加碳源的条件下对敌稗的降解及生长曲线(B)。

图4本发明特异性降解敌稗的酰胺酶基因克隆的策略图。

图5本发明特异性降解敌稗的酰胺酶基因在E.coli BL21[pET-29a(+)]中高效表达实验方案图。

图6本发明特异性降解敌稗的酰胺酶基因在表达宿主菌株E.coli BL21(DE3)中表达的并纯化后的蛋白SDS-PAGE电泳图。

图7本发明特异性降解敌稗的酰胺酶蛋白质在标准酶活体系中降解敌稗的高效液相色谱图和质谱检测图。

图8本发明特异性降解敌稗的酰胺酶蛋白质的最适反应温度的研究结果图(A)；本发明特异性降解敌稗的酰胺酶蛋白质的最适反应pH值的研究结果图(B)；金属离子对本发明特异性降解敌稗的酰胺酶蛋白质酶活影响的研究结果图(C)。

生物材料保藏信息

P5，分类命名为Bosea sp.，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCCNO:M 2021603，保藏日期为2021年5月24日，保藏地址为中国-武汉，武汉大学。

具体实施方式

实施例1菌株的分离与鉴定

本发明提供一种能特异性高效降解除草剂敌稗的菌株及其降解酰胺酶基因和应用，所用菌株为革兰氏染色阴性菌株P5，分离自江苏新沂某废弃农药厂厂区的土壤中。菌株具体的分离筛选方法为：

取土样10.0g加入到100mL含有30mg/L敌稗的液体无机盐培养基(以下简称MSM)，30℃、180rpm摇床培养7d，以10％接种量(v/v)转接至新鲜的MSM中，连续富集传代培养四次。利用紫外分光光度计在200-350nm范围内扫描，检测第五代富集液的降解效果。将有效果富集液在含有30mg/L敌稗的无机盐固体培养基上稀释涂布，30℃培养5d，挑取平板上的单菌落于3mL液体LB试管培养基中，然后保存并转接至20mL含有30mg/L敌稗的MSM培养基中，30℃培养5d。然后用等体积的二氯甲烷进行萃取，紫外分光光度计检测效果，从而获得敌稗的降解菌株P5。

2021年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M2021603，经鉴定属于Bosea sp.。菌株P5在LB固体培养基上菌落呈淡黄色，边缘整齐、湿润、有粘性(图1A)。主要生物学特性为G^－，菌体为杆状，大小约1.0μm宽,2.3μm长，有鞭毛(图1B)，好氧；过氧化氢酶、氧化酶、V.P.反应和吲哚反应阴性；不能水解淀粉，不能使石蕊牛乳酸凝固。将菌株P5的16S rRNA基因序列(SEQ ID NO.5)在数据库EzBioCloud中比对分析，结果显示菌株P5与Bosea属亲缘关系最近，其中与Bosea thiooxidans DSM 9653^T的16S rRNA序列一致性高达99.79％，与Bosea lupini LMG 26383^T的16S rRNA序列一致性99.72％。结合菌株的菌落形态特征、生理生化特性以及16S rRNA基因比对分析。最终将菌株P5初步鉴定为Bosea属(图2)。

实施例2菌株P5降解敌稗的效果评估和代谢产物分析

1.1种子液制备

将菌株P5(CCTCC M 2021603)接入含30mg L^-1敌稗的100mL LB培养基中，30℃、160rpm摇床培养，48h后6,000rpm离心收集菌体，使用灭菌的MM培养基洗涤菌体两次，最后用10mL MM培养基重悬，作为种子液备用。

1.2菌株P5对除草剂敌稗的降解

将菌株P5种子液按5％的接种量分别接至含有30mg L^-1敌稗的100mL MM培养基中，30℃、160rpm摇床培养。每隔24h，取3mL培养液，用等体积的二氯甲烷萃取，无水硫酸钠除水后取2mL有机相吹干，然后0.5mL甲醇复溶，用滤膜(孔径0.22μm)过滤，采用高效液相色谱进行检测。液相色谱仪型号为Dionex UltiMate 3000，使用条件为：C18反相柱，柱温为40℃，流速为1mL/min，流动相为乙腈：水(65:35，v/v)，紫外检测波长为210nm和250nm，进样量为20μL。

