UA124449C2 - Трансгенна рослина з модифікованою редокс-залежною модуляцією пігментів фотосинтетичних антенних комплексів та спосіб її одержання - Google Patents

Трансгенна рослина з модифікованою редокс-залежною модуляцією пігментів фотосинтетичних антенних комплексів та спосіб її одержання Download PDF

Info

Publication number
UA124449C2
UA124449C2 UAA201705754A UAA201705754A UA124449C2 UA 124449 C2 UA124449 C2 UA 124449C2 UA A201705754 A UAA201705754 A UA A201705754A UA A201705754 A UAA201705754 A UA A201705754A UA 124449 C2 UA124449 C2 UA 124449C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
gene
plants
sequence
plant
chlorophyll
Prior art date
Application number
UAA201705754A
Other languages
English (en)
Inventor
Річард Томас Сейр
Ричард Томас Сэйр
Original Assignee
Нмк, Інк.
Нмк, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Нмк, Інк., Нмк, Инк. filed Critical Нмк, Інк.
Publication of UA124449C2 publication Critical patent/UA124449C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0073—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C12N15/8269—Photosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)
    • C12Y114/13122—Chlorophyllide-a oxygenase (1.14.13.122)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Винахід стосується генетично модифікованої рослини, в якій нативний ген хлорофіл a-оксидази має пригнічену експресію та яка здатна модулювати склад своїх фотосинтетичних антенних комплексів у відповідь на збільшення або зменшення інтенсивності світла шляхом модуляції співвідношення хлорофілу a та хлорофілу b (Chl a/b), а також способу її одержання.

Description

С -8)
Світло / врннететтн кв. ще МАО ж вхіз
Аррж а ко Х со,
Ї реакції шк у ! ; і «база 1: фіксація вуслене о | Кан у раза І: фіксвия вуслетшю с
ЗО 6000
Енбулозобієфоаєта СКИВР) З росфв чер сн В у - Єв Аде здоет вороє
Кальніа і ; - «ВОГО
ТА 1 Дифосдхи піді л- ВІМАЄРНІ
Б МАреї
Фаза 3: 858: 6 регенеразн ср ОС хо ! акнпенптора СО» Гайхоринь неті д З. фос фах Фаза:
ФиБР МІР відновлення ск: Тчновоза та вх «ргацізні спонуки
Нихід
Фіг.
Дана заявка являє собою частково продовжувальну заявку заявки на патент США
Моб2/078936 під назвою "Епдіпеегеа ріапів5 мйп іпіеппедіаце 5і2е ПдМРЕ-Нагмевіїпд сотрієх апівєппа сотріехе5 апа теїпоа ог зате", подану 12 листопада 2014 року, і при цьому її опис та формула винаходу включені в даний документ шляхом посилання.
ЗАЯВА ЩОДО ДОСЛІДЖЕННЯ АБО РОЗРОБКИ, ФІНАНСОВАНИХ З ФЕДЕРАЛЬНОГО
БЮДЖЕТУ
Даний винахід було зроблено за підтримки уряду за грантами МоМе ЕЕ-1219603 та 21018-М, виданими Національною Науковою Організацією та Міністерством сільського господарства
Сполучених Штатів Америки відповідно. Уряд володіє деякими правами на даний винахід.
ВКЛЮЧЕННЯ ЗА ДОПОМОГОЮ ПОСИЛАННЯ МАТЕРІАЛУ, ПОДАНОГО НА КОМПАКТ-
ДИСКУ
Не передбачено.
МАТЕРІАЛ, ЩО ОХОРОНЯЄТЬСЯ АВТОРСЬКИМ ПРАВОМ
Не передбачено.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Варто відзначити, що в наступному розгляді є посилання на велику кількість публікацій за автором(ами) та роком публікації, та що через наявність нещодавніх дат публікацій деякі публікації не слід розглядати як попередній рівень техніки щодо даного винаходу. Розгляд таких публікацій у даному документі поданий для повнішого опису рівня техніки та його не слід розглядати як визнання, що такі публікації являють собою попередній рівень техніки для цілей встановлення патентоспроможності.
Фотосинтетичні рослини використовують сонячне світло для забезпечення енергією всіх клітинних процесів (безпосередньо або опосередковано) та, передусім, одержують переважну більшість або всю їхню біомасу за допомогою хімічних реакцій, що здійснюються за рахунок світла. Усі комерційно важливі фотосинтетичні рослини належать до царства Рослини. Вони включають добре відомі організми, як наприклад дерева, трави, кущі, злаки, повзучі рослини, папороті, мохи та зелені водорості з відділу Спіоторпуїа.
Рослини отримують енергію з сонячного світла за допомогою процесу, що має назву фотосинтез. Фотосинтез являє собою процес, який перетворює вуглекислий газ на органічні
Зо сполуки, головним чином цукри, використовуючи енергію сонячного світла (ВіапКепз5Пір, 2010).
Рослини поглинають сонячне світло за допомогою їхніх фотосинтетичних антенних комплексів, які також мають назву світлозбиральні комплекси (НС) та іноді зазначаються у даному документі як світлозбиральні антенні комплекси, функція яких полягає у перенесенні енергії збудження до комплексів реакційних центрів фотосистеми ІІ (РБІЇ) та фотосистеми І (РБІ).
Згодом реакційні центри здійснюють перенесення електронів, фотофосфорилювання та реакції оксигенування, що веде до одержання енергії та захоплення діоксиду вуглецю у формі складних біомолекул (наприклад, цукру, крохмалю, ліпідів та іншого).
Світлозбиральні антенні комплекси для РбБІ (які мають назву І-НС І) та РОЇ! (які мають назву
НС ІЇ) складаються з пігмент-білкових комплексів. Світлозбиральні антенні пігменти включають хлорофіл а (СНІ а) і хлорофіл Ь (СПІ Б) та багато допоміжних пігментів (наприклад, каротиноїди та ксантофіли), що беруть участь у складному шляху перенесення енергії фотосинтезу.
Світлозбиральний комплекс РОЇ містить проксимальні (прилеглі) антенні СІ а-зв'язувальні білки, асоційовані з реакційним центром РЗІЇ; та периферійні (віддалені) антенні СНІ а-, СНІ р- та каротиноїд-зв'язувальні білки. Периферійний антенний комплекс РІЇ (Не ІЇ) додатково містить головні (зовнішні) більш поширені тримерні антенні білки, які кодуються дев'ятьма генами (НСВМІ1-І НСВМО), та коровий (внутрішній) комплекс антенних білків, який кодується трьома генами (І НСВА4, ІГНСВ5 та ГНСВ7) (Міпадажа апа ТаКапавзнпі, 2004). Білки НС ІІ містять до 80 Фо усього хлорофілу з мембран тилакоїдів рослин та водоростей.
Процес фотосинтезу був оптимізований протягом еволюції для одержання рослин, адаптованих, щоб більш відповідати природному середовищу; проте, він не обов'язково оптимізований, щоб давати найвищий індекс врожаю в умовах монокультури, що актуальні для сільського господарства. У даному документі "індексом врожаю" називають вихід потрібного продукту у порівнянні із загальною масою рослини. Стратегії, що передбачають зменшення розміру оптичного перерізу фотосинтетичної світлозбиральної антени, були розроблені та успішно впроваджені в культурах водоростей, що приводило до збільшеної продуктивності.
Даний винахід описує аналогічний підхід, який також можна застосовувати у рослинах для збільшення продуктивності. Можна одержувати сконструйовані рослини з великою кількістю співвідношень хлорофілів а/ь та, як результат, розмірів світлозбиральних антен. Оптимальний діапазон розмірів антен веде до збільшеної фотосинтетичної здатності, та в даному винаході 60 описана чітка точка переходу, за якої додаткове зменшення розміру антен стає шкідливими для ефективності фотосинтезу. Автори даного винаходу висунули гіпотезу, що ця точка переходу пов'язана з фазовим переходом у розташуванні фотосистеми ІЇ в мембранах тилакоїдів, що регулюється відносною кількістю світлозбиральних комплексів ІІ. Рослини з оптимізованою антеною демонструють добрі результати не лише за контрольованих умов теплиці, але також і в полі. У варіанті здійснення даного винаходу передбачені трансгенні рослини, що характеризуються збільшеним виходом продуктивності, конструкції та способи їх застосування для одержання вказаних трансгенних рослин.
У природі фотосинтетичні клітини можуть пристосовуватись до змінених умов освітленості з метою оптимізації захоплення та ефективності перетворення енергії або, як альтернатива, захисту клітин від надмірного світла. Клітини, пристосовані до низьких рівнів освітленості, зазвичай мають більш великі світлозбиральні антенні комплекси, ніж такі, що акліматизувались до високих рівнів інтенсивності світла, щоб максимізувати захоплення світла за умов обмеженої освітленості. Такі рослини, що акліматизувались до малої освітленості, характеризуються більш низькими співвідношеннями СТІ а/р, оскільки фотосистеми містять відносно високі кількості СПІ
Ь та мають велику антену світлозбирального комплексу (НС) (що складається переважно з хлорофілів а та Б). Повідомлялось, що рослини можуть адаптуватись до високої інтенсивності світла, проте зв'язок між певними співвідношеннями СТІ а/5 та збільшеними виходами не був доведений. Було продемонстровано, що адаптовані рослини, які вирощують за високої інтенсивності світла (НІ), мають відносно низькі кількості СІ Б в їхніх НС, більш невеликі антени І НС та більш високе співвідношення СТІ а/ь (ВібгКтап еї а!., 1972; І еопд апа Апаегзоп, 1984; Іаге5оп еї аїЇ.,, 1987). Однак в інших дослідженнях було продемонстровано, що в фотосинтетичних клітинах, акліматизованих до високих інтенсивностей світла, клітинний вміст
СпІ знижений на 5095, проте вони характеризуються лише невеликими (якщо вони є) збільшеннями у співвідношенні СНІ а/ь (Меаїє апа Меїї5, 1986).
Негативний наслідком наявності ефективних світлозбиральних комплексів є те, що фотосинтетичне перенесення електронів у майже всіх фотосинтетичних клітинах сягає світлового насичення за лише 25 95 від максимальної інтенсивності сонячного світла (у даному випадку вважається, що максимальна інтенсивність сонячного випромінення становить 2000 мкмоль фотонів м-20-1 при 400-700 нм) (РоПе еї аїЇ.,, 2001). За умов високої густини
Зо фотосинтетичного фотонного потоку (густина фотосинтетичного фотонного потоку являє собою міру кількості фотонів у 400-700 нм діапазоні видимого спектра, які падають на квадратний метр цільової зони за секунду) швидкість поглинання фотонів перевищує швидкість, 3 якої фотосинтез конвертує активовані антенні комплекси на продуктивні процеси переносу заряду (які використовуються для одержання відновлювальних еквівалентів та енергії). Надмірне збудження світлозбиральних антенних комплексів за умов високої інтенсивності світла збільшує ймовірність довгострокових збуджених станів та фотоокисного пошкодження рослин, воно зумовлено утворенням та накопиченням активних форм кисню (КО5), таких як хлорофіл в його триплетному стані (ЗСНПІ) та активні форми кисню (Кгіедег-І із2Кау еї а!., 2008, Мабз5 апа Сзег, 2009).
Рослини мають коротко- та довгострокові реакції для захисту фотосинтетичного апарата від шкідливих ефектів надлишкового світла. Короткострокові реакції включають теплорозсіювання надлишку поглинених фотонів (ДЕ) та переходи між станами (дТ), обидві з яких є компонентами нефотохімічного гасіння (МРО). Процеси ДЕ (енергозалежного гасіння) передбачають перехід
СП у незбуджений стан з його синглетного збудженого стану (СІМ), утвореного в антені РЗІЇ під час поглинанні світла, щоб мінімізувати утворення триплетного стану хлорофілу (ЗСПІ) та КО у фотосинтетичному апараті (МипПег еї аїЇ., 2001). Процеси, асоційовані з дТ, залучені в регуляцію відносного збудження РО5ІЇ та РБІ та, у зв'язку з цим, регулюють лінійний та циклічний потоки електронів під час фотосинтезу (Ерегпага сеї аї.,, 2008). Більш довгострокові реакції спостерігаються через години та дні після впливу високоіїнтенсивного світла та включають зміни рівнів трансляції та транскрипції МРНК ГНС та мРНК, індукованих за високої інтенсивності світла, оновлення корового білка РБОЇІ (О І) та відновлення РбБІЇ, та збільшення каротиноїдів ксантофілового циклу. Отже, за високої інтенсивності світла до 80 95 поглинених фотонів може розсіюватися у вигляді тепла або флуоресценції внаслідок флуоресценція та активації короткострокових фотозахисних реакцій (МРО), що спричиняє велике зниження ефективності використання світла та фотосинтетичної продуктивності (Роїе еї а!., 2002).
СпІ р синтезується з прото-СПІ а за допомогою хлорофіл а-оксигенази (САС), що іноді в літературі має назву хлорофіл БрБ-синтаза. Будь-яка назва є застосовною у даному винаході.
Надекспресія гена Сао веде до підвищення біосинтезу СТІ р у Агабрідорзі5 та, внаслідок цього, до збільшення периферійних антен, асоційованих з РОЗІ (ТапаКа єї аїЇ., 2001). Важливо бо зауважити, що мутанти зеленої водорості Спіатудотопа5, що не мають СпІ р (срз-3),
характеризуються істотним підвищенням швидкості світлового насичення під час виділення фотосинтетичного кисню (до 1,25 кратного збільшення, у перерахунку на основі СП) порівняно з диким типом та не демонструють світлового насичення за максимальної інтенсивності сонячного світла (Роїе еї аї., 2000). Більш того, дослідження, в яких переважно було знижені розміри НС ІІ, продемонстрували, що зменшення розмірів антен РБІЇ (а не РБІ) приводило до підвищеної швидкості виділення кисню за умов високої інтенсивності світла порівняно з клітинами дикого типу (Роїе еї а!., 2002; Роїе єї а!ї., 2001).
Варіанти здійснення трансгенних рослин за даним винаходом сконструйовані, щоб штучно модулювати світлозбиральні комплекси. Наприклад, модуляція НС може здійснюватися тканиноспецифічним способом, тобто експресія одного або більше генів або пов'язана з промотором, що активується під дією світла, або здійснюється за рахунок тканиноспецифічного промотора, який є активним лише в фотосинтетичних тканинах рослини. Несподіваним чином, трансгенна рослина, описана згідно з одним варіантом здійснення даного винаходу, забезпечує збільшений розподіл значної кількості збільшеної фіксації вуглецю в запасаючі тканини, такі як насіння або крохмаль, а не збільшення біомаси всіх тканин загалом. Крім того, дані трансгенні рослини характеризуються збільшеною швидкістю росту, накопиченням крохмалю в пластидах та нефотохімічним гасінням (фотозахистом від високоїнтенсивного світла) у порівнянні з рослинами дикого типу, які вирощують за тих самих умов.
Ця та інші незадоволені потреби з попереднього рівню техніки задовольняються за допомогою ілюстративних композицій та способів, описаних більш докладно нижче.
КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
В одному варіанті здійснення даного винаходу передбачена трансгенна рослина, що здатна модулювати склад своїх фотосинтетичних антенних комплексів у відповідь на збільшення або зменшення інтенсивності світла шляхом модуляції співвідношення хлорофілу а та хлорофілу б, завдяки чому має місце збільшення співвідношення СТІ а/ь за високої інтенсивності світла та зменшення співвідношення СТІ а/р за низької інтенсивності світла порівняно з рослинами дикого типу, які вирощують за тих самих умов. Нативний ген хлорофіл а-оксидази трансгенної рослини може бути вирізаним, інактивованим або його експресія пригнічена. Наприклад, нативний ген хлорофіл а-оксидази інактивований із застосуванням процедури, вибраної з геномного редагування, опосередкованого СКІЗРК/Са5 9, інактивації генів, опосередкованої ТАГЕМ, хімічного мутагенезу, сполученого з ТІСІМО, інсерційного мутагенезу, сполученого з ПЛР- скринінгом щодо виявлення події вставки в нативному гені хлорофіл а-оксидази, інактивації гена шляхом РНК-інтерференції (КМАї). У переважному варіанті здійснення трансгенна рослина містить ДНК-конструкцію, що містить гетерологічну послідовність контролю експресії, функціонально пов'язану з полінуклеотидною послідовністю, що кодує хлорофіл а-оксидазу або її фрагмент. Послідовність контролю експресії може взаємодіяти з редоксо-залежним модулятором, який реагує на зміни інтенсивності навколишнього світла, та при цьому редокс- залежний модулятор може бути вибраний з МАВІ, 5002 та СІ 0-1. Послідовності контролю експресії можуть містити мотив послідовності домену холодового шоку, та у переважному варіанті здійснення мотив послідовності домену холодового шоку вибраний з С5ООС, та він може бути функціонально пов'язаний з промотором. Промотор може бути вибраний з групи, яка складається з промотора рзаб, актину, убіквітину, В-тубуліну, РЕ-1а та 355, або промотор являє собою тканиноспецифічний промотор, такий як САВІ або Кро5. У переважному варіанті здійснення полінуклеотидна послідовність конструкції являє собою гетерологічну послідовність
ДНК. ДНК-конструкція може містити зворотно комплементарну послідовність щодо полінуклеотидної послідовності, що кодує фрагмент хлорофіл а-оксидази, та при цьому послідовність контролю експресії може являти собою тканиноспецифічний промотор, який реагує на зміни інтенсивності навколишнього світла.
В іншому варіанті здійснення передбачений спосіб одержання трансгенної рослини зі здатністю до модулювання співвідношення СТІ а/о5 в своєму антенному комплексі у відповідь на навколишнє сонячне світло, який включає стадії здійснення стабільної трансформації рослини за допомогою гетерологічної полінуклеотидної послідовності, що містить послідовності, які націлюються она частину ендогенного гена хлорофіл а-оксидази, де гетерологічна полінуклеотидна послідовність зумовлює вирізання, інактивацію або пригнічення експресії ендогенного гена хлорофіл а-оксидази у відповідь на зміни інтенсивності навколишнього світла.
Відбирають трансформант, який здатний модулювати розмір антен у відповідь на зміни інтенсивності світла.
В іншому способі трансгенну рослину одержують зі здатністю до модулювання співвідношення СпІ а/юб в своєму антенному комплексі у відповідь на навколишнє сонячне 60 світло, при цьому спосіб включає стадії одержання трансгенної рослини, де ендогенний ген хлорофіл а-оксидази був інактивований. Трансгенну рослину піддають стабільній трансформації гетерологічною полінуклеотидною послідовністю, що кодує модифіковану хлорофіл а-оксидазу, де експресія модифікованої хлорофіл а-оксидази контролюється змінами інтенсивності навколишнього світла. Відбирають трансформант, який здатний модулювати розмір антен у відповідь на зміни інтенсивності світла. У переважному варіанті здійснення гетерологічна полінуклеотидна послідовність містить промотор, функціонально пов'язаний з консенсусною послідовністю домену холодового шоку, наприклад послідовність домену холодового шоку вибрана з групи, яка складається з ЗЕО ІЮ МО 18-26. Крім того, гетерологічний полінуклеотид може містити промотор, функціонально пов'язаний з модифікованою хлорофіл а-оксидазою, який вибраний з промотора рзаб, актину, убіквітину, б-тубуліну, 355 та РК1-а. У переважному варіанті здійснення гетерологічна полінуклеотидна послідовність містить послідовність, що націлюється на певну тканину.
В іншому варіанті здійснення даного винаходу передбачена ДНК-конструкція для одержання трансгенної рослини, що містить гетерологічну послідовність контролю експресії, функціонально пов'язану з полінуклеотидною послідовністю, що кодує хлорофіл а-оксидазу або її фрагмент, де експресія полінуклеотидної послідовності контролюється змінами інтенсивності навколишнього світла. У переважному варіанті здійснення гетерологічна послідовність контролю експресії знаходиться під контролем редоко-залежного модулятора, який реагує на зміни інтенсивності навколишнього світла. Наприклад, гетерологічна послідовність контролю експресії містить промотор, який функціонально пов'язаний з консенсусною послідовністю домену холодового шоку, та переважно послідовність домену холодового шоку вибрана з групи, яка складається з
ЗЕО ІЮ МО 18-26. У переважному варіанті здійснення промотор вибраний з промотора рзаб, актину, убіквітину, В-тубуліну, 355 та РЕ1-а, та/або редоксо-залежний модулятор вибраний з
МАВІ, 5002 та С210-1. У переважному варіанті здійснення гетерологічна послідовність контролю експресії являє собою промотор, який реагує на зміни інтенсивності навколишнього світла, та полінуклеотидна послідовність кодує частину хлорофіл а-оксидази та її зворотно комплементарну послідовність. Наприклад, хлорофіл а-оксидаза або її фрагмент, які кодуються полінуклеотидною послідовністю, вибрані з групи, яка складається з 5БО ІЮ МО 1-5. Як альтернатива, полінуклеотид кодує поліпептид з активністю хлорофіл а-оксидази або поліпептид, який є коротшим за поліпептид з активністю хлорофіл а-оксидази, проте має істотну гомологію послідовностей з природним геном, з якого ця частина полінуклеотиду експресується.
Трансгенна рослина може бути вибрана з групи, яка складається з проса, кукурудзи (маїсу), сорго, ячменю, вівса, рису, жита, тефу, тритикале, пшениці, рису, дикого рису, амаранту, різновидів квасолі, різновидів сочевиці, бобу звичайного, люпину, різновидів арахісу, різновидів нуту, різновидів голубиного гороху, різновидів сої, різновидів гірчиці, ріпаку (каноли), сафлору, соняшнику, льону, ятрофи, конопель, Агарідорві5, Сатеїїпа, маку, дерев (тополі, верби, евкаліпта, південного бука, платана, ясена), Мібсапійи5, конопель, світчграсу, очерету, канаркової трави, жита, очерету гігантського, різновидів буряку, цукрового сорго, цукрової тростини, різновидів картоплі, різновидів солодкої картоплі, касави, різновидів маслини, сої, ріпаку та кукурудзи, та переважно являє собою Саптеїїпа. У переважному варіанті здійснення співвідношення СП а/ю за високих рівнів світла у трансгенних рослинах на приблизно 10 95 перевищує таке, що спостерігається в рослинах дикого типу. Наприклад, співвідношення СпІ а/р становить від 4 до 8 за високої інтенсивності світла, та переважно співвідношення Сп а/р становить від 5 до 8 за високої інтенсивності світла. Переважно, спостерігається більше ніж приблизно 10 95 збільшення накопичення запасних сполук в вуглець-акцепторних тканинах трансгенної рослини відносно рослини дикого типу, наприклад, запасні сполуки трансгенної рослини вибрані з ліпіду, крохмалю, цукру, восків, пігментів та масел. У переважному варіанті здійснення трансгенна рослина росте швидше на приблизно 10 95 за рослину дикого типу тієї самої лінії.
В одному аспекті за даним винаходом передбачені способи та композиції для одержання трансгенних рослин, здатних самостійно модулювати розмір периферійного антенного комплексу фотосистеми ІІ (РБІЇ) шляхом регуляції експресії гена хлорофіл а-оксигенази (Сабо) у відповідь на різні інтенсивності світла та тканиноспецифічним способом порівняно з рослинами дикого типу. Також передбачені трансгенні рослини, які також проявляють підвищену фотосинтетичну продуктивність, більш високі виходи запасних сполук рослини, збільшену швидкість росту та/або інші посилені ознаки (порівняно з рослинами дикого типу тієї самої лінії) та способи їх застосування.
В одному аспекті такої посиленої трансгенної фотосинтетичної рослини передбачені вдосконалені системи продукування з більш високою гнучкістю щодо умов зростання та 60 збільшеними виходами.
В одному варіанті здійснення даного винаходу описані способи одержання трансгенних рослин, здатних модулювати розмір своїх периферійних антен РБІ! залежно від інтенсивності світла, та які проявляють підвищену фотосинтетичну продуктивність. Хоча водорості дикого типу мають вже існуючі механізми модулювання експресії та розміру їхніх антен І НС Ії на транскрипційному та посттранскрипційному рівні за перемінних рівнів світла (Юигптога еї аї., 2003), діапазон регулювання антен РбБІЇ у рослин дикого типу обмежений та не може так само контролюватися з забезпеченням переваг, передбачених у даному винаході.
В одному варіанті здійснення даного винаходу використовуються переваги нещодавно описаного регульованого світлом та редоко-залежного, діючого в трансо-положенні білкового фактора, що має назву нуклеїнова кислота-зв'язувальний білок 1 ("МАВ 1"), який зв'язується з
МРНК НС Ії, негативно регулюючи їх трансляцію, що веде до зниження вмісту І НС ІІ при рості в умовах високоінтенсивного світла у Спіатудотопавх геїіпНагаїії (Михзадпид еї а!., 2005). МАВІ1 зв'язується з мотивом консенсусної послідовності домену холодового шоку (С50С5), знайденому у декількох мРНК НС ІЇ (наприклад ГНСМ Вб), зв'язуючи їх в трансляційно мовчазні матричні рибонуклеопротеїнові комплекси. Внаслідок вставки елементу С5ОС5 мРНК
ІНСМ Вб в ділянку промотора, що використовується для регуляції експресії гена Сао, трансгенні організми за даним винаходом модулюють експресію гена Сао залежним від світла способом. За високої інтенсивності світла білок МАВ 1 зв'язується з його відповідним сайтом зв'язування мРНК на сконструйованому транскрипті Сас, репресуючи його трансляцію та синтез
СПІВ, що веде до зменшеного розміру периферійних антен РБЇЇ. Навпаки, за більш низьких інтенсивностей світла репресія трансляції під дією МАВ 1 знижується через більш низькі рівні експресії МАВ 1, що забезпечує підвищені рівні трансляції гена Сао та синтезу СПІ Б, що веде до збірки периферійних антен Ро! на рівні дикого типу та до збільшеного захоплення світла за більш низьких значеннях інтенсивності світла.
Варіанти здійснення трансгенних рослин за даним винаходом сконструйовані для модуляції поширеності НС тканиноспецифічним способом, тобто експресія генів або пов'язана з промотором, що активується під дією світла, або здійснюється за рахунок тканиноспецифічного промотора, який є активним лише в фотосинтетичних тканинах рослини.
Дані трансгенні рослини здатні модулювати розмір своїх периферійних антен РБЇЇ залежно
Зо від інтенсивності світла та проявляють підвищену фотосинтетичну продуктивність порівняно з рослинами дикого типу. Такі посилені фотосинтетичні рослини передбачають вдосконалені системи продукування з більш високою гнучкістю щодо умов зростання та збільшеними виходами. Несподівано, ці рослини розподіляють більшу частину збільшеної фіксації вуглецю в запасаючі тканини, такі як насіння або крохмалю, а не збільшують біомасу всіх тканин загалом.
Крім того, дані рослини характеризуються збільшеною швидкістю росту, накопиченням крохмалю в пластидах та нефотохімічним гасінням (фотозахистом від високоїнтенсивного світла) порівняно з рослинами дикого типу, які вирощують за тих самих умов.
Ця та інші незадоволені потреби з попереднього рівню техніки задовольняються за допомогою ілюстративних композицій та способів, описаних більш докладно нижче.
