CN101938897B

CN101938897B - 改良植物的多核苷酸和方法

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Publication number: CN101938897B
Application number: CN200880125634.2A
Authority: CN
Inventors: 萨特希施·普特希格; 乔纳森·罗伯特·菲利普斯; 克劳蒂亚·珍妮特·斯密斯-埃斯皮诺萨; 凯瑟琳·简·布赖恩特; 希尔兰·迈克尔·埃尔博拉夫; 玛格丽特·比斯瓦斯
Original assignee: Fonterra Cooperative Group Ltd
Current assignee: Vision Genomics Ltd
Priority date: 2007-11-27
Filing date: 2008-11-26
Publication date: 2015-05-27
Anticipated expiration: 2028-11-26
Also published as: MX2010005716A; AR069441A1; AU2008330292A1; US8227665B2; BRPI0819610A2; NZ585431A; CA2706184A1; CN101938897A; WO2009070038A2; US20090229009A1; WO2009070038A3; EP2219434A2; ZA201004974B; US20120260369A1; AU2008330292B2; EP2219434A4; MY157117A; US20160017357A1

Abstract

本发明提供了产生具有改变的生物量的植物的方法和组合物，该方法包括改变植物细胞或植物中包含SEQ ID NO：1的序列的多肽或其变体的表达和/或活性的步骤。本发明还提供了包含SEQ ID NO：1的序列的多肽及该序列变体片段。本发明还提供了编码这类多肽序列的多核苷酸。本发明还提供了包含这类多核苷酸的构建体、细胞和植物。

Description

改良植物的多核苷酸和方法

技术领域

本发明涉及产生具有增加的生物量的植物的组合物和方法。

背景技术

随着世界人口的增长，农业研究的一个主要目标是改良作物和饲用植物物种的生物量产量。

直到最近，这样的改良依赖为所期望特性对植物选择性育种。但是对于很多植物来说，子代中产生的异源遗传互补不引起与其亲代中一样的期望性状，因此限制了选择性育种方法的有效性。

如今分子生物学的进展使得可以对植物和动物的种质进行遗传操作。植物的遗传工程包括分离并操作遗传材料以及后续的将该材料导入植物。这种技术已经引起能够表达药物和其它化学物的植物的开发、具有增强的害虫抗性、增强的压力耐受的植物的开发和表达其它有益性状的植物的开发。

尽管本领域已知可以应用某些生长因子来增加植物大小，但是这些生长因子的应用是高成本且耗时的。因此亟需相对于它们的栽培对应物具有增加的生物量的植物。

本发明的目标是提供开发具有改变的生物量的植物品种的改良的组合物和/或方法，或至少为公众提供有用的选择。

发明概述

在第一方面，本发明提供了产生具有改变的生物量的植物的方法，该方法包括使用下列多核苷酸来转化植物：

a)包含编码具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽或该多肽变体的序列的多核苷酸；或

b)包含a)中的多核苷酸的长度为至少15个核苷酸的片段的多核苷酸，或

c)包含a)中的多核苷酸的长度为至少15个核苷酸的互补物的多核苷酸；或

d)包含能够在严紧条件下与a)中的多核苷酸杂交的长度为至少15个核苷酸的序列的多核苷酸。

优选地，多核苷酸被包含为遗传构建体的部分。

在一实施方式中，变体与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽具有至少70％的序列同一性。

在另一实施方式中，变体包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。

在另一实施方式中，变体源自植物物种并且包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。

在另一实施方式中，变体源自双子叶植物物种并且包含SEQ IDNO：21的氨基酸序列。

优选地，变体能够调节植物的生物量。

在另一实施方式中，a)中的多核苷酸编码具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽。

优选地，该多核苷酸在植物中的表达导致植物中能够调节生物量产生的内源多核苷酸/多肽的下调。

优选地，减少的表达受反义抑制、正义抑制或RNA干扰的影响。

优选地，产生的植物相对于合适对照植物具有增加的生物量。

在另一方面，本发明提供了产生具有增加的生物量的植物的方法，该方法包括使用与编码具有SEQ ID NO：1的序列的多肽或其变体的内源核酸具有足够序列相似性的多核苷酸来转化植物，以致该多核苷酸的表达导致所述内源核酸表达的抑制。

优选地，多核苷酸被包含为遗传构建体的部分。

在另一实施方式中，变体包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。

优选地，变体能够调节植物的生物量。

在另一实施方式中，多肽具有SEQ ID NO：1的序列。

在另一方面，本发明提供了产生具有改变的生物量的植物的方法，该方法包括转化植物细胞或植物，所述转化使用：

a)包含SEQ ID NO：10的核苷酸序列的多核苷酸或其变体；或

b)包含a)中的多核苷酸的长度为至少15个核苷酸的片段的多核苷酸；或

优选地，多核苷酸被包含为遗传构建体的部分。

优选地，变体编码能够调节植物生物量的多肽。

在一实施方式中，a)中的多核苷酸包含SEQ ID NO：10的序列。

优选地，下调受反义抑制、正义抑制或RNA干扰的影响。

优选地，通过本发明的方法产生的植物相对于合适对照植物具有增加的生物量。

在另一方面，本发明提供了产生具有增加的生物量的植物的方法，该方法包括使用与具有SEQ ID NO：10的序列的内源核酸或其变体具有足够序列相似性的多核苷酸来转化植物，以致该多核苷酸的表达导致所述内源核酸表达的抑制。

优选地，多核苷酸被包含为遗传构建体的部分。

在一实施方式中，变体与SEQ ID NO：10的全长编码序列具有至少70％的序列同一性。

在另一实施方式中，变体编码包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的多肽。

在另一实施方式中，变体源自植物物种并且编码包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的多肽。

在另一实施方式中，变体源自双子叶植物物种并且编码包含SEQID NO：21的氨基酸序列的多肽。

优选地，变体编码能够调节植物生物量的多肽。

在另一实施方式中，内源核酸包含SEQ ID NO：10的全长编码序列。

在另一方面，本发明提供了产生具有改变的生物量的植物细胞或植物的方法，该方法包括减少包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其变体的多肽的表达或活性。

在另一实施方式中，变体包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。

在另一实施方式中，多肽具有SEQ ID NO：1的序列。

在另一方面，本发明提供了产生具有改变的生物量的植物的方法，该方法包括减少包含SEQ ID NO：20的序列的多肽在植物细胞或植物中的表达或活性的步骤。

在一实施方式中，多肽包含SEQ ID NO：21的序列。

在另一实施方式中，多肽包含与SEQ ID NO：1的序列具有至少70％同一性的序列。

在另一实施方式中，多肽包含SEQ ID NO：1的序列。

在另一实施方式中，将能够在严紧条件下与编码多肽的内源核酸杂交的多核苷酸导入植物细胞或植物以实现该多肽的减少的表达。

在另一实施方式中，内源核酸包含与SEQ ID NO：10的全长编码序列具有至少70％同一性的序列。

在另一实施方式中，多核苷酸包含与SEQ ID NO：10的序列具有至少70％同一性的序列的至少15个相邻核苷酸。

在另一实施方式中，多核苷酸包含SEQ ID NO：10的至少15个相邻核苷酸。

在另一方面，本发明提供了通过本发明的方法产生的植物细胞或植物。

优选地，通过本发明的方法产生的植物相对于合适对照植物具有增加的生物量产生。

优选地，通过本发明的方法产生的植物相对于合适对照植物具有数量增加的分蘖。

在另一方面，本发明提供了分离的多核苷酸，其与编码包含SEQID NO：1的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列具有至少71％的序列同一性。

优选地，多核苷酸编码能够调节植物生物量的多肽。

在一实施方式中，多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在另一实施方式中，核苷酸序列包含SEQ ID NO：10的序列。

在另一实施方式中，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：10的全长编码序列。

在另一方面，本发明提供了分离的多核苷酸，其编码包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列的多肽。

在一实施方式中，多核苷酸包含SEQ ID NO：10的序列。

在另一实施方式中，多核苷酸包含SEQ ID NO：10的全长编码序列。

在另一方面，本发明提供了包含SEQ ID NO：10的全长编码序列或其变体的分离的多核苷酸，其中该变体源自黑麦草或羊茅并且编码能够调节植物生物量的多肽。

在一实施方式中，分离的多核苷酸包含SEQ ID NO：10的序列。

在另一方面，本发明提供了分离的多肽，其与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，其中该多肽能够调节植物生物量。

在一实施方式中，分离的多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了编码本发明多肽的分离的多核苷酸。