实验结果表明，所述菌株P5能够完全降解除草剂敌稗，培养144h后，所述菌株P5对敌稗的降解率可达100％(图3)。

实施例2特异性降解敌稗的酰胺酶基因的克隆

2.1细菌基因组总DNA的提取

保藏号为CCTCC M 2021603的菌株P5(Bosea sp.)为分离自某除草剂污染土壤的敌稗高效降解菌株。大量培养后，采用CTAB法提取高纯度、大片段的Bosea sp.P5的基因组总DNA，溶于TE(pH 8.0)中，置于-20℃保藏，具体方法参考F·奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。

2.2 pUC118(BamHI)购买于宝生物工程(大连)有限公司。

2.3总DNA的酶切

Bosea sp.P5总DNA采用Sau3AI部分酶切(图4)。

2.4 DNA的回收

酶切后的总DNA通过电泳(TAE缓冲液)进行纯化，采用Omega胶回收试剂盒进行回收，回收的DNA溶于TE(pH 8.0)中，置于-20℃保藏。

2.5酶连

建立如下反应体系:

16℃温育12小时。

2.6制备大肠杆菌DH5α高效感受态细胞

具体方法参照F.奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》P 22-23。

2.7转化

取10μl酶连产物转化100μl感受态细胞，具体方法参照F.奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》P 23。涂布含有100mg/L的对乙酰氨基苯酚(丙酮溶解成的10,000mg/L的母液)，100mg/L氨苄青霉素的LB平板，培养24h后挑取菌落周围产生棕色(对乙酰氨基苯酚与敌稗均具有酰胺键，对乙酰氨基苯酚酰胺键断裂后产生棕色的对氨基苯酚)的菌落，即是含对乙酰氨基苯酚降解酶基因的阳性克隆。然后验证该转化子对除草剂敌稗的降解效果。最终获得降解敌稗的酰胺酶基因。

2.8基因核苷酸序列测定

南京擎科生物科技有限公司进行序列测定，敌稗降解酰胺酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，根据敌稗降解酰胺酶基因核苷酸序列所推到的478个氨基酸序列为SEQ IDNO.2。

实施例3特异性降解敌稗的酰胺酶基因在大肠杆菌BL21[pET-29a(+)]中的高效表达及纯化

3.1特异性降解敌稗的酰胺酶基因的PCR扩增

以正向引物F1:5’-AAACATATGTCACATGATCAACAGGGCCCCAAAA-3’(SEQ ID NO.3)和反向引物R1:5’-TATAAGCTTTGACCGCGTGTCGCCCCC-3’(SEQ ID NO.4)为引物，用PCR从Boseasp.P5基因组中扩增出特异性降解敌稗的酰胺酶基因片段。

扩增体系：

PCR扩增程序：

3.2 PCR产物及载体用Nde I和HindⅢ分步酶切。

酶切体系：

酶切产物用纯化回收试剂盒纯化回收。

3.3转化和表达

3.2中酶切好的DNA片段、pET-29a(+)进行酶连(参考2.5)。将酶连好的含有特异性降解敌稗的酰胺酶酶基因(命名为psaA)的pET-29a(+)重组质粒转化到表达宿主菌E.coliBL21(DE3)，涂布于含有50mg/L卡那霉素的平板，获得重组转化子E.coli BL21(DE3)(pET-29a-psaA)(图5)。

3.4特异性降解敌稗的酰胺酶基因的高效表达及纯化

将阳性转化子在LB培养基中培养至OD₆₀₀＝0.5左右，向培养基中加入终浓度为0.5mM的IPTG，30℃诱导15h后，离心收集菌体。用Tris-HCl(pH 8.0)洗涤菌体，超声波破碎，离心取上清。由于构建的重组菌株E.coli BL21(DE3)(pET-29a-psaA)经过IPTG诱导表达的PsaA蛋白N端带有6个组氨酸残基组成的标签，重组蛋白可以通过Ni²⁺-NTA Resin(Novagen)进行洗脱纯化。详细纯化步骤及所需溶液见试剂盒内附说明书。将纯化后收集到的所有不同梯度的酶液分别倒入透析袋中，并置于20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中4℃过夜透析，最后进行SDS-PAGE电泳检测目的蛋白纯度(图6)。蛋白操作均在层析柜(4℃)中进行，蛋白浓度的测定采用Bradford方法(Bradford,1976)，牛血清白蛋白作为标准蛋白质。以敌稗为底物建立纯酶的酶促反应体系(3mL)：