Ілюстративні варіанти здійснення композицій, систем та способів, розкритих у даному документі, передбачають підвищені виходи рослин та/або вуглець-акцепторних тканин у рослині(ах). У додатковому варіанті здійснення підвищені виходи модифікованих рослин не характеризуються збільшенням всіх тканин загалом, а збілоьшенням в запасаючих тканинах таких загальних запасних сполук, як без обмеження полісахариди, білки та ліпіди. Загалом, сполуки, в яких зберігається вуглець для подальшого використання в метаболічних процесах, вважаються вуглець-акцепторними тканинами та називатимуться так у даній заявці.
У ще одному додатковому варіанті здійснення підвищені виходи супроводжуються збільшенням загальної швидкості росту сконструйованих рослин відносно рослин дикого типу, які вирощують за ідентичних умов.
В одному аспекті в варіантах здійснення даного винаходу передбачені нові елементи для конструювання рослин так, щоб вони містили самостійно регульовані світлозбиральні антенні комплекси проміжного розміру (співвідношення СпіІ а/б від З до 6), розташовані тканиноспецифічним способом.
В іншому варіанті здійснення даного винаходу передбачена нова стадія для одержання нокаутів гена хлорофіл а-оксигенази (Сао) в рослинах із застосуванням однієї з декількох стратегій, що включають без обмеження інактивацію гена, опосередковану короткими паліндромними повторами, регулярно розташованими групами, сполученими з нуклеазою Саз 9 (СКІБРРУ/Са59) (Сопоа еї аї., 2013, 2папо, 2014), інактивацію гена, опосередковану ефекторними нуклеазами, подібними до активаторів транскрипції (ТАГЕМ) (Са) еї аї., 2013), хімічний 60 мутагенез, сполучений з індукованими націлюванням локальними порушеннями в геномах
(ТІСІМО) (Сотап еї аї., 2013, І еміазап еї аї., 2013), та інсерційний мутагенез, сполучений з ПЛР- скринінгом щодо подій вставки в гені Сас.
У додатковому варіанті здійснення рослини з нокаутом гена Сао (де ендогенний ген Сао був видалений або зроблений нефункціональним) модифікують шляхом введення /-5'- модифікованого гена Сао в генетичний фон рослини з нокаутом Сао із застосуванням опосередкованої Ті-плазмідою трансформації. Введений ген Сао був модифікований для включення або 3'-, або 5'--чуклеотид-зв'язувальних доменів інгібітора трансляції, які взаємодіють зі специфічними діючими в транс-положенні білками-репресорами трансляції з різних джерел, такими як МАВІ (водорості), ЗСО2 (дріжджі; засспаготусез сегемівзіає) (Еоїапі еї аї., 1991), СІ 0- 1 з 54 мишей в Ебспегіспіа соїї (діпк5-Кобегізоп апа Мотига, 1982), білки ЗТАК (Зассотаппо еї а!., 1999) та КедА бактеріофага КВб69 (догмік апа Мійег, 1995), та інші діючі в транс-положенні репресори.
У ще одному додатковому варіанті здійснення експресія білка-репресора/нгібітора трансляції контролюється промотором, специфічним для листків, та промотором генів, що індукуються світлом, таких як САВІ, гро5, Бої 1, РРОК та подібних (Хападізажа апа 5пееп, 1998, МаїзцоКа еї аї., 1993, Спайораднпуау еї аї., 1998). Отже, білок САО пригнічується за високоїнтенсивного світла, проте активується за низькоіїнтенсивного світла. Кінцевим результатом є більш високі співвідношення СТІ а/ь за високої інтенсивності світла (верхній ярус) та більш низькі співвідношення СТІ а/р за низької інтенсивності світла (нижній ярус) порівняно з диким типом.
В іншому варіанті здійснення ендогенний ген САО рослини є або модифікованим, або інактивованим, або репресованим.
В іншому варіанті здійснення для регуляції експресії гена Сабо, щоб модулювати співвідношення СТІ а/б та розмір антен у рослинах, застосовують технологію 5ікМА. вікМА- конструкцію(її), що націлюється на ген Сао (САОЇї), вводять в рослини із застосуванням Ті- плазміди Адгобасіегішт. Експресія 5ікМА-конструкцій для Сао контролюється промотором, специфічним для листків, та промотором генів, що індукуються світлом, які можуть являти собою без обмеження САВІ, гро5, Бої 1, РРОК та подібні (Уападізаула апа 5пееп, 1998,
Маїзцока есеї а!., 1993, Спанораднуау еї а!ї., 1998).
Зо В іншому варіанті здійснення рослини з даного експерименту характеризуються співвідношенням СпІ а/0 приблизно 5 та демонструють більш високу локальну швидкість фотосинтезу, ніж рослини, які характеризуються будь-яким іншим співвідношенням СТІ а/р.
У ще одному варіанті здійснення рослини зі співвідношеннями СТІ а/ь6 приблизно 5 також характеризуються більш високими рівнями нефотохімічного гасіння (МРО), ніж рослини дикого типу.
У ще одному варіанті здійснення рослини зі співвідношеннями СпіІ а/б приблизно 5 характеризуються більш високим накопиченням крохмалю або запасних сполук, ніж рослини дикого типу.
У ще одному варіанті здійснення рослини з проміжним розміром антен (СпПІ а/р в діапазоні від приблизно 4 до б) мали знижене передчасне осипання нижніх листків та нижні листки зберігалися довше, ніж у дозрілих рослин дикого типу.
В іншому варіанті здійснення 5ікМА-конструкції, які націлюються на ген Сао (САОЇ), зумовлюють рослини, які характеризуються співвідношеннями СІ а/ю приблизно 5 та ростуть швидше за рослини дикого типу за тих самих умов.
У додатковому варіанті здійснення рослини, які мають зікМА-елементи, що націлюються на ген Сабо, характеризуються більшою кількістю насіння, ніж рослини дикого типу, та збільшеною масою насіння на рослину, яка щонайменше на приблизно 15 95, переважно приблизно вдвічі, перевищує масу насіння рослини дикого типу.
В іншому аспекті трансгенна рослина містить ДНК-конструкцію, що містить гетерологічну послідовність контролю експресії, здатну зв'язуватись з редоко-залежним модулятором, який реагує на інтенсивність навколишнього світла. В одному аспекті редоко-залежний репресор є більш активним за низької інтенсивності світла, ніж за високої інтенсивності світла.
В іншому аспекті редоксо-залежним модулятором є МАВ 1. В іншому аспекті послідовності контролю експресії містять мотив консенсусної послідовності домену холодового шоку (С500С5). У ще одному аспекті послідовності контролю експресії додатково містять промотор, функціонально пов'язаний з консенсусною послідовністю домену холодового шоку. В одному аспекті промотор вибраний з групи, яка складається з промотора рзаб, актину, убіквітину та р- тубуліну.
В одному аспекті послідовності контролю експресії функціонально пов'язані з 60 полінуклеотидною послідовністю, яка кодує білок САО. В одному аспекті полінуклеотидна послідовністю, яка кодує білок САО, являє собою гетерологічну послідовність нуклеїнової кислоти.
В іншому аспекті трансгенну рослина містить гетерологічний редоко-залежний модулятор. В одному аспекті гетерологічним редоко-залежним модулятором є МАВ 1. В іншому аспекті трансгенна рослина проявляє збільшення у виробництві біомаси порівняно з рослинами дикого типу, які вирощують за ідентичних умов.
В іншому варіанті здійснення передбачений спосіб одержання вдосконаленої рослини, який включає стадії здійснення стабільної трансформації рослини за допомогою гетерологічної полінуклеотидної послідовності, що містить послідовності контролю експресії, які містять мотив консенсусної послідовності домену холодового шоку (С500ОС5), здатний зв'язуватися з редокс- залежним модулятором, що реагує на інтенсивність навколишнього світла; здійснення відбору трансформанта, здатного модулювати розмір антен РІ у відповідь на інтенсивність навколишнього світла.
В одному аспекті гетерологічні полінуклеотидні послідовності містять послідовності, що специфічно націлюються на ендогенний ген Сао.
В одному аспекті ендогенний ген хлорофіл а-оксидази (Сао) рослини був модифікований, інактивований або його експресія була пригнічена.
В одному аспекті послідовності контролю експресії додатково містять промотор, функціонально пов'язаний з консенсусною послідовністю домену холодового шоку. В одному аспекті промотор вибраний з групи, яка складається з промотора рзаб, актину, убіквітину та Д- тубуліну.
В одному аспекті послідовності контролю експресії функціонально пов'язані з полінуклеотидною послідовністю, яка кодує білок САО.
В одному аспекті відбір оснований на скринінгу трансгенних організмів, які проявляють збільшення співвідношень СТІ а/ю, під час вирощування за умов високої інтенсивності світла, та зниження співвідношень а/р, під час вирощування за умов низької інтенсивності світла.
В одному аспекті відбір оснований на скринінгу трансгенних рослин, які проявляють збільшення виробництва біомаси порівняно з організмами дикого типу, які вирощують за ідентичних умов.
Зо В одному аспекті рослина містить гетерологічний редоко-залежний модулятор.
В одному аспекті гетерологічним редоко-залежним модулятором є МАВ 1.
В іншому варіанті здійснення даний винахід включає спосіб підвищення виходів фотосинтетичної продуктивності за умов високої інтенсивності світла та/або вирощування за високої густини, при цьому спосіб включає забезпечення рослини, що містить гетерологічну полінуклеотидну послідовність, яка містить послідовності контролю експресії, що містять мотив консенсусної послідовності домену холодового шоку (С500С5), функціонально пов'язаний з полінуклеотидною послідовністю, яка кодує білок САО; де експресія Сао є підвищеною за низької інтенсивності світла порівняно з експресією Сао за високої інтенсивності світла; культивування трансгенної рослини за високої інтенсивності світла та/або високої густини.
В іншому варіанті здійснення даний винахід включає спосіб підвищення продукції біонафти або біодизеля з рослини, при цьому спосіб включає забезпечення рослини, що містить гетерологічну полінуклеотидну послідовність, яка містить послідовності контролю експресії, що містять мотив консенсусної послідовності домену холодового шоку (С500С5), функціонально пов'язаний з полінуклеотидною послідовністю, яка кодує білок САО, де експресія гена Сао є підвищеною за низької інтенсивності світла порівняно з експресією гена Сао за високої інтенсивності світла; та культивування рослини високої інтенсивності світла та/або високої густини.
В іншому варіанті здійснення даний винахід включає спосіб підвищення продукції В- каротину, лютеїну або зеаксантину з рослини, при цьому спосіб включає забезпечення рослини, що містить гетерологічну полінуклеотидну послідовність, яка містить послідовності контролю експресії, що містять мотив консенсусної послідовності домену холодового шоку (С50ОС5), функціонально пов'язаний з полінуклеотидною послідовністю, яка кодує білок САС, де експресії
Сао є підвищеною за низької інтенсивності світла порівняно з експресією Сао за високої інтенсивності світла; та культивування рослини за високої інтенсивності світла та/або високої густини.
В одному аспекті будь-якого з даних способів ендогенний ген хлорофіл а-оксидази (Сабо) трансгенної рослини був модифікований, інактивований або його експресія була пригнічена.
В іншому аспекті будь-якого з даних способів послідовності контролю експресії додатково містять промотор, функціонально пов'язаний з консенсусною послідовністю домену холодового бо шоку. В одному аспекті даного варіанту здійснення промотор вибраний з групи, яка складається з промотора рзар, актину, убіквітину та р-тубуліну.
В іншому аспекті будь-якого з даних способів, полінуклеотидна послідовність, яка кодує білок САС, являє собою гетерологічну послідовність нуклеїнової кислоти.
В іншому аспекті будь-якого з даних способів рослина містить гетерологічний редокс- залежний репресор трансляції. В одному аспекті даного варіанту здійснення гетерологічним редоксо-залежним репресором є МАВ 1.
В іншому варіанті здійснення даний винахід включає вектор експресії, що містить послідовності контролю експресії, які містять мотив консенсусної послідовності домену холодового шоку (5005), функціонально пов'язаний з полінуклеотидною послідовністю, яка кодує білок САО.
В одному аспекті вектор експресії додатково містить промотор, функціонально пов'язаний з консенсусною послідовністю домену холодового шоку. В одному аспекті промотор вибраний з групи, яка складається з промотора рзаб, актину, убіквітину та р-тубуліну. В одному аспекті вектор експресії містить мотив С5ОЮОС5, вибраний з групи, яка складається з ЗЕО ІЮ МО 18,
ЗЕО ІО МО 19, БЕО ІО МО 20, 5ЕО ІО МО 21, 5ЕО ІЮ МО 22, 5ЕО ІЮ МО 23, 5ЕО ІО МО 24, 5ЕО
ІО МО 25 та 5ЕО ІО МО 26.
В одному аспекті вектор експресії містить ген Сабо, вибраний з групи, яка складається з БЕО
ІО МО 1, 5ЕО ІО МО 2, 5ЕО ІЮО МО 3, 5ЕО ІЮО МО 4 та 5ЕО ІЮ МО 5.
Додатковий обсяг застосовності даного винаходу частково буде викладений в подальшому докладному опису у взаємозв'язку з супровідними графічними матеріалами, та частково стане очевидним для фахівців в даній галузі після розгляду наступного, або може бути вивчений за допомогою здійснення даного винаходу на практиці. Об'єкти та переваги даного винаходу можуть бути зрозумілі та досягнуті за допомогою засобів та комбінацій, докладно зазначених в формулі винаходу, що додається.
КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
На супровідних графічних матеріалах, які включені в даний опис і які складають його частину, проілюстровані один або більше варіантів здійснення даного винаходу і вони, разом з описом, слугують для пояснення принципів даного винаходу. Графічні матеріали надані лише з метою ілюстрації одного або більше переважних варіантів здійснення даного винаходу та не
Зо розглядаються як такі, що обмежують даний винахід. Краще розуміння особливостей та переваг ілюстративних варіантів здійснення даного винаходу буде одержано з посиланням на супровідні графічні матеріали.
ФІГ. 1 - Схематичне зображення фіксації вуглецю під час фотосинтезу.
ФІГ. 2 - Ілюстрація, яка пояснює базис та корисність, що лежать в основі даного винаходу, щодо захоплення та використання світла.
ФІГ. З - Перетворення хлорофілу а (СПІ а) на хлорофіл Б (СПІ Б) здійснюється ферментом
СНІ а-оксигеназою (САС). В одному варіанті здійснення даного винаходу експресію даного гена знижена або усунута.
ФІГ. 4 А-В - Дві конструкції, придатні для опосередкованої Ті-плазмідою Адгобасіегійт трансформації Сатеїймпа 5аїїма (С. займа) згідно з одним або більше варіантами здійснення за даним винаходом.
ФІГ. 5 - Швидкість фотосинтезу порівнюють за різної інтенсивності світла в трансгенних рослинах Сатеїйпа, в яких застосовували технологію 5ікМА для контролю експресії гена Сабо на різних рівнях. Абревіатура САОЇ вказує, що ген хлорофіл а-оксидази знаходиться під контролем сконструйованого ефектора 5ікМА.
ФІГ. 6 - Порівняння співвідношення СТІ а/р в різних місцях на рослині, а також відносний вміст хлорофілу на одиницю площі листа в різних місцях на рослині. На вісі х гістограми показані три різні мутанти САОЇ (САОЇ 4, 6 та 7) та рослина дикого типу.
ФІГ. 7 - Проходження світла крізь листя рослин дикого типу та мутантів за експресією хлорофіл а-оксидази, одержаних із застосуванням методик КМАї (мутанти САОЇ).
Співвідношення хлорофілів а/р в них дорівнюють 6, у той час як у досліджуваних рослин дикого типу співвідношення хлорофілів а/о дорівнювали 3.
ФІГ. 8 А-О - Порівняння флуоресценції хлорофілу в Сатеїйпа дикого типу та мутанті САОЇ.
Вихідні зображення піддали зафарбовуванню штучними кольорами, синім, зеленим, жовтим та червоним, які використовувалось для позначення різних рівнів флуоресценції. Синій зображував відсутність флуоресценції або низький рівень флуоресценції хлорофілу, зелений зображував низький рівень флуоресценції жовтий зображував підвищений рівень флуоресценції, а червоний зображував високий рівень флуоресценції. Листок мутантів САОЇ на всіх фігурах характеризувався зоною з низьким рівнем флуоресценції у верхній правій частині бо листка, що виглядає як темно-сіра (синя на вихідному зображенні). Після 1 секунди впливу світла мутант САОЇї характеризувався низьким рівнем флуоресценції (світло-сірий/зелений), у той час як М/УТ швидко демонструвала підвищений рівень флуоресценції (світло-сірий/жовтий).
Після 10 секунд впливу світла мутант САОі починав демонструвати підвищений рівень флуоресценції біля його верхівки (світло-сірий/жовтий), у той час як М/Т характеризувалася високим рівнем флуоресценції (темно-сірий/червоний). За умов подовженого впливу світла (1 хв. та 5 хв.) САОЇ та М/І поверталися до сталого стану, за якого мутант САОЇї характеризувався низьким рівнем флуоресценції (сірий/зелений), а МУУТ характеризувалася підвищеним рівнем флуоресценції (світло-сірий/жовтий).
ФІГ. 9 - Нефотохімічне гасіння (МРО) протягом певного часу для декількох різних ліній мутантів САОЇі порівняно з рослинами дикого типу. Верхня смужка зображує час, коли світло було ввімкнено (світла), або вимкнено (заштрихована).
ФІГ. 10 - Порівняння білків, асоційованих з фотосинтетичними комплексами рослини дикого типу та мутантних ліній САОЇ Сатеїіпа.
ФІГ. 11А-О - Вплив інгібування антенного комплексу за допомогою САОЇїі на накопичення крохмалю у Сатеїїйпа та кількість гранул на поперечний розріз тилакоїда при дослідженні за допомогою електронного мікроскопу.
ФІГ. 12 - Мутантні рослини САОЇї Сатеїїйнпа порівняно з рослинами дикого типу мали більше листя та подовжений термін життя.
ФІГ. 13 - Мутантна лінія САОЇ Сатеїіпа (САОЇ 8-1; співвідношення СТІ а/о дорівнює 6) віком три тижні у вегетаційному досліді росте швидше за лінію дикого типу (співвідношення СП а/р дорівнює 3).
ФІГ. 14 - Порівняння лінії САОЇї (САОЇї 8-1) з лінією дикого типу щодо ваги рослини, ваги стручків та кількості стручків.
ФІГ. 15 - Конструкція для трансформації Агарідорзіз для одержання лінії, як описано в прикладі 4. Фізична карта Ті-плазміди Адгорасієгічшт рр110-САО-МАВ-сар-по5. Кістяк РЬ110 застосовували для розташування гена Сао Агарідорхіз з КЕ (світлочутливим елементом)
СНіатудотопав, злитим на 5'-кінці гена Сао Агарідорзі5, під керуванням промотора САО (САО- рго) та термінатора САО (САО-їепгт) Агабрідорзіб; а також гена МАВІ (з Спіатудотопав) під керуванням залежного від світла промотора саб та термінатора поз). Т-ОМА І В/АВ -- ліва/права
Зо межа. Послідовності ДНК гена Сао з Агабідорзі5 знаходяться нижче (відносно промотора) або вище (відносно термінатора), отже трансляція гена регулюється тим самим промотором та термінатором, що й у рослини, що росте.
ФІГ. 1ба являє собою схематичне зображення генної конструкції, що застосовується для індукції БіЕнМА-сайленсінгу генів САО в С. заїїма. ФІГ. 1665 являє собою порівняння фенотипів росту рослин дикого типу та трансгенних рослин віком три тижні. ФІГ. 1бс являє собою порівняння розміру повністю розвинених стручків у ліній УУТ, СЕ І-І, СА Н-Ї та СК М-Н. Розвиток стручків у ліній СК Н-ЇІ та СК М-Н не порушений, у той час як стручки СЕК М-Н є набагато дрібнішими у зрілому стані. Масштабна лінійка, 1 см.
На ФІГ. 17А зображені криві залежності фотосинтезу від насичення світлом у УМТ, СЕК І-І, СА
Н-Ї та СК У-Н. На ФІГ. 17В зображене нефотохімічне гасіння (МРО) у М/Т, СК І-І, СВ Н-Ї та СК
У-Н. Листя піддавали впливу актинічного світла протягом 150 с (800 мкмоль фотонів м-2с-1; біла смужка), з подальшою темновою релаксацією протягом 150 с (чорна смужка).
ФІГ. 18а-т включають порівняння структури тилакоїдів та складу комплексу РБІЇ у рослин
МЛ та трансгенних організмів СК. На панелях а-п проілюстровані електронні мікрофотографії мембран тилакоїдів від ліній дикого типу та СЕ, одержані за допомогою трансмісійної електронної мікроскопії. Листки рослин дикого типу та СЕ І-І, СА Н-Ї, та СЕ М-Н віком три тижні фіксували негайно через З год. після початку світлової фази фотоперіоду росту та готували для трансмісійної електронної мікроскопії. Зрізи хлоропластів показані для рослин дикого типу (а та е), СВ І-І (Б та Ю), СЕ. Н-Ї (с та 9) та СК У-Н (й та ПМ). Лінійки на верхній та нижній панелях мають довжину 50 нм та 100 нм відповідно.
Фізичні параметри тилакоїдів у МУТ та мутантних ліній: () товщина подвійних мембран тилакоїдів у М/П та мутантів СЕ І-І, СА Н-Ї, та СЕ М-Н, (Ї) товщина просвіту у МЛ та мутантів СЕ, (К) кількість тилакоїдів на грану у рослин дикого типу та мутантів. Показані середня та максимальна кількість тилакоїдів на стопку, (І) кількість гранул крохмалю на зріз хлоропластів у
УМ та мутантів СЕ І-І, СА Н-Ї та СК М-Н.
На панелі т зображений блакитний нативний електрофорез в поліакриламідному гелі (ВМ-
РАСЕ) утворення суперкомплексу РБЇЇ залежно від поширеності СПІ 5. Мембрани тилакоїдів (8 мкг хлорофілу), виділені з дикого типу та ліній СК І-І, СА Н-Ї, та СК М-Н, солюбілізували за кінцевої концентрації 1 95 (вага/об'єм) 4-ОМ та піддавали ВМ-РАСЕ. Позначення комплексів бо фотосистем надані ліворуч від панелі. Суперкомплекси РЗБІЇ визначені наступним чином: 5С1
(С25 або С2М), 5С2 (0252 та С25М), 5СЗ (С252М) та 5С4 (С252М2).
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Якщо не визначено іншим чином, усі технічні та наукові терміни, які застосовуються у даному документі, мають такі ж значення, які зазвичай зрозумілі фахівцю в галузі техніки, до якої належить даний винахід. Хоча способи та матеріали, аналогічні або еквівалентні тим, що описані у даному документі, можна застосовувати під час втілення на практиці ілюстративних варіантів здійснення, придатні способи та матеріали описані нижче. Усі публікації, заявки на патенти, патенти та інші посилання, зазначені у даному документі, включені за допомогою посилання в своїй повноті. У випадку суперечностей даний опис, включно з визначеннями, матиме переважну силу. Крім того, матеріали, способи та приклади слугують лише для цілей ілюстрації та не призначені бути обмежувальними.
Як використовується у даному документі, форми однини включають посилання на об'єкти в множині, якщо з контексту чітко не випливає інше. Отже, наприклад, посилання на "молекулу" включає одну або більше таких молекул, "реагент" включає один або більше таких різних реагентів, посилання на "антитіло" включає одне або більше таких різних антитіл, а посилання на "спосіб" включає посилання на еквівалентні стадії та способи, відомі фахівцям в даній галузі, які можна модифікувати або застосовувати замість способів, описаних у даному документі.
Якщо передбачений діапазон значень, слід розуміти, що також конкретно розкрито кожне проміжне значення, до десятої частки одиниці виміру нижньої межі, від верхньої до нижньої межі даного діапазону, якщо контекст чітко не диктує інше. Кожний більш малий діапазон від будь-якого зазначеного значення або проміжного значення в зазначеному діапазоні до будь- якого іншого зазначеного значення або проміжного значення в такому зазначеному діапазоні охоплюється даним винаходом. Верхні та нижні межі таких більш малих діапазонів незалежно можуть бути включені або виключені з діапазону, та кожний діапазон, в якому будь-яка, жодна або обидві межі включені в більш малі діапазони, також охоплюються даним винаходом, за винятком будь-якої конкретно виключеної межі у вказаному діапазоні. Якщо вказаний діапазон включає одну або обидві межі, діапазони, що виключають будь-яку або обидві з цих включених меж, також включені в даний винахід.
Терміни "приблизно" або "наближено" означають конкретне значення в межах діапазону допустимої похибки, як визначено фахівцем в даній галузі, що частково буде залежати від того, як значення вимірюється або визначається, тобто обмежень системи вимірювання. Наприклад, "приблизно" може означати в межах 1 або 2 стандартних відхилень від середнього значення. Як альтернатива, "приблизно" може означати плюс або мінус діапазон до 20 95, переважно до 10 95, більш переважно до 5 95.
Як використовується у даному документі, терміни "клітина", "клітини", "клітина-хазяїн" та "клітини-хазяї" використовуються взаємозамінно та охоплюють будь-які клітини, та переважно включають клітини рослин та водоростей. Усі такі позначення включають клітинні популяції та потомство клітин. Отже, терміни ""трансформанти" та ""трансфектанти" включають початкову піддану впливу клітину та клітинні лінії що походять від неї, не беручи до уваги кількість перенесень.
Як використовується у даному документі, "контрольна рослина" означає рослину, що не містить рекомбінантну ДНК, яка експресує білок або елемент, що надає посилену ознаку.
Контрольна рослина слугує для ідентифікації та відбору трансгенної рослини, яка має посилену ознаку. Придатна контрольна рослина може являти собою нетрансгенну рослину батьківської лінії, яку застосовували для одержання трансгенного організму, тобто не має рекомбінантної
ДНК. Придатний контрольний організм у деяких випадках може являти собою потомка гемізиготної трансгенної рослини, який не містить рекомбінантної ДНК, що має назву негативний сегрегант.
Вираз "консервативна амінокислотна заміна" або "консервативна мутація" стосується заміщення однієї амінокислоти іншою амінокислотою, яка має спільні характеристики з амінокислотою, що заміщується. Функціональним шляхом визначення спільних характеристик у окремих амінокислот є аналізі нормалізованих частот амінокислотних змін у відповідних білках гомологічних організмів (5спиІ2 апа Зспіптег, 1979). За результатами таких аналізів можна визначити групи амінокислот, при цьому амінокислоти в межах групи обмінюють переважно одна з однією та отже найбільш подібні одна іншій з точки зору їх впливу на загальну структуру білка (5спиі2 апа 5спігтег, 1979).
Приклади груп амінокислот, визначених таким шляхом, включають "групу заряджених полярних амінокислот", яка складається з глутамінової кислоти (Сім), аспарагінової кислоти (Азр), аспарагіну (Азп), глутаміну (Сп), лізину (Гуз), аргініну (Агод) та гістидину (Ні); "групу бо ароматичною або циклічних амінокислот", яка складається з проліну (Рго), фенілаланіну (Ре),
тирозину (Туг) та триптофану (Тгр); та "групу аліфатичних амінокислот", яка складається з гліцину (Су), аланіну (Аа), валіну (Маї), лейцину (Геи), ізолейцину (Пе), метіоніну (Ме), серину (Зег), треоніну (ТПг) та цистеїну (Суз).