在另一方面，本发明提供了分离的多核苷酸，包含：

a)包含本发明的多核苷酸的长度为至少15个核苷酸的片段的多核苷酸；或

b)包含本发明的多核苷酸的长度为至少15个核苷酸的互补物的多核苷酸；或

c)包含能够与本发明的多核苷酸杂交的长度为至少15个核苷酸的序列的多核苷酸。

在另一方面，本发明提供了包含本发明的多核苷酸的遗传构建体。

在一实施方式中，遗传构建体是表达构建体。

在另一方面，本发明提供了包含本发明的表达构建体或遗传构建体的载体。

在另一方面，本发明提供了经遗传修饰以表达本发明的多核苷酸或本发明的多肽的宿主细胞。

在另一方面，本发明提供了包含本发明的表达构建体或遗传构建体的宿主细胞。

在另一方面，本发明提供了经遗传修饰以表达本发明的多核苷酸或本发明的多肽的植物细胞。

在另一方面，本发明提供了包含本发明的表达构建体或遗传构建体的植物细胞。

优选地，表达构建体能够表达多核苷酸，从而导致能够调节植物生物量产生的内源多核苷酸/多肽的表达的抑制。

在另一方面，本发明提供了包含本发明的植物细胞的植物。

在另一方面，本发明提供了选择具有改变的生物量的植物的方法，该方法包括测试植物的本发明的多核苷酸的改变的表达。

在另一方面，本发明提供了选择具有改变的生物量的植物的方法，该方法包括测试植物的本发明的多肽的改变的表达。

在另一方面，本发明提供了根据本发明的方法产生的植物细胞或植物。

在另一方面，本发明提供了根据本发明的方法选择的植物。

在另一方面，本发明提供了针对本发明的多肽产生的抗体。

本发明的多核苷酸和多核苷酸变体可以源自任何物种和/或可以通过重组或合成产生。

在一实施方式中，多核苷酸或变体源自植物物种。

在另一实施方式中，多核苷酸或变体源自裸子植物物种。

在另一实施方式中，多核苷酸或变体源自被子植物物种。

在另一实施方式中，多核苷酸或变体源自双子叶植物物种。

在另一实施方式中，多核苷酸或变体源自单子叶植物物种。

本发明的多肽和多肽变体可以源自任何物种和/或可以通过重组或合成产生。

在一实施方式中，多肽或变体源自植物物种。

在另一实施方式中，多肽或变体源自裸子植物物种。

在另一实施方式中，多肽或变体源自被子植物物种。

在另一实施方式中，多肽或变体源自双子叶植物物种。

在另一实施方式中，多肽或变体源自单子叶植物物种。

植物细胞或植物可以源自任何植物物种。

在另一实施方式中，植物细胞或植物源自裸子植物物种。

在另一实施方式中，植物细胞或植物源自被子植物物种。

在另一实施方式中，植物细胞或植物源自双子叶植物物种。

在另一实施方式中，植物细胞或植物源自单子叶植物物种。

优选的双子叶植物的属包括：桃属(Amygdalus)、腰果属(Anacardium)、落花生属(Arachis)、芸苔属(Brassica)、木豆属(Cajanus)、大麻属(Cannabis)、红花属(Carthamus)、山核桃属(Carya)、木棉属(Ceiba)、鹰咀豆属(Cicer)、椰子属(Cocos)、芫荽属(Coriandrum)、小冠花属(Coronilla)、棉属(Cossypium)、野百合属(Crotalaria)、扁豆属(Dolichos)、油棕属(Elaeis)、大豆属(lycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)、山黧豆属(Lathyrus)、兵豆属(Lens)、胡枝子属(Lespedeza)、亚麻属(Linum)、百脉根属(Lotus)、羽扇豆属(Lupinus)、澳洲坚果属(Macadamia)、苜蓿属(Medicago)、草木犀属(Melilotus)、黎豆属(Mucuna)、木犀榄属(Olea)、红豆草属(Onobrychis)、乌足豆属(Ornithopus)、罂粟属(Papaver)、菜豆属(Phaseolus)、刺葵属(Phoenix)、黄连木属(Pistacia)、豌豆属(Pisum)、樱桃属(Prunus)、葛属(Pueraria)、茶藨子属(Ribes)、蓖麻属(Ricinus)、胡麻属(Sesamum)、可可属(Theobroma)、车轴草属(Trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、蚕豆属(Vicia)和豇豆属(Vigna)。

优选的双子叶植物的种包括：扁桃(Amygdalus communis)、腰果(Anacardium occidentale)、花生(Arachis hypogaea)、花生(Arachishypogea)、甘蓝型油菜(Brassica napus Rape)、黑芥(Brassica nigra)、白菜(Brassica campestris)、木豆(Cajanus cajan)、印度木豆(Cajanusindicus)、大麻(Cannabis sativa)、红花(Carthamus tinctorius)、美国山核桃(Carya illinoinensis)、爪哇木棉(Ceiba pentandra)、鹰嘴豆(Cicerarietinum)、椰子(Cocos nucifera)、芫荽(Coriandrum sativum)、绣球小冠花(Coronilla varia)、棉花(Cossypiumhirsutum)、菽麻(Crotalariajuncea)、扁豆(Dolichos lablab)、油棕(Elaeis guineensis)、亚洲棉(Gossypium arboreum)、中国棉(Gossypium nanking)、海岛棉(Gossypiumbarbadense)、草棉(Gossypium herbaceum)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)、大豆(Glycine max)、野大豆(Glycine ussuriensis)、宽叶蔓豆(Glycine gracilis)、向日葵(Helianthus annus)、狭叶羽扇豆(Lupinusangustifolius)、黄羽扇豆(Lupinus luteus)、杂色羽扇豆(Lupinusmutabilis)、野鸡草(Lespedeza sericea)、鸡草眼(Lespedeza striata)、大百脉根(Lotus uliginosus)、山黧豆(Lathyrus sativus)、兵豆(Lensculinaris)、鸡眼草(Lespedeza stipulacea)、亚麻(Linum usitatissimum)、百脉根(Lotus corniculatus)、白羽扇豆(Lupinus albus)、木本苜蓿(Medicago arborea)、黄花苜蓿(Medicago falcate)、南苜蓿(Medicagohispida)、Medicago officinalis、紫花苜蓿(Medicago.sativaAlfalfa)、蒺藜状苜蓿(Medicago tribuloides)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、褐斑苜蓿(Medicago arabica)、白花草木樨(Melilotus albus)、刺毛黧豆(Mucuna pruriens)、油橄榄(Olea europaea)、红豆草(Onobrychisviciifolia)、锯齿草(Ornithopus sativus)、Phaseolus aureus、紫叶李(Prunus cerasifera)、酸樱桃(Prunus cerasus)、多花菜豆(Phaseoluscoccineus)、欧洲李(Prunus domestica)、棉豆(Phaseolus lunatus)、黄果酸樱桃(Prunus.maheleb)、绿豆(Phaseolus mungo)、桃(Prunus. Persica)、樱桃(Prunus.pseudocerasus)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、罂粟(Papaversomniferum)、宽叶菜豆(Phaseolus acutifolius)、海枣(Phoenixdactylifera)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆(Pisum sativum)、扁桃(Prunusamygdalus)、杏(Prunus armeniaca)、野葛(Pueraria thunbergiana)、黑穗醋栗(Ribes nigrum)、红醋栗(Ribes rubrum)、欧洲醋栗(Ribesgrossularia)、篦麻(Ricinus communis)、芝麻(Sesamum indicum)、Trifolium augustifolium、分散三叶草(Trifolium diffusum)、杂三叶草(Trifolium hybridum)、绛三叶(Trifolium incarnatum)、球三叶草(Trifolium ingrescens)、红三叶(Trifolium pratense)、白三叶(Trifoliumrepens)、波斯三叶草(Trifolium resupinatum)、地三叶草(Trifoliumsubterraneum)、可可树(Theobroma cacao)、亚历山大三叶草(Trifoliumalexandrinum)、香豆子(Trigonella foenumgraecum)、窄叶野豌豆(Viciaangustifolia)、深紫花野豌豆(Vicia atropurpurea)、Vicia calcarata、野豌豆(Vicia dasycarpa)、荆豆(Vicia ervilia)、红莓苔子(Vacciniumoxycoccos)、褐毛野豌豆(Viciapannonica)、长豇豆(Vigna sesquipedalis)、豇豆(Vigna sinensis)、长柔毛野豌豆(Vicia villosa)、蚕豆(Vicia faba)、大巢菜(Vicia sative)和小豆(Vigna angularis)。

优选的单子叶植物的属包括：冰草属(Agropyron)、葱属(Allium)、看麦娘属(Alopecurus)、须芒草属(Andropogon)、燕麦草属(Arrhenatherum)、天门冬属(Asparagus)、燕麦属(Avena)、簕竹属(Bambusa)、孔颖草属(Bothrichloa)、格兰马草属(Bouteloua)、雀麦属(Bromus)、沙茅属(Calamovilfa)、蒺藜草属(Cenchrus)、虎尾草属(Chloris)、香茅属(Cymbopogon)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)、双花草属(Dichanthium)、马唐属(Digitaria)、椮属(Eleusine)、画眉草属(Eragrostis)、荞麦属(Fagopyrum)、羊茅属(Festuca)、向日葵属(Helianthus)、大麦属(Hordeum)、毒麦属(Lolium)、芒属(Miscanthis)、奇岗属(Miscanthus xgiganteus)、稻属(Oryza)、黍属(Panicum)、雀稗属(Paspalum)、狼尾草属(Pennisetum)、虉草属(Phalaris)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、甘蔗属(Saccharum)、黑麦属(Secale)、狗尾草属(Setaria)、印第安草属(Sorghastrum)、高粱属(Sorghum)、小麦属(Triticum)、香果兰属(Vanilla)、小黑麦属(X Triticosecale Triticale)和玉蜀黍属(Zea)。