敌稗 30mg L^-1

PsaA 1μM

Tris-HCl缓冲液(pH 8.0) 20mM

30℃水浴反应30min，加入等体积的二氯甲烷萃取终止反应。去除上清水相，用无水硫酸钠除水。将二氯甲烷相挥发除尽，然后甲醇复溶。用滤膜(孔径0.22μm)过滤，最后采用高效液相色谱进行检测。液相色谱检测条件同上1.2。

最后采用高效液相色谱串联质谱检测并鉴定代谢产物。MS分析使用ESI模式，检测器为Agilent G6410B Triple Quad Mass Spectrometer。

LC-MS(高效液相色谱和质谱联用)检测结果表明，所述的纯酶PsaA可以将敌稗转化为苯胺化合物3,4-二氯苯胺(图7)。

3.5 PsaA动力学参数测定

将阳性转化子在LB培养基中培养OD₆₀₀至0.5左右，向培养基中加入终浓度为0.5mM的IPTG，30℃诱导15h后，离心收集菌体。用Tris-HCl(pH 8.0)洗涤菌体，超声波破碎，离心取上清。按照3.4所述方法获得重组蛋白的纯酶，同时构建如3.4所述的酶促反应体系。向酶促反应体系中添加终浓度为30mg L^-1的供试底物。30℃水浴反应30min，加入等体积的二氯甲烷萃取终止反应。通过设定不同底物的不同浓度梯度，测定在不同浓度下的酶促反应速率，采用双倒数作图法(Lineweaver-Burk法)将米氏方程改写为1/V＝(K_m/V_max)×(1/[S])+1/V_max，并绘制酶动力学曲线，从而求出K_m和k_cat。实验结果的检测方法同2.10。

实验结果表明，特异性降解敌稗的酰胺酶对敌稗的动力学参数为K_m＝125μM，k_cat＝5.7s^-1。

3.6重组蛋白PsaA的酶学特性研究

根据上述方法获得重组蛋白PsaA的纯酶。将PsaA纯酶加入到酶活测定体系中，放置于不同温度梯度(4℃、16℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、60℃和70℃)条件下反应20min。在酶活体系中加入等体积的二氯甲烷终止反应。HPLC检测敌稗的转化率，以30℃条件下的酶活力为100％，计算相对酶活。

将PsaA纯酶分别加入到不同pH缓冲范围的缓冲液中。包括20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3.6-5.8)、20mM柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液(pH 5.0-8.0)、20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5-8.6)。20mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 8.6-10.6)。30℃反应20min。在酶活体系中加入等体积的二氯甲烷终止反应。HPLC检测敌稗的转化率。以20mM Tris-HCl冲液pH 7.5条件下的酶活力为100％，计算相对酶活。

在最适反应pH条件下，向酶促反应体系中加入终浓度为1.0mM的常见金属离子(Ni²⁺,Cu²⁺,Fe³⁺,Al³⁺,Co²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺和Cd²⁺)，在最适反应温度条件下反应20min。以不添加任何金属离子的反应体系下的酶活力定义为100％，计算各实验组的相对酶活。

实验结果表明，PsaA的最适温度为30℃(图8A)，最适pH为7.5(图8B)。不同金属离子对PsaA酶活影响的实验结果显示，除了Fe³⁺，其他金属离子均可以在不同程度上抑制PsaA的酶活，其中Co²⁺、Cu²⁺和Ni²⁺的抑制抑制作用较强(图8C)。

序列表

<110> 淮北师范大学

<120> 除草剂敌稗特异性降解菌株及降解酰胺酶基因和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1437

<212> DNA

<213> Bosea sp.