В межах кожної групи також можна ідентифікувати підгрупи, наприклад групу заряджених полярних амінокислот можна розділяти на підгрупи, що складаються з "підгрупи позитивно заряджених амінокислот", яка складається з Гуз, Агд та Нів; "підгрупи негативно заряджених амінокислот»", яка складається з Сі та Авр, та "підгрупи полярних амінокислот", яка складається з Ап та Сіп. Групу ароматичну або циклічних амінокислот можна розділяти на підгрупи, що складаються з "підгрупи амінокислот з атомом азоту в кільці", яка складається з
Рго, Ні5 та Тгр; та "підгрупи фенільних амінокислот", яка складається з Рпе та Туг. Групу аліфатичних амінокислот можна розділяти на підгрупи, що складаються з "підгрупи великих аліфатичних неполярних амінокислот", яка складається з Маї, Геи та Пе; "підгрупи аліфатичних слабко полярних амінокислот", яка складається з Меї, Зег, ТНг та Су; та "підгрупу амінокислот з малим залишком", яка складається з Су та Аа.
Приклади консервативних мутацій включають заміни амінокислот в межах вищезазначених підгруп, наприклад, Гух на Агд та навпаки, завдяки чому може бути збережений позитивний заряд; Сім на Ар та навпаки, внаслідок чого може бути збережений негативний заряд; Зег на
Тиг, внаслідок чого може бути збережена вільна -ОН; та Сіп на Азп, внаслідок чого може бути збережена вільна -МН2.
Термін "мотив консенсусної послідовності домену холодового шоку (С5ООС5)» або "мотив с5рОсСЗ" стосується послідовності нуклеїнової кислоти, яка істотно ідентична будь-якій з «ЕО
ІО МО 6-14. С5рОСЗ5 стосується групи послідовностей нуклеїнових кислот, які слугують як сайти зв'язування для білків, які мають РНК-зв'язувальні домени, що можуть слугувати факторами транскрипції. Такі послідовності домену холодового шоку виявлені в різних, очевидно неспоріднених білках та всі функціонально контролюють експресію білка. "Посилена ознака" або "посилений фенотип", як використовується у даному документі, стосується вдосконалення ознаки рослини, яке можна виміряти, включаючи без обмеження збільшення виходу, включно з підвищенням виходу за нестресових умов та підвищенням виходу за умов стресу під дією навколишнього середовища. Більшість посилених ознак можуть впливати на "вихід", включаючи без обмеження кількість клітин в рідкій культурі одноклітинної або багатоклітинної рослини, підвищені ефективності використання світла рослиною, кількість виробництва біомаси рослиною, кількість виробництва біопалива рослиною, кількість вибраних запасних матеріалів в рослині та кількість сполук, включаючи без обмеження агар, альгінат, карагенан, крохмаль, омега жирні кислоти, ліпіди, коензим 010, астаксантин та р-каротин.
Нутрицевтик, термін, в якому комбінуються слова "живлення" та "фармацевтичний", являє собою їжу або харчовий продукт, який забезпечує переваги для здоров'я та медичні переваги, включаючи запобігання та лікування захворювання. Такі продукти можуть варіювати від виділених поживних речовин, дієтичних добавок та спеціальних дієт до одержаних методами генетичної інженерії продуктів харчування, продуктів на основі лікарських трав та підданих обробці продуктів харчування, таких як пластівці, супи та напої. Інші посилені ознаки включають висоту рослини, кількість стручків, положення стручка на рослині, число міжвузлів, кількість випадків розтріскування стручків, розмір зерна, ефективність утворення бульб та фіксації азоту, ефективність засвоєння поживних речовин, стійкість до біотичного та абіотичного стресу, засвоєння вуглецю, розташування рослини у просторі, стійкість до вилягання, відсоток проростання насіння, потужність паростків та ювенільні ознаки. Інші ознаки, які можуть впливати на вихід, включають ефективність проростання (включаючи проростання за умов стресу), швидкість росту (включаючи швидкість росту за умов стресу), кількість колосків, кількість насінин за рік, розмір насіння, склад насіння (крохмаль, олія, білок) та характеристики наливу насіння.
Термін "експресія", як використовується у даному документі, стосується транскрипції та/або трансляції нуклеотидної послідовності в клітині. Рівень експресії потрібного продукту в клітині можна визначати на основі або кількості відповідної мРНК, що присутня в клітині, або кількості потрібного поліпептиду, який кодується вибраною послідовністю. Наприклад, мРНК, яка транскрибована з вибраної послідовності, можна кількісно оцінювати за допомогою нозерн-блот гібридизації, захисту РНК від рибонуклеаз, гібридизації іп 5йи з клітинною РНК або за допомогою
ПЛР. Білки, що закодовані у вибраній послідовності, можна кількісно оцінювати за допомогою різноманітних способів, включаючи без обмеження, наприклад, ЕГІ5ЗА, вестерн-блотинг, радіоїмунологічний аналіз, імунопреціпітацію, аналіз на біологічну активність білка або за допомогою імунофарбування білка після ЕАС5-аналізу. бо "Послідовності контролю експресії" являють собою регуляторні послідовності нуклеїнових кислот, та можуть передбачати одне або більше з наступного: промотори, лідерні послідовності, енхансери, інтрони, мотиви розпізнавання РНК або білки зв'язування з ДНК, сигнали поліаденілювання, термінатори, ділянки внутрішньої посадки рибосоми (ІКЕ5) тощо, які мають здатність до впливу на транскрипцію або трансляцію кодуючої послідовності в клітині.
Ілюстративні послідовності контролю експресії описані в соєдаеєї; Сепе Ехргеззіоп Тесппоіоду:
Меїподз іп Епгутоіоду 185, Асадетіс Ргез5, Зап Оіедо, Саїї. (1990). "Ген" являє собою послідовність нуклеотидів, яка кодує функціональний "продукт гена". Як правило, продуктом гена є функціональний білок. Однак продуктом гена може також бути інший тип молекули в клітині, такий як РНК (наприклад, тРНК або рРНК). Ген може також містити регуляторні (тобто некодуючі) послідовності, а також кодуючі послідовності та інтрони.
Ілюстративні регуляторні послідовності являють собою промотори, енхансери та термінатори.
Ділянка гена, що транскрибується, може також являти собою нетрансльовані ділянки, зокрема інтрони, 5'-ч-етрансльовану ділянку (5'-ОТК) та 3'-нетрансльовану ділянку (3- ОТ).
Термін "гетерологічна ДНК" стосується ДНК, яку було введено в клітину, або молекули нуклеїнової кислоти, яка походить з іншого джерела, або яка походить з того самого джерела, але розташована в іншому контексті, як наприклад множинні копії нативного гена, що введені в тандемі, або промотор, що керував одним геном у дикого типу, керує іншим або введеним геном.
Термін "висока інтенсивність світла" стосується потоку фотонів приблизно 500 мкЕ м-2с-1 або більше; навпаки термін "низька інтенсивність світла" стосується потоку фотонів приблизно 50 мкЕ м-2с-1 або менше.
Терміном "гомологія" описують математичне порівняння схожості послідовностей, яке застосовують для визначення генів або білків, які характеризуються схожими функціями або мотивами. Послідовності нуклеїнових кислот та білків за даним винаходом можна застосовувати як "шукану послідовність" для здійснення пошуку в загальнодоступних базах даних, наприклад, для визначення інших членів родини, споріднених послідовностей або гомологів. Такі пошуки можна здійснювати із застосуванням програм МВІ А5Т та ХВГІ А5Т (версії 2.0) від Айбспи! (Айбеспц! єї аї., 1990). ВГА5Т-пошуки нуклеотидів можна виконували за допомогою програми МВІАЗТ, оцінка - 100, довжина слова - 12, щоб отримати нуклеотидні послідовності, гомологічні молекулам нуклеїнової кислоти за даним винаходом. ВІ А5Т-пошуки білків можна виконували за допомогою програми ХВІ А5Т, оцінка - 50, довжина слова - 3, щоб отримати амінокислотні послідовності, гомологічні білоовим молекулам за даним винаходом.
Для отримання вирівнювань з гепами з метою порівняння можна використовувати Саррей
ВІ А5Т, як описано в Айб5спиці (Ай5епиї еї аї., 1997). У разі застосування програм ВГ А5Т і Саррей
ВГА5БТ можна застосовувати параметри за замовчуванням відповідних програм (наприклад,
ІГАЗТ і ХВІ АЗТ).
Термін "гомологічний" стосується взаємозв'язку між двома білками, які мають "спільне еволюційне походження", включаючи білки з надродин (наприклад, надродини імуноглобулінів) у тварин одного виду, а також гомологічні білки з тварин різних видів (наприклад, поліпептид легкого ланцюга міозину тощо. (КеескК еї аї., 1987). Такі білки (та нуклеїнові кислоти, що їх кодують) характеризуються гомологією послідовностей, судячи з схожості їхніх послідовностей, що виражена або відсотком ідентичності, або наявністю специфічних залишків або мотивів та консервативних положень.
Як використовується у даному документі, термін "збільшення" або споріднені терміни "збільшений", "підвищення" або "підвищений" стосуються статистично значущого збільшення.
Щоб уникнути неясності, звичайно дані терміни відносяться до щонайменше 10 95 збільшення даного параметра, та можуть охоплювати щонайменше 20 95 збільшення, 30 95 збільшення, 40 95 збільшення, 50 95 збільшення, 60 95 збільшення, 70 95 збільшення, 80 95 збільшення, 90 95 збільшення, 95 95 збільшення, 97 95 збільшення, 99 95 або навіть більше ніж 100 95 збільшення понад контрольне значення.
Термін "виділений", при застосуванні для опису білка або нуклеїнової кислоти, означає, що матеріал був визначений та відокремлений та/або витягнутий з компонента його природного навколишнього середовища. Контамінантними компонентами свого природного навколишнього середовища є матеріали, які, як правило, заважатимуть використанню білка або нуклеїнової кислоти в дослідницьких, діагностичних або терапевтичних цілях, та вони можуть включати ферменти, гормони та інші білкові або небілкові розчинені речовини. У деяких варіантах здійснення білок або нуклеїнова кислота будуть очищатися щонайменше до 95 95 однорідності, як визначено за допомогою 505-РАСЕ за невідновлюваних або відновлювальних умов із застосуванням барвника Кумассі блакитний або, переважно, срібла. Виділений білок включає бо білок іп 5йи в рекомбінантних клітинах, оскільки щонайменше один компонент природного навколишнього середовища білка, що представляє інтерес, не буде присутнім. Зазвичай, однак, виділені білки та нуклеїнові кислоти будуть одержувати за допомогою щонайменше однієї стадії очищення.
Як використовується у даному документі, "ідентичність" означає відсоткову частку ідентичних нуклеотидних або амінокислотних залишків у відповідних положеннях двох або більше послідовностей, якщо ці послідовностей піддані вирівнюванню для максимального збільшення збігу послідовностей, тобто з урахуванням гепів та вставок. Ідентичність можна легко підрахувати за допомогою відомих способів, включаючи без обмеження писані в
Сотршиїанопа! Моїесшіаг Віоіоду, ГевзК, А. М., єй., Охіога Опімегейу Ргевз5, Мем МоїКк, 1988;
Віосотриііпа: Іптогтаїййс5 апа Сепоте Рго|есів, тій, О. МУ., єд., Асадетіс Ргез5, Мем/ Могк, 1993; Сотршиїег Апаїузі5 ої Зедиєпсе Оаїа, Рап І, Сптініп, А. М., апа Стініп, Н. С, ед5., Нитапа
Ргезв, Мем дегзеу, 1994; Зедиепсе Апаїувів іп МоїІесшціаг Віоіоду, хоп Неїіпіє, С., Асадетіс Ргев5, 1987; та Зедиепсе Апаїузів Ргїтег, сгір5Ком, М. апа Оемегеих, 9., ей5., М БіосКіоп Ргев55, Мем
УогК, 1991; та Сапгійо, Н., апа Гіртап, 0., ЗБІАМ .). Арріїейа Маїйй., 48: 1073 (1988). Розроблені способи визначення ідентичності, що забезпечують найбільший збіг між досліджуваними послідовностями. Більш того, способи визначення ідентичності кодифіковані в загальнодоступних комп'ютерних програмах.
Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння можна проводити, наприклад, за допомогою алгоритму локальної гомології, описаному в Зтіїй 85 Умаїептап 1981, за допомогою алгоритму вирівнювання гомології, описаному в Мееаєтап 5 МУМУсп5сп 1970, за допомогою способу пошуку схожості, описаному в Реаг:хоп 4. І іртап 1988, за допомогою комп'ютеризованої реалізації цих алгоритмів (ЗАР, ВЕЗТЕРІТ, РАБТА та ТЕАБТА в СО УМіб5сопвіп РаскКаде, доступному від Ассеїгу5, Іпс., Сан-Дієго, Каліфорнія, Сполучені Штати Америки) або за допомогою візуального перегляду. Див. загальні посилання, як наприклад Аїй5спиЇї, 5. Р. еї аї., чу.
Моїес. Віої. 215: 403-410 (1990) та Ай5сПиї еї а). Мис. Асіаз Кев. 25: 3389-3402 (1997).
Одним прикладом алгоритму, що є придатним для визначення відсотка ідентичності послідовностей і подібності послідовностей, є алгоритм ВІ АБ5Т, який описаний в (Ай5спПиЇ, 5., еї аі,, МСВІ МІ М МІН Веїнезаа, Ма. 20894; 8 Авспиі, 5., еї аї., у. Мої. ВіоіІ. 215: 403-410 (1990).
Програмне забезпечення для виконання аналізів ВІА5БТ є загальнодоступним завдяки
Зо Національному центру біотехнологічної інформації (Маїйопа! Сепіег ог Віоїесппоіоду
Іптогітайіоп). Цей алгоритм передбачає спочатку визначення пар послідовностей з високою оцінкою (Н5Р) шляхом виявлення коротких "слів" довжиною МУ в шуканій послідовності, які або збігаються, або задовольняють деякій позитивній пороговій оцінці Т, у випадку вирівнювання зі "словом" тієї самої довжини в послідовності з бази даних. Т має назву поріг оцінки сусіднього "слова".
Ці початкові збіги сусідніх "слів" виконують роль зародків для ініціації пошуків для знаходження більш довгих НОР, що їх містять. Збіги "слів" згодом подовжують в обидва боки уздовж кожної послідовності, доки можна підвищувати сукупну оцінку вирівнювання. Сукупні оцінки для нуклеотидних послідовностей обчислюють із застосуванням параметрів М (винагорода за пару залишків, що збігаються; завжди; 0) та М (штраф за залишки, що не збігаються; завжди; 0). Для обчислення сукупної оцінки у випадку амінокислотних послідовностей застосовують матрицю замін. Розширення збігів "слів" в кожному напрямку зупиняють, якщо: сукупна оцінка вирівнювання знижується на значення Х від її максимального досягнутого значення; сукупна оцінка знижується до нуля або нижче внаслідок накопичення одного або декількох вирівнювань залишків з негативною оцінкою; або досягають кінця будь- якої з послідовностей. Параметри МУ, Т і Х алгоритму ВІ А5Т визначають чутливість і швидкість вирівнювання. У програмі ВГА5БТМ (для нуклеотидних послідовностей) застосовуються такі значення за замовчуванням: довжина слова (М/) 11, очікування (Е) 10, відсікання 100, М-5, М--4 та порівняння обох ниток. У програмі ВІГАБТР для амінокислотних послідовностей застосовуються такі значення за замовчуванням: довжина слова (УМ) 3, очікування (Е) 10 та матриця замін В ОБИМб2.
Окрім підрахунку відсотку ідентичності послідовностей алгоритм ВІ АБТ також виконує статистичний аналіз схожості двох послідовностей. Однією мірою схожості, що надається алгоритмом ВІАБТ, є найменша сумарна ймовірність (Р(М)), яка забезпечує показник ймовірності того, що збіг між двома нуклеотидними або амінокислотними послідовностями буде випадковим. Наприклад, досліджувану послідовність нуклеїнової кислоти вважають схожою з еталонною послідовністю, якщо найменша сумарна ймовірність під час порівняння досліджуваної послідовності нуклеїнової кислоти з еталонною послідовністю нуклеїнової кислотою становить в одному варіанті здійснення менш ніж приблизно 0,1, в іншому варіанті бо здійснення менш ніж приблизно 0,01 і в ще одному варіанті здійснення менш ніж приблизно
0,001.
Термін "олія", як використовується у даному документі, стосується будь-якої комбінації ліпідних фракцій біомаси. "Ліпід", "ліпідна фракція" або "ліпідний компонент", як використовується у даному документі, можуть включати будь-який вуглеводень, розчинний в неполярних розчинниках, та нерозчинний або відносно нерозчинний у воді. Ліпідні фракції можуть включати без обмеження вільні жирні кислоти, воски, стероли та естери стеролів, триацилгліцериди, діацилгліцериди, моноацилгліцериди, токофероли, ейкозаноїди, глікогліцероліпіди, глікосфінголіпіди, сфінголіпіди та фосфоліпіди. Ліпідні фракції також можуть містити інші жиророзчинні матеріали, такі як хлорофіл та інші пігменти водоростей, включаючи, наприклад, антиоксиданти, такі як без обмеження астаксантин, зеаксантин та кантаксантин.
Терміни "пов'язані функціональним зв'язком" та "функціонально пов'язані", як взаємозамінно використовується у даному документі, стосуються розташування двох або більше нуклеотидних послідовностей або елементів послідовностей таким способом, який дозволяє їм функціонувати способом, яким вони мають функціонувати. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом містить один або більше елементів ДНК, здатних до відкривання хроматину та/або підтримування хроматину в відкритому стані, функціонально пов'язаних з нуклеотидною послідовністю, що кодує рекомбінантний білок. В інших варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти може додатково містити одну або більше нуклеотидних послідовностей ДНК або РНК, вибраних з: (А) нуклеотидної послідовності, що здатна збільшувати трансляцію; (Б) нуклеотидної послідовності, що здатна збільшувати секрецію рекомбінантного білка поза межі клітини; (с) нуклеотидної послідовності, що здатна підвищувати стабільність мРНК та (4) нуклеотидної послідовності, що здатна зв'язувати діючий в транс-положенні фактор для модулювання транскрипції або трансляції, при цьому такі нуклеотидні послідовності функціонально пов'язані з нуклеотидною послідовністю, яка кодує рекомбінантний білок. Звичайно, проте не обов'язково, нуклеотидні послідовності, що функціонально пов'язані, є суміжними та, за необхідності, знаходяться в рамці зчитування.
Однак, хоча функціонально пов'язаний елемент ДНК, здатний до відкривання хроматину та/або підтримування хроматину в відкритому стані, звичайно розташований вище нуклеотидної послідовності, яка кодує рекомбінантний білок; він не обов'язково є суміжними з нею.
Зо Функціональний зв'язок різних нуклеотидних послідовностей забезпечують за допомогою рекомбінантних способів, добре відомих з рівня техніки, наприклад, із застосуванням методів
ПЛР, за допомогою лігування в придатні сайти рестрикції або за допомогою гібридизації. Згідно з загальноприйнятною практикою можна застосовувати синтетичні олігонуклеотидні лінкери або адаптори, якщо придатні сайти рестрикції відсутні.
Терміни "полінуклеотид", "нуклеотидна послідовність" та "нуклеїнова кислота", що застосовуються взаємозамінно у даному документі, стосуються полімерної форми нуклеотидів будь-якої довжини, як рибонуклеотидів, так і дезоксирибонуклеотидів. Ці терміни включають одно-, дво- або триниткову ДНК, геномну ДНК, кКДНК, РНК, гібрид ДНК ії РНК або полімер, що містить пуринові та піримідинові основи або інші природні, хімічно, біохімічно модифіковані, неприродні або дериватизовані нуклеотидні основи. Кістяк полінуклеотиду може містити цукри та фосфатні групи (що зазвичай можна виявити в РНК або ДНК), або модифіковані або заміщений цукри або фосфатні групи. Крім того, двонитковий полінуклеотид можна одержувати з однониткового полінуклеотидного продукту хімічного синтезу або шляхом синтезу комплементарного ланцюга та гібридизації ниток за відповідних умов, або шляхом синтезу комплементарного ланцюга де помо із застосуванням ДНК-полімерази разом в відповідним праймером. Молекула нуклеїнової кислоти може набувати різних форм, наприклад, являти собою ген або фрагмента гена, один або більше екзонів, один або більше інтронів, мРНК, тРНК,
РРНК, рибозими, кКДНК, рекомбінантні полінуклеотиди, розгалужені полінуклеотиди, плазміди, вектори, виділену ДНК з будь-якою послідовністю, виділену РНК з будь-якою послідовністю, зонди з нуклеїнової кислоти та праймери. Полінуклеотид може містити модифіковані нуклеотиди, такі як метильовані нуклеотиди та аналоги нуклеотидів, урацил, інші цукри та зв'язувальні групи, такі як фторрибоза та тіоат, та нуклеотидні розгалуження. Як використовується у даному документі, полінуклеотид містить не лише основи природного походження, такі як А, Т, М, С, та б, а також включає будь-які їхні аналоги або модифіковані форми цих основ, як наприклад метильовані нуклеотиди, міжнуклеотидні модифікації, такі як незаряджені зв'язки та тіоати, застосування аналогів цукрів, та модифіковані та/або альтернативні структури кістяка, такі як поліаміди. "Промотор" являє собою регуляторну ділянку
ДНК, здатну зв'язувати РНК-полімеразу в клітині та ініціювати транскрипцію кодуючої послідовності, що розташована нижче (3'-напрямок). Як використовується у даному документі, бо промоторна послідовність зв'язана на її 3'-кінці з сайтом ініціації транскрипції та простягається вгору (5'--сапрямок) та містить мінімальну кількість основ або елементів, необхідних для ініціації транскрипції на рівнях, які можна виявляти як такі що перевищують фонові. Сайт ініціації транскрипції (який зручно визначати за допомогою картування з нуклеазою 51) може знаходитися в межах промоторної послідовності, а також білок-зв'язувальних доменів (консенсусні послідовності), які відповідають за зв'язування РНК-полімерази. Прокаріотичні промотори містять послідовності Шайна-Дальгарно на додаток до консенсусних послідовностей -10 та -35.
Велика кількість промоторів, включаючи конститутивні індуковні та репресовні промотори, з багатьох різних джерел добре відома з рівня техніки. Типові джерела включають, наприклад, типи клітин водоростей, вірусів, ссавців, комах, рослин, дріжджів та бактерії, та придатні промотори з цих джерел легко доступні або їх можна одержати синтетично на основі послідовностей, що є загальнодоступними онлайн, або, наприклад, з депозитаріїв, таких як
АТСС, а також інших комерційних або окремих джерел. Промотори можуть бути однонаправленим (тобто ініціювати транскрипцію в одному напрямку) або двонаправленими (тобто ініціювати транскрипцію або в 3'-напрямку, або в 5'-напрямку). Необмежувальні приклади промоторів, активних в рослинах, включають, наприклад, промотор нопалінсинтази (по5) та промотори октопінсинтази (005), що містяться на плазмідах Адгобасіегішт Ішптегасієп5, які індукують утворення пухлин, та для способу, де з послідовностей вибрано послідовність, націлену на певну тканину, промотори, такі як промотор 195 або 355 вірусу мозаїки цвітної капусти (Самум) (патент США Ме 5352605), промотор 355 Самм з дуплікованим енхансером (патенти США МоМо 5164316; 5196525; 5322938; 5359142 та 5424200), та промотор 355 вірусу мозаїки ранника (ЕММУ) (патент США Мо 5378619). Такі промотори та багато інших були застосовані в створенні конструкцій для експресії трансгенів в рослинах або рослинних клітинах. Інші застосовні промотори описані, наприклад, в патентах США МоМо 5391725; 5428147; 5447858; 5608144; 5614399; 5633441; 6232526 та 5633435, всі з яких включені у даний документ шляхом посилання. Додаткові придатні промотори, що індукуються світлом, включають без обмеження: (1) РРС2т!1 (фосфоєнолпіруваткарбоксилаза кукурудзи) Кайзсі еї аІ. (2001) Ріапі МоїІєсшаг Віоіоду 45, 1-15; (2) Кро5 (рибулозобісфосфаткарбоксилаза рису)
Мотига еї аї. (2000) Те Ріапі доштаї 22(3), 211-221 (3) Кса (Кибізсо активаза рису) Мапа еї аї.
Зо (2012) Віоспетісаі апа Віорпузісаї Везеагтсі Соттипісайоп5 418, 565-570 (4) ІНСР2 (свіглозбиральний білок зв'язування хлорофілу а/ь рису) Тада єї аї. (1991), ЕМВО 4. 10(7), 1803- 1808 (5) сугВРавзе (цитозольна фруктозо-1,6-бісфосфатаза рису) зі еї а!., 2002, Асіа Воїапіса
Зіпіса. 44(11), 1339-1345. У переважному варіанті здійснення промотор буде являти собою промотор, що індукується світлом, такий як промотор з гро5, САВІ1, бо, рорОо, РРОК, РРС2т!,
Кса, НСР2, сугВРавзе тощо.
Термін "очищений", як використовується у даному документі, стосується матеріалу, який був виділений за умов, які знижують або усувають наявність неспоріднених матеріалів, тобто контамінантів, включаючи природні матеріали, з яких матеріал одержують. Наприклад, очищений білок переважно фактично не містить інші білки або нуклеїнові кислоти, з якими він асоційований в клітині. Способи очищення добре відомі з рівня техніки. Як використовується у даному документі, термін "фактично не містить" використовують в операційному сенсі в контексті аналітичного дослідження матеріалу. Переважно, очищений матеріал, що фактично не містить контамінантів, є чистим щонайменше на 50 95; більш переважно є чистим щонайменше на 75 95, та ще більш переважно є чистим щонайменше на 95 95. Чистоту можна оцінювати за допомогою хроматографії, гель-електрофорезу, імуноаналізу, аналізу складу, біологічного аналізу та інших способів, відомих з рівня техніки. Термін "фактично чистий" вказує на найвищій ступінь чистоти, якого можна дося!їти із застосуванням звичайних методик очищення, відомих з рівня техніки.
Термін "схожість послідовностей" стосується ступеня ідентичності або відповідності послідовностей нуклеїнових кислот або амінокислотних послідовностей, які можуть мати спільне еволюційне походження або ні (див. КеескК еї аЇ., вище). Однак за звичайного застосування та в даній заявці термін "гомологічний", якщо він модифікується прислівником, таким як "високо", може стосуватись схожості послідовностей та може буде пов'язаний зі спільним еволюційним походженням або ні.
У деяких варіантах здійснення дві послідовності нуклеїнових кислот є "істотно гомологічними" або "істотно схожими", якщо щонайменше приблизно 85 95, та більш переважно щонайменше приблизно 90 95 або щонайменше приблизно 95 95 нуклеотидів збігаються уздовж визначеної довжини послідовностей нуклеїнової кислоти, як визначено за відомими алгоритмом порівняння послідовностей, таким як ВІ А5Т, ЕАЗТА, ОМА зігідег, СГО5ТАГЇ. тощо. Прикладом 60 такої послідовності є алельний або видовий варіант конкретних генів за даним винаходом.
Послідовності, які є істотно гомологічними, також можна ідентифікувати за допомогою гібридизації, наприклад, в експерименті із Саузерн-блот гібридизацією, наприклад, за жорстких умов, як визначено для такої конкретної системи.