优选的单子叶植物的种包括：扁穗冰草(Agropyron cristatum)、沙生冰草(Agropyron desertorum)、长穗偃麦草(Agropyron elongatum)、中间偃麦草(Agropyron intermedium)、蓝茎冰草(Agropyronsmithii)、丛生小麦草(Agropyron spicatum)、细茎冰草(Agropyron trachycaulum)、毛冰草(Agropyron trichophorum)、火葱(Allium ascalonicum)、洋葱(Alliumcepa)、藠头(Allium chinense)、韭葱(Allium porrum)、北葱(Alliumschoenoprasum)、大葱(Allium fistulosum)、大蒜(Allium.sativum)、草原看麦娘(Alopecurus pratensis)、须芒草(Andropogon gerardi)、大须芒草(Andropogon Gerardii)、小须芒草(Andropogon scoparious)、燕麦草(Arrhenatherum elatius)、石刁柏(Asparagus officinalis)、莜麦(Avenanuda)、燕麦(Avena sativa)、佛肚竹(Bambusa vulgaris)、Bothrichloabarbinodis、白羊草(Bothrichloa ischaemum)、Bothrichloa saccharoides、垂穗草(Bouteloua curipendula)、黑格兰马草(Bouteloua eriopoda)、格兰马草(Bouteloua gracilis)、直立雀麦(Bromus erectus)、无芒雀麦(Bromus inermis)、草地雀麦(Bromus riparius)、沙拂子茅(Calamovilfalongifilia)、纤毛蒺藜草(Cenchrus ciliaris)、非洲虎尾草(Chlorisgayana)、亚香茅(Cymbopogon nardus)、狗牙根(Cynodon dactylon)、鸭茅(Dactylis glomerata)、双花草(Dichanthium annulatum)、毛梗双花草(Dichanthium aristatum)、Dichanthium sericeum、俯仰马唐(Digitariadecumbens)、南非马唐(Digitaria smutsii)、穇子(Eleusine coracan)、窄颖赖草(Elymus angustus)、俄罗斯野麦(Elymus junceus)、弯叶画眉草(Eragrostis curvula)、苔麸(Eragrostis tef)、荞麦(Fagopyrumesculentum)、鞑靼荞麦(Fagopyrum tataricum)、高羊茅(Festucaarundinacea)、羊茅(Festuca ovina)、草甸羊茅(Festuca pratensis)、紫羊茅(Festuca rubra)、葵花(Helianthus annuus sunflower)、二棱大麦(Hordeum distichum)、大麦(Hordeum vulgare)、多花黑麦草(Loliummultiflorum)、黑麦草(Lolium perenn)、芒草(Miscanthis sinensis)、奇岗(Miscanthus x giganteus)、水稻(Oryza sativa)、秫米(Panicum italicium)、大黍(Panicum maximum)、黍(Panicummiliaceum)、紫黍草(Panicumpurpurascens)、柳枝稷(Panicum virgatum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、毛花雀稗(Paspalum dilatatum)、百喜草(Paspalum notatum)、狼尾草(Pennisetum clandestinum)、御谷(Pennisetum glaucum)、象草(Pennisetumpurpureum)、御谷(Pennisetum spicatum)、虉草(Phalaris arundinacea)、梯牧草(Phleum bertolinii)、猫尾草(Phleum pratense)、羊肉草(Poafendleriana)、草地早熟禾(Poa pratensis)、林地早熟禾(Poa nemoralis)、甘蔗(Saccharum officinarum)、大茎野生蔗(Saccharum robustum)、竹蔗(Saccharum sinense)、云南割手密(Saccharum spontaneum)、黑麦(Secalecereale)、非洲狗尾草(Setaria sphacelata)、拟高梁(Sorghastrum nutans)、拟高梁(Sorghastrum nutans)、甜高粱(Sorghum dochna)、假高梁(Sorghum halepense)、苏丹草(Sorghum sudanense)、高梁(Sorghumvulgare)、高梁(Sorghum vulgare)、小麦(Triticum aestivum)、二粒小麦(Triticum dicoccum)、硬粒小麦(Triticum durum)、一粒小麦(Triticummonococcum)、香荚兰(Vanilla fragrans)、小黑麦(X Triticosecale)和玉米(Zea mays)。

优选的植物是饲用植物物种，其来自包括但不限于以下属的组：毒麦属、羊茅属、鸭茅属、雀麦属、车轴草属、苜蓿属、梯牧草属、虉草属、绒毛草属(Holcus)、百脉根属、车前属(Plantago)和菊苣属(Cichorium)。

特别优选的植物来自毒麦属和车轴草属。特别优选的种是黑麦草和白三叶。

特别优选的单子叶植物的种是：黑麦草和水稻。

术语“植物”旨在包括完整植物、植物的任何部分、繁殖体和植物的子代。

术语“繁殖体”意思是可用于再生或繁殖(无论有性的还是无性的)的任何植物部分，包括种子和插条(cutting)。

发明详述

多核苷酸和片段

本文所用的术语“多核苷酸”意思是单链或双链的任何长度的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，但优选为至少15个核苷酸，并且包括(作为非限制性例子)基因的编码和非编码序列、正义和反义序列互补物、外显子、内含子、基因组DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核糖酶、重组多肽、分离的和纯化的天然产生的DNA或RNA序列、合成的RNA和DNA序列、核酸探针、引物和片段。

本文提供的多核苷酸序列的“片段”是能够与目标靶特异性杂交的连续核苷酸的亚序列，例如，长度为至少15个核苷酸的序列。本发明的片段包含本发明的多核苷酸的连续核苷酸的15个核苷酸，优选至少20个核苷酸，更优选至少30个核苷酸，更优选至少50个核苷酸，更优选至少50个核苷酸，最优选至少60个核苷酸。多核苷酸序列的片段可用于反义、基因沉默、三螺旋或核糖酶技术，或作为引物、探针被包括在微阵列内，或用于本发明的基于多核苷酸的选择方法。

术语“引物”是指短的多核苷酸，通常具有自由的3’OH基团，其与模板杂交并用于启动与靶标互补的多核苷酸的聚合。

术语“探针”是指用于在基于杂交的检验中检测与探针互补的多核苷酸序列的短的多核苷酸。探针可以由本文定义的多核苷酸的“片段”组成。

多肽和片段

本文所用的术语“多肽”包括任意长度的氨基酸链，但是优选为至少5个氨基酸，包括全长的蛋白，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。本发明的多肽可以是纯化的天然产物，或者可以部分或全部使用重组或合成技术产生。该术语可以指多肽、多肽的聚集体例如二体或其它多聚体、融合多肽、多肽片段、多肽变体或其衍生物。

多肽的“片段”是多肽的亚序列，其实现生物活性所需要的功能和/或提供多肽的三维结构。该术语可以指能够实现上述酶学活性的多肽、多肽的聚集体例如二体或其它多聚体、融合多肽、多肽片段、多肽变体或其衍生物。

对于本文公开的多核苷酸或多肽的序列所用的术语“分离的”是指脱离其天然细胞环境的序列。分离的分子可以通过任何方法或方法的组合获得，包括生物化学、重组和合成技术。

术语“重组体”是指脱离其天然环境中环绕它的序列的多核苷酸序列，和/或与那些不存在于其天然环境中的序列进行重组的多核苷酸序列。

“重组的”多肽序列通过翻译“重组的”多核苷酸序列而产生。

关于本发明的多核苷酸和多肽的术语“源自”(“源自”特定的属或种)意思是该多核苷酸或多肽与那些在该属或种中天然发现的多核苷酸或多肽具有相同的序列。因此可通过合成或重组产生多核苷酸或多肽，所述多核苷酸或多肽源自属或种。

变体

本文所用的术语“变体”是指与具体指明的序列不同的多核苷酸或多肽的序列，其中删除、替换或添加了一个或多个核苷酸或氨基酸残基。变体可以是天然产生的等位基因变体，或非天然产生的变体。变体可以来自相同的物种或其它物种，可以包括同源物、旁系同源物和直系同源物。在某些实施方式中，本发明的多肽和多核苷酸的变体与本发明的多肽或多核苷酸变体具有相同或相似的生物学活性。提及多肽和多核苷酸时的术语“变体”包括本文定义的所有形式的多肽和多核苷酸。

多核苷酸变体

变体多核苷酸序列相对于指明的多核苷酸序列优选显示出至少50％，更优选至少51％，更优选至少52％，更优选至少53％，更优选至少54％，更优选至少55％，更优选至少56％，更优选至少57％，更优选至少58％，更优选至少59％，更优选至少60％，更优选至少61％，更优选至少62％，更优选至少63％，更优选至少64％，更优选至少65％，更优选至少66％，更优选至少67％，更优选至少68％，更优选至少69％，更优选至少70％，更优选至少71％，更优选至少72％，更优选至少73％，更优选至少74％，更优选至少75％，更优选至少76％，更优选至少77％，更优选至少78％，更优选至少79％，更优选至少80％，更优选至少81％，更优选至少82％，更优选至少83％，更优选至少84％，更优选至少85％，更优选至少86％，更优选至少87％，更优选至少88％，更优选至少89％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的同一性。在指明的多核苷酸序列的至少20个核苷酸位置，优选至少50个核苷酸位置，更优选至少100个核苷酸位置，最优选其全长的比较窗口中找到同一性。

可以根据以下方式确定多核苷酸的序列同一性。使用bl2seq(Tatiana A.Tatusova，Thomas L.Madden(1999)，″Blast 2sequences-anew tool for comparing protein and nucleotide sequences″，FEMSMicrobiol Lett.174：247-250)中的BLASTN(来自程序的BLAST套装软件(the BLAST suite of programs)，版本2.2.5[2002年11月])(其可以公开地从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)获得)将主题多核苷酸序列与候选多核苷酸序列进行比较。使用bl2seq的缺省参数，只是需要关闭低复杂性部分的滤除。

可以使用以下的unix命令行参数测定多核苷酸序列的同一性：

bl2seq-i nucleotideseq 1-j nucleotideseq2-F F-p blastn

参数-F F关闭低复杂性部分的滤除。参数-p为序列对选择合适的算法。bl2seq程序在行“同一性＝”中以相同核苷酸的数字和百分率报告序列同一性。

也可以使用全域序列比对程序(例如Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453)在候选和主题多核苷酸序列之间的重叠的全长上计算多核苷酸的序列同一性。可以在EMBOSS程序包(Rice，P.Longden，I.和Bleasby，A.EMBOSS：The European MolecularBiology Open Software Suite，Trends in Genetics June 2000，vol 16，No 6.pp.276-277；其可以从http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/获得)的needle程序中找到Needleman-Wunsch全域比对算法的完全应用。欧洲生物信息学研究所服务器也提供工具而在http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/上在线进行两个序列之间的EMBOSS-needle全域比对。

或者可以使用GAP程序，其计算两个序列的最佳全域比对而无处罚末端空隙。在以下文章中描述了GAP：Huang，X.(1994)On GlobalSequence Alignment.Computer Applications in the Biosciences 10，227-235。

如上所述的BLASTN的使用优选地用于确定本发明的多核苷酸变体的序列同一性。

本发明的多核苷酸变体还包括那些与一个或多个具体指明的序列显示相似性的序列，其可能保留那些序列的功能等同性，并且不能合理地被预计通过随机的机会产生。这样的关于多肽的序列相似性可以使用从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)来自程序的BLAST套装软件(版本2.2.5[2002年11月])公开获得的bl2seq程序来确定。