<400> 1

atgatcaaca gggccccaaa aggagcttcg atgacgacga tcgccgcgct ttccgccacc 60

gagctcgggc cgctctacgc cagcaaggag ctatcccccg tcgaggtcgc cagggatgcg 120

ctggcgcgca tcgaacgctt cgagcctgag gtcaacgcct tcatcgtccg cgacgcggcc 180

gcggcgttgg cgatggcgga ggcctcgcag gcgcgctggc tgaaggggga ggcgatcggc 240

ccgctcgatg gtgtgcccgt caccatcaag gacaatctcg gcgtcgccgg ctggccgatg 300

cgccgcggct cggccgtggc ctccgatgcg cccttcgccg aggattctcc ggtcacggcg 360

cggctgcgcg aggccggtac ggtcttcctc ggcaagacca ccatgccgga atatggctgg 420

aagggcgtcg gcgattcccc gctctccggc atcacccgca atccctggaa cacgggcacc 480

gggccgggcg gctcctcgtc cggcgcggct gtctgcgcgg cgctcaatct cggctgcatc 540

catctcggca cggacggggc gggttcggta cgcatcccgg ccgccttcac cggcgtcgtg 600

ggcctgaagc ccagctatgg ccgcgttccg gcctggccga tctcgaccat gggcttcctc 660

gcccatctcg gcccgctgac ccgtaccgtc gccgacacgg cgctcgcgat gaaggtgatc 720

ggccagcccg atgcgcgcga catgacggcg ctgacggacc gcccgccgga ttatgtcgac 780

gggctgaagg gtggagtccg gggcctgcgc gtggcctggt cgccgcgtct cgggcaggat 840

gtgagcgtcg atcccgagat cgcgtcgctc acggccgcgg cggcgcaggt cttctccgag 900

ctcggtgcga tggtggagga ggtcgatccc ggtttcgccg acccgatcga gacgctgatg 960

acgatctggg cctccggcgc ggcgctggct ctgcgcagcg tcgacgcggc cgggcgggcg 1020

caaatggatc ccggcctcgt cgccgtcgcc gaacagggcg aggcgatcgc ggcctcgacc 1080

tatgtcgatg cgctgctcaa ccagcgcaac gcgctggcct atcgcatggc gcagttccat 1140

gcgcgcttcg acttgctgct gacgccgacc ctgccgctgc cggccttcgc cgtggggcgc 1200

aacacgccgg aacatggagc ctatggcgag gactggacac gctggacgcc cttcacctac 1260

cccttcaaca tcaccgaaca gccggctgtc tccgtgccct gcggcctgac cgcggcgggg 1320

cttccggcgg ggctccagat cgtcggcgcc ttcggcaagg acgcgctggt gctgcgcgcg 1380

gccgcggcct tcgagcaggc gaggccgttc gcgcgggtcg acgagccgcg cgggtga 1437

<210> 2

<211> 478

<212> PRT

<213> Bosea sp.

<400> 2

Met Ile Asn Arg Ala Pro Lys Gly Ala Ser Met Thr Thr Ile Ala Ala

1 5 10 15

Leu Ser Ala Thr Glu Leu Gly Pro Leu Tyr Ala Ser Lys Glu Leu Ser

20 25 30

Pro Val Glu Val Ala Arg Asp Ala Leu Ala Arg Ile Glu Arg Phe Glu

35 40 45

Pro Glu Val Asn Ala Phe Ile Val Arg Asp Ala Ala Ala Ala Leu Ala

50 55 60

Met Ala Glu Ala Ser Gln Ala Arg Trp Leu Lys Gly Glu Ala Ile Gly

65 70 75 80

Pro Leu Asp Gly Val Pro Val Thr Ile Lys Asp Asn Leu Gly Val Ala

85 90 95

Gly Trp Pro Met Arg Arg Gly Ser Ala Val Ala Ser Asp Ala Pro Phe

100 105 110

Ala Glu Asp Ser Pro Val Thr Ala Arg Leu Arg Glu Ala Gly Thr Val

115 120 125

Phe Leu Gly Lys Thr Thr Met Pro Glu Tyr Gly Trp Lys Gly Val Gly

130 135 140

Asp Ser Pro Leu Ser Gly Ile Thr Arg Asn Pro Trp Asn Thr Gly Thr

145 150 155 160

Gly Pro Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ala Ala Val Cys Ala Ala Leu Asn