Термін "специфічний" застосовується в ситуації, за якої один член специфічної пари зв'язування не буде проявляти жодного істотного зв'язування з молекулами, відмінними від його специфічного партнера(ів) по зв'язуванню. Термін застосовується в ситуації, за якої дві комплементарні полінуклеотидні нитки можуть гібридизуватися разом, однак кожний однонитковий полінуклеотид за жорстких умов гібридизації демонструє слабке зв'язування з іншими полінуклеотидними послідовностями або його відсутність.
Так само, в конкретних варіантах здійснення даного винаходу дві амінокислотні послідовності є "істотно гомологічними" або "істотно схожими", якщо більше ніж 90 95 амінокислотних залишків є ідентичними. Дві послідовності є функціонально ідентичними, якщо більше ніж приблизно 9595 амінокислотних залишків є схожими. Переважно схожі або гомологічні поліпептидні послідовності ідентифікують за допомогою вирівнювання із застосуванням, наприклад, групи програм СО (Сепеїйс5 Сотршег ОСгоир, версія 7, Медісон,
Вісконсин), або із застосуванням будь-яких програм та алгоритмів, описаних вище. Програма може використовувати алгоритм локальної гомології Сміта-Вотермана із параметрами за замовчуванням: штраф за створення гепа - -(14ІК), К являє собою число подовження гепа, середній збіг - І, середня відсутність збігу - -0,333.
Термін "пригнічений" в контексті "пригнічена експресія Сао" охоплює відсутність ендогенного білка хлорофіл а-оксигенази (САС) в клітині рослини, наприклад Агабідорбвів5, а також експресію білка, що відбувається, але знижена порівняно з рівнем продукції білка САО в рослині дикого типу. Термін "пригнічений" також охоплює кількість білка САО, яка є еквівалентною рівням дикого типу, але при цьому білок характеризується зниженим рівнем активності порівняно з рослинами дикого типу. Загалом, переважним є щонайменше 50 90 зменшення активності ендогенної САО, або її експресії, або щось подібне, в іншому аспекті особливо переважним є щонайменше приблизно 7595, або щонайменше приблизно 9595, або 10095 зменшення активності (тобто відсутність ендогенної активності). Умовно та для ясності абревіатура САО (усі прописні літери) буде стосуватись білка, а Сао (нижній регістр, курсив) буде стосуватись
Зо послідовності гена, якщо на інше не вказує контекст речення.
Термін "нокаут" або "рослина з нокаутом" стосується рослини, в якій специфічний ген був безпосередньо зроблений недієздатним шляхом генетичної модифікації самого гена. Цього можна досягти за допомогою багатьох різних способів, таких як вставка нонсенс-послідовності, вставка стоп-кодонів, делеція послідовності в межах гена, для зміни рамки зчитування гена, роблячи її на недієвою. Це відрізняється від контролю гену шляхом конструювання діючого в транс-положенні елемента, де контролюється експресія гена, але ген не змінюється безпосередньо для запобігання його експресії. Часто до рослин, що містять гени, які контролюються діючими в транс-положенні елементами, застосовують назву "рослини з нокдауном", для відокремлення їх у даному документі із застосуванням вищенаведеного визначення як відмінних від рослин з нокаутом.
Як використовується у даному документі, "трансгенна рослина" являє собою рослину, геном якої було змінено шляхом введення екзогенного генетичного матеріалу, наприклад, шляхом трансформації, як описано у даному документі. Термін "трансгенна рослина" застосовують для позначення рослини, одержаної внаслідок вихідної події трансформації, або потомства від подальших поколінь або схрещувань трансгенної рослини за умови, що потомство містить екзогенний генетичний матеріал в своєму геномі. Під "екзогенним" мають на увазі, що молекула нуклеїнової кислоти, наприклад, рекомбінантна ДНК, надходить ззовні в рослину, в яку її вводять. Екзогенна молекула нуклеїнової кислоти може містити ДНК природного або неприродного походження, та може походити від того самого або іншого виду рослини ніж той, в який Її вводять.
Термін ""трансформація" або "трансфекція" стосується переносу однієї або більше молекул нуклеїнової кислоти в клітину або організм. Способи введення молекул нуклеїнової кислоти в клітини включають, наприклад, трансфекцію за допомогою фосфату кальцію, трансфекцію, опосередковану ЮЕАЕ-декстраном, мікроін'єкцію, трансфекцію, опосередковану катіонними ліпідами, електропорацію, введення під час зіскоблювання, балістичне введення або інфікування вірусами або іншими інфекційними агентами. "Трансформований", ""трансфектований" або "трансгенний" в контексті клітини або організму стосується клітини або організму, в які була введена молекула рекомбінантної або гетерологічної нуклеїнової кислоти (наприклад, одна або більше ДНК-конструкцій, або РНК, або бо відповідні 5іфЖМА). Молекула нуклеїнової кислоти може стабільно експресуватися (тобто підтримуватися у функціональній формі в клітині протягом більш ніж приблизно трьох місяців) або нестабільно підтримуватися в функціональній формі в клітині протягом менше ніж три місяці, тобто експресуватися тимчасово. Наприклад, ""трансформований", ""рансформант" та "трансгенні" клітини або організми були піддані процесу трансформації та містять чужорідну нуклеїнову кислоту. Термін "нетрансформований" стосується клітин або організмів, які не були піддані процесу трансформації.
Під час здійснення даного винаходу на практиці будуть застосовуватися, якщо не вказано інше, звичайні методики хімії, молекулярної біології, мікробіології, технології рекомбінантних
ДНК та імунології, які знаходяться в межах навичок середнього фахівця в даній галузі техніки.
Такі методики пояснені в літературі. Див., наприклад, -). затбгоок, Е. Е. Егйї5сп, апа Т. Мапіаїйв, 1989, Моїесшаг Сіопіпд: А Гарогаїту Мапиа!ї, Бесопа Еайіоп, Воок5 1-3, Соїй брііпд Нагрог
ІГарогаїогу Рге55; А!ЄзибеїЇ, Е. М. еї аіІ. (1995 та періодичні доповнення; Ситепі Ргоїосої5 іп
Моїесціаг Віоіоду, глави 9, 13 і 16, дхопп Уміеу 5 5оп5, Мем/ МогК, М.У.); В. Кое, 9. Стабігеє, апа А.
Канп, 1996, ОМА Ізоїайоп апа бедиепсіпуд: Евзепіїа! Тесппідцев, Чопп УМПеу б 5опв; у. М. Роїак апа дате5 00. МеСеє, -1990, Іп 5йи НуБбгіаігайоп: Ргіпсірієє апа Ргасіїсе; Охіога Опімегтейу
Ргезв; М. 9. Сай (Едйог), 1984, Оіїдописієоїіде Зупіпевів: А Ргасіїса! Арргоасн, І Ргев5; 0. М. У.
Піеу апа 9. Е. Ранібега, 1992, Меїйоде ої Епгутоіоду: ОМА бігисіцге Рай А: Бупіпевзів апа
Рпузіса! Апаїузіє ої ОМА Меїпоа5 іп ЕпгутоіІоду, Асадетіс Ргебз5; А Напароок ої Несірев,
Веадепіх, апа ОїШег Веїегепсе ТооІ5 ог Обе аї Ше Вепсі, Едієд дапе Во5Катв апа І іпаа
Воддетх, 2002, Соїй 5ргіпд Натог І арогаїгу, ІЗВМ 0-87969-630-3. Кожний з цих загальних посібників включений у даний документ шляхом посилання.
Терміни "послідовність хлорофіл а-оксигенази", "ген хлорофіл а-оксигенази" або "Саог2" стосуються послідовності гена для ферментів, здатних синтезувати хлорофіл Б шляхом окиснення метильної групи на кільці ІЇ хлорофілу а. У літературі хлорофіл а-оксигеназа також зазначалася як хлорофіл Б-синтаза та, як використовується в даному винаході, будь-які посилання на хлорофіл рБ-синтазу вважаються такими, що однаково стосуються і хлорофіл а- оксигенази. Типові послідовності для різних видів хлорофіл а-оксигенази передбачені в
Переліку послідовностей, та гени з інших видів можна легко ідентифікувати за допомогою стандартного пошуку гомології у загальнодоступних або пропрієтарних базах даних.
Зо Терміни "хлорофіл а-оксигеназа" або "САС" стосуються всіх форм білка хлорофіл а- оксигенази, як природного походження, так і синтетичних форм. В одному аспекті хлорофіл а- оксигеназа походить з рослини. В іншому аспекті хлорофіл а-оксигеназа походить з водоростей.
Хлорофіл являє собою зелений пігмент, що міститься в хлоропластах водоростей та рослин, а також у фотосинтетичних мембранах ціанобактерій та фотосинтетичних бактерій. Він грає ключову роль у процесі фотосинтезу шляхом поглинання світла та перенесення енергії світла за допомогою резонансного перенесення енергії до реакційних центрів фотосистем.
Хлорофіл а (СП а) являє собою форму хлорофілу, яка поглинає енергію світла від фіолетово- синьої та оранжево-червоної частин електромагнітного спектру, з максимальним піком поглинання червоного кольору 659 нм. Хлорофіл Б (СПІ 5) являє собою іншу форму хлорофілу, яка також поглинає енергію світла від фіолетово-синьої та оранжево-червоної частин електромагнітного спектру, з максимальним піком поглинання червоного кольору 642 нм.
Невеликий зсув максимуму поглинання між СпІ а та СНІ Б дозволяє СПІ Б легко передавати енергію на СпІ а вниз за градієнтом енергії (від більш високого енергетичного стану до більш низького енергетичного стану) з високою ефективністю, при цьому кінцевим пунктом призначення цієї енергії є реакційні центри.
Відповідно, термін "редоко-залежні модулятори" стосується групи білків, здатних опосередковувати оборотну редоксо-залежне регуляцію транскрипції або трансляції генів. В одному аспекті такі редоко-залежні модулятори являють собою білки, які містять консервативний домен холодового шоку (мотив Ргозйе РБЗО0352; Виспег апа Ваїгоси, (в) ІЗМВ- 94; Ргосеєдіпов 2па Іпіегпайопа! Сопієгепсе оп Іпівйдепі Зувівєтв їТог Моїесшіаг Віоіоду, Айтап
В., Вішіая 0., Кагр Р., І агпгор В., 5вагіз 0., ав., рр 53-61, АААЇІРгев5, Мепіо Рак, 1994; Ноїтапп еї а!., Мисівїс Асіа5 Не5. 27:215, 1999).
Термін "МАВ 1", як використовується у даному документі, включає всі форми природного походження та синтетичні форми МАВ 1, які зберігають активність редокс-залежного модулятора. До таких білків МАВ 1 належить білок з Спіатудотопах, а також пептиди, що походять від інших видів та родів рослин. В одному аспекті "МАВ 1" стосується МАВ 1
Спатудотопавх з амінокислотною послідовністю під ЕС. ІЮ МО 6.
Як використовується у даному документі, "рослини дикого типу" належать до тієї самої лінії, що і трансгенні рослини, з якими їх порівнюють. бо Як використовується у даному документі, світлочутливий елемент (КЕ) означає послідовність довжиною13 п. о. ЗССАСАСССССОС під БЕО ІЮ МО 27, що являє собою сайт зв'язування для МАВ 1 для регуляції/нгібування трансляції білка, розташованого нижче.
Публікації, що обговорюються вище, наведені лише в межах їх розкриття до дати подачі даної заявки. Нічого у даному документі не слід трактувати як визнання того, що даний винахід не має права датувати такі розкриття заднім числом на основі попереднього винаходу.
Звертаючись зараз до ФІГ. 1, вуглець у вигляді бікарбонату (НСОЗ) транспортується через клітинну мембрану за допомогою переносника бікарбонату (НІГАЗ), через мембрану хлоропласта у вигляді бікарбонату за допомогою іншого переносника бікарбонату (І СІА), він взаємодіє з електрон-транспортним апаратом фотосинтезу, який функціонує за рахунок енергії антенних комплексів в стопках тилакоїдів або гранах (показані як стопки пластинок на ФІГ. 1).
Електрон-транспортна система виробляє енергію та відновлювальні еквіваленти, які використовуються рибулозо-1,5-біфосфаткарбоксилазою/оксигеназою (КиВізСо) для фіксації вуглецю у вигляді придатної молекули-субстрату. Потім вона живить решту клітини з утворенням енергії, яка забезпечує функціонування метаболічних процесів у рослині.
Звертаючись зараз до ФІГ. 2, рослини дикого типу мають повний комплект антенного комплексу СП а/Ю, який здатний до захоплення більшої кількості енергії світла, ніж може обробити електрон-транспортна система. Ця надлишкова енергія розсіюється у вигляді тепла та активних форм кисню (КО5; які чинять шкідливий вплив на рослину через інші процеси, такі як фотоінгібування). Повний комплект антенного комплексу оптимізований підтримувати функціонування рослини, коли вона затінена конкуруючими рослинами, і є неефективним у переробці максимального сонячного випромінення. Варіанти здійснення даного винаходу передбачають систему, в якій під час високоїнтенсивного сонячного світла або високоїнтенсивного світла антенний комплекс може пристосуватися для оптимізації захоплення енергії та зв'язку з доступною електрон-транспортною системою. Зі зменшенням інтенсивності світла виробляються більше антенних комплексів, та трансгенна рослина може продовжувати функціонувати оптимально за такого низькоїнтенсивного світла та/або демонструє кращі результати, ніж рослини дикого типу за тих самих умов.
Звертаючись зараз до ФІГ. З, перетворення СПІ а на СП Б здійснюється за допомогою ферменту САО, який кодується геном Сао. Контроль експресії гена Сао для забезпечення
Зо високої експресії гена Сао за низьких рівнів світла та зниженої експресії за за високих рівнів світла робить можливим саморегулювання розміру доступного антенного комплексу.
Звертаючись зараз до ФІГ. 4, конструкції згідно з одним варіантом здійснення даного винаходу були основані на векторі рсСатбіа1301 та містили або коротку (272 п. 0о.), або довгу (750 п. о.) ділянку гена Сао Агарідорзіз плюс зворотно комплементарна послідовність цих частин з геному Сатеїїйпа під контролем специфічного для листків промотора САВІ. Крім того, вектори містили бактеріальний ген стійкості до канаміцину та рослинний ген стійкості до гігроміцину та два інтрони Агарідорзі5. Докладний опис цих плазмід наведено в прикладі 3.
Звертаючись зараз до ФІГ. 5, швидкість фотосинтезу порівнювали за різних інтенсивностей світла в трансгенних рослинах Сатеїйпа займа, в яких застосовували технологію 5ікМА для контролю експресії гена Сас на різних рівнях. Цих мутантів одержували із застосуванням лінії зиуипезоп, за допомогою рСатрьгаі1З0О1 САОЇї опа (ФІГ. 4) з використанням методу "Пога1І-аїр", як описано в прикладах 4 та 5. Це приводило до утворення трансгенних рослин з нокдауном гена
Саос.
За допомогою способів, описаних у даному винаході, експресія Сп! р інгібувалася та змінювалася кількість антенних комплексів. Ця зміна відбилася на співвідношенні СПІ а та СП Б (співвідношення СТІ а/б). Рослини дикого типу мали співвідношення СТІ а/о 1,9. Одержували трансгенні рослини, в яких це співвідношення варіювалося від 3,3 до 12. З цих даних очевидно, що високі співвідношення СпІ а/5 (наприклад, 12) не були оптимальними для збільшення швидкості фотосинтезу (наприклад, САОЇї 9-5). Однак, якщо співвідношення СТІ а/ю становило від 3,3 до 4,3, спостерігали значне збільшення швидкості фотосинтезу порівняно з диким типом.
Звертаючись зараз до ФІГ. 6, проілюстровано порівняння співвідношення СпПІ а/р в різних місцях на рослині, а також відносний вміст хлорофілу на одиницю площі листа в різних місцях на рослині. Рослини дикого типу характеризувались більш низькими співвідношеннями СТІ а/р, ніж три різні мутанти САОЇ (зазначені на осі х як 4, 6 та 7). Усі три трансгенні рослини САОЇ, в яких ген Сао регулюється інтенсивністю світла, характеризувались значно більш високими співвідношеннями СТІ а/ю, ніж рослини дикого типу у двох місцях на рослині, які вимірювали (низ та верх). Регуляція була найбільш вираженою у мутанта САОЇ 7, в якого затінені листки (низ) характеризувалися співвідношенням Сп! а/б приблизно 3,4, у той час як листки під максимальним сонячним випроміненням характеризувалися співвідношенням СТІ а/ю ближче до 60 5,2. На нижній панелі показані дані від рослин дикого типу та САОЇ 7, хлорофіл на одиницю площі листка нормалізували щодо рослин МТ. Хлорофіл на одиницю площі листків САОЇ 7 за високоіїнтенсивного світла (верх) становив 40 95 від хлорофілу, виявленого у дикого типу. Однак хлорофіл на одиницю площі у рослин САОЇ 7 та МЛ в нижніх листках був майже ідентичним.
Звертаючись зараз до ФІГ. 7, три рослини дикого типу Сатеїїйпа, які мали співвідношення
СП а/ь 3, характеризувалися зменшеним проходженням світла крізь листок порівняно з трьома мутантами з 5ікМА до САО (САОЇ), які характеризувалися співвідношеннями СП а/ь 6. Оскільки товщина листків була дуже схожою, таке збільшення проходження світла у мутантів САОЇ відбиває зменшення антенних комплексів, пов'язаних з реакційними центрами, у цих мутантів
СА.
Звертаючись зараз до ФІГ. 8, проілюстровано порівняння флуоресценції хлорофілу в
Сатеїйпа дикого типу та мутанта САОі. Це зображення являє собою чорно-білий варіант кольорової фотографії. Темно синій на вихідному зображенні вказує на відсутність флуоресценції, та він спостерігався лише у верхньому правому куті у кожного мутанта САОЇ.
Зелений показаний тут як середньо-сірий та відображає помірну флуоресценцію. Жовтий являє собою підвищену флуоресценцію та зображений більш світлим сірим кольором. А червоний показаний як темно-сірий та зображує частини листка з високою флуоресценцією. Більш темна частина листка мутанта САОїі є артефактом, а не флуоресценцією хлорофілу. Після впливу тривалістю 1 секунда листок рослини М/Т починає демонструвати підвищену флуоресценцію (спостерігається на даному зображені як посвітління в центральній та верхній половині листка).
Через 10 секунд мутант САОі починав демонструвати збільшення флуоресценції на верхівці його листка (посвітління кольору), у той час як рослина М/Т характеризувалася високою флуоресценцією. За тривалого впливу світла здавалось, що мутанти САОЇ досягали стабільного низького рівня флуоресценції, у той час як у рослини М/Т встановлювалась флуоресценція хлорофілу середнього рівня. Листки мутантів САОЇ демонстрували знижену флуоресценцію хлорофілу після тривалого впливу світла.
Звертаючись зараз до ФІГ. 9, проілюстровано нефотохімічне гасіння (МРО) протягом певного часу для декількох різних ліній мутантів САОЇ порівняно з рослинами дикого типу.
Світло було ввімкнуто протягом 0-5 хв., потім рослини знаходились у темряві. Рослини зі співвідношеннями СП а/ьб » 7 демонстрували знижене МРО та знижений фотозахист. Таке зниження МРО за умови високих співвідношень СпІ а/б може пояснити, чому швидкість фотосинтезу зменшувалась у мутантів зі співвідношенням СТІ а/б 12 (ФІГ. 5).
Звертаючись зараз до ФіГ. 10, проілюстровано порівняння білків, асоційованих з фотосинтетичними комплексами в рослинах дикого типу та лініях мутантів САОЇї Сатеїїйпа. За допомогою блакитного нативного гель-електрофорезу із застосуванням зеленого барвника для виявлення фотосинтетичного комплексу рослини дикого типу порівняно з мутантом САОЇ, в якому співвідношення Сп! а/5 становило 6,2, виявили змінений склад білків, пов'язаних з захопленням світла, таких як суперкомплекси РЗП/Л НС ІІ та тример НС І.
Звертаючись зараз до ФІГ. 11, продемонстровано вплив інгібування антенного комплексу на накопичування крохмалю у САОі Сатеїїпа. Мутант САО-7 зі співвідношенням СІ а/в 5 характеризувався схожим відкладенням крохмалю порівняно з таким у рослини дикого типу.
Однак висока експресія системи САОЇ в САО-9 призводила до сильного зменшення кількості видимих гранул крохмалю на зріз.
Звертаючись зараз до ФІГ. 12, мутантні рослини САОЇї Сатеїїпа порівняно з рослинами дикого типу мали більше нижніх листків з Подовженим часом життя.
Звертаючись зараз до ФІГ. 13, лінія мутантів САОЇ Сатеїйпа (САОЇї 8-1; співвідношення СП а/5 дорівнює 6) віком три тижні у вегетаційному досліді росте швидше за лінію дикого типу (співвідношення СТІ а/о дорівнює 3).
Звертаючись зараз до ФІГ. 14, проілюстровано порівняння лінії САОЇі (САОЇї 8-1) з лініями дикого типу щодо ваги рослини, ваги стручків та кількості стручків. Загальна біомаса лінії мутантів САОЇі була значно більшою ніж у рослин дикого типу. Загальна вага частки стручків була значно більшою у мутанта, ніж у рослини дикого типу. Однак це біло пов'язано з кількістю утворених стручків, а не збільшенням ваги стручків.
Звертаючись зараз до ФІГ. 15, представлена карта конструкції РВ110-САООМАВІ1 -саб-пов.
Фізична карта Ті-плазміди Адгорасіегішт рр110-САО-МАВ-сар-по5. Кістяк /РБрБ110 використовували для розташування гена Сао Агарідорзі5 з КЕ (світлочутливим елементом)
Спіатудотопав, злитим на 5'-кінці гена Сао Агабідорзі5, під керуванням нативного промотора
САО (САО-рго) та термінатора САС (САО-їегт) Агабідорзіє; а також гена МАВІ (з
Спіатудотопав), під керуванням залежного від світла промотора саб та термінатора пов). Т-
ОМА І В/АВ -- ліва/права межа. 60 Варіанти здійснення даного винаходу передбачають способи та композиції для модуляції розміру периферійних антен Ре! рослин, зокрема таких рослин, як пшениця, ячмінь,
Агарідорзі5, Сатеїїйпа, та будь-яких рослин, важливих з точки зору сільського господарства або одержання біопалива, шляхом негативної регуляції експресії гена хлорофіл а-оксигенази (Сас) за високої інтенсивності світла тканиноспецифічним способом.
Отже в одному аспекті даний винахід включає спосіб одержання вдосконаленої рослини, який включає стадії здійснення стабільної трансформації рослини за допомогою гетерологічної полінуклеотидної послідовності, що містить послідовності контролю експресії, які містять мотив консенсусної послідовності домену холодового шоку (С500С5), здатний зв'язуватися з редоксо- залежним модулятором, що реагує на інтенсивність навколишнього світла, при цьому вказані контрольні послідовності функціонально пов'язані з природним або гетерологічним геном Сао, здійснення відбору трансформанта, здатного модулювати розмір антен РОЇ у відповідь на інтенсивність навколишнього світла.
В іншому варіанті здійснення даний винахід включає спосіб підвищення виходів фотосинтетичної продуктивності за умов високої інтенсивності світла та/або вирощування за високої густини, при цьому спосіб включає забезпечення рослини, що містить гетерологічну полінуклеотидну послідовність, яка містить послідовності контролю експресії, що містять мотив консенсусної послідовності домену холодового шоку (С500С5), функціонально пов'язаний з полінуклеотидною послідовністю, яка кодує білок САО; де експресія гена Сао є підвищеною за низької інтенсивності світла порівняно з експресією гена Сао за високої інтенсивності світла; та культивування трансгенної рослини за високої інтенсивності світла та/або високої густини.
В іншому варіанті здійснення даний винахід включає спосіб підвищення одержання запасних сполук вуглець-акцепторних тканин, а саме олії, крохмалю та цукру, з рослини, при цьому спосіб включає забезпечення рослини, яка містить гетерологічну полінуклеотидну послідовність, що містить послідовності контролю експресії, що містять мотив консенсусної послідовності домену холодового шоку (5005), функціонально пов'язаний з полінуклеотидною послідовністю, яка кодує білок САО, де експресія Сао є підвищеною за низької інтенсивності світла порівняно з експресією Сао за високої інтенсивності світла; культивування рослини за високої інтенсивності світла та/або високої густини. В іншому варіанті здійснення даний винахід включає спосіб підвищення одержання ліпідів та/або олій (що придатні як сировина для одержання біопалива) з
Зо рослини, при цьому спосіб включає забезпечення рослини, яка містить гетерологічну полінуклеотидну послідовність, що містить послідовності контролю експресії, що містять мотив консенсусної послідовності домену холодового шоку (С500С5), функціонально пов'язаний з полінуклеотидною послідовністю, що кодує білок САО, де експресія Сао є підвищеною за низької інтенсивності світла порівняно з експресією Сао за високої інтенсивності світла; культивування рослини за високої інтенсивності світла та/або високої густини.
В іншому варіанті здійснення даний винахід включає спосіб підвищення рівнів В-каротину, лютеїну або зеаксантину у рослині, при цьому спосіб включає забезпечення рослини, що містить гетерологічну полінуклеотидну послідовність, що містить послідовності контролю експресії, що містять мотив консенсусної послідовності домену холодового шоку (С50ОС5), функціонально пов'язаний з полінуклеотидною послідовністю, що кодує САС, де експресія Сао є підвищеною за низької інтенсивності світла порівняно з експресією Сао за високої інтенсивності світла; культивування рослини за високої інтенсивності світла та/або високої густини.
У ще одному варіанті здійснення даний винахід включає трансгенні рослини, одержані за допомогою будь-якого зі способів, описаних вище.
ХЛОРОФІЛ А-ОКСИГЕНАЗА (САО)
Хлорофіл а-оксигеназа (САО) може знаходитись у своїй нативній формі (що природним чином міститься в рослині), тобто у вигляді різних форм апопротеїнів або алельних варіантів, як вони представлені у природі, які можуть відрізнятися за їхньою амінокислотною послідовністю,
БО наприклад, внаслідок відсікання (наприклад, з М- або С-кінця або обох) або інших делецій, додавань, вставок, замін, або посттрансляційних модифікацій амінокислот. Хімічні модифікації природного походження, які включають посттрансляційні модифікації та продукти деградації
САО, також специфічно включені в будь-які зі способів за даним винаходом, включаючи наприклад, варіанти САС, модифіковані піроглутамілом, ізоаспартилом, піддані протеолізу, фосфорильовані, глікозильовані, відновлені, окиснені, ізомеризовані та деаміновані варіанти
САС.
САС, яку можна використовувати в даному винаході, включаючи будь-які способи за даним винаходом, може мати амінокислотні послідовності, які є істотно гомологічними або істотно схожими 3 амінокислотними послідовностями нативної САО, наприклад, з будь-якими 60 послідовностями нативного Сао, представленими у Переліку послідовностей. Як альтернатива,
САО може мати амінокислотну послідовність, що характеризується щонайменше 30 95, переважно щонайменше 40 95, 50 90, 60 в, 70 Зо, 75 Зо, 80 95, 85 90, 90 9, 95 95, 98 95 або 99 95 ідентичністю з генами Сао, які кодують білки під ЗЕО ІЮ МО 1-5. У переважному варіанті здійснення ген хлорофіл а-оксигенази для використання в будь-якому зі способів за даним винаходом є щонайменше на 80 95 ідентичним зі зрілою САО з Спіатудотопав.