可以使用以下的unix命令行参数测定多核苷酸序列的相似性：

bl2seq-i nucleotideseq 1-j nucleotideseq2-F F-p tblastx

参数-F F关闭低复杂性部分的滤除。参数-p为序列对选择合适的算法。该程序在序列间找到相似性区，对于每个这样的区域报告一个“E值”，E值是在含有随机序列的固定参考大小的数据库中可以预期随机见到这样的匹配的预期次数。该数据库的大小在bl2seq程序中设定为缺省值。对于小的E值(远小于1)，E值大约是这样的随机匹配发生的概率。

当与任何一个具体指明的序列相比时，变体多核苷酸序列优选显示出1×10^-10以下，更优选1×10^-20以下，更优选1×10^-30以下，更优选1×10^-40以下，更优选1×10^-50以下，更优选1×10^-60以下，更优选1×10^-70以下，更优选1×10^-80以下，更优选1×10^-90以下，最优选1×10^-100以下的E值。

或者，本发明的变体多核苷酸在严谨条件下与指明的多核苷酸序列或其互补物杂交。

术语“在严谨条件下杂交”及其语法等同物是指在确定的温度和盐浓度的条件下，多核苷酸分子与靶多核苷酸分子(例如固定于DNA或RNA印迹例如Southern印迹或Northern印迹上的靶多核苷酸分子)杂交的能力。可以通过最初在低严谨条件下杂交然后将严谨度增加至需要的严谨度来确定在严谨杂交条件下的杂交能力。

对于长度为大约100个碱基以上的多核苷酸分子，通常的严谨杂交条件为不低于原态双链的熔解温度(Tm)的25℃至30℃(例如，10℃)以下(一般性参见，Sambrook等人，Eds，1987，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2nd Ed.Cold Spring Harbor Press；Ausubel等人，1987，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing)。对于大约100个碱基以上的多核苷酸分子，其Tm值可以根据公式Tm＝81.5+0.41％(G+C-log(Na+).(Sambrook等人，Eds，1987，MolecularCloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.Cold Spring Harbor Press；Boltonand McCarthy，1962，PNAS 84：1390)计算。对于长度为100个碱基以上的多核苷酸，通常的严谨条件为下列的杂交条件：例如在6×SSC，0.2％SDS的溶液中预先洗涤；在65℃，6×SSC，0.2％SDS中杂交过夜；然后在65℃，1×SSC，0.1％SDS中洗涤两次，每次30分钟，然后在65℃，0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤两次，每次30分钟。

对于长度为100个碱基以下的多核苷酸分子，示例性的严谨杂交条件为Tm以下5℃至10℃。平均来讲，长度为100bp以下的多核苷酸分子的Tm大约下降(500/寡核苷酸长度)℃。

对于被称作肽核酸(PNA)的DNA类似物(Nielsen等人，Science.1991Dec 6；254(5037)：1497-500)，其Tm值比DNA-DNA或DNA-RNA杂交体的要高，可以使用根据Giesen等人，Nucleic Acids Res.1998Nov1；26(21)：5004-6描述的公式计算。具有100个碱基以下长度的DNA-PNA杂交体的示例性的严谨杂交条件为Tm以下5℃至10℃。

本发明的变体多核苷酸还包括这样的多核苷酸：其与本发明的序列不同，但是由于遗传密码的简并性的结果，其编码与本发明的多核苷酸编码的多肽具有相似活性的多肽。不改变多肽的氨基酸序列的序列改变是“沉默变异”。除了ATG(蛋氨酸)和TGG(色氨酸)之外，可以通过本领域承认的技术改变同一个氨基酸的其它密码子，例如为了在特定宿主生物中使密码子的表达最优化。

本发明还包括在编码的多肽序列中引起一个或几个氨基酸的保守性替换而不显著改变其生物学活性的多核苷酸序列的改变。本领域技术人员将知道进行表型沉默氨基酸替换的方法(参见，例如Bowie等人，1990，Science 247，1306)。

可以使用从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)公开获得的来自程序的BLAST套装软件(版本2.2.5[2002年11月])的bl2seq程序通过如上所述的tblastx算法来确定由于编码的多肽序列中的沉默变异和保守性替换而产生的变体多核苷酸。

多肽变体

提及多肽时的术语“变体”包括天然产生的、重组的和合成产生的多肽。变体多肽序列相对于本发明的序列优选显示出至少50％，更优选至少51％，更优选至少52％，更优选至少53％，更优选至少54％，更优选至少55％，更优选至少56％，更优选至少57％，更优选至少58％，更优选至少59％，更优选至少60％，更优选至少61％，更优选至少62％，更优选至少63％，更优选至少64％，更优选至少65％，更优选至少66％，更优选至少67％，更优选至少68％，更优选至少69％，更优选至少70％，更优选至少71％，更优选至少72％，更优选至少73％，更优选至少74％，更优选至少75％，更优选至少76％，更优选至少％，更优选至少77％，更优选至少78％，更优选至少79％，更优选至少80％，更优选至少81％，更优选至少82％，更优选至少83％，更优选至少84％，更优选至少85％，更优选至少86％，更优选至少87％，更优选至少88％，更优选至少89％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的同一性。在本发明的多肽的至少20个氨基酸位置，优选至少50个氨基酸位置，更优选至少100个氨基酸位置，最优选其全长的比较窗口中找到同一性。

可以根据以下方式确定多肽的序列同一性。使用bl2seq中的BLASTP(来自程序的BLAST套装软件，版本2.2.5[2002年11月])(其可以公开地从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)获得)将主题多肽序列与候选多肽序列进行比较。使用bl2seq的缺省参数，只是需要关闭低复杂性区的滤除。

也可以使用全域序列比对程序在候选和主题多核苷酸序列之间的重叠的全长上计算多肽的序列同一性。如上文讨论的EMBOSS-needle(可以从http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/获得)和GAP(Huang，X.(1994)On Global Sequence Alignment.Computer Applications in theBiosciences 10，227-235)也是合适的用于计算多肽的序列同一性的全域序列比对程序。

上面描述的BLASTP用途优选用于确定根据本发明的多肽变体。

本发明的多肽变体还包括那些与一个或多个具体指明的序列显示相似性的序列，其可能保留那些序列的功能等同性，并且不能合理地被预计通过随机的机会产生。这样的关于多肽的序列相似性可以使用从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)公开获得的来自程序的BLAST套装软件(版本2.2.5[2002年11月])的bl2seq程序来确定。可以使用以下的unix命令行参数测定多肽序列的相似性：

bl2seq-i peptideseq 1-j peptideseq2-F F-p blastp

当与任何一个具体指明的序列相比时，变体多肽序列优选显示出1×10^-10以下，更优选1×10^-20以下，更优选1×10^-30以下，更优选1×10^-40以下，更优选1×10^-50以下，更优选1×10^-60以下，更优选1×10^-70以下，更优选1×10^-80以下，更优选1×10^-90以下，以及最优选1×10^-100以下的E值。

参数-F F关闭低复杂性部分的滤除。参数-p为序列对选择合适的算法。该程序在序列间找到相似性区，对于每个这样的区域报告一个“E值”，E值是在含有随机序列的固定参考大小的数据库中可以预期随机见到这样的匹配的预期次数。对于小的E值(远小于1)，E值大约是这样的随机匹配发生的概率。

本发明还包括所描述的多肽序列的一个或几个氨基酸的保守性替换(而不显著改变其生物学活性)。本领域技术人员将知道进行表型沉默氨基酸替换的方法(参见，例如Bowie等人，1990，Science 247，1306)。构建体、载体及其成分

术语“遗传构建体”是指这样的多核苷酸分子，其通常为双链DNA，其中可以插入另一个多核苷酸分子(插入的多核苷酸分子)例如但不限于，cDNA分子。遗传构建体可以含有允许插入的多核苷酸分子转录的，以及可选的将转录本翻译成多肽的必需元件。插入的多核苷酸分子可以源自宿主细胞，或者可以源自不同的细胞或生物和/或可以是重组的多核苷酸。一旦进入宿主细胞，遗传构建体可以整合进入宿主的染色体DNA。遗传构建体可以与载体相连。

术语“载体”是指这样的多核苷酸分子，其通常为双链DNA，用于将遗传构建体运送至宿主细胞。载体能够在至少一个另外的宿主系统例如大肠杆菌(E.coli)中复制。

术语“表达构建体”是指包括允许插入的多核苷酸分子转录的，以及可选的将转录本翻译成多肽的必需元件的遗传构建体。表达构建体通常以5’至3’方向包含：

a)在构建体转化进入的宿主细胞中有功能的启动子；

b)要表达的多核苷酸；和

c)在构建体转化进入的宿主细胞中有功能的终止子。

术语“编码区域”或“开放读码框”(ORF)是指基因组DNA序列或cDNA序列的正义链，其能够在合适的调控序列的控制下产生转录产物和/或多肽。编码序列由5’翻译起始密码子和3’翻译终止密码子的存在而鉴别。当插入遗传构建体中时，当“编码序列”与启动子和终止子序列可操作地连接时，“编码序列”能够表达。

“可操作地连接”意思是要表达的序列置于调控元件(包括启动子、组织特异性调控元件、时间调控元件、增强子、抑制子和终止子)的控制之下。

术语“非编码区域”是指在翻译起始位点上游和翻译终止位点下游的非翻译序列。这些序列也被分别称为5’UTR和3’UTR。这些区域包括转录起始和终止以及调节翻译效率所需的元件。

终止子是终止转录的序列，存在于基因的3’非翻译末端，被翻译的序列的下游。终止子是mRNA稳定性的重要决定者，在一些情况下，发现终止子具有空间调控功能。

术语“启动子”是指调节基因转录的位于编码区域上游的非转录顺式调控元件。启动子包含顺式起始元件(其指明转录的起始位点)和保守性的盒例如TATA盒，以及被转录因子结合的基序。