165 170 175

Leu Gly Cys Ile His Leu Gly Thr Asp Gly Ala Gly Ser Val Arg Ile

180 185 190

Pro Ala Ala Phe Thr Gly Val Val Gly Leu Lys Pro Ser Tyr Gly Arg

195 200 205

Val Pro Ala Trp Pro Ile Ser Thr Met Gly Phe Leu Ala His Leu Gly

210 215 220

Pro Leu Thr Arg Thr Val Ala Asp Thr Ala Leu Ala Met Lys Val Ile

225 230 235 240

Gly Gln Pro Asp Ala Arg Asp Met Thr Ala Leu Thr Asp Arg Pro Pro

245 250 255

Asp Tyr Val Asp Gly Leu Lys Gly Gly Val Arg Gly Leu Arg Val Ala

260 265 270

Trp Ser Pro Arg Leu Gly Gln Asp Val Ser Val Asp Pro Glu Ile Ala

275 280 285

Ser Leu Thr Ala Ala Ala Ala Gln Val Phe Ser Glu Leu Gly Ala Met

290 295 300

Val Glu Glu Val Asp Pro Gly Phe Ala Asp Pro Ile Glu Thr Leu Met

305 310 315 320

Thr Ile Trp Ala Ser Gly Ala Ala Leu Ala Leu Arg Ser Val Asp Ala

325 330 335

Ala Gly Arg Ala Gln Met Asp Pro Gly Leu Val Ala Val Ala Glu Gln

340 345 350

Gly Glu Ala Ile Ala Ala Ser Thr Tyr Val Asp Ala Leu Leu Asn Gln

355 360 365

Arg Asn Ala Leu Ala Tyr Arg Met Ala Gln Phe His Ala Arg Phe Asp

370 375 380

Leu Leu Leu Thr Pro Thr Leu Pro Leu Pro Ala Phe Ala Val Gly Arg

385 390 395 400

Asn Thr Pro Glu His Gly Ala Tyr Gly Glu Asp Trp Thr Arg Trp Thr

405 410 415

Pro Phe Thr Tyr Pro Phe Asn Ile Thr Glu Gln Pro Ala Val Ser Val

420 425 430

Pro Cys Gly Leu Thr Ala Ala Gly Leu Pro Ala Gly Leu Gln Ile Val

435 440 445

Gly Ala Phe Gly Lys Asp Ala Leu Val Leu Arg Ala Ala Ala Ala Phe

450 455 460

Glu Gln Ala Arg Pro Phe Ala Arg Val Asp Glu Pro Arg Gly

465 470 475

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaacatatgt cacatgatca acagggcccc aaaa 34

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tataagcttt gaccgcgtgt cgccccc 27

<210> 5

<211> 1448

<212> DNA

<213> Bosea sp.

<400> 5

agagtttgat cctggctcag agcgaacgct ggcggcaggc ttaacacatg caagtcgaac 60

gggcacttcg gtgctagtgg cagacgggtg agtaacacgt gggaacgtac ctttcggttc 120

ggaataattc agggaaactt ggactaatac cggatacgcc cttcggggga aagatttatc 180

gccgatagat cggcccgcgt ctgattagct agttggtgag gtaatggctc accaaggcga 240

cgatcagtag ctggtctgag aggatgatca gccacattgg gactgagaca cggcccaaac 300

tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc gcaagcctga tccagccatg 360

ccgcgtgagt gatgaaggcc ttagggttgt aaagctcttt tgtccgggaa gataatgact 420

gtaccggaag aataagcccc ggctaacttc gtgccagcag ccgcggtaat acgaaggggg 480

ctagcgttgc tcggaatcac tgggcgtaaa gggcgcgtag gcggactctt aagtcggggg 540

tgaaagccca gggctcaacc ctggaattgc cttcgatact gggagtcttg agttcggaag 600

aggttggtgg aactgcgagt gtagaggtga aattcgtaga tattcgcaag aacaccagtg 660

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aggtagcc 1448

Claims

1.一株敌稗降解菌P5，其特征在于分类命名为Bosea sp.，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2021603，保藏日期为2021年5月24日，保藏地址为中国-武汉，武汉大学。

2.由权利要求1所述的敌稗降解菌P5制备的菌剂。

3.权利要求1所述的降解菌P5或权利要求2所述的菌剂在降解酰胺类除草剂敌稗中的应用。

4.特异性降解敌稗的酰胺酶基因，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

5.权利要求2所述的酰胺酶基因编码的酰胺酶蛋白质，其特征在于氨基酸序列为：SEQID NO.2。

6.含权利要求4所述的酰胺酶基因的重组质粒。

7.含权利要求4所述的酰胺酶基因或含权利要求6所述的重组质粒的基因工程菌。

8.权利要求4所述的酰胺酶基因在降解土壤、水体或农作物的敌稗残留方面的应用；优选在去除土壤、水体或农作物中的敌稗残留方面的基因工程应用。

9.权利要求4所述的酰胺酶基因在抗敌稗除草剂转基因作物培育中的应用。

10.权利要求5所述的酰胺酶蛋白质在去除农作物、土壤、水体的敌稗残留方面的应用。