Пригнічення експресії гена хлорофіл а-оксигенази (Сао)
Даний винахід передбачає способи, композиції та трансгенні рослини, що характеризуються зменшеним розміром антен з хлорофілу внаслідок пригнічення ендогенної експресії Сао та функціонального зв'язку експресії гетерологічного гена Сао з послідовностями контролю експресії, які регулюються активністю редоко-залежного модулятора. Отже, в одному аспекті даний винахід включає трансгенні рослини, в яких ендогенний ген Сао був нокаутований або експресія гена була пригнічена.
Ілюстративні послідовності нуклеїнової кислоти хлорофіл а-оксигенази, які можна використовувати для одержання касет експресії, придатних для інгібування або пригнічування експресії хлорофіл а-оксигенази, та для забезпечення гетерологічних рекомбінантних генів Сао, ідентифіковані в Переліку послідовностей. Можна застосовувати багато способів для інгібування експресії генів у рослинах. Наприклад, можна зручно застосовувати технології 5ікМА, антисенсових РНК або рибозимів для розробки нових сільськогосподарських рослин зі збільшеними виходами та/або стійкістю до захворювань (АЇЇї єї а!., 2010).
Для експресії антисенсової РНК сегмент нуклеїнової кислоти з гена потрібної хлорофіл а- оксигенази клонують та функціонально пов'язують з промотором таким чином, щоб транскрибувалася антисенсова нитка РНК хлорофілу а. Потім касету експресії трансформують у рослини, наприклад Сатеїйпа, та продукується антисенсова нитка РНК. Антисенсова послідовність нуклеїнової кислоти, трансформована в рослини, буде істотно ідентична з щонайменше частиною ендогенного гена або генів, які необхідно піддати репресії. Проте, щоб інгібувати експресію, послідовність не повинна бути абсолютно ідентичною. Отже, антисенсова або сенсова молекула нуклеїнової кислоти, що кодує частину цілого гена хлорофіл а- оксигенази, може бути придатною для одержання рослини, в якої експресія хлорофіл а- оксигенази пригнічена. Таку рослину часто називають мутант з нокдауном, на відміну від
Зо мутанту з нокаутом, у якому цільовий ген модифікований сам по собі. Вектори за даним винаходом можна розробляти так, щоб інгібіторний ефект застосовувався до інших білків в межах родині генів, які демонструють гомологію або істотну гомологію з цільовим геном.
Для пригнічення за допомогою антисенсової РНК введена послідовність також не повинна мати повну довжину відносно або первинного продукту транскрипції, або повністю процесованої 35 МРАК. Загалом, для компенсації застосування більш короткої послідовності можна застосовувати більш високий рівень гомології. Крім того, введена послідовність не повинна мати такий самий патерн інтронів або екзонів, а так само ефективною може бути гомологія некодуючих сегментів. Зазвичай, слід використовувати послідовність довжиною від приблизно або 40 нуклеотидів до приблизно кількості нуклеотидів у послідовності повної довжини, хоча переважною є послідовність щонайменше з приблизно 100 нуклеотидів, більш переважною є послідовність щонайменше з приблизно 200 нуклеотидів та особливо переважною є послідовність щонайменше з приблизно 500 нуклеотидів. Послідовності можуть також бути більш довгими, наприклад, 1000 або 2000 нуклеотидів у довжину або більше.
Молекули каталітичної РНК або рибозими можна також застосовувати для інгібування експресії генів хлорофіл а-оксигенази. Можливо розробляти рибозими, які специфічно спарюються фактично з будь-якою цільовою РНК та розщеплюють фосфодіестерний кістяк у специфічному місці, таким чином призводять до функціональної інактивації цільової РНК. У разі здійснення такого розщеплення рибозим сам по собі не змінюється, та отже він здатний до повторного використання та розщеплення інших молекули, що робить його справжнім ферментом. Включення послідовностей рибозима в антисенсові РНК надає їм активності розщеплення РНК, тим самим підвищуючи активність цих конструкцій.
Було ідентифіковано багато класів рибозимів. Один клас рибозимів походить від великої кількості малих кільцевих РНК, які здатні до саморозщеплення та реплікації в рослинах.
Рибозими, наприклад, інтрони групи І, також були ідентифіковані в хлоропласті зелених водоростей (див., наприклад, Сесії еї аї!., (1990) Аппи Кем Віоспет 59:543-568; Впанаснагуа єї а!., (1996) Моїес Віої! апа Емої 13:978-989; Енпп, єї а!., (2003) Атег У Воїапу 90:628-633; Типтеї, єї а!., (1993) Мис! Асіа5 Нев. 21:5242-5250; та Мап Орреп еї аї., (1993) Моїес Віої! та Емої 10:1317- 1326). Структура та застосування специфічних щодо цільових РНК рибозимів описані, наприклад, у Назеїйоїї єї а. (1988) Майиге, 334:585-591. бо Іншим способом пригнічення є пригнічення за допомогою сенсової РНК (також відоме як косупресія). Було показано, що введення касет експресії в яких нуклеїнова кислота розташована в сенсовому положенні відносно промотора, являє собою ефективний засіб, за допомогою якого блокують транскрипцію цільових генів. Приклад застосування даного способу для модулювання експресії ендогенних генів див. в Мароїї еї аї., (1990) Те Ріапі СеїІ 2:279-289; Намеї, (1994) Ргос. Маї!. Асай. 5сі., ОБА 91:3490-3496; Кооїег апа Мої, (1993) Ситепі Оріп. Віо!. 4: 166-171; та патенти США МоМо 5034323, 5231020 та 5283184.
Загалом, якщо необхідне інгібування експресії, у деякій мірі спостерігається транскрипція введеної послідовності. Даний ефект може спостерігатися, якщо введена послідовність не містить кодуючої послідовності як такої, а лише послідовності інтронів або нетрансльовані послідовності, гомологічні послідовностям, присутнім у первинному транскрипті ендогенної послідовності. Введена послідовність загалом буде істотно ідентичною з ендогенною послідовністю, яку збираються піддати репресії. Така мінімальна ідентичність, як правило, буде більше ніж приблизно 65 95, проте більш висока ідентичність може спричиняти більш ефективну репресію експресії ендогенної послідовності. Преважною є істотно більша ідентичність, що становить більш ніж приблизно 80 95, хоча найбільш переважною буде ідентичність приблизно 9095 або 9595. Аналогічно регуляції за допомогою антисенсової РНК даний ефект буде розповсюджуватись на будь-які інші білки в межах схожої родини генів, які проявляють гомологію або істотну гомологію.
Стосовно пригнічення за допомогою сенсової РНК, введена послідовність в касеті експресії, що не потребує абсолютної ідентичності, також не повинна мати повну довжину відносно або первинного продукту транскрипції, або повністю процесованої мРНК. Вона може бути переважною для уникнення одночасного продукування в деяких рослин, які є рослинами з надекспресією. Більш висока ідентичність у послідовності, що є меншою за послідовність повної довжини, може замінити більш довгу послідовність з меншою ідентичністю. Крім того, введена послідовність не повинна мати такий самий патерн інтронів або екзонів, а так само ефективною буде ідентичність некодуючих сегментів. У більшості випадків застосовують послідовність з діапазонами розмірів, як відмічено вище для регуляції за допомогою антисенсової РНК.
Експресія ендогенного гена може також пригнічуватися за допомогою РНК-інтерференції (КМАї), яка використовує двониткову РНК з послідовністю, ідентичною або схожою на
Зо послідовність цільового гена хлорофіл а-оксигенази. Див., загалом, міжнародні публікації згідно з РСТ МоМо УМО 99/32619, УМО 99/07409, УМО 00/44914, МО 00/44895, УМО 00/63364, УМО 00/01846, УУО 01/36646, МО 01175164, МО01/29058, УМО 02/055692, МО 02/44321, МО 2005/054439 та УМО 2005/110068.
КМАЇ є явищем, що полягає у тому, що у разі введення у клітину двониткової РНК з послідовністю, ідентичною або схожою на послідовність цільового гена, експресія як введеного екзогенного гена, так і цільового ендогенного гена пригнічується. Двониткова РНК може бути утворена з двох окремих комплементарних РНК або може являти собою один ланцюг РНК з комплементарними послідовностями всередині, які формують двониткову РНК. Введена двониткова РНК спочатку розщеплюється на малі фрагменті, які потім слугують як такі собі вказівники цільового гена, що призводить до деградації, таким чином, цільового гена. Відомо, що КМАЇї також є ефективною у рослини (див., наприклад, Спиапо, С. Р. 5 Меуегом/й, Е. М., (2000); Ргос. Май). Асайд. бсі. ОБА 97:4985; Маїетоизе еї аї., (1998) Ргос. Май). Асад. 5сі. ОБА 95:13959-13964; Тарага єї аЇ. (1998) Збсіепсе 282:430-431). Наприклад, щоб досягти пригнічування експресії ДНК, що кодує білок, із застосуванням 5ікМА, двониткову РНК з послідовністю, що ідентична ДНК, яка кодує білок, або істотно схожа на її послідовність (включаючи послідовності, сконструйовані не для того, щоб транслювати білок) або її фрагмент, вводять в рослину, яка становить інтерес, наприклад, пшеницю. Згодом одержані рослини можна піддавати скринінгу щодо фенотипу, асоційованого з цільовим білком, та/або моніторингу сталих рівнів РНК-транскриптів, що кодують білок. Хоча нуклеїнові кислоти, які створюють основу для ЕМАЇ, не мають бути повністю ідентичними з цільовим геном, вони можуть бути щонайменше на 70 95, 80 95, 90 95, 95 95 або більше ідентичні з послідовністю цільового гена
САО; такого як, наприклад, ген під ЗЕО ІЮ МО 1-5 та його фрагменти. Див., наприклад, публікацію заявки на патент США Мо 2004/0029283. Конструкції, що кодують молекулу РНК зі структурою "стебло-петля", яка не споріднена з цільовим геном та яка розташована віддалено від послідовності, специфічної для гена, що становить інтерес, можна також застосовувати для інгібування експресії цільового гена. Див., наприклад, публікацію заявки на патент США Мо 2003/0221211 та приклади у даному документі.
Полінуклеотиди 5ікМА можуть охоплювати цільову РНК повної довжини або можуть відповідати фрагменту цільової РНК. У деяких випадках фрагмент буде мати менше 100, 200, 60 300, 400, 500 600, 700, 800, 900 або 1000 нуклеотидів, що відповідають цільовій послідовності.
Крім того, у деяких варіантах здійснення ці фрагменти становлять, наприклад, щонайменше 15, 20, 25, 30, 50, 100, 150, 200 або більше нуклеотидів у довжину. У деяких випадках, фрагменти для застосування у КМАЇї будуть щонайменше істотно схожими з ділянками цільового білка, які не зустрічаються в інших білках організму або можуть бути вибрані так, щоб мати якомога меншу схожість з іншими транскриптами в організмі, наприклад, вибрані шляхом порівняння з послідовностями під час аналізу загальнодоступних баз даних послідовностей. Отже, фрагменти 5ікМА можуть бути вибрані за схожістю або ідентичністю з М-кінцевою ділянкою послідовностей хлорофіл а-оксигенази за даним винаходом (тобто послідовностей, які не характеризуються значною гомологією з послідовностями в базах даних) або можуть бути вибрані за ідентичністю або схожістю з консервативними ділянками білків хлорофіл а- оксигенази.
Були сконструйовані вектори експресії, які безперервно експресують 5ікМА в тимчасово та стабільно трансфектованих клітинах, для експресії малих шпилькових РНК, які піддаються процесингу іп мімо в молекули 5ікМА, здатні здійснювати ген-специфічний сайленсінг (ВгиттеїКатр еї аї., (2002) Зсіепсе 296:550-553, та Радаїізоп, евї а!., (2002) Сепез 5 Оеу. 16:948- 958). Посттранскрипційний сайленсінг генів за допомогою двониткової РНК обговорюється більш докладно в Наттопа еї аІ. Маїшге Кем Сеп 2:110-119 (2001), Ріге єї аї. (1998) Маїшйге 391:806-811 та Тіттопз5 та Ріге (1998) Маїшге 395:854.
Фахівець в даній галузі техніки буде розуміти, що із застосуванням технології на основі специфічної нуклеотидної послідовності (наприклад, технології пригнічення за допомогою антисенсової РНК або сенсової РНК), можна здійснювати пригнічування родин гомологічних генів за допомогою одного транскрипту сенсової РНК або антисенсової РНК. Наприклад, якщо транскрипт сенсової РНК або антисенсової РНК розроблено так, щоб він мав послідовність, яка є консервативною серед родини генів, то можна пригнічувати декілька членів родини генів.
Навпаки, якщо ціллю є пригнічення лише одного члена родини гомологічних генів, то слід націлювати транскрипт сенсової РНК або антисенсової РНК на послідовності з найбільшою мінливістю між членами родини.
МОДУЛЯТОРИ ТРАНСЛЯЦІЇ, ЯКІ РЕГУЛЮЮТЬСЯ СВІТЛОМ
Даний винахід використовує здатність деяких білків (редоксо-залежних модуляторів) діяти як
Зо оборотні редокс-перемикачі на основі тіолів для регуляції експресії генів в рослинах, щоб забезпечити можливість регуляції розміру антен РБЇЇ залежним від світла чином. Такі білки є представниками родину білків, що збільшується, яка широко розповсюджена середин представників царств рослин та тварин. Див. загалом Апіеітапп Н, 5 Нейтапп 90. (2010),
Вгапаевз еї аї., (2009) ТпіоІ-базей гедох 5м/йснев іп еиКагуоїіс ргоївїіп5. Апіїохій Недох зідпаї. 11(5):997-1014, Радеї М5, а Вийпег М). (2003) ТніоІ-базед гедшіаюгу вм/йспез. Аппи Вем Сепві. 37:91-121.
Домен холодового шоку (С5О)) належить до найбільш древніх та висококонсервативних доменів зв'язування нуклеїнових кислот, що характерний для організмів від бактерій до вищих тварин і рослин (Сп5зікат еї аІ., ВМВ Керогів (2010) 43(1) 1-8; Макатіпаті еї аї., (2006) 103(26) 10123-10127).
Білки, що містять мотив С50О, також мають назву У-боксо-зв'язувальні білки, та члени цієї великої родини в еукаріот звичайно містять вторинний допоміжний домен РНК, який модулює
РНК-афінність білка, проте може бути необов'язковим для селективного розпізнавання РНК.
Ілюстративний редоксо-залежний модулятор являє собою цитозольний РНК-зв'язувальний білок МАВ 1 (ЗЕО ІО МО 6) з Спіатудотопавх. МАВ 1 несе 2 РНК-зв'язувальні мотиви, та один із цих мотивів, розташований на М-кінці, Є доменом холодового шоку. МАВ 1 здійснює репресію трансляції І НС ІІ (світлозбирального комплексу фотосистеми ІІ) шляхом ізолювання кодуючих
МРНК в трансляційно мовчазні мРНК-комплекси. (Миз5дпид еї аї., Те Ріапі Сеїї (2005) 17 3409- 3421).
МАВ 1 містить 2 цистеїнові залишки, Суб5-81 та Су5-226, в межах свого С-кінцевого мотиву розпізнавання РНК. Модифікація цих цистеїнових залишків або шляхом окиснення, або шляхом алкілування іп міго супроводжується зниженням афінності зв'язування РНК щодо послідовності цільової МРНК. Нещодавні дослідження підтвердили, що МАВ 1 є повністю активним в своєму дитіол-відновленому стані, та оборотно дезактивується внаслідок модифікацій своїх цистеїнів. (Уу/орбе еї а!., (2009) Рго. Маї. Асад. 5сі. 106(32) 13290-13295).
МАВ 1 та МАВ 1-подібні редоксо-залежні модулятори від багатьох різних видів були піддані секвенування, та з рівня техніки відомо, що вони є щонайменше частково функціонально взаємозамінними. Отже, рутинною справою буде ідентифікація та відбір варіанта, що є МАВ 1 або МАВ 1-подібним білком, з виду або роду, який не належить до Спіатудотопав. Декілька 60 таких варіантів МАВ 1 або МАВ 1-подібних редоко-залежних модуляторів від багатьох видів ідентифіковані за їхньою амінокислотною послідовністю під 5ЕО ІЮ МО 6-17.
Отже, всі такі гомологи, ортологи та ізоформи МАВ 1 природного походження від
СпПіатудотопав, а також інших видів (ЗЕО ІЮ МО 6-17) включено в будь-які способи та набори за даним винаходом, за умови, що вони зберігають активність, що піддається виявленню. Буде зрозуміло, що для рекомбінантного одержання МАВ 1 в різних видах, як правило, буде необхідно здійснювати оптимізацію кодонів послідовності нуклеїнової кислоти для гена організму, що розглядається. Таку оптимізацію кодонів можна здійснювати шляхом стандартного аналізу переважної частоти використання кодонів для організму, що розглядається, та синтезу оптимізованої нуклеїнової кислоти шляхом стандартного синтезу
ДНК. Велика кількість компаній надає такі послуги на відрядній основі та вони включають, наприклад, ОМА2.0 (Каліфорнія, США) та Орегоп Тесппоїодіє5. (Каліфорнія, США).
З рівня техніки відомо як здійснювати синтетичне модифікування послідовності білків або пептидів, у той самий час зберігаючи їхню корисну активністю, та цього можна досягти із застосуванням методик, які є стандартними в рівні техніки та значною мірою описані в літературі, наприклад, випадковий або сайт-спрямований мутагенез, розщеплення та зшивання нуклеїнових кислот, або шляхом хімічних синтезу або модифікацій амінокислот або поліпептидних ланцюгів. Наприклад, можна створювати зміни білка МАВ | шляхом введення консервативних амінокислотних мутацій, та вважається, що вони знаходяться в межах обсягу даного винаходу.
Отже, МАВ І та МАВ 1-подібні редоксо-залежні модулятори можуть містити одну або більше амінокислотних делецій, додавань, вставок та/або замін на основі будь-яких ізоформ МАВ 1 природного походження. Вони можуть бути суміжними або не суміжними. Типові варіанти можуть включати такі, що мають 1-8, або більш переважно 1-4, 1-3, або 1, або 2 амінокислотні заміни, вставки та/або делеції порівняно з будь-якою з послідовностей під ЗЕО ІЮ МО 6-17.
Поліпептиди МАВ і! та МАВ 1-подібних редоксо-залежних модуляторів, які можна застосовувати в будь-якому зі способів за даним винаходом, можуть мати амінокислотні послідовності, які є істотно гомологічними або істотно схожими на будь-яку з послідовностей
МАВ 1 під 5ЗЕО ІО МО 6-17. Як альтернатива, МАВ 1 та МАВ 1-подібні редоксо-залежні модулятори можуть мати амінокислотні послідовності з щонайменше 30 95, переважно
Зо щонайменше 40 95, 50 90, 60 бо, 70 90, 75 Чо, 80 У, 85 Фо, 90 о, 95 95, 98 95 або 99 95 ідентичністю з МАВ 1 або МАВ 1-подібними редоксо-залежними модуляторами, наведеними під 5ЕО ІЮ МО 6- 17. В одному аспекті МАВ 1 та/"або МАВ 1-подібний редоксо-залежний модулятор є істотно гомологічним або істотно схожим з ЗЕО ІЮ МО 6.
Фрагменти послідовностей ендогенного або синтетичного МАВ 1 та/"або МАВ 1-подібного редоксо-залежного модулятора можуть також мати бажані функціональні властивості пептиду, з якого вони походять, та можуть застосовуватися в будь-якому зі способів за даним винаходом.
Отже, термін "фрагмент", як використовується у даному документі, включає фрагменти МАВ 1 за умови, що фрагмент зберігає біологічну активністю цілої молекули. Фрагмент може також являти собою М-кінцевий або С-кінцневий фрагмент МАВ 1. Переважні фрагменти містять залишки 1-80 з ендогенного МАВ 1 та/або МАВ 1-подібного редоксо-залежного модулятора, що містять домен холодового шоку, або залишки 160-247, що містять мотив розпізнавання РНК.
Також включеними є фрагменти, що мають М- та/або С-кінцеві подовження або фланкуючі послідовності. Довжина таких подовжених пептидів може варіювати, проте зазвичай становить не більше 50, 30, 25 або 20 амінокислот у довжину.
Також включені білки злиття МАВ 1 та фрагментів МАВ 1 з іншими білками, та такі білки злиття можуть посилювати біологічну активність, націлювання, зв'язування або редокс- залежність МАВ 1. Буде зрозумілим, що гнучкий молекулярний лінкер (або спейсер) необов'язково може бути розміщений між МАВ 1 та будь-яким з білків злиття, розкритих у даному документі, та ковалентно з'єднувати їх. Будь-який з таких білків злиття можна застосовувати в будь-якому зі способів за даним винаходом.
Варіанти можуть включати, наприклад, різні алельні варіанти, які зустрічаються у природі, наприклад, в інших видах або зумовлені географічною мінливістю. Усі таки включені варіанти, похідні, білюи злиття або фрагменти МАВ 1 можна застосовувати в будь-якому зі способів формули винаходу, розкритих у даному документі, та всі вони охоплюються терміном "МАВ 17".
Варіанти, похідні та фрагменти є функціонально еквівалентними у тому сенсі, що вони мають редоксо-залежну активність зв'язування РНК, яку можна визначити. А саме, вони проявляють щонайменше 40 95, переважно щонайменше 60 95, більш переважно щонайменше 80 906 активність МАВ 1 дикого типу, зокрема МАВ 1 з Спіатудотопав5. Отже, вони здатні до функціонування як МАВ 1, тобто, можуть заміняти собою МАВ 1. бо Така активність означає будь-яку активність, яку демонструє ендогенний МАВ 1 та/або МАВ
1-подібний редоксо-залежний модулятор, чи то фізіологічну реакцію, яка інгібується в тест- системі іп мімо або іп міго, чи то будь-яку біологічну активність або реакцію, опосередковану ендогенним МАВ 1 та/(або МАВ 1-подібним редоко-залежним модулятором (наприклад, в ферментному аналізі або при зв'язуванні з тканинами, нуклеїновими кислотами або іонами металів, які тестують).
Отже, відомо, що МАВ 1 зв'язується з мотивами консенсусної послідовності домену холодового шоку, наприклад, наведеними під зЕО ІЮ МО 18-26. Отже, аналіз щодо активності
МАВ 1 можна проводити шляхом аналізу щодо редоко-залежного зв'язування з нуклеїновою кислотою, що містить мотив консенсусної послідовності домену холодового шоку. Такий аналіз описаний в Уморбье еї аї., (2009) Ргос. Маїй!. Асад. Зсі. О5А 106 (32) 13290-13295.
В одному аспекті будь-якого з даних способів та трансгенних організмів МАВ 1 та/або МАВ 1- подібний редоксо-залежний модулятор є ендогенним щодо організму. В іншому аспекті будь- якого з даних способів та трансгенних організмів, МАВ І є гетерологічним щодо трансгенного організму.
РОСЛИНИ
Даний винахід можна здійснювати на практиці із застосуванням будь-якої рослини зі світлозбиральними антенами. У попередній заявці щодо застосування даної технології у водоростей (Зауге ММО2013/016267) було продемонстровано, що одноклітинні фотосинтетичні еукаріоти здатні модулювати розмір антен за різної інтенсивності світла. Цей попередній винахід не стосувався ані тканиноспецифічної експресії в рослинах, ані збільшеної продукції запасаючих тканин, таких як крохмаль та масла, що спостерігається у даному винаході. Даний винахід демонструє, що це також можливо з більш складними тканиноспецифічними комплексами у вищих рослин, та що спостерігалися несподівані результати щодо відкладення крохмалю та інших запасних сполук. Рослини, які застосовують за даним винаходом, можуть включати будь-які види рослин природного походження або будь-яку генетично сконструйовану рослину. Рослина, яку застосовують за даним винаходом, включає будь-яку комерційно доступну лінію, будь-яку лінію, яка походить з конкретного регіону, або будь-яку пропрієтарну лінію. Крім того, рослина може належати до будь-якого відділу, класу, порядку, родини, роду або виду, або будь-якого їх підрозділу. Інша відмінність від винаходу під УМО2013/016267
Зо полягає у збільшеній швидкості росту трансформованої рослини порівняно з рослиною дикого типу.
У деяких варіантах здійснення рослини, яких застосовують у способах за даним винаходом, можуть бути членами будь-якого відділу царства Рослини (Ріапіає), чи то судинні або несудинні, однодольні або дводольні, наземні або водні рослини. В одному аспекті даного винаходу рослини вибрані з наземних рослин. У додатковому аспекті рослини вибрані з таких, що є важливими для сільськогосподарського виробництва або виробництва біопалива. У додатковому аспекті рослини вибрані з насінних рослин.
Рослини, яка можуть бути особливо важливими в застосуванні даного винаходу, являють собою насінні культури, такі як без обмеження просо, кукурудза (маїс), сорго, ячмінь, овес, рис, жито, теф, тритикале, пшениця, рис, дикий рис, амарант, різновиди квасолі, різновиди сочевиці, біб звичайний, люпин, різновиди арахісу, різновиди нуту, різновиди голубиного гороху, різновиди сої, різновиди гірчиці, ріпак (канола), сафлор, соняшник, льон, ятрофа, коноплі та мак.
Рослини, які можуть бути особливо важливими в застосуванні даного винаходу, являють собою культури для виробництва біомаси, такі як без обмеження дерева (тополя, верба, евкаліпт, південний бук, платан, ясен), Міх5сапіпив5, коноплі, світчграс, очерет, канаркова трава, жито та очерет гігантський.
Рослини, які можуть бути особливо важливими в застосуванні даного винаходу, являють собою культури для одержання цукру, крохмалю та олії, такі як без обмеження різновиди буряку, цукрове сорго, цукрова тростина, різновиди картоплі, різновиди солодкої картоплі, касава, різновиди маслини, соя, ріпак, кукурудза та льон звичайний.
В одному аспекті будь-якого із заявлених способів переважними є рослини наступних видів:
Сатеїнмпа та Агабрідорвів.
ВЕКТОРИ ЕКСПРЕСІЇ
У будь-якому з даних варіантів здійснення вектор експресії можна застосовувати для доставки молекули нуклеїнової кислоти, яка містить послідовності контролю експресії, що містять мотив консенсусної послідовності домену холодового шоку (С500С5), функціонально пов'язаний з полінуклеотидною послідовністю, що кодує САО. В одному аспекті вектор експресії буде додатково містити промотор, функціонально пов'язаний з мотивом С5ООС5, та який керує експресією кодуючої ділянки САО. Як правило, мотив С500ОС5 вставляють між промотором та 60 початком стартового кодона Сао.
В одному аспекті вектор експресії містить мотив С5ОЮС5, що є істотно ідентичним з послідовністю, вибраною з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО 18, 5ЕО ІО МО 19, 5ЕО ІЮ МО 20, ЗЕО ІЮ МО 21, 5ЕО ІЮ МО 22, ЗЕО ІЮ МО 23, ЗЕО ІЮ МО 24, 5ЕО ІО МО 25 та 5ЕО ІЮ МО 26.
У різних варіантах здійснення ген Сао може являти собою ендогенний ген з рослини, яку мають застосовувати з вектором експресії. Відповідно, в різних аспектах ген Сао може бути геном Сао з будь-якої рослини. В одному аспекті ген Сао є істотно ідентичним з послідовністю, вибраною з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО 1, 5ЕО ІЮО МО 2, 5ЕО ІЮ МО 3, 5ЕО ІЮ МО 4 та
ЗЕО ІЮ МО 5.