“转基因”是从一个生物中取出并通过转化被导入一个不同生物的多核苷酸。转基因可以源自相同的物种或来自与转基因所导入的生物的物种不同的物种。

“反向重复”是重复序列，其中重复的后一半在互补链中，例如

(5’)GATCTA.......TAGATC(3’)

(3’)CTAGAT.......ATCTAG(5’)

通读转录将产生这样的转录本，其进行互补性碱基配对以形成发夹结构，只要在重复区域之间有3-5pb的间隔子。

“转基因植物”是指由于遗传操作或转化的结果而含有新的遗传材料的植物。新的遗传材料可以源自于得到的转基因植物相同的物种或来自不同物种。

术语“改变本发明的多核苷酸或多肽的表达”和“本发明的多核苷酸或多肽的改变的表达”包括这样的情况：对应于本发明的多核苷酸的基因组DNA被修饰，因而引起本发明的多核苷酸或多肽的改变的表达。可以通过遗传转化或本领域已知的用于诱导突变的其它方法进行基因组DNA的修饰。“改变的表达”可以与信使RNA和/或产生的多肽的量的增加或减少相关，也可以由于产生的多核苷酸和多肽的序列改变而引起多肽的活性改变。

术语“生物量”是指处于特定年龄或发育阶段的植物的营养器官的大小和/或质量和/或数目。因此，相对于相同年龄或等同发育阶段的合适对照植物来说，具有增加的生物量的植物具有增加的营养器官的大小和/或质量和/或数目。相反地，具有减少的生物量的植物与合适对照相比，具有减少的营养器官的大小和/或质量和/或数目。改变的生物量还可以包括相对于合适对照，在植物生命周期的某些或全部时期中营养器官的生长速率和/或营养器官的形成速率的改变。因此，改变的生物量可以导致这类植物到达某发育阶段所耗时间的提前或延缓。

合适对照植物可以包括相同物种和品种的非转化植物，或以对照构建体转化的相同的物种和品种的植物。

本发明提供了产生和/或选择相对于合适对照植物来说具有改变的生物量的植物的方法，包括具有增加的和减少的生物量的植物以及通过这样的方法产生的植物。

本发明提供了编码调节植物中生物量的多肽(SEQ ID NO：1)的多核苷酸(SEQ ID NO：10)。本发明提供了编码SEQ ID NO：1的多肽变体(SEQ ID NOs：2-9)的SEQ ID NO：10的多核苷酸变体(SEQ ID NO：11-18)。本申请人还鉴定了如SEQ ID NO：20所示的、存在于SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：1的全部多肽变体中的共有多肽序列基序，以及存在于SEQ ID NO：1(ORF54)及其源自双子叶植物的全部多肽变体中的另一共有基序(SEQ ID NO：21)。

分离多核苷酸的方法

可以使用本领域技术人员已知的各种技术分离本发明的多核苷酸分子。举例来说，可以通过使用Mullis等人，Eds.1994The PolymeraseChain Reaction，Birkhauser(通过引用并入本文)中描述的聚合酶链式反应(PCR)分离这样的多肽。可以使用本文定义的源自本发明的多核苷酸序列的引物扩增本发明的多肽。

分离本发明的多核苷酸或可用于本发明的方法的多核苷酸的其它方法包括使用全部或部分的本文列出的作为杂交探针的多核苷酸。将标记的多核苷酸探针与固定于固体支持物(例如硝酸纤维素膜或尼龙膜)上的多核苷酸杂交的技术可用于筛选基因组或cDNA库。示例性的杂交和洗涤条件为：于65℃在5.0×SSC，0.5％十二烷基硫酸钠，1×Denhardt′s溶液中杂交20小时；在1.0×SSC，1％(w/v)十二烷基硫酸钠中洗涤(三次，每次在55℃洗涤20分钟)，可选地在60℃，0.5×SSC，1％(w/v)十二烷基硫酸钠中洗涤1次(20分钟)。可选地，可以在60℃，0.1×SSC，1％(w/v)十二烷基硫酸钠的条件下再洗涤一次(20分钟)。

可以通过本领域熟知的技术产生本发明的多核苷酸片段，例如限制性内切酶消化和寡核苷酸合成。

多核苷酸序列的一部分可用于本领域熟知的方法以鉴定相应的全长多核苷酸序列。这样的方法包括基于PCR的方法，5’RACE(FrohmanMA，1993，Methods Enzymol.218：340-56)和基于杂交的方法，基于计算机/数据库的方法。另外，举例来说，反向PCR允许获得从基于已知区域的引物开始，本文公开的多核苷酸序列侧翼的未知序列(Triglia等人，1998，Nucleic Acids Res 16，8186，通过引用并入本文)。该方法使用几个限制性酶以在基因的已知区域产生合适的片段。然后该片段通过分子内的连接而环化并用作PCR的模板。从已知的区域设计分散引物(divergent primer)。为了物理组合全长克隆，可以使用标准分子生物学方法(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndEd.Cold Spring Harbor Press，1987)。

当从特定物种产生转基因植物时，以序列或源自该物种的序列转化这样的植物可能是有益的。该益处可以缓解公众对于跨物种转化而产生转基因生物的担心。另外，当某基因的下调是想要的结果时，可能需要使用与植物(希望其中的表达降低)中的序列相同(或至少高度相似)的序列。由于这些原因(除了其它的之外)，所以需要能够鉴定并分离几个不同植物物种中特定基因的直系同源物。可以通过所描述的方法鉴定变体(包括直系同源物)。

鉴定变体的方法

物理方法

可以使用基于PCR的方法鉴定变体多核苷酸(Mullis等人，Eds.1994The Polymerase Chain Reaction，Birkhauser)。通常，用于通过PCR扩增变体多核苷酸分子的引物的多核苷酸序列可以基于编码相应氨基酸序列的保守性区域的序列。

或者，可以使用本领域技术人员会知道的库筛选方法(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.Cold SpringHarbor Press，1987)。当鉴定探针序列的变体时，杂交和/或洗涤的严紧条件通常比寻找完整序列匹配时要低。

可以通过物理方法鉴定本发明的多肽变体，例如通过使用针对本发明多肽产生的抗体来筛选表达库(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.Cold Spring Harbor Press，1987)或通过这样的抗体的帮助从天然来源鉴定多肽。

基于计算机的方法

还可以使用公共的结构域序列比对算法和序列相似性搜索工具(以搜索序列数据库)(公共的结构域数据库包括Genbank，EMBL，Swiss-Prot，PIR和其它)通过本领域技术人员熟知的基于计算机的方法来鉴定包含多核苷酸和多肽变体的本发明的变体序列。参见例如Nucleic Acids Res.29：1-10and 11-16，2001，例如在线来源。相似性搜索检索并比对靶序列以与待分析的序列(即待查询序列)进行比较。序列对比算法使用得分阵距以分配给每个比对一个总体分值。

用于在序列数据库中鉴定变体的示例性的程序家族为程序的BLAST套装软件(版本2.2.5[2002年11月])包括BLASTN，BLASTP，BLASTX，tBLASTN和tBLASTX，可以从(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)或从National Center for Biotechnology Information(NCBI)，NationalLibrary of Medicine，Building 38A，Room 8N805，Bethesda，MD 20894USA公开地获得。NCBI服务器还提供使用程序筛选一些可公开获得的序列数据库的工具。BLASTN比较待查询核苷酸序列和数据库核苷酸序列。BLASTP比较待查询氨基酸序列和数据库蛋白序列。BLASTX比较以所有读码框翻译的待查询核苷酸序列和数据库蛋白序列。tBLASTN比较待查询蛋白序列和以所有读码框动态翻译的数据库核苷酸序列。tBLASTX比较待查询核苷酸序列的六框翻译和数据库核苷酸序列的六框翻译。可以以缺省参数使用BLAST程序或者按照需要改变参数以改善筛选。

BLAST家族算法(包括BLASTN，BLASTP和BLASTX)的使用在Altschul等人的论文Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997中有描述。

BLASTN，BLASTP，BLASTX，tBLASTN，tBLASTX或相似算法产生的待查询序列对于一个或多个数据库序列的“命中”比对并鉴定序列的相似部分。命中按照相似度的顺序和序列重叠的长度而排列。对数据库序列的命中一般代表只有待查询序列的序列长度的一部分上重叠。

BLASTN，BLASTP，BLASTX，tBLASTN和tBLASTX算法还产生比对的“预计”值。预计值(E)表示当搜索含有随机连续序列的相同大小的数据库时能够“预计”随机见到的命中的数目。预计值用作显著性临界值以确定对数据库的命中是否表示真实的相似性。例如，分配给多核苷酸命中的E值为0.1被解读为意思是在所筛选的数据库大小的数据库中，可以在具有相似得分的序列比对的部分上能够简单地通过随机预计见到0.1个匹配。对于在比对和匹配部分上具有0.01或更低的E值的序列，使用BLASTN，BLASTP，BLASTX，tBLASTN或tBLASTX算法在该数据库中随机发现匹配的概率是1％或更低。

可以使用CLUSTALW(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.(1994)CLUSTALW：improving the sensitivity of progressivemultiple sequence alignment through sequence weighting，positions-specific gap penalties and weight matrix choice.Nucleic AcidsResearch，22：4673-4680，http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/Top.html)或T-COFFEE(Cedric Notredame，Desmond G.Higgins，Jaap Heringa，T-Coffee：A novel method for fast and accuratemultiple sequence alignment，J.Mol.Biol.(2000)302：205-217))或PILEUP(其使用累进的成对比对)(Feng和Doolittle，1987，J.Mol.Evol.25，351)进行一组相关序列的多重序列比对。