В будь-якому з цих варіантів здійснення можна також застосовувати вектор для доставки молекули нуклеїнової кислоти, що кодує РНК, яка забезпечує сайленсінг, в рослинну клітину, щоб забезпечити пригнічення експресії ендогенної САО в клітині.
Наприклад, вектори експресії можуть бути ДНК-плазмідами або вірусними векторами. З рівня техніки відомі різні вектори експресії. Відбір відповідного вектора експресії можна проводити на основі декількох факторів, включаючи без обмеження тип клітин, в яких потрібна експресія. Наприклад, вектори експресії на основі Адгорасіегішт можна застосовувати для експресії нуклеїнових кислот об'єкта винаходу, розкритого в даному документі, якщо прагнуть до стабільної експресії векторної вставки в рослинній клітині.
В інших варіантах здійснення даного винаходу передбачається, що для трансформації рослин можливо використовувати вектори на основі компетентних за реплікацією вірусів. Такі вектори являють собою, наприклад, "човникові" вектори на основі вірусу карликовості пшениці (МУОМ), такі як рУМ І-11 та ру І-3О05 (ОдакКі еї аїІ., 1991). Ці вектори здатні до автономної реплікації в клітинах маїсу, а також Е. соїї, та, таким чином, можуть забезпечувати підвищену чутливість у виявленні ДНК, доставленої в трансгенні клітини. Вектор, що реплікується, також може бути придатним для доставки генів, фланкованих послідовностями ДНК з мобільних генетичних елементів, таких як Ас/Юр5 або Ми. Було висунуто припущення, що транспозиція цих елементів в геном маїсу потребує реплікації ДНК (І ації: єї аї, 1990). Також передбачається, що мобільні генетичні елементі будуть придатним для одержання трансгенних рослин, в яких відсутні елементи, необхідні для відбору та підтримання плазмідного вектора в бактеріях, наприклад, гени стійкості до антибіотиків або інші селективні маркерів та точки початку
Зо реплікації ДНК. Також висунуто припущення, що застосування мобільного генетичного елемента, такого як Ас, Ю5 або Ми, активно сприятиме інтеграції потрібної ДНК та, отже, збільшенню частоти стабільно трансформованих клітин.
Промотори
Експресія нуклеотидної послідовності касети експресії може перебувати під контролем конститутивного промотора або індуковного промотора, який ініціює транскрипцію лише у випадку, якщо трансформована клітина піддається впливу деякого конкретного зовнішнього стимулу. Основні промотори у рослин, як правило, містять канонічні ділянки, асоційовані з ініціацією транскрипції, такі як СААТ- та ТАТА-бокси. Елемент ТАТА-бокс звичайно розташований на приблизно 20-35 нуклеотидів вище за сайт ініціації транскрипції. Елемент
СААТ-бокс звичайно розташований на приблизно 40-200 нуклеотидів нижче за сайт початку транскрипції. Місцерозташування цих елементів основних промоторів веде до синтезу РНК- транскрипту, що містить нуклеотиди вище за сайт початку трансляції АТО. Ділянка РНК, розташована вище за АТО, звичайно зазначається як 5'-нетрансльована ділянка або 5-ШТВ.
Існує можливість застосування стандартних методик молекулярної біології для одержання комбінацій основних промоторів, тобто ділянок, що містять послідовності від СААТ-боксу до сайту початку трансляції, разом з іншими вищерозташованими елементами промоторів для посилення або іншої зміни активності або специфічності промотора.
Промотори можна змінювати так, щоб вони містили "енхансерну ДНК" для сприяння збільшенню експресії гену. Як відомо з рівня техніки деякі елементи ДНК можна застосовувати для посилення транскрипції ДНК. Такі енхансери часто знаходяться в напрямку 5' від сайту початку транскрипції в промоторі, який функціонує в клітинах еукаріот, проте часто їх можна вставляти вище (5) або нижче (3) кодуючої послідовності. У деяких випадках такі 5'-енхансерні елементи ДНК являють собою інтрони. Серед інтронів, які є особливо придатними як енхансерні
ДНК, 5-інтрони гена актину 1 рису (див.патент США Мо 5641876), гена актину 2 рису, гена алкогольдегідрогенази маїсу, гена білка теплового шоку 70 маїсу (патент США Мо 5593874), гена 5пгипкеп!1 маїсу, гена світлозалежного білка 1 5оїапит їшибегозит та гена білка теплового шоку 70 Решпіа пубгіда (патент США Мо 5659122).
Ілюстративні конститутивні промотори для іп мімо експресії в рослинах являють собою промотори, що походять з генів 355 Саму, актину рису та убіквітину маїсу, кожний з який 60 описано у даному документі нижче.
До ілюстративних індуковних промоторів для цієї мети належать хімічно індуковний РЕ- промотор та промотор, який індукується пораненням, які також описані у даному документі нижче. Вибрані промотори можуть керувати експресією в специфічних типах клітин (таких як клітини епідермісу листя, клітини мезофілу, клітини кори кореня) або в специфічних тканинах або органах (наприклад, коренях, листках або квітках). До ілюстративних тканиноспецифічних промоторів належать добре вивчені специфічні для листків промотори, кожний з яких описаний у даному документі нижче.
Можна застосовувати будь-який з багатьох придатних промоторів, залежно від того, яку клітинну систему використовують. Відбір промоторів може базуватися на профілі експресії та рівні експресії. Далі представлені типові необмежувальні приклади промоторів, яка можна застосовувати в касетах експресії.
Промотор 355. Промотор 355 Самм можна застосовувати для керування конститутивною експресією генів. Конструкція плазміди рСОМІ 761 описана в опублікованій заявці на європейський патент ЕР 0392225, в ній містяться промотор 355 Самм та термінатор транскрипції їті з унікальним сайтом ЕсокКіІ між промотором та термінатором, та вона має кістяк рисС-типу.
Промотор гена актину. Як відомо, декілька ізоформ актину експресуються в більшості типів клітин, та, внаслідок цього, промотор актину являє собою гарний вибір для конститутивного промотора. Зокрема, був клонований та описаний промотор з гена Асії рису (МеЕїгоу еї аї., 1990). Виявлено, що фрагмент промотора розміром 1,3 т. п. 0. містить, серед іншого, регуляторні елементи, необхідні для експресії в протопластах рису. Крім того, численні вектори експресії на основі промотора Асі були сконструйовані спеціально для застосування в односім'ядольних (МеоЕїІгоу еї аїЇ.,, 1991). Вони включають інтрон 1 з АсСИ, 5'-фланкуючу послідовність з Аді та інтрон 1 з АДБІ (гена алкогольдегідрогенази маїсу) та послідовність з промотора 355 Саму. Векторами, що демонстрували найвищу експресію, були злиття 355 та інтрона з Асі або 5'-фланкуючої послідовності з Асії та інтрона з АсИ. Оптимізація послідовностей навколо сайта ініціації АТО (репортерного гена 505) також посилювала експресію.
Промотор гена убіквітину. Убіквітин являє собою інший продукт гена, який, як відомо, накопичується в клітинах багатьох типів, та його промотор був клонований з декількох видів для застосування в трансгенних рослинах (наприклад, соняшнику - Віпеї еї аї., 1991, та маїсу -
Спгістепзеп еї а), 1989). Був розроблений промотор гена убіквітину маїсу для систем трансгенних однодольних рослин, та його послідовність та вектори, сконструйовані для трансформації однодольних, розкриті в публікації європейського патенту ЕР 0342926, яка включена в даний документ шляхом посилання. Тауїог еї аї., 1993 описали вектор (рАНС25), який містить промотор гена убіквітину маїсу та перший інтрон, і його високу активність в клітинних суспензіях чисельних односім'ядольних рослин після внесення шляхом бомбардування мікрочастинками. Промотор гена убіквітину є придатним для експресії генів у трансгенних рослинах, головним чином односім'ядольних. Придатні вектори є похідними від рАНС25 або будь-якими векторами трансформації, описаними в даній заявці, що модифіковані шляхом введення відповідного промотора гена убіквітину та/або послідовностей інтрона.
Індуковна експресія під дією хімічно індуковного промотора РЕ-іа. Подвійний промотор 355 в рСОМ І 761ЕМХ можна замінити на будь-який інший придатний промотор, який приведе до належно високих рівнів експресії. Як приклад, один з хімічно індуковних промоторів, описаних в патенті США Мо 5614395, може замінити подвійний промотор 355.
Придатний промотор переважно вирізають з його джерела за допомогою рестрикційних ферментів, але, як альтернатива, він може бути ампліфікований за допомогою ПЛР із застосуванням праймерів, які несуть відповідні кінцеві сайти рестрикції.
Вибрану кодуючу послідовність цільового гена можна вставити в даний вектор, та потім продукті злиття (тобто промотор-ген-термінатор) можна перенести в будь-який вибраний вектор трансформації включаючи описані нижче. Для індукції експресії вибраної кодуючої послідовності в рослинах, трансформованих згідно з розкритим в даному документі об'єктом винаходу можна використовувати різні хімічні регулятори, включаючи бензотіадіазол, ізонікотинову кислоту та сполуки саліцилової кислоти, розкриті в патентах США МоМо 5523311 та 5614395, які включені в даний документ шляхом посилання.
Термінатори транскрипції. Для застосування в касетах експресії доступні різноманітні термінатор и транскрипції. Вони відповідальні за термінацію транскрипції за межами трансгена та його правильне поліаденілювання.
Належними термінаторами транскрипції є такі, що, як відомо, функціонують у відповідній бо рослинній системі. До типових термінаторів транскрипції рослин належать термінатор 355
Саму, термінатор Ії ті, термінатор нопалінсинтази та термінатор гро5 Е9 гороху. Що стосується термінаторів для РНК-полімерази ІІ, ці термінатори, як правило, містять 52 повторів з 5 або більше суміжних тимідинових залишків. В одному варіанті здійснення термінатор для РНК- полімерази ПІ містить послідовність ТТТТТТТ. Їх можна застосовувати як з однодольними, так і з дводольними рослинами.
Послідовності для посилення або регуляції експресії. Як було виявлено, численні послідовності посилюють експресію функціонально пов'язаної послідовності нуклеїнової кислоти, та ці послідовності можна застосовувати спільно з нуклеїновими кислотами з розкритого в даному документі об'єкта винаходу для збільшення їх експресії в трансгенних рослинах.
Було показано, що різні послідовності інтронів посилюють експресію, зокрема у клітинах односім'ядольних рослин. Наприклад, було виявлено, що інтрони гена дарі маїсу значно посилюють експресію гена дикого типу під контролем його спорідненого промотора, коли їх вводять в клітини маїсу. Було виявлено, що інтрон 1 є особливо ефективним та посилює експресію в конструкціях злиття з геном хлорамфеніколацетилтрансферази (Саїї5 еї а!., 1987).
У тій самій експериментальній системі інтрон з гена Бгоп7е маїсу характеризувався схожим ефектом посилення експресії. Послідовності інтронів були звичайним чином введені в вектори для трансформації рослин, як правило, в нетрансльовану лідерну послідовність.
Відома велика кількість нетрансльованих лідерних послідовностей, які походять з вірусів, що також посилюють експресію, та вони є особливо ефективними в клітинах двосім'ядольних рослин. Зокрема, було показано, що лідерні послідовності з вірусу мозаїки тютюну (ТММ, "Му/- послідовність"), вірусу хлорозної крапчастості маїсу (МСММУ) та вірусу мозаїки люцерни (АМУ) є ефективними в посиленні експресії (наприклад, саїре еї а!., 1987; Ки? езкі еї а!., 1990).
Вектори для трансформації за допомогою Адгобасіегішт. Доступна велика кількість векторів для трансформації із застосуванням Адгобасіепйчт шптегасієп5, та їх можна застосовувати для трансформації рослин. Вони, як правило, несуть послідовність щонайменше однієї межі Т-ОМА, та включають вектори, такі як рВІМ І 9 (Вемап, 1984) та споріднені вектори.
Інші вектори для трансформації рослин. Трансформація без застосування Адгобасіегійт їштеїасіеп5 уникає вимоги включення послідовності Т-ОМА у вибраний вектор для
Зо трансформації, та, внаслідок цього, можна використовувати вектори без цих послідовностей, крім описаних вище векторів, які містять послідовності Т-ОМА. Методики трансформації, які не пов'язані з Адгорасіегішт, включають трансформацію шляхом бомбардування частинками, поглинання протопластами (наприклад, РЕС та електропорація), перемішування на вортексі зі скляними кульками та мікроін'єкцію. Вибір вектора може залежати від методики, вибраної для виду, який піддають трансформації.
Селективні маркери. Для деяких цільових видів можуть бути переважними маркери відбору щодо різних антибіотиків або гербіцидів. Маркери відбору, які традиційно застосовують під час трансформації, являють собою ген прій, який надає стійкість до канаміцину та споріднених антибіотиків (Меб55іпд 8: Мієїта, 1982; Вемап еї аї., 1983), ген Баг, який надає стійкість до гербіциду фосфінотрицину (УУ/піе еї аї!., 1990; Зрепсег еї аї., 1990), ген прі, який надає стійкість до антибіотика гігроміцину (Віоспіїпдег 5 Оіддеітапп, 1984), ген апії, який надає стійкість до метотрексату (Вошигоці5 8 дату, 1983), та ген ЕРБР-синтази, який надає стійкість до гліфосату (патенти США МоМо 4940935 та 5188642).
Маркери для здійснення скринінгу. Приклад маркерів для здійснення скринінгу, які можна використовувати, включає ген ВД-глюкуронідази або цідА (денНегзоп еї аї., 1986; білковий продукт, як правило, називають 505), виділений з Е. соїї, який кодує фермент, для якого відомі різні хромогенні субстрати; ген К-локусу, який кодує продукт, що регулює продукування антоціанінових пігментів (червоного кольору) в рослинних тканинах (ОеїІарогіа еї аї., 1988); ген
Р-пактамази (Змйцісійе, 1978), який кодує фермент, для якого відомі різні хромогенні субстрати (наприклад, РАСАС, хромогенний цефалоспорин); ген хуЇЕ (2гиКкому5Ку еї а!., 1983), який кодує катехолдіоксигеназу, яка може перетворювати хромогенні катехоли; ген альфа-амілази (Ікша еї а!., 1990); ген тирозинази (Каї? єї а!., 1983), який кодує фермент, здатний до окиснення тирозину до РОРА та допахінону, який з плином часу конденсується з утворенням меланіну, сполуки яку легко виявити; ген ВД-галактозидази, який кодує фермент, для якого є хромогенні субстрати; ген люциферази (І их) (Оу еї а!., 1986), який забезпечує можливість біолюмінесцентного виявлення; ген екворіну (Ргазпег еї аїЇ,, 1985), який можна використовувати для кальцій-залежного біолюмінесцентного виявлення, або ген, що кодує зелений флуоресцентний білок (Зпееп еї аї., 1995; Назейой еї аї., 1997; Кеїспеї еї аї., 1996; Тіап еї аї., 1997; публікація згідно РСТ УМО 97/41228). бо Комплекс К-генів в маїсі кодує білок, який бере участь у регуляції продукування антоціанінових пігментів, переважно, в насінні та рослинній тканині. Лінії маїсу можуть мати один або до чотирьох К-алелів, які об'єднуються для регуляції пігментації за допомогою пов'язаного з розвитком та тканиноспецифічного способу. Отже, К-ген, введений в такі клітини, буде викликати експресію червоного пігменту та, у разі стабільного включення, може визначатися візуально як червоний сектор. Якщо лінія маїсу несе домінантні алелі генів, що кодують проміжні ферменти шляху біосинтезу антоціаніну (С2, АТ, А2, В7І та В22), але несе рецесивний алель в К-локусі, то трансформація будь-якої клітини з цієї лінії за допомогою К приведе до утворення червоного пігменту. ілюстративні лінії включають Умі5сопвіп 22, яка містить алель гд-еїадіег, та ТЕ І 12, похідну К55, яка має генотип г-9, Б, РІ. Як альтернатива, можна використовувати будь-який генотип маїсу, якщо алелі Сі та Е вводяться разом.
Додатково висунуто припущення, що регуляторні ділянки К-гена можна використовувати в химерних конструкціях з метою забезпечення механізмів контролю експресії химерних генів. У
В-локусі відома більша різноманітність фенотипічної експресії, ніж у будь-якому іншому локусі (Сое еї аї., 1988). Передбачається, що регуляторні ділянки, одержані з ділянок у напрямку 5' щодо структурного К-гена, будуть важливими для керування експресією генів, наприклад, стійкості проти комах, толерантності до гербіцидів або інших білок-кодуючих ділянок. В рамках даного винаходу вважається, що можна з успіхом використовувати будь-який з різних членів родини К-генів (наприклад, Р, 5, Ге тощо). Однак найбільш переважним звичайно буде 5п (зокрема Зп:броїІЗ3). Зп є домінантним членом комплексу К-генів та є функціонально схожим на К- та В-локуси у тому сенсі, що Зп контролює тканиноспецифічне відкладення антоціанінових пігментів у окремих паростках та рослинних клітинах, отже, його фенотип схожий на К.
Інші маркери забезпечують випромінювання світла у видимому діапазоні спектра, створюючи фенотип, що легко піддається скринінгу. Селективний маркер, що передбачається для застосування у даному винаході, являє собою люциферазу світляка, яка кодується геном
Гих. Наявність гена Гих в трансформованих клітинах може бути виявлена із застосуванням, наприклад, рентгенівської плівки, сцинтиляційних вимірювань, флуоресцентної спектрофотометрії, відеокамер для зйомки за низької освітленості, камер з підрахуванням фотонів або люмінометрії багатолункових планшетів. Також передбачено, що таку систему можна розробити для скринінгу популяції щодо біолюмінісценції, як наприклад для планшетів з
Зо культурами тканин, або навіть для скринінгу цілої рослини. Ген, який кодує зелений флуоресцентний білок (СЕР), вважається особливо придатним репортерним геном (Зпееп еї аї., 1995; Назейой еї аї., 1997; Кеїспеї еї аї., 1996; Тіап еї аї., 1997; публікація згідно РСТ УМО 97/41228). Експресію зеленого флуоресцентного білка можна візуалізувати в клітині або рослині у вигляді флуоресценції після освітлення світлом з конкретними довжинами хвилі. Якщо потрібно застосувати ген селективного маркера, такий як І их або СЕР, автори даного винаходу передбачають, що можна досягти переваги шляхом створення генного злиття між геном селективного маркера та геном іншого селективного маркера, наприклад, генного злиття СЕР-
МРТЇЇ (публікація згідно РСТ УМО 99/60129). Це могло б дозволити, наприклад, відбір трансформованих клітин після скринінгу трансгенних рослин або насіння. Схожим чином, можна використовувати інші легкодоступні флуоресцентні білки, такі як червоний флуоресцентний білок (СІ ОМТЕСН, Пало-Альто, Каліфорнія).
СПОСОБИ ТРАНСФОРМАЦІЇ
Вважається, що придатні способи трансформації рослин для застосування за даним винаходом включають фактично будь-який спосіб, за допомогою якого ДНК можна ввести в клітину, такий як шляхом прямої доставки ДНК, як наприклад шляхом трансформації протопластів, опосередкованої РЕС (ОтігиПШепй еї аїЇ,, 1993), шляхом поглинання ДНК, опосередкованого висушуванням/інгібуванням (Роїгуки5 еї аЇ., 1985), шляхом електропорації (патент США Мо 5384253, конкретно включений у даний документі шляхом посилання у всій своїй повноті), шляхом перемішування з волокнами карбіду кремнію (Каеррієг еї аї., 1990; патент США Мо 5302523 та патент США Мо 5464765, кожний конкретно включений у даний документ шляхом посилання у всій своїй повноті), шляхом трансформації, опосередкованої
Адгорасієгішт (патент США Мо 5591616 та патент США Мо 5563055; кожний конкретно включений у даний документ шляхом посилання), та шляхом прискорення частинок, вкритих
ДНК (патент США Мо 5550318; патент США Мо 5538877 та патент США Мо 5538880; кожний конкретно включений у даний документ шляхом посилання у всій своїй повноті) тощо. За допомогою застосування методик, таких як ці, клітини маїсу, а також клітини фактично будь-яких інших видів рослин можна піддавати стабільній трансформації, та такі трансформовані клітини розвиваються у трансгенні рослини. В деяких варіантах переважними є способи прискорення, й вони передбачають, наприклад, бомбардування мікрочастинками тощо. (510)
Електропорація
Якщо ДНК бажано ввести за допомогою електропорації, передбачається, що спосіб згідно з
Кггу;ек еї аІ. (патент США Мо 5384253, включений у даний документ шляхом посилання у всій своїй повноті) буде особливо сприятливим. У даному способі застосовують деякі ферменти, які руйнують клітинну стінку, такі як ферменти, які руйнують пектин, щоб зробити цільові клітини- реципієнти більш сприйнятливими до трансформації за допомогою електропорації, ніж необроблені клітини. Як альтернатива, клітини-реципієнти роблять більш сприйнятливими до трансформації шляхом механічного нанесення поранення.
Для здійснювання електропорації можна використовувати або пухкі тканини, такі як суспензійна культура клітин або ембріогенний кал.с, або, як альтернатива, можна піддавати трансформації незрілих зародків або інші організовані тканини напряму. У даній методиці частково руйнують клітинні стінки вибраних клітин, піддаючи їх впливу ферментів, які руйнують пектин (пектоліази), або механічно наносячи поранення контрольованим способом. Приклади деяких видів, які були трансформовані шляхом електропорації інтактних клітин, включають маїс (патент США Мо 5384253; Р'Наїймчіп еї аї., 1992), пшеницю (2Ппои еї аї., 1993) та сою (Спгібіоим еї а!., 1987).
Для трансформації рослин шляхом електропорації також можна використовувати протопласти (Ваїе5, 1994; | а?7егі, 1995). Наприклад, утворення трансгенних рослин сої за допомогою електропорації протопластів, що походять з сім'ядолі, описано ОПіг та УМіапоїт в публікації згідно РСТ УМО 92117598 (конкретно включеної у даний документ шляхом посилання).
Інші приклади видів, у яких була описана трансформація протопластів, включають ячмінь (Іаге!їті, 1995), сорго (Вангам апа Наї, 1991), маїс (Внанаснагієе еї аї., 1997), пшеницю (Не еї аї., 1994) та томат (ТзиКада, 1989).
Бомбардування мікрочастинками
Одним способом доставки сегментів ДНК для трансформації у рослинних клітин є бомбардування мікрочастинками (патент США Мо 5550318; патент США Мо 5538880; патент
США Мо 5610042 та публікація згідно РСТ УМО 95/06128; кожний з яких конкретно включений у даний документ шляхом посилання у всій своїй повноті). У даному способі частинки можуть бути вкриті нуклеїновими кислотами та доставлені в клітини за допомогою рушійної сили. Дл
Зо ілюстративних частинок належать такі, одержані з вольфраму, платини та, переважно, золота.
Передбачається, що у деяких випадках осадження ДНК на металеві частинки не буде необхідним для доставки ДНК в клітину-реципієнта із застосуванням бомбардування мікрочастинками. Проте, передбачається, що частинки можу містити ДНК, а не бути вкритими
ДНК. Отже, висунуто припущення, що частинки, вкриті ДНК, можуть збільшити рівень доставки
ДНК шляхом бомбардування мікрочастинками, але як такі не є необхідними. Для бомбардування клітини в суспензії концентрують на фільтрах або твердому поживному середовищі. Як альтернатива, незрілі зародки або інші цільові клітини можна розташовувати на твердому поживному середовищі. Клітини, які підлягають бомбардуванню, розміщують на належній відстані нижче пластини, що зупиняє мікрочастинки.
Ілюстративний варіант здійснення способу доставки ДНК в рослинну клітину шляхом прискорення являє собою систему доставки частинок за допомогою біобалістики (ВіоКавй,
Геркулес, Каліфорнія), яку можна застосовувати для проштовхування частинок, вкритих ДНК, або клітин через екран, наприклад, екран з нержавіючої сталі або Муїех, на поверхню фільтра, вкриту клітинами однодольної рослини, які культивували в суспензії. Екран розсіює ці частинки таким чином, що вони не доставляються до клітин-реципієнтів у вигляді великих агрегатів.
Вважається, що екран, розташований між апаратом для бомбардування мікрочастинками та клітинами, які підлягають бомбардуванню, зменшує розмір агрегатів мікрочастинок для бомбардування і може сприяти більш високій частоті трансформації, внаслідок зменшення пошкодження, що наносяться клітинам-реципієнтам мікрочастинками для бомбардування, які є занадто великими.
Методики бомбардування мікрочастинками є широко вживаними та можуть бути застосовані для трансформації фактично будь-якого виду рослин. Приклади видів, які були трансформовані за допомогою бомбардування мікрочастинками, включають види однодольних рослин, таких як маїс (публікація згідно РСТ УМО 95/06128), ячмінь (Кіаїа еї аї., 1994; Непздеп5 еї аї., 1993), пшениця (патент США Мо 5563055, конкретно включений у даний документ шляхом посилання у всій своїй повноті), рис (Непздепз еї аї!., 1993), овес (Тагбреї еї а!., 1995; Тагбеї еї аї., 1998), жито (Непздепз еї аї., 1993), цукрова тростина (Вомег еї аї., 1992) та сорго (Саза еї аї., 1993; Надіо єї а!., 1991); а також багато дводольних рослин, включаючи тютюн (Тотез еї аї., 1990; Виїівіпд та
Вепром/, 1994), сою (патент США Мо 5322783, конкретно включений у даний документ шляхом бо посилання у всій своїй повноті), соняшник (Кпійе! еї аЇ. 1994), арахіс (5іпуо5зії еї аї., 1997),
Зо бавовник (МеСабре апа МагіпеїЇ, 1993), томат (Мап ЕскК еї аї. 1995) та бобові культури у цілому (патент США Мо 5563055, конкретно включений у даний документ шляхом посилання у всій своїй повноті).
Трансформація, опосередкована Адгорасіегійт
Перенесення, опосередковане Адгорасіегійшт, є переважною системою, яку широко вживають для введення генів в рослину. Застосування векторів для інтеграції в рослину, опосередкованої Адгорасієгічшт, для введення ДНК в рослинній клітини добре відоме з рівня техніки. Див., наприклад, способи, описані в Егаїеу єї а. (1985), Кодег5 еї аї. (1987) та патент
США Мо 5563055, конкретно включений у даний документ шляхом посилання у всій своїй повноті.
Трансформація, опосередкована Адгобасіегішт, найбільш ефективна у двосім'ядольних рослин та є переважним способом трансформації дводольних, включаючи Агарідорвіб5, тютюн, томат та картоплю. Дійсно, у той час як трансформація, опосередкована Адгобасієегійт, традиційно застосовувалась для двосім'ядольних рослин протягом багатьох років, її стали лише нещодавно застосовувати для односім'ядольних рослин. Прогрес у методиках трансформації, опосередкованої Адгобасіегішт, на даний момент зробили цю методику застосовною до майже всіх односім'ядольних рослин. Наприклад, методики трансформації, опосередкованої
Адгобасіегішт, на даний момент були застосовані до рису (Ніеєї єї аї., 1997; 2папо еї аї., 1997; патент США Мо 5591616, конкретно включений у даний документ шляхом посилання у всій своїй повноті), пшениці (МеСогтас еї аї., 1998), ячменю (Тіпдау еї аї., 1997; МеСогптас еї аї., 1998) та маїсу (ІзПпіда еї аї!., 1996; патент США Мо 5981840).
Сучасні вектори для трансформації за допомогою Адгорасіегішт здатні до реплікації в Е. соїї, а також в Адгобасіегішт, що забезпечує можливість зручних маніпуляцій, як описується (КІве еї аї., 1985). Більш того, нещодавній технологічний прогрес у векторах для перенесення генів, опосередкованого Адгобасіегійт, вдосконалив розташування генів і сайтів рестрикції в векторах для полегшення конструювання векторів, здатних експресувати гени, які кодують різні поліпептиди.
Описані вектори (Кодег5 еї аїЇ., 1987) мають зручні мультілінкерні ділянки, фланковані промотором та сайтом поліаденілювання для безпосередньої експресії введених генів, які кодують поліпептиди, та є придатними для цілей даного винаходу. Крім того, для здійснення трансформації може застосовуватися Адгобрасієегічт, яка містить як "озброєні", так і "роззброєні"
Ті--ени. У таких ліній рослин, в яких трансформація, опосередкована Адгобасіегішт, є ефективною, даний спосіб є пріоритетним способом внаслідок легкої і визначеної природи перенесення генів.
Багато штамів дикого типу та "роззброєних" штамів Адгобасіегішт (ішптегасіеп5 та
Адгобасієегішт гпі7одепев, які несуть Ті- або Кі-плазміди, можна застосовувати для перенесення генів в рослини. Переважно, Адгобасієегішт містить "роззброєні" Ті- та Кі-плазміди, які не містять онкогенів, що викликають утворення пухлин або утворення коренів відповідно, вони застосовуються як вектори та містять гени, що становлять інтерес, які потім вводять в рослини.
Переважні штами будуть включати без обмеження штам С58 Адгорасіегішт Шшптегтасіеп5, штам нопалінового типу, який застосовують для опосередковування перенесення ДНК в рослинну клітину, штами октопінового типу, такі як /ВА4404, або штами сукцинамопінового типу, наприклад, ЕНА 101 або ЕНАТО5. Повідомлялося про застосування даних штамів для трансформації рослин, та способи відомі фахівцям в даній галузі.
Фахівцям в даній галузі відомі типові стадії процесу трансформації рослин. Адгобасієгійт можна одержувати за допомогою або інокуляції рідкого середовища, такого як середовище І игіа
Вигапі (8), безпосередньо вихідною культурою в гліцерині, або посіву Адгорасіегічт штрихуванням на загущені середовища за допомогою вихідної культури в гліцерині, створення бактеріям можливості росту за відповідних селективних умов, звичайно, за приблизно 26-30 "С, більш переважно за приблизно 28 "С, та відбирання окремої колонію з чашки та інокулювання рідкого поживного середовища, що містить селективні агенти. Як альтернатива, Адгобасіегійт з чашки можна переносити за допомогою петлі для пересівання або переносити густу суспензію, ресуспендувати в рідкому середовищі та застосовувати для інокуляції. Фахівцям в даній галузі відомі процедури для вирощування та придатні умови для культивування Адгобасіегішт, а також подальші процедури інокуляції. Густина культури Адгобасіегішт, яку застосовують для інокуляції, та співвідношення клітин Адгобасіегішт до експлантата можуть варіювати в різних системах, та, отже, очікується оптимізація цих параметрів для будь-якого способу трансформації.
Як правило, культуру Адгобасієгішт інокулюють за допомогою культури в чашці з посівом бо штрихуванням або вихідної культури в гліцерині та вирощують протягом ночі, та клітини бактерій промивають та ресуспендують в поживному середовищі, яке є придатним для інокуляції експлантата. Придатні середовища для інокуляції згідно з даним винаходом включають без обмеження М5РІ. з 1/2 концентрацією (2,2 г/л солей М5 від СІВСО (Карлсбад,
Каліфорнія), 2 мг/л гліцину, 0,5 г/л ніацину, 0,5 г/л І - піридоксин-НСЇ, 0,1 мг/л тіаміну, 115 г/л І- проліну, 26 г/л Ю-глюкози, 68,5 г/л сахарози, рН 5,4) або М5 МІ з Ж» концентрацією (2,2 г/л солей
М5 від СІВСО (Карлебад, Каліфорнія), 2 мг/л гліцину, 0,5 г/л ніацину, 0,5 г/л І -піридоксину-НСЇ, 0,1 мг/л тіаміну, 115 г/л І -проліну, 10 г/л О-глюкози та 10 г/л сахарози, рН 5,4). Середовище для інокуляції можна доповнювати засобом для пригнічення росту (публікація згідно РСТ УМО 01109302). Діапазон та концентрація засобу для пригнічення росту можуть варіювати та залежать від засобу та рослинної системи. Засоби для пригнічення росту, які включають без обмеження нітрат срібла, тіосульфат срібла або карбеніцилін, є переважними факторами пригнічення росту. Засіб для пригнічення росту додають у кількості, необхідній для досягнення потрібного ефекту. Нітрат срібла переважно застосовують в середовищі для інокуляції за концентрації, що становить від приблизно 1 мкМ (мікромолярна) до 1 мМ (мілімолярна), більш переважно від 5 мкМ до 100 мкМ. Концентрація карбеніциліну, яку застосовують в середовищі для інокуляції, становить від приблизно 5 мг/л до 100 мг/л, більш переважно приблизно 50 мг/л.
Сполуку, яка індукує гени вірулентності АдгоБбасіегічшт, таку як ацетосирингон, також можна додавати до середовища для інокуляції.
У переважному варіанті здійснення Аадгобасіегішт, які застосовують для інокуляції, попередньо піддають індукції у середовищі, такому як буферне середовище з відповідними солями, що містить ацетосирингон, вуглевод та селективні антибіотики. У переважному варіанті здійснення культури Адгобасіегічт, які застосовують для трансформації, піддають попередньої індукції шляхом культивування за температури приблизно 28 "С у мінімальному АВ-середовищі з глюкозою (Спіноп еї а!., 1974; І ісп(епзівїп апа Огарег, 1986), доповненому ацетосирингоном з розрахунку приблизно 200 мкМ та глюкозою з розрахунку приблизно 2 95. Концентрація антибіотиків, селективних щодо Адгобасіегішт, у середовищі для попередньої індукції становить приблизно половину концентрації, яку звичайно застосовують для відбору. Густина клітин
Адгобасіегіцт, які застосовуються, становить приблизно 107-1010 КУО/мл Адгобасіегішт. Більш переважно, густина клітин Адгорасіегішт, які застосовуються, становить приблизно 5 х 108-4 х
Зо 109 КУО/мл. Перед інокуляцією Адгобасіегічшт можна промивати в придатному середовищі, як наприклад М5 з Ж5 концентрацією.
У переважному варіанті здійснення застосовували метод трансформації "ПогаІ-дір" з
Адгобрасієегічт та Ті-плазмідою, як описано в прикладі 4.
Наступна стадія процесу трансформації являє собою інокуляцію. На даній стадії експлантати та суспензії клітин Адгобасіегішт перемішують між собою. Перемішування
Адгобасієегішт та експлантата(ів) можна проводити перед або після стадії нанесення поранення.
Під нанесенням поранення, як застосовується в даному документі, мають на увазі будь-який спосіб пошкодження рослинної клітини, створюючи таким чином можливість Адгобасіегішт взаємодіяти з клітинами рослини. Фахівцям в даній галузі відомо багато способів нанесення поранення. Ці способи включають без обмеження бомбардування рослинних тканин частинками, ультразвукову обробку, вакуум-інфільтрацію, зрізання, проколювання, протикання, розрізання або розривання тканин рослини за допомогою скальпеля, голки або іншого пристрою. Тривалість та умови інокуляції та густина клітин Адгобасіегішт будуть варіювати залежно від системи трансформації рослини. Інокуляцію звичайно виконують за температури приблизно 15 "С-30 "С, переважно 23 "С-28 "С протягом від менше однієї хвилини до приблизно
З годин. Інокуляцію можна також виконувати із застосуванням системи вакуум-інфільтрації.
Після інокуляції будь-який надлишок суспензії Адгобасієгчт можна видалити, та здійснюють спільне культивування Адгобасіегпут та матеріалу цільової рослини. Спільним культивуванням називають час після інокуляції та до перенесення на затримувальне середовище або середовище відбору. На стадії спільного культивування можна застосовувати будь-яке з багатьох поживних середовищ для рослинних тканин. У даному винаході застосовують середовища зі зниженою концентрацією солей, такі як середовища для спільного культивування на основі М5 з 72 концентрацією, а також середовища не містять складних добавок до поживного середовища, включаючи без обмеження добавки з невизначеним складом, такі як гідролізат казеїну, та вітаміни В5, та органічні добавки. Рослинні тканини після інокуляції
Адгорасієгішт можна культивувати в рідкому середовищі. Більш переважно, рослинні тканини після інокуляції Адгорасіегішт культивують на напівтвердому поживному середовищі, загущеному за допомогою гелеутворювального засобу, такого як агароза, білош переважно агароза з низьким ЕЕО. Тривалість спільного культивування становить від приблизно однієї 60 години до 72 годин, переважно менше 36 годин, більш переважно від приблизно 6 годин до 35 годин. Середовище для спільного культивування може містити один або більше засобів для пригнічення росту Адгорасієегішт або комбінацію засобів для пригнічення росту, таких як нітрат срібла, тіосульфат срібла або карбеніцилін. Концентрація нітрату срібла або тіосульфату срібла становить переважно від приблизно 1 мкМ до 1 мМ, більш переважно від приблизно 5 мкМ до 100 мкМ, ще більш переважно від приблизно 10 мкМ до 50 мкМ, найбільш переважно приблизно 20 мкМ. Концентрація карбеніциліну в середовищі для спільного культивування становить переважно від приблизно 5 мг/л до 100 мг/л, більш переважно від 10 мг/л до 50 мг/л, ще більш переважно приблизно 50 мг/л. Спільне культивування, як правило, виконують протягом приблизно одного-трьох днів, більш переважно менше 24 годин, за температури приблизно 18 70-30 "С, більш переважно приблизно 23 "С-25 "С. Спільне культивування можна виконувати за умов освітлення або умов з обмеженим освітленням. Переважно, спільне культивування виконують за умов з обмеженим освітленням. Умовами з обмеженим освітленням, як використовується у даному документі, вважають будь-які умови, за яких обмежується освітлення в період спільного культивування, включаючи без обмеження накривання чашки для культивування, яка містить суміш рослина/Адгобасіегішт, тканиною, фольгою, або розміщення чашок для культивування в чорному пакеті, або розміщення клітин, що культивуються, в темній кімнаті. Умови освітлення можна оптимізувати для кожної рослинної системи, як відомо фахівцям в даній галузі.
Після спільного культивування з Адгобасіегішт експлантати можна вмістити безпосередньо на селективне середовище. Експлантати можна субкультивувати на селективному середовищі протягом послідовних етапів або стадій. Наприклад, перше селективне середовище може містити малу кількість селективного агента, а наступна субкультура може містити більш високу концентрацію селективного агента або навпаки. Експлантати можна також розміщати безпосередньо за фіксованої концентрації селективного агента. Як альтернатива, після спільного культивування з Адгобасіегішт експлантати можна вміщувати на середовище без селективного агента. Фахівцям в даній галузі відомо багато модифікацій селективних схем, середовищ та умов росту, які можна варіювати залежно від рослинної системи та селективного агента. У переважному варіанті здійснення після інкубації на неселективному середовищі, яке містить антибіотики для інгібування росту Адгобасіегішт, без селективних агентів, експлантати
Зо культивують на селективному поживному середовищі. До типових селективні агенти належать без обмеження антибіотики, такі як генетицин (5418), канаміцин, паромоміцин, гербіциди, такі як гліфосат або фосфінотрицин, або інші сполуки для інгібування росту, такі як аналоги амінокислот, наприклад, 5-метилтриптофан. Для інгібування росту Адгорасіегчцт до середовища відбору або затримувального середовища можна додавати додаткові відповідні компоненти середовища. До таких компонентів середовища можуть належати без обмеження антибіотики, такі як карбеніцилін або цефотаксим.
Після стадії спільного культивування та переважно перед вміщенням експлантатів на селективне або затримувальне середовище клітини можна аналізувати щодо ефективності доставки ДНК за допомогою аналізу тимчасової експресії який можна застосовувати для виявлення наявності одного або більше генів, які містяться у векторі для трансформації, включаючи без обмеження ген селективного маркера, такий як ген, що кодує ВД-глюкуронідазу (5И5). Загальну кількість синіх точок (які вказують на експресію ЗИ) у вибраній кількості експлантатів використовують як пряму залежність від ефективності перенесення ДНК.
Ефективність доставки Т-ОМА та ефект маніпулювання різними умовами культивування щодо доставки Т-ОМА можна досліджувати у аналізах тимчасової експресії, як описано. Зменшення процесу перенесення Т-ОМА може приводити до зниження кількості копій та складності інтегрування, оскільки складні патерни інтегрування можуть виникати внаслідок спільної інтеграції різних Т-ОМА (ОеМеме еї а!., 1997). Ефект умов культивування цільової тканини можна тестувати за допомогою аналізів тимчасової експресії та, більш переважно, в рослин, у яких відбулася стабільна трансформація. Для аналізів рослин придатні будь-який з багатьох способів, включаючи без обмеження гістохімічні аналізи, біологічні аналізи та молекулярні аналізи.
Після ефективної доставки екзогенної ДНК у клітини-реципієнти наступні стадії звичайно полягають у ідентифікації трансформованих клітин для подальшого культивування та регенерації рослини. Як зазначено у даному документі, щоб збільшити можливість ідентифікації трансформантів, можна використовувати ген селективного маркера як ген, що становить інтерес, або на додачу до нього. У цьому випадку потім звичайно проводять аналіз потенційно трансформованої популяції клітин шляхом піддавання клітин впливу селективного агента або агентів або проводять скринінг клітин щодо потрібної ознаки, яку надає маркерний ген. 60 Інші способи трансформації
Трансформацію протопластів рослини можна виконувати із застосуванням способів на основі осадження з фосфатом кальцію, обробки поліетиленгліколем, електропорації та комбінацій цих типів обробок (див., наприклад, РоїгуКиз еї аї., 1985; І ог еї аї., 1985; ОтігиПей еї а!., 1993; Еготт еї а!., 1986; Оспітпіуа єї а!., 1986; Саї5 єї а!., 1987; Магсоцйе еї а!., 1988).
Застосування даних систем до різних ліній рослин залежить від можливості регенерувати цю конкретну лінію рослини з протопластів. Були описані ілюстративні способи регенерації зернових з протопластів (Тогіуата єї а!ї., 1986; Матада еї аїІ., 1986; Арашіан еї аї., 1986;
ОтігийПенй еї аї., 1993 та патент США Мо 5508184; кожний конкретно включений у даний документ шляхом посилання у всій своїй повноті). Приклади застосування трансформації протопластів зернових шляхом безпосереднього поглинання включають трансформацію рису (Зпо5п-Вібзулав еї аї,, 1994), сорго (Ванйгамж апа Наї, 1991), ячменю (і а?еїті, 1995), вівса (2пепд апа Едууагав, 1990) та маїсу (ОгпігиПей еї аї., 1993).
Для трансформації ліній рослин, які не можна успішно регенерувати з протопластів, можна використовувати інші шляхи для введення ДНК в інтактні клітини або тканини. Наприклад, регенерацію зернових з незрілих зародків або експлантатів можна здійснити, як описано (Мавії, 1989). Також можна застосовувати трансформацію, опосередковану волокнами карбіду кремнію, з одержанням спочатку протопластів або без цього (Каерріег, 1990; Каерріег еї аї., 1992; патент США Мо 5563055, конкретно включений у даний документ шляхом посилання у всій своїй повноті). Трансформацію за допомогою даної методики виконують шляхом перемішування волокон карбіду кремнію разом з клітинами в розчині ДНК. ДНК пасивно проникає в клітини, коли вони проколюються. Дану методику с успіхом було застосовано, наприклад, з однодольними зерновими рослинами маїсу (публікація згідно РСТ УМО 95/06128, конкретно включена в даний документ шляхом посилання у всій своїй повноті).
ВІДБІР
Вважається, що ДНК вводиться лише в невелику відсоткову частку цільових клітин в будь- якому експерименті. Для забезпечення ефективних систем ідентифікації клітин, що одержали
ДНК та інтегрували її у власні геноми, можна використовувати способи відбору клітин, які є стабільно трансформованими. Один ілюстративний варіант здійснення такого способу являє собою введення в клітину маркерного гена, який надає стійкості до деякого засобу, що в нормі є
Ко) інгібіторним, такого як антибіотик або гербіцид. Прикладами антибіотиків, які можна застосовувати, є аміноглікозидні антибіотики неоміцин, канаміцин, 5418 та паромоміцин, або антибіотик гігроміцин. Стійкість до аміноглікозидних антибіотиків надається за допомогою ферментів аміноглікозидфосфотрансфераз, таких як неоміцинфосфотрансфераза І! (МРТ ІЇ) або
МРТ їЇ, у отой час о яко стійкість до гігроміцину о надається за допомогою гігроміцинфосфотрансферази.
Потім потенційно трансформовані клітини піддають впливу селективного агента, У популяції клітин, що вижили, будуть такі клітини, в яких, у більшості випадків, ген, що надає стійкість, був інтегрований та експресований за достатніх рівнів, щоб забезпечити виживання клітин. Клітини можна додатково тестувати для підтвердження стабільної інтеграції екзогенної ДНК.
Застосовуючи методики, розкриті у даному документі, більше ніж 40 95 зародків, підданих бомбардуванню, можуть ставати трансформантами.
Один приклад гербіциду, який є придатним для відбору ліній трансформованих клітин під час здійснення даного винаходу на практиці, являє собою гербіцид гліфосату широкого спектра дії. Гліфосат інгібує дію ферменту ЕРБР5, який функціонує в шляху біосинтезу ароматичних амінокислот. Інгібування цього ферменту веде до нестачі амінокислот фенілаланіну, тирозину та триптофану, та вторинних метаболітів, що походять з них. У патенті США Мо 4535060 описано виділення мутацій ЕРБР5, які надають стійкості до гліфосату, в гені ЕРБР, загоА, у заІтопеїа їурпітигішт. Ген ЕРБР5 клонували із 2еа тауз та мутації, схожі на ті, що знайдені в гені стійкості до гліфосату агоА, вводили іп міго. Мутантні гени, що кодують ферменти ЕРБР5, що є стійкими до гліфосату, наприклад, описані в публікації згідно РСТ УМО 97/04103. Найкраще описаний мутантний ген ЕРБР5, який надає стійкості до гліфосату, містить амінокислотні зміни в залишках 102 та 106, хоча передбачається, що інші мутації також будуть придатними (публікація згідно РСТ МО 97/04103). Крім того, можна застосовувати ЕРБР5 природного походження, який надає стійкості до гліфосату, наприклад, ген СР4А, виділений з Адгобрасіегійт, кодує ЕРБР5, який надає стійкості до гліфосату (патент США Мо 5627061).
Для застосування селективних систем раг-біалафос або ЕРБР5Б-гліфосат тканину культивують протягом 0-28 днів на неселективному середовищі та потім переносять на середовище, що містить 1-3 мг/л біалафосу або 1-3 мМ гліфосату відповідно. Хоча, як правило, переважними будуть діапазони 1-3 мг/л біалафосу або 1-3 мМ гліфосату, вважається, що 60 діапазони 0,1-50 мг/л біалафосу або 0,1-50 мМ гліфосату можуть бути застосовані під час здійснення даного винаходу на практиці. Біалафос та гліфосат передбачені як приклади агентів, що придатні для відбору трансформантів, але методика за даним винаходом не обмежується ними.
Інший гербіцид, який є бажаним агентом відбору, являє собою гербіцид біалафос широкого спектру дії. Біалафос являє собою трипептидний антибіотик, який виробляє Зігеріотусе5 пудго5соріси5, та він складається з фосфінотрицину (РРТ), аналога І -глутамінової кислоти, та двох залишків І/-аланіну. Після видалення залишків І/-аланіну за допомогою внутрішньоклітинних пептидаз виділяється РРТ, та він є сильним інгібітором глутамінсинтази (05), центрального ферменту, який бере участь в засвоєнні аміаку та метаболізмі азоту (Одау/а еї аі!,, 1973). Синтетичний РРТ, активний інгредієнт гербіциду Гірепу "М, також є ефективним як агент відбору. Інгібування 55 у рослин під дією РРТ спричиняє швидке накопичення аміаку та загибель рослинних клітин.
Організм, який продукує біалафос, та інші види роду Зігеріотусе5 також синтезують фермент фосфінотрицинацетилтрансферазу (РАТ), який кодується геном Баг у Зігеріотусе5 пудгозсорісиз та геном раї у 5ігеріотусез мігідоспготодепе5. Застосування гену стійкості до гербіциду, що кодує фосфінотрицинацетилтрансферазу (РАТ), зазначено в ОЕ 3642829 А, де даний ген виділений з бігеріотусе5 мігідоспготодепе5. У бактеріальному організмі-джерелі даний фермент спричиняє ацетилювання вільної аміногрупи РРТ, що запобігає аутотоксичності (Тотрзоп еї аї!., 1987). Ген Баг був клонований (Мигакаті еї а!., 1986; Тпотрзоп еї аї., 1987) та експресований в трансгенному тютюні, томаті, картоплі (Оеє Віоск еї а!., 1987), Вгаззіса (Оеє ВіоскК еї аї,, 1989) та маїсі (патент США Мо 5550318). У попередніх повідомленнях деякі трансгенні рослини, які експресували ген стійкості, були повністю стійкими до комерційних складів РРТ та біалафосу у теплицях.
Додатково передбачається, що гербіцид далапон, 2,2-дихлорпропіонова кислота, може бути придатним для ідентифікації трансформованих клітин. Фермент дегалогеназа 2,2- дихлорпропіонової кислоти (дей) інактивує гербіцидну активність 2,2-дихлорпропіонової кислоти та, отже, надає гербіцидної стійкості клітинам або рослинам, які експресують ген, що кодує фермент дегалогеназу (Виспапап-УуоПавоп еї а!., 1992; патент США Мо 5780708).
Як альтернатива, ген, що кодує антранілатсинтазу, яка надає стійкості до деяких аналогів
Зо амінокислот, наприклад, 5-метилтриптофану або б-метилантранілату, може бути придатним як ген селективного маркера. Застосування гена антранілатсинтази як селективного маркера було описано в патенті США Мо 5508468 та патенті США Мо 6118047. Прикладом ознаки селективного маркера є червоний пігмент, який продукується під контролем К-локусу в маїсу. Даний пігмент може бути виявлений шляхом культивування клітин на твердій основі, що містить середовище з поживними речовинами, здатне забезпечувати ріст на даній стадії, та відбором клітин з колоній (видимих агрегатів клітин), які є пігментованими. Ці клітини можна культивувати далі або у суспензії, або на твердому середовищі. Аналогічним чином, введення генів СІ та В приводить до розвитку пігментованих клітин та/або тканин.
Фермент люциферазу можна застосовувати як селективний маркер в контексті даного винаходу. За наявності субстрату люциферину, клітини, які експресують люциферазу, випромінюють світло, яке можна виявити на фотографічній або рентгенівській плівці, в люмінометрі (або рідинному сцинтиляційному лічильнику), за допомогою пристроїв, які підсилюють нічне бачення, або за допомогою дуже світлочутливої відеокамери, такої як камера з підрахуванням фотонів. Усі ці види аналізу є недеструктивними, та трансформовані клітини можна культивувати далі після ідентифікування. Камера з підрахуванням фотонів є особливо корисною, оскільки вона дозволяє ідентифікувати специфічні клітини або групи клітин, які експресують люциферазу, та маніпулювати клітинами, що експресують її у режимі реального часу. Інший селективний маркер, який можна застосовувати аналогічним чином, являє собою ген, що кодує зелений флуоресцентний білок (СЕР), або ген, що кодує інші флуоресцентні білки, такі як О5Кедф (СіІопіесії, Пало-Альто, Каліфорнія).
Додатково передбачається, що комбінації селективних маркерів будуть придатними для ідентифікації трансформованих клітин. У деяких типах клітин або тканин агент відбору, такий як біалафос або гліфосат, або може не характеризуватися достатньою активністю знищення, щоб явно розпізнавати трансформовані клітини, або може спричиняти істотне неселективне інгібування трансформантів та нетрансформантів схожим чином, що тим самим призводить до того, що методика відбору не є ефективною. Було висунуто припущення, що відбір за допомогою сполуки, що інгібує ріст, такої як біалафос або гліфосат, за концентрацій, нижчих за ті, що спричиняють 100 95 інгібування, після скринінгу тканини, що росте, щодо експресії гена селективного маркера, такого як люцифераза або СЕР, буде створювати можливість виявлення бо трансформантів з типів клітин або тканин, які не піддаються добору окремо. Було висунуто припущення, що комбінації для відбору та скринінгу можуть дозволяти ідентифікувати трансформантів у більшому різноманітті типів клітин та тканин. Цього можна ефективно досягнути із застосуванням генного злиття між геном селективного маркера та геном іншого селективного маркера, наприклад, між геном МРТІЇ ї геном СЕР (УМО 99/60129).
РЕГЕНЕРАЦІЯ ТА ОДЕРЖАННЯ НАСІННЯ
Клітини, які пережили вплив селективного агента, або клітини, які було позитивними в скринінговому аналізі, можна культивувати в середовищі, яке забезпечує регенерацію рослин. В ілюстративному варіанті здійснення середовища Ме та Мб (Спи еї аї., 1975) можна модифікувати шляхом включення додаткових речовин, таких як регулятори росту. Переважними регуляторами росту для регенерації рослин є цитокіни, такі як б-бензиламінопурин, зеатин, кінетин, тидіазурон, дифенілсечовину тощо, та абсцизову кислоту. Було виявлено, що вдосконалення середовища таким та подібними способами сприяє росту клітин на конкретних стадіях розвитку. Тканину можна підтримувати на базовому середовищі з регуляторами росту ауксинового типу, поки не з'явиться достатня кількість тканин для початку спроб регенерації рослини, або після повторюваних циклів ручного відбору, поки морфологія тканини не стане придатною для регенерації, потім її переносять на середовище, яке сприяє дозріванню зародків. Культури переносять кожні 1-4 тижні, переважно кожні 2-3 тижні на дане середовище.
Розвиток пагонів буде означати час для перенесення на середовище без регуляторів росту.
Трансформованим клітинам, ідентифікованим шляхом відбору або скринінгу та підданим культивуванню у відповідному середовищі, яке підтримує регенерацію, потім забезпечать змогу розвинутися у рослини. Паростки, що розвиваються, переносили на безгрунтову суміш для росту рослин, та загартовували, наприклад, у камері з контрольованими характеристиками навколишнього середовища за приблизно 85 95 відносній вологості, 600 ррт СО2 та 25-250 мікромоль фотонів м-2с-1 світла, перед перенесенням до теплиці або вегетаційної камери для дозрівання. Рослини переважно дозрівають або у вегетаційній камері, або в теплиці. Рослини піддають регенерації від приблизно 6 тижнів до 10 місяців після ідентифікації трансформантів, в залежності від початкової тканини. Під час регенерації клітини вирощують на твердому середовищі в посудинах для культивування тканин. Ілюстративні варіанти здійснення таких посудин являють собою чашки Петрі та колби для культивування рослинних тканин. Рослини,
Зо що регенерують, переважно вирощують за температури від приблизно 19 "С до 28 "С. Після того, як рослини, що регенерують, досягли стадії розвитку пагона та кореня, їх можна переносити в теплицю для подальшого вирощування та тестування. Рослини можна запилювати із застосуванням звичайних способів селекції рослин, відомих фахівцям в даній галузі, та одержувати насіння.