可以获得模式识别软件应用以寻找基序或标志序列。例如，MEME(Multiple Em for Motif Elicitation)在一组序列中寻找基序和标志序列，MAST(Motif Alignment and Search Tool)使用这些基序在待查询序列中鉴定相似或相同的基序。MAST的结果作为一系列的具有合适的统计学数据的比对和所发现的基序的可视概况而提供。MEME和MAST由University of California，San Diego开发。

PROSITE(Bairoch和Bucher，1994，Nucleic Acids Res.22，3583；Hofmann等人，1999，Nucleic Acids Res.27，215)是鉴定从基因组或cDNA序列翻译而来的未鉴定的蛋白的功能的方法。PROSITE数据库(www.expasy.org/prosite)含有生物学显著模式和概述，其被设计为可以使用合适的计算机工具将新的序列分配给已知的蛋白家族或确定在序列中存在何种已知的结构域(Falquet等人，2002，Nucleic Acids Res.30，235)。Prosearch是一种可以按照给定序列模式或标志搜索SWISS-PROT和EMBL数据库的工具。

分离多肽的方法

可以使用本领域熟知的肽合成方法(例如使用固相技术(例如Stewart等人，1969，in Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co，San Francisco California)直接合成肽或自动化合成(例如使用AppliedBiosystems 431A肽合成仪(Foster City，California)))来制备本发明的多肽，包括变体多肽。也可以在这样的合成中产生突变形式的多肽。

还可以使用本领域已知的各种技术(例如Deutscher，1990，Ed，Methods in Enzymology，Vol.182，Guide to Protein Purification)从天然来源纯化本发明的多肽和变体多肽。

或者可以在合适的宿主细胞中重组表达本发明的多肽和变体多肽并按照以下讨论从细胞中分离本发明的多肽和变体多肽。

产生构建体和载体的方法

本发明的遗传构建体包含一个或多个本发明的多核苷酸序列和/或编码本发明的多肽的多核苷酸，可用于转化例如细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物生物。本发明的遗传构建体包括本文定义的表达构建体。

用于产生和使用遗传构建体和载体的方法是本领域熟知的，在Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.ColdSpring Harbor Press，1987；Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing，1987)中有一般性描述。

产生包含构建体和载体的宿主细胞的方法

本发明提供了包含本发明的遗传构建体或载体的宿主细胞。宿主细胞可以源自例如细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物生物。

包含本发明的遗传构建体(例如表达构建体)的宿主细胞可用于本领域熟知的方法(例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd Ed.Cold Spring Harbor Press，1987；Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing，1987)以重组产生本发明的多肽。这样的方法可以包括在合适的培养基中在适合于或有益于表达本发明多肽的条件下培养宿主细胞。然后可以通过本领域熟知的方法(例如Deutscher，Ed，1990，Methods in Enzymology，Vol 182，Guide to Protein Purification)将所表达的重组多肽(其可选地可以被分泌到培养物中)从培养基、宿主细胞或培养基中分离出来。

本发明的宿主细胞还可用于生产由所表达的本发明多肽产生的酶产物的方法。这样的方法可以包括可选地当存在用于所表达的本发明多肽的另外的酶底物时，在适合表达本发明的重组多肽的培养基中培养本发明的宿主细胞。然后可以通过各种本领域标准方法将产生的酶产物从宿主细胞或培养基中分离出来。

产生包含构建体和载体的植物细胞和植物的方法

本发明还提供了包含本发明的遗传构建体的植物细胞和为了改变本发明的多核苷酸或多肽的表达而修饰的植物细胞。包含这样的细胞的植物也构成本发明的一个方面。

可以通过本发明的方法产生具有改变的生物量的植物。这样的方法可以包括以本发明的构建体(其被设计为改变能够调节这样的植物细胞和植物中生物量产生的多核苷酸或多肽的表达)转化植物细胞和植物。这样的方法还包括以本发明的构建体与一种或多种其它构建体(其被设计为改变能够调节这样的植物细胞和植物中生物量产生的一种或多种多核苷酸或多肽的表达)的组合来转化植物细胞和植物。

在Draper等人，1988，Plant Genetic Transformation and GeneExpression.A Laboratory Manual.Blackwell Sci.Pub.Oxford，p.365；Potrykus和Spangenburg，1995，Gene Transfer to Plants.Springer-Verlag，Berlin.；和Gelvin等人，1993，Plant Molecular Biol.Manual.Kluwer Acad.Pub.Dordrecht中描述了以多核苷酸转化植物细胞、植物及其部分的方法。在Galun和Breiman，1997，Transgenic Plants.ImperialCollege Press，London中提供关于转基因植物(包括转化技术)的综述。

遗传操作植物的方法

一些遗传操作植物的策略是可以获得的(例如Birch，1997，AnnRev Plant Phys Plant Mol Biol，48，297)。例如，策略可被设计为在正常表达多核苷酸/多肽的植物细胞、器官和/或特定发育阶段中增加多核苷酸/多肽的表达，或者在不正常表达多核苷酸/多肽的细胞、组织、器官和/或特定发育阶段中异位表达多核苷酸/多肽。所表达的多核苷酸/多肽可以源自待转化的植物物种或者可以源自不同的植物物种。

可以将转化策略设计为在正常表达多核苷酸/多肽的植物细胞、组织、器官或特定发育阶段中减少多核苷酸/多肽的表达。这样的策略被称为基因沉默策略。

转基因植物中用于基因表达的遗传构建体通常包括用于驱动一个或多个克隆的多核苷酸表达的启动子、终止子和检测在转化植物中存在遗传构建体的选择性标记序列。

适合用于本发明的构建体中的启动子在单子叶植物或双子叶植物的细胞、组织或器官中是功能性的，包括细胞、组织和器官特异性的启动子，细胞周期特异性启动子，时间启动子，可诱导启动子，在多数植物组织中有活性的组成性启动子和重组启动子。启动子的选择将取决于所需要的克隆的多核苷酸的时间和空间的表达。启动子可以是那些通常与目标转基因相连的启动子或源自其它植物、病毒和植物病原性细菌和真菌的基因的启动子。本领域技术人员无需经过过量实验即能够选择适合用于使用包含本发明的多核苷酸序列的遗传构建体而改变和调节植物特性的启动子。组成性植物启动子的例子包括CaMV35S启动子，胭脂碱合成酶启动子和章鱼碱合成酶启动子，以及来自玉米的Ubi 1启动子。在科技文献中描述了在特异性组织中有活性的，对内部发育信号或外部非生物或生物的压力有反应的植物启动子。在例如WO 02/00894(通过引用并入本文)中描述了示例性的启动子。

通常用于植物转化遗传构建体的示例性的终止子包括例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S终止子、根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)胭脂碱合成酶或章鱼碱合成酶终止子、玉米(Zea mays)玉米蛋白(zein)基因终止子、水稻(Oryza sativa)ADP-葡萄糖焦磷酸化酶终止子和马铃薯(Solanum tuberosum)PI-II终止子。

通常用于植物转化的选择性标记包括新霉素磷酸转移酶II基因(NPT II)，其赋予卡那霉素抗性；aadA基因，其赋予奇霉素和链霉素抗性；草丁膦乙酰转移酶(bar基因)，其赋予Ignite(AgrEvo)和Basta(Hoechst)抗性；以及潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)，其赋予潮霉素抗性。

还考虑到可用于分析植物和植物组织中的启动子表达的包含报告基因(其编码表达对于宿主来说为外源的活性(通常为酶活性和/或可见信号(例如荧光素酶、GUS、GFP))的序列)的遗传构建体的使用。关于报告基因的文献见综述：Herrera-Estrella等人，1993，Nature 303，209和Schrott，1995，In：Gene Transfer to Plants(Potrykus，T.，Spangenberg.Eds)Springer Verlag.Berline，pp.325-336。

基因沉默策略可聚集在基因本身或影响编码多肽的表达的调控元件。“调控元件”在本文中以最可能宽的意义使用且包括其它的与目标基因相互作用的基因。

设计为减少本发明的多核苷酸/多肽的表达或使其沉默的遗传构建体可以包括本发明的多核苷酸的反义拷贝。在这样的构建体中，多核苷酸被置于相对于启动子和终止子的反义方向。

通过将多核苷酸或多核苷酸的部分倒置而获得“反义”多核苷酸，从而所产生的转录本将与基因的mRNA转录本互补，例如

5’GATCTA 3’(编码链)3’CTAGAT 5’(反义链)

3’CUAGAU 5’mRNA 5’GAUCUCG 3’反义RNA

设计用于基因沉默的遗传构建体还可以包括反向重复。“反向重复”是重复序列，其中重复的后一半在互补链中，例如

5’GATCTA.......TAGATC-3’

3’CTAGAT.......ATCTAG-5’

形成的转录本可以进行互补性碱基配对以形成发夹结构。发夹结构的形成通常需要在重复区域之间有3-5pb的间隔子。

另一个沉默方法包括使用靶向等同于miRNA的转录本的小的反义RNA(Llave等人，2002，Science 297，2053)。也明确考虑到这样的对应于本发明的多核苷酸的小的反义RNA的使用。

本文所用的术语遗传构建体还包括小的反义RNA和其它这样的用于影响基因沉默的多核苷酸。

以本文定义的表达构建体进行转化还可能通过被称为正义抑制的过程引起基因沉默(例如Napoli等人，1990，Plant Cell 2，279；deCarvalho Niebel等人，1995，Plant Cell，7，347)。在一些情况下，正义抑制可以包括全部或部分编码序列的过表达，但还可以包括基因的非编码区域例如内含子或5’或3’非翻译区域(UTR)的表达。可以使用嵌合的部分正义构建体协调地使多个基因沉默(Abbott等人，2002，PlantPhysiol.128(3)：844-53；Jones等人，1998，Planta 204：499-505)。使用这样的正义抑制策略以使本发明的多核苷酸的表达沉默也考虑在内。

设计用于基因沉默的遗传构建体中的多核苷酸插入物可以对应于编码序列和/或非编码序列，例如启动子和/或内含子和/或5’或3’UTR序列，或相应的基因。

其它的基因沉默策略包括显性负性方法和使用核糖酶构建体(McIntyre，1996，Transgenic Res，5，257)。

可以通过基因本身的突变或其调控元件的突变引起转录前沉默。这样的突变可以包括点突变、移框、插入、删除和取代。

以下的代表性文献公开了可以用于遗传转化下列植物物种的遗传转化规程：水稻(Alam等人，1999，Plant Cell Rep.18，572)；玉米(美国专利系列号5,177,010和5,981,840)；小麦(Ortiz等人，1996，Plant CellRep.15，1996，877)；番茄(美国专利系列号5,159,135)；马铃薯(Kumar等人，1996Plant J.9，：821)；木薯(Li等人，1996Nat.Biotechnology 14，736)；莴苣(Michelmore等人，1987，Plant Cell Rep.6，439)；烟草(Horsch等人，1985，Science 227，1229)；棉花(美国专利系列号5,846,797和5,004,863)；草(美国专利号5,187,073，6.020,539)；薄荷(Niu等人，1998，Plant Cell Rep.17，165)；柑橘属植物(Pena等人，1995，Plant Sci.104，183)；香菜(Krens等人，1997，Plant Cell Rep，17，39)；香蕉(美国专利系列号5,792,935)；大豆(美国专利号5,416,011；5,569,834；5,824,877；5,563,04455和5,968,830)；菠萝(美国专利系列号5,952,543)；白杨(美国专利号4,795,855)；一般性单子叶植物(美国专利号5,591,616和6,037,522)；芸苔(美国专利号5,188,958；5,463,174和5,750,871)；苜蓿(Weeks et al.，(2008)Transgenic Research 17：587-597；Samac et al.，(2006)Methods Mol Biol，Vol 343，AgrobacteriumProtocols.2nd edition.Totowa，NJ：Humana Press.p 301-311.)；和谷类(美国专利号6,074,877)。其它的物种也考虑在内，本领域技术人员使用的合适的方法和规程可以在科学文献中获得。

本领域已知的几个其它方法可以用于改变本发明的核苷酸的表达和/或改变本发明的多肽的表达或活性，或者用于本发明的方法中。这样的方法包括但不限于Tilling(Till等人，2003，Methods Mol Biol，2％，205)，所谓的“Deletagene”技术(Li等人，2001，Plant Journal 27(3)，235)以及使用人工转录因子，例如合成的锌指转录因子(例如Jouvenot等人，2003，Gene Therapy 10，513)。还可以在植物中表达另外的靶向特定多肽的抗体或其片段(Jobling等人，2003，Nat.Biotechnol.，21(1)，35)。还可以使用转座子标签方法。可以通过一些技术例如噬菌体展示(DyaxCorporation)来鉴定与本发明的多肽相互作用的其它多肽。这样的相互作用的肽可以在植物中表达或者应用到植物中以影响本发明的多肽的活性。植物抗体(Stoger et al.，Current Opinion in Biotechnology Volume13，Issue 2，2002年4月1日，Pages 161-166；Sudarshana et al.，MethodsMol Biol.2007；354：183-95.)也可以用于调节植物中多肽的表达或活性。被特别考虑在内的是，将以上方法(包括所讨论的沉默方法)中的每一个用于改变本发明的核苷酸的表达和/或本发明的多肽的表达或活性。

选择植物的方法

还提供了选择具有改变的生物量的植物的方法。这样的方法包括测试植物中的本发明的多核苷酸或多肽的表达的改变。这样的方法可用于年幼的年龄或早期发育阶段(当改变的生物量不是必须可见时)以加速朝向改善的生物量的育种程序。

多核苷酸例如信使RNA的表达经常被用作相应的多肽表达的指示。示例性的测定多核苷酸表达的方法包括但不限于Northern分析、RT-PCR和点杂交分析(Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd Ed.Cold Spring Harbor Press，1987)。因此本发明的多核苷酸或多核苷酸的部分可用作如本文定义的用于鉴定具有改变的生物量的植物的方法的探针或引物。本发明的多肽可用作杂交实验中的探针，或基于PCR的实验中的引物，其被设计为鉴定这样的植物。

或者可以产生针对本发明的多肽的抗体。产生和使用抗体的方法在本领域中是标准的(参见例如：Antibodies，A Laboratory Manual，Harlow A Lane，Eds，Cold Spring Harbour Laboratory，1998)。这样的抗体可用于检测调节植物中生物量的多肽的表达的改变的方法。这样的方法可以包括ELISA(Kemeny，1991，A Practical Guide to ELISA，NYPergamon Press)和Western分析(Towbin和Gordon，1994，J ImmunolMethods，72，313)。

这些分析多核苷酸或多肽表达并选择具有改变的表达的植物的方法在被设计为产生具有改变的生物量的品种的常规育种程序中是有用的。

植物

可以种植本发明的植物并且自交或与不同植物株进行杂交，可以鉴定所产生的具有需要的表型特征的杂交体。可以种植两代或两代以上以确保主题表型特征被稳定地保持和遗传。从这样的标准育种方法产生的植物也构成本发明的一个方面。

期望的可以是增加或减少特定植物物种中的生物量。增加的生物量会对例如人食物、饲用和林业作物以及装饰植物是有利的。减少的生物量对于上述情况中的某些也可能是期望的，例如在装饰植物的小型化中。

可以通过本发明的方法改变植物中的生物量。这样的方法可以包括以本发明的构建体(其被设计为改变调节这样的植物细胞和植物中的生物量的多核苷酸或多肽的表达)转化植物细胞和植物。这样的方法还包括以本发明的构建体和一个或多个其它构建体(其被设计为改变调节植物中生物量的一个或多个多核苷酸或多肽的表达)的组合转化植物细胞和植物。

在Boyes DC等人，2001，Plant Cell.13(7)：1499-510；Lancashire P.D等人，1991，Ann.Appl.Biol.119：560-601和下面的实施例1中提供了用于评价本发明的植物中生长速率和生物量的示例性方法。

附图简述

将通过参考附图会更好地理解本发明，其中：

图1显示了以ORF54多肽(SEQ ID NO：1)作为种子序列，对NR-植物数据库(公开日期2005年1月1日)进行BLAST-P搜索的输出总结。

图2显示了多肽(SEQ ID NO：1至9)(包括ORF54及其变体)的PrettyPlot比对。

图3显示了在多肽序列(SEQ ID NO：1至9)中发现的、称为RCC重复的7个重复元件的“T-COFFEE”比对，该比对由本申请人用于鉴定存在于全部序列的每个重复中的共有区域(SEQ ID NO：10)。

图4显示了用于植物转化的载体的图，该载体包含以相对于CaMV35S启动子的反义方向克隆的ORF54。载体的序列示于SEQ ID NO：20中。

图5显示了来自ORF54T0转基因植物的基因组DNA的DNA凝胶印迹分析，其以HindIII消化并以ORF54编码序列的片段探测(probe)，从而确定基因拷贝数并鉴定独立转化事件。

图5a-5e显示了在两个单独试验中观察到的相对于表现最好的野生型对照(日本晴(Nipponbare))的这些ORF54T1植物系的生长参数。其中，图5a是在实验1中测量的植株高度；图5b是在实验1中测量的植物分蘖数目；图5c是超过表现最好的野生型对照(日本晴)分蘖能力的ORF54系中的分蘖数目；图5d是在实验2中测量的植株高度；图5e是来自实验2的分蘖数目。

图6a显示了ORF54植物与野生型对照(日本晴)之间的茎生物量分析。学生t-检验：*1样品与日本晴之间的平均差异是高度显著的(p-0.01)。*2样品与日本晴之间的平均差异是非常高度显著的(p＝0.001)。

图6b显示了超过表现最好的野生型对照(日本晴)的干物质产能的ORF54系的干物质产量。

图7显示了ORF54多肽及其来自单子叶物种的变体的比对。高亮表示在全部序列中完全保守的共有序列基序(SEQ ID NO：20)的位置。

图8显示了ORF54多肽及其来自双子叶物种的变体的比对。高亮表示在全部序列中完全保守的共有序列基序(SEQ ID NO：21)的位置。

图9显示转基因黑麦草系(1V20、1V5、1V1、1V8、1V11、1V3、2V9、2V8、2V5、2V7、2V2、3V5、3V12、3V11、3V10和3V7)相对于非转基因对照系(T40、T41和T101)改变的生物量(以克表示的干重)。柱上的条代表标准偏差。

实施例

现在将通过参考以下非限制性实施例来解释本发明。

实施例1.通过在转基因植物中下调本发明的多核苷酸来增加生物量ORF54

在ViaLactia Biosciences Ltd所有的黑麦草(Lolium perenne)GeneThresher(Orion Genomics)基因组文库中鉴定了编码SEQ ID NO：1的多肽的多核苷酸序列，将其称为ORF54(SEQ ID NO：10)。

ORF54变体

使用ORF54多肽序列(SEQ ID NO：1)作为种子序列以进行对NR-植物数据库(公开日期2005年1月1日)的BLASTP搜索，从而鉴定ORF54的变体。基于本申请人对公众数据库中相关分数值和注解的评价，将小于或等于1e-140的截止(cut-off)值鉴定为区分ORF54变体。BLASTP输出总结示于图1中。

利用EMBOSS工具EMMA(Thompson et al 1994)，对所选择的变体序列进行比对，该EMMA是流行的多重比对程序ClustalW的接口。如图2所示，利用称为prettyplot的另一种EMBOSS工具使比对的序列可视化。

ORF54变体的多肽序列如序列表中SEQ ID NO：2至9所列。对应的多核苷酸序列分别如SEQ ID NO：11至18所列。

多肽序列的分析揭示了每个多肽序列存在7个重复，该重复序列称为RCC重复。利用T-COFFEE比对程序(版本1.37)(Notredame et.al2000，Higgins)对上文的来自全部多肽(SEQ ID NO：1-9)的重复序列进行比对，结果示于图3中。

鉴定了基于并存在于来自ORF54和每个ORF54变体的全部RCC重复的多肽基序，并示于图3中。

包含ORF54的载体

将ORF54多核苷酸序列(SEQ ID NO：10)以反义方向克隆至双35S启动子上游，以下调水稻中ORF54同源物的表达。通过标准分子生物学技术产生包含ORF54的载体。双元载体图示于图4中。载体的序列示于SEQ ID NO：19。

植物转化-水稻

通过电穿孔(den Dulk-Ras A and Hooykaas PJ.)，将纯化的双元载体(SEQ ID NO：19)导入土壤杆菌(Agrobacterium)菌株EHA105，并将悬浮液在26℃下孵育30分钟。将一小等份平板接种于含有100mg/L卡那霉素的AB最小培养基(minimal medium)(Schmidt-Eisenlohr等人1999)。在26℃将平板孵育3天，使用构建体特异性引物测试单克隆中质粒的存在，并确认转化。

使土壤杆菌培养物在26℃下生长于含有100mg/L卡那霉素的AG最小培养基中，200rpm振摇。在5,000rpm沉淀土壤杆菌悬浮液5分钟，在含有1％葡萄糖和3％蔗糖的基础MS培养基(pH为5.2)中洗涤一次，并重悬于含有200μM乙酰丁香酮的相同培养基中至OD6000.6-0.8。

使用含有双元载体ORF54的根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)共培养至少1,000个未成熟水稻(水稻(Oryza sativa))栽培种日本晴胚。在无菌水中洗涤来自水稻的未成熟种子，然后以含有1.25％活性氯的次氯化钠和10μL20进行表面灭菌20分钟。灭菌后，以无菌水将种子洗涤几次，并在无菌滤纸(3M)上吸干。使用一对无菌钳将种子人工去壳，以无菌刀剖开胚。将分离的胚浸没于10mL培养管中的土壤杆菌悬浮液中，在100rpm持续振摇30分钟。排掉多余液体，将胚在无菌滤纸上吸干，然后将其置于含MS培养基(Murashige和Skoog，1964)(添加了3％蔗糖、1％葡萄糖、2mg/L 2，4-D、0.1mg/L BA、400μM乙酰丁香酮)的共培养培养基(pH为5.2)中，暗下培养4天。共培养后，将形成愈伤组织的胚每两周一次在选择性培养基上传代培养，直至达到至少30个显示指示健康出芽的绿色斑点的健康愈伤组织，所述选择培养基由添加了3％蔗糖、1％葡萄糖、2mg/L 2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)、0.1mg/L BA(苄基腺嘌呤)的MS培养基组成，并含有50mg/L潮霉素和300mg/L特美汀TM(替卡西林+克拉维酸)。将含有绿色斑点的愈伤组织转移至不含2，4-D的选择性培养基以再生最少10个转化植株。使再生的植物生根，然后移植到6英寸含有土壤的罐子中，使植物在温室中生长。通过用HindIII消化来自转基因植物的基因组DNA，并用ORF54编码序列的片段进行探测，来进行DNA凝胶印迹分析(图5)，以确定基因拷贝数并鉴定5个独立转化事件。从转化的植物(T0)中收获T1种子。

T1植物表型分型

将来自Southern阳性T0植物的30粒种子种植于单个的含有椰糠的杯子中，将其中的20个健康植物移植到温室。利用CRD以来自随机数字表的随机数字排列这些植物。

在两个单独的实验中进行T1植物表型分型。第一个实验包括来自T0事件1129503和123602及日本晴(野生型对照)的子代系，第二个实验包括来自T0事件1164906、1164914和1164922及日本晴(野生型对照)的子代系。

T1系的表型分析

移植后每周测量一次植株高度和分蘖数目，直至达到结籽。图5a、图5b、图5c、图5d和图5e描述了在两个单独的实验中观察到的这些植物的生长参数。转基因ORF54植物(T1)的植株高度没有表现出与野生型对照(日本晴)太大的差异(图5a和图5d)。然而，ORF54植物(T1)的分蘖能力显得比野生型对照(日本晴)更高(图5b和图5e)。更仔细的分析揭示，12.5％的ORF54T1植物胜过分蘖最好的野生型对照植物(图5c)，并且分蘖数目超过两倍。因此，由ORF54植物(T1)的干物质产生所测量的生物量也增加了(图6a)。与野生型对照(日本晴)相比，生物量平均增加约66％。再次观察到12.5％的ORF54T1植物群体产生比干物质产量最高的野生型对照(日本晴)更多的干物质(图6b)。总之，通过反义或类似技术的植物中ORF54基因表达或ORF54变体的基因表达的下调导致增加的植物生物量。

植物转化-黑麦草

基本上如Bajaj等人(Plant Cell Reports，2006，25：651-659)所述，对多年生黑麦草(黑麦草栽培种英派克(Lolium perenne L.cv.Impact))进行转化。将源自所选黑麦草系分蘖的分生组织区的胚胎形成愈伤组织和携带修饰的双元载体(ORF54，图4)的根癌土壤杆菌菌株EHA101用于转化实验。将胚胎形成愈伤组织浸没在过夜生长的土壤杆菌培养物中30分钟，并持续振摇。将它们在共培养培养基上传代培养4周后，选择对潮霉素具有抗性的愈伤组织。选择后，将抗性愈伤组织每两周在再生培养基中传代培养，直至植物再生。两轮或三轮选择后继续生长的再生物(regenerant)被证明为稳定的转化体。然后，将每个再生的植株在维持培养基(maintenance medium)中倍增，以产生克隆小植株(clonal plantlet)，随后使其在不含激素的MS培养基中生根。将来自每个克隆的生根植物转移至受控温室(contained glasshouse)条件下，而保留组织培养中的克隆对应物作为备份。在气候控制环境实验室中分析了18个独立的转基因系(1V1、1V3、1V5、1V8、1V10、1V11、1V20、2V2、2V4、2V5、2V7、2V8、2V9、3V5、3V7、3V10、3V11、3V12)和它们的非转基因对照植物(分别是T40、T41和T101)，其中在全水条件(fully water condition)下评价它们的生物量产生。

在生长室中筛选增加的生物量

利用长度为500mm、直径为90mm的塑料雨水管来建立植物生长系统。将管置于移动托架上，并通过绳索和金属框架在侧面进行支持。将管在底部用石棉塞住，并用洗过的灰泥用砂逐渐填充，其用水实现均匀包装。在每个管的开口端的中心种植一丛多年生黑麦草(5分蘖)。将来自每个事件的植物在三个管中重复种植。将植物随机排列，三重复中每一取一个，并使其在70％的相对湿度、16/8小时的昼/夜循环和650μmol.m^-2.s^-1的光照强度下生长。每天早晨向植物一次浇灌50mL荷格伦特溶液(Hoagland’s solution)(Hoagland and Arnon，1938)，并在下午再浇灌50mL淡水。开始使植物适应20天，然后将植物修剪回15cm的高度。允许所有的植物在接下来的14天从修剪恢复。分别从计时日起的7天和14天后，记录植物分蘖数目。14天后，将植物修剪回15cm的高度。将收获的样品在60℃下干燥3天，然后记录干重。允许植物在全水条件下再生长14天。再次将植物修剪回15cm的高度，然后在将样品在60℃干燥3天后，记录修剪的样品的干重。允许植物再生长13天，并通过收获高于15cm的植物并将样品在60℃干燥3天来记录生物量产生(干物质)的最终数据。

在每个收获中，大于四分之一的测试的转基因事件产生了比野生型植物更多的生物量。当在3次收获的时间段内确定累积生长时，转基因系之一的3V7产生大于470％的生物量；而在4个其它系2V2、2V7和3V10中，生物量增加的范围从大于35％至95％(参见图9)。

上文的实施例示例了本发明的实施。本领域技术人员应当理解，可以进行众多变化和修饰而不偏离本发明的精神和范围。

参考文献

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序列小结

Claims

1.产生具有增加的生物量的植物的方法，所述方法包括使用包含下列多核苷酸的遗传构建体来转化植物细胞或植物：

SEQ ID NO：10的多核苷酸，其与启动子可操作地连接，其中所述多核苷酸相对于所述启动子为反义方向。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸在植物中的表达导致以下内源性多核苷酸和内源性多肽中至少一个的下调：

a)具有SEQ ID NO：10至16中任一序列的内源性多核苷酸，以及

b)具有SEQ ID NO：1至7中任一序列的内源性多肽，

以及其中所述下调导致增加的生物量。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸在植物中的表达导致以下内源性多核苷酸和内源性多肽中至少一个的下调：

a)具有SEQ ID NO：10所示序列的内源性多核苷酸，以及

b)具有SEQ ID NO：1所示序列的内源性多肽，

以及其中所述下调导致增加的生物量。

4.由SEQ ID NO：10的全长编码序列组成的分离的多核苷酸。

5.由SEQ ID NO：10的序列组成的分离的多核苷酸。

6.如权利要求4或5所述的分离的多核苷酸，其编码由SEQ IDNO：1的氨基酸序列组成的多肽。

7.由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的分离的多肽。

8.分离的多核苷酸，其编码权利要求7所述的多肽。

9.遗传构建体，其包含权利要求4至6及8中任一权利要求所述的多核苷酸。

10.如权利要求9所述的遗传构建体，其中所述多核苷酸与启动子可操作地连接，以及其中所述多核苷酸相对于所述启动子为反义方向。

11.宿主细胞，其经遗传修饰以表达权利要求4至6及8中任一权利要求所述的多核苷酸或者权利要求7所述的多肽。

12.宿主细胞，其包含权利要求9或10所述的遗传构建体。

13.植物细胞，其经遗传修饰以表达权利要求4至6及8中任一权利要求所述的多核苷酸或者权利要求7所述的多肽。

14.植物细胞，其包含权利要求9或10所述的遗传构建体。

15.抗体，其针对权利要求7所述的多肽而产生。