З трансформованих рослин можна одержувати потомство та досліджувати його щодо експресії екзогенного гена, що може експресуватися. Проте, варто відзначити, що насіння на трансформованих рослинах може у деяких випадках потребувати порятунку зародків через зупинку розвитку насіння та передчасне старіння рослин. Для порятунку зародків, що розвиваються, їх вирізають з насіння, підданого дезінфекції поверхні, через 10-20 днів після запилення та культивують. Варіант здійснення середовища, яке застосовують для культивування на даній стадії, включає солі М5, 2 95 сахарози та 5,5 г/л агарози. У випадку порятунку зародків великі зародки (які характеризуються довжиною більше ніж З мм) пророщують безпосередньо на відповідному середовищі. Зародки, менші за такі, можна культивувати протягом 1 тижня на середовищі, що містить вищезазначені інгредієнти разом з 10-5 М абсцизової кислоти, та потім переносити на середовище без регулятора росту для проростання.
Визначення характеристик
Для підтвердження наявності екзогенної ДНК або "трансгена(ів)» в рослинах, що регенерують, можна виконувати різноманітні види аналізів, відомих з рівня техніки. Такі види аналізів включають, наприклад, "молекулярно-біологічні" аналізи, такі як Саузерн- та нозерн блотинг та ПЛР; "біохімічні" аналізи, такі як виявлення наявності білкового продукту, наприклад, за допомогою імунологічних засобів (різновиди ЕГІ5А та вестерн блотингу) або за допомогою ферментативної функції; аналізи частин рослин, такі як аналізи листків або коренів; а також аналіз фенотипу цілої регенерованої рослини.
Інтеграція ДНК, експресія РНК та успадковування
Геномну ДНК можна виділити з ліній клітин калюсу або будь-яких частин рослини для визначення наявності екзогенного гена шляхом застосування методик, добре відомих фахівцям в даній галузі. Варто відзначити, що інтактні послідовності не завжди будуть присутні, очевидно через перегрупування або делецію послідовностей в клітині. 60 Наявність елементів ДНК, введених за допомогою способів за даним винаходом, може бути визначена за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Застосовуючи цю методику, дискретні фрагменти ДНК ампліфікують та виявляють за допомогою гель-електрофорезу.
Даний тип аналізу дозволяє визначити, чи присутній ген в стабільному трансформанті, проте не обов'язково підтверджує інтеграцію введеного гена в геном клітини. Як правило, ДНК інтегрована в геном всіх трансформантів, для яких показана наявність гена шляхом ПЛР- аналізу. Крім того, із застосуванням методики ПЛР неможливо визначити, чи мають трансформанти екзогенні гени, введені в різні сайти в геномі, тобто чи мають трансформанти незалежне походження. Застосовуючи методики ПЛР, можливо клонувати фрагменти геномної
ДНК, розташовані поряд із введеним геном.
Беззаперечне підтвердження інтеграції ДНК в геном хазяїна геном та незалежні відмінні характеристики трансформантів можуть бути визначені із застосуванням методики Саузерн- блот гібридизації. Застосовуючи цю методику, можна ідентифікувати специфічні послідовності
ДНК, які були введені в геном хазяїна, та фланкуючі послідовності ДНК хазяїна. Отже, патерн
Саузерн-блот гібридизації конкретного трансформанта слугує як ідентифікаційна характеристика цього трансформанта. Крім того, за допомогою Саузерн-блот гібридизації можливо продемонструвати наявність введених генів у високомолекулярній ДНК, тобто підтвердити, що введений ген інтегрувався в геном трансформованої клітини. Методика
Саузерн-блот гібридизації надає інформацію, яку одержують із застосуванням ПЛР, наприклад, щодо наявності гена, але також демонструє інтеграцію в геном та характеризує кожний окремий трансформант.
Передбачається, що застосування методик дот-блот або слот-блот гібридизації, які є модифікаціями методик Саузерн-блот гібридизації, можна одержати таку саму інформацію, що й одержану за допомогою ПЛР, наприклад, щодо наявності гена.
Як методику ПЛР, так і методику Саузерн-блот гібридизації можна застосовувати для демонстрації передавання трансгена потомству. У більшості випадків характерний патерн
Саузерн-блот гібридизації конкретного трансформанта буде сегрегувати у потомстві як один або більше менделевських генів (Зрепсег еї а!., 1992), що вказує на стабільне успадковування трансгена.
У той час як методики аналізу ДНК можна проводити із застосуванням ДНК, виділеної з
Зо будь-якої частини рослини, РНК буде експресуватися лише в конкретних типах клітин або тканин та, отже, буде необхідно одержувати РНК для аналізу з цих тканин. Методики ПЛР, що мають назву КТ-РСК, також можна застосовувати для виявлення та кількісного визначення
РНК, що продукується з введених генів. При такому застосуванні ПЛР, по-перше, необхідно піддати РНК зворотній транскрипції в ДНК із застосуванням ферментів, таких як зворотна транскриптаза, а потім шляхом застосування звичайних методик ПЛР ампліфікувати ДНК. У більшості випадків методики ПЛР, хоча і є придатними, не буде демонструвати чистоти РНК- продукту. Додаткова інформація щодо природи РНК-продукту може бути одержана за допомогою нозерн-блотингу. Ця методика буде демонструвати наявність молекул РНК та надавати інформацію щодо чистоти даної РНК. Наявність або відсутність молекули РНК також можна визначити із застосуванням дот-блот або слот-блот гібридизації. Дані методики є модифікаціями нозерн-блотингу та будуть демонструвати лише наявність або відсутність молекули РНК.
Додатково передбачається, що технологія ТАОМАМФО (Арріїей Віозузіет»5, Фостер-Сіті,
Каліфорнія) може застосовуватися для кількісного визначення в трансгенній клітині як ДНК, так і
РНК.
Експресія гена
У той час як Саузерн-блотинг та ПЛР можна застосовувати для виявлення генаців), що розглядається, вони не забезпечують інформацію про те, чи експресується даний ген.
Експресію можна оцінювати за допомогою специфічної ідентифікації білкових продуктів введених генів або оцінки фенотипічних змін, зумовлених їх експресією. Серед найбільш загальних способів визначення експресії білків є полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскриптазою (ЕТ-РСК) та КТ-РСК у реальному часі. Обидві ці методики забезпечують можливість визначення фенотипічної експресії гена за допомогою добре розвинених способів.
В аналізах щодо продукування та ідентифікації специфічних білків можуть використовуватися фізико-хімічні, структурні, функціональні або інші властивості білків.
Унікальні фізико-хімічні або структурні властивості дозволяють розділяти та ідентифікувати білки за допомогою процедур електрофорезу, таких як нативний або денатуруючий гел- електрофорез або ізоелектричне фокусування, або за допомогою методик хроматографії, таких як іонообмінна хроматографія або гель-ексклюзійна хроматографія. Унікальні структури бо окремих білків надають можливості для застосування специфічних антитіл, щоб виявити їх наявність, в форматах, таких як аналіз ЕІ І5А. Можна застосовувати комбінації підходів з навіть більшою специфічністю, такі як вестерн-блотинг, за яких антитіла застосовують для визначення розташування окремих продуктів генів, які були розділені за допомогою методик електрофорезу. З метою повного підтвердження ідентичності продукту, що становить інтерес, можна застосовувати додаткові методики, такі як оцінка за допомогою секвенування амінокислотної послідовності після очищення. Хоча ці методики входять до числа найбільш вживаних, можна додатково застосовувати інші процедури.
Процедури аналізу також можна застосовувати для ідентифікації експресії білків за їх функціональними властивостями, зокрема, здатності ферментів каталізувати специфічні хімічні реакції, які включають специфічні субстрати та продукти. Такі реакції можуть супроводжуватись забезпеченням та кількісним визначенням витрати субстратів або утворення продуктів реакцій за допомогою процедур фізичного або хімічного аналізу. Приклади настільки ж різноманітні, як і фермент, що підлягає аналізу, та можуть включати аналізи щодо ферментативної активності
РАТ за утворенням міченого радіоактивною міткою ацетильованого фосфінотріцину з фосфінотріцину та 14С-ацетил-СоА або щодо активності антранілатсинтази за збільшенням флуоресценції в міру того, як продукується антранілат, що являють собою лише два приклади.
Дуже часто, експресія продукту гена визначається шляхом оцінювання фенотипічних результатів його експресії. Дані аналізи також можуть бути дуже різноманітними, включаючи без обмеження аналіз змін хімічного складу, морфології або фізіологічних властивостей рослини.
Хімічний склад може змінюватися внаслідок експресії генів, що кодують ферменти або запасні білки, які змінюють амінокислотний склад та можуть бути виявлені за допомогою амінокислотного аналізу, або ферментів, які змінюють кількість крохмалю, що можна аналізувати за допомогою відбивної спектроскопії в ближній інфрачервоній частині спектра.
Морфологічні зміни можуть передбачати більшу висоту або товстіші стебла. Найчастіше зміни рослин або частин рослин у відповідь на призначену обробку оцінюють за ретельно контрольованих умов, що мають назву біоаналізи.
Аналіз трансгена, специфічного за явищем
Методики Саузерн-блотингу, ПЛР та КТ-РСК можна застосовувати для виявлення наявності або відсутності та експресії конкретного трансгена, але, залежно від плану експерименту, не
Зо можуть специфічно та унікально ідентифікувати ідентичні або споріднені трансгенні конструкції, розташовані в різних точках вставки в межах генома реципієнта. Щоб більш точно охарактеризувати наявність трансгенного матеріалу в трансформованій рослині, фахівець в даній галузі техніки може ідентифікувати точку вставки трансгена та із застосуванням послідовності в геномі реципієнта, яка фланкує трансген, розробити аналіз, який специфічно та унікально ідентифікує конкретну подію вставки. Для визначення точки вставки можна застосовувати багато способів, таких як без обмеження технологія Сепоте УмаїКегтм (СІ ОМТЕСН, Пало-Альто, Каліфорнія), технологія Месіогеце "м (Бідта, Сент-Луїс, Міссурі), ПЛР з олігонуклеотидами, які містять сайт рестрикції (заткаг еї аї., 1993; УМебрег еї аї., 1998), нерівна
ПЛР (Спеп апа Уми, 1997) та утворення клонів геномної ДНК, які містять трансген, що становить інтерес, у векторі, такому як без обмеження фаг лямбда.
Як тільки визначена послідовність геномної ДНК, що розташована безпосередньо поряд зі вставленим трансгеном з будь-якого одного або обидвох боків, фахівець в даній галузі може розробити аналіз для специфічної та унікальної ідентифікації події вставки. Наприклад, можна розробити два олігонуклеотидні праймери, щоб один містився повністю в межах трансгена, та один містився повністю в межах фланкуючої послідовності, які можна застосовувати разом у методиці ПЛР для одержання ПЛР-продукту, що є унікальним щодо вставленого трансгена.
В одному варіанті здійснення два олігонуклеотидні праймери для застосування у ПЛР можна розробити так, щоб один праймер був комплементарним до послідовностей як трансгена, так і розташованої поряд фланкуючої послідовності, внаслідок чого праймер охоплює місце з'єднання сайта вставки, у той час як другий праймер може бути гомологічним до послідовностей, що містяться повністю в межах трансгена. В іншому варіанті здійснення два олігонуклеотидні праймери для застосування у ПЛР можна розробити так, щоб один праймер був комплементарним до послідовностей як трансгена, так і розташованої поряд фланкуючої послідовності, внаслідок чого праймер охоплює місце з'єднання сайта вставки, у той час як другий праймер може бути гомологічним до послідовностей, що містяться повністю в межах геномної послідовності, що розташована поряд з сайтом вставки. Підтвердження реакції ПЛР можна відслідковувати за допомогою без обмеження аналізу розміру на гель-електрофорезі, аналізу послідовностей, гібридизації продукту ПЛР зі специфічним міченим радіоактивною міткою ДНК- або РНК-зондом або молекулярним маяком (Туаді апа Кгатег, 1996) або бо застосування праймерів в сполученні з зондом та технологією ТАОМАМ "М (Арріїеа Віозувіетв,
Фостер Сіті, Каліфорнія).
Сайт-специфічна інтеграція або вирізання трансгенів
Авторами даного винаходу конкретно передбачається, що можна застосовувати методики сайт-специфічної інтеграції або вирізання конструкцій для трансформації, що одержані згідно з даним винаходом. Перевага сайт-специфічної інтеграції або вирізання полягає у тому, що її можна застосовувати для подолання проблем, асоційованих зі звичайними методиками трансформації, в яких конструкції для трансформації, як правило, випадковим чином інтегрують в геном хазяїна та можуть інтегруватися множинні копії конструкції. Така випадкова вставка введеної ДНК в геном цільових клітин може бути шкідливою для клітини, якщо чужорідна ДНК вставлена в життєво важливий ген. Крім того, на експресію трансгена можуть впливати "ефекти положення", причиною яких є геномна ДНК, що їх оточує. Додатково, через труднощі, асоційовані з тим, що рослини мають множинні копії трансгена, включаючи сайленсінг генів, рекомбінацію та непередбачуване успадковування, звичайно потрібно контролювати кількість копій вставленої ДНК, при цьому часто потрібна вставка лише однієї копії послідовності ДНК.
Сайт-специфічної інтеграції можна досягти у рослин за допомогою гомологічної рекомбінації (див., наприклад, патент США Мо 5527695, конкретно включений у даний документ шляхом посилання у всій своїй повноті). Гомологічна рекомбінація являє собою реакцію між будь якою парою послідовностей ДНК, що мають схожі послідовності нуклеотидів, за якої ці дві послідовності взаємодіють (рекомбінують) з утворенням нової рекомбінантної молекули ДНК.
Частота гомологічної рекомбінації збільшується пропорційно збільшенню довжини послідовностей ДНК зі спільними нуклеотидами, та є більш високою із застосуванням лінеаризованих молекул плазмід, ніж для кільцевих молекул плазмід. Гомологічна рекомбінація може відбуватися між двома послідовностями ДНК, які не є зовсім ідентичними, проте частота рекомбінації знижується пропорційно збільшенню розбіжності між двома послідовностями.
Введені послідовності ДНК можна націлювати шляхом гомологічної рекомбінації за допомогою поєднання молекули ДНК, що становить інтерес, з послідовностями, що мають гомологію з ендогенними послідовностями цільової клітини. Як тільки ДНК потрапляє до клітини, дві гомологічні послідовності можуть взаємодіяти, що веде до вставки введеної ДНК в сайт, де були розташовані гомологічні послідовності геномної ДНК. Отже, вибір гомологічних послідовностей, що містяться на введеній ДНК, визначатиме сайт, в який введена ДНК інтегрується шляхом гомологічної рекомбінації. Наприклад, якщо послідовність ДНК, що становить інтерес, поєднана з послідовностями ДНК, що мають гомологію з однокопійним геном клітини рослини-хазяїна, то послідовність ДНК, що становить інтерес, буде вставлена шляхом гомологічної рекомбінації лише в цей один специфічний сайт. Проте, якщо послідовність ДНК, що становить інтерес, поєднана з послідовностями ДНК, що мають гомологію з мультикопійним геном еукаріотичної клітини-хазяїна, то послідовність ДНК, що становить інтерес, може бути вставлена шляхом гомологічної рекомбінації в кожний зі специфічних сайтів, в яких розташована копія гена.
ДНК може бути вставлена в геном хазяїна за допомогою реакції гомологічної рекомбінації, що передбачає або одну реципрокну рекомбінацію (що веде до вставки введеної ДНК повної довжини), або подвійну реципрокну рекомбінацію (що веде до вставки лише ДНК, розташованої між двома подіями рекомбінації). Наприклад, якщо чужорідний ген потрібно вставити в геномний сайт, де розташований вибраний ген, то введена ДНК має містити послідовності, гомологічні вибраному гену. Одинична подія гомологічної рекомбінації згодом приводить до того, що повна послідовність введеної ДНК буде вставлена у вибраний ген. Як альтернатива, події подвійної рекомбінації можна досягти шляхом фланкування кожного кінця послідовності ДНК, що становить інтерес (послідовність, яка призначена до вставки в геном), послідовностями ДНК, гомологічними вибраному гену. Подія гомологічної рекомбінації за участі кожної гомологічної фланкуючої ділянки буде приводити до вставки чужорідної ДНК. Отже, лише ті послідовності
ДНК, що розташовані між двома ділянками, що мають гомологію з геномом, будуть інтегруватися в геном.
Хоча введені послідовності можна націлювати на вставку в специфічний геномний сайт шляхом гомологічної рекомбінації у вищих еукаріот гомологічна рекомбінація є відносно рідкісною подією, порівняно з подіями випадкової вставки. Отже, у рослин більш розповсюдженою є випадкова інтеграція трансгенів. Для збереження контролю над кількістю копій та розташуванням вставленої ДНК, послідовності ДНК, що вставлені випадковим чином, можна видаляти. Одним способом видалення цих випадкових вставок є використання сайт- специфічної рекомбіназної системи (патент США Мо 5527695).
Велику кількість різних сайт-специфічних рекомбіназних систем можна застосовувати згідно 60 з даним винаходом, включаючи без обмеження систему СтелЛох бактеріофага РІ (патент США Мо
5658772, конкретно включений у даний документ шляхом посилання у всій своїй повноті), систему ЕГР/ЕКТ дріжджів ((соїїе апа Гіпідиіві, 1989), рекомбіназу Сіп фага Ми (Маєзег еї аї., 1991), рекомбіназу Ріп Е. соїї (Епотоїйо еї аї., 1983) та систему Е/К5 плазміди рок І (Агакі еї аї., 1992). Системи СтеЛох бактеріофага РІ та ЕГР/ЕКТ дріжджів являють собою дві особливо придатні системи для сайт-специфічної інтеграції або вирізання трансгенів. У цих системах рекомбіназа (Сте або РІ Р) буде специфічно взаємодіяти з її відповідною послідовністю для сайт-специфічною рекомбінації (ох або ЕКТ відповідно) з інвертуванням або вирізанням проміжних послідовностей. Послідовність для кожної з цих двох систем є відносно короткою (34 п. о. для ох та 47 п. о. для ЕКТ) та, отже, придатною для застосування з векторами для трансформації.
Було продемонстровано, що рекомбіназна система РІ Р/РЕТ ефективно функціонує в рослинних клітинах. Експерименти щодо характеристик системи БІ Р/ЕКТ, проведені на протопластах як маїсу, так і рису вказують на те, що структура сайту ЕКТ та кількість присутнього білка РІ Р впливають на активність вирізання. Загалом, короткі неповні сайти ЕКТ приводять до більш високого рівня накопичення продуктів вирізання, ніж повні сайти ЕКТ повної довжини. Системи можуть каталізувати як внутрішньо-, так і міжмолекулярні реакції в протопластах маїсу, що вказує на їхню придатність для реакцій вирізання ДНК, а також реакцій інтеграції. Реакція рекомбінації є оборотною, та ця оборотність може погіршувати ефективність реакції в кожному напрямку. Зміна структури сайт-специфічних послідовностей рекомбінації являє собою один підхід підхід до виправлення цієї ситуації. Послідовність для сайт- специфічної рекомбінації можна піддавати мутації таким чином, щоб продукт реакції рекомбінації більше не розпізнавався як субстрат для оборотної реакції, стабілізуючи таким чином подію інтеграції або вирізання.
У системі Сте-Іох, виявленої у бактеріофага РІ, рекомбінація між сайтами ох відбувається за наявності рекомбінази Стге (див., наприклад, патент США Мо 5658772, конкретно включений у даний документ шляхом посилання у всій своїй повноті). Ця система була використана для вирізання гена, розташованого між двома сайтами ох, який був введений в геном дріжджів (Зацег, 1987). Сте експресувалася за допомогою індуковного промотора СА дріжджів, та даний ген Сте був розташований на дріжджовому векторі, що автономно реплікується.
Оскільки сайт Іох являє собою асиметричну нуклеотидну послідовність, то сайти Іох на одній і тій самій молекулі ДНК можуть мати однакову або протилежну орієнтацію один відносно іншого. Рекомбінація між сайтами ох одній і тій самій орієнтації приводить до делеції сегмента
ДНК, розташованого між двома сайтами Іох, та з'єднання утворених кінців вихідної молекули
ДНК. Видалений сегмент ДНК утворює кільцеву молекулу ДНК. Кожна з вихідної молекули ДНК та утвореної кільцевої молекули містить один сайт ох. Рекомбінація між сайтами ох в протилежній орієнтації на одній і тій самій молекулі ДНК приведе до інверсії нуклеотидної послідовності сегмента ДНК, розташованого між двома сайтами Іох. Крім того, може відбуватися реципрокний обмін сегментів ДНК поблизу сайтів ох, що розташовані на двох різних молекулах
ДНК. Усі ці події рекомбінації каталізуються продуктом кодуючої ділянки Стге.
Делеція послідовностей, розташованих в межах вставленого трансгена
Під час процесу трансформації часто необхідно вводити допоміжні послідовності, такі як селективний маркер або репортерні гени, для відслідковування наявності або відсутності гена, що забезпечує потрібну ознаку, трансформованого в рослину за допомогою ДНК-конструкції.
Такі допоміжні послідовності часто не приводять до одержання потрібної ознаки або характеристики, що надає гена фенотипової ознаки. Гомологічна рекомбінація являє собою спосіб, за допомогою якого введені послідовності можна селективно видаляти з трансгенних рослин.
Відомо, що гомологічна рекомбінація приводить до генетичних перегрупувань трансгенів в рослинах. Було продемонстровано, що послідовності ДНК з повторами ведуть до делеції фланкованої послідовності у різних видів дводольних рослин, наприклад Агарідорзі5 ІПаїапа (Бмородіа єї а!., 1994; УдеІевкКо еї аї!., 1999), Вгаззіса париз (Саї єї аї!., 1991; 5уобоаа 6вї аї, 1993) та Місойапа їабасит (Реїетпап5 еї аїЇ., 1990; 7иБКо еї аїЇ.,, 2000). Одна з найбільш широко поширених моделей гомологічної рекомбінації являє собою модель репарації двониткових розривів ДНК (О5ВЕ) (52051аК еї а!., 1983).
Делеція послідовностей шляхом гомологічної рекомбінації залежить від послідовностей ДНК з прямими повторами, що розташовані біля ділянки, яка буде піддаватися вирізанню, при цьому послідовності ДНК з повторами керують вирізанням із застосуванням природних механізмів клітинної рекомбінації. Фертильні трансгенні рослини першого покоління схрещують з одержанням або гібридних, або інбредних рослин-потомків, та серед цих рослин-потомків бо відбирають одну або більше фертильних трансгенних рослин другого покоління, які містять другу послідовність ДНК, яка була змінена шляхом рекомбінації, що переважно приводить до делеції допоміжної послідовності. Фертильна рослина першого покоління може бути або гемізиготною, або гомозиготною за послідовністю ДНК, що містить ДНК з прямими повторами, що буде керувати подією рекомбінації. Послідовності з прямими повторами розташовані в напрямку 5' та 3' відносно цільової послідовності в трансгені. Внаслідок події рекомбінації цільова послідовність трансгена може бути видалена, ампліфікована або іншим чином модифікована в межах генома рослини. У переважному варіанті здійснення це приведе до делеції цільової послідовності, рланкованої послідовністю з прямими повторами.
Як альтернатива, зміни вставок трансгенів, опосередковані послідовністю ДНК з прямими повторами, можуть бути одержані в соматичних клітинах. Переважно, рекомбінація відбувається в клітині, що культивується, наприклад, калюсі, та її можна відбирати на основі делеції гена негативного селективного маркера, наприклад, гена регіА, виділеного з ВигКпоїЇдегіа сагуо!рпійй, який кодує фермент гідролазу фосфонатних естерів, що каталізує гідроліз гліцерилгліфосату з утворенням токсичної сполуки гліфосату (патент США Мо 5254801).
СЕЛЕКЦІЯ РОСЛИН ЗА ДАНИМ ВИНАХОДОМ
Крім безпосередньої трансформації генотипу конкретної рослину за допомогою конструкції, одержаної згідно з даним винаходом, трансгенні рослини можна одержувати шляхом схрещування рослини, яка має конструкцію за даним винаходом, з іншою рослиною, що не має такої конструкції. Наприклад, вибрану кодуючу ділянку, функціонально пов'язану з промотором, можна вводити в конкретний сорт рослини шляхом схрещування, без будь-якої потреби проведення безпосередної трансформації рослини такого конкретного сорту. Отже, даний винахід охоплює не лише рослину, безпосередньо регенеровану з клітини, яка була трансформована згідно з даним винаходом, але також і потомство таких рослин. Як використовується у даному документі терміном "потомство" називають нащадка батьківської рослини будь-якого покоління, одержаного згідно з даним винаходом, де потомство містить конструкцію, одержану згідно з даним винаходом. "Схрещування" рослини з одержанням лінії рослин, що має один або більше доданих трансгенів порівняно з вихідною лінією рослин, як розкрито у даному документі, визначається як методики, які приводять до того, що трансген за даним винаходом вводиться в лінію рослин шляхом схрещування вихідної лінії з донорною лінією рослин, яка містить трансген за даним винаходом.
Щоб досягти цього, можна, наприклад, здійснювати наступні стадії: висаджування насіння першої (вихідної лінії) та другої (донорної лінії рослин, яка містить трансген за даним винаходом) батьківських рослин; вирощування насіння першої та другої батьківських рослин до моменту, коли рослини починають квітнути; запилення квітки першої батьківської рослини пилком з другої батьківської рослини та збір насіння, одержаного з батьківської рослини із заплідненою квіткою.
Зворотне схрещування у даному документі визначається як спосіб, який включає стадії схрещування рослини першого генотипу, що містить потрібний ген, послідовність ДНК або елемент, з рослиною другого генотипу, що не містить потрібний ген, послідовність ДНК або елемент; здійснення відбору одного або більше потомків рослини, що містять потрібний ген, послідовність ДНК або елемент; схрещування рослини-потомка з рослиною другого генотипу; повторювання стадій (Б) та (с) з метою перенесення потрібного гена, послідовності ДНК або елемента з рослини першого генотипу у рослину другого генотипу.
Інтрогресія елемента ДНК в генотип рослини визначається як результат способу конверсії за допомогою зворотного схрещування. Генотип рослини, в який була |інтрогресована послідовність ДНК, може бути зазначений як генотип, лінія, інбред або гібрид, щор зазнали конверсії за допомогою зворотного схрещування. Схожим чином, генотип рослини, що не має потрібної послідовності ДНК, може зазначатися як генотип, лінія, інбред або гібрид, які не зазнали конверсії.
Застосування різних способів з ілюстративних варіантів здійснення даного винаходу спрямоване на вдосконалення неруйнівного екстрагування гідрофобних матеріалів з клітин. Це, зокрема, стосується збільшеної продуктивності у вищих рослин, зі особливим акцентом на сільськогосподарські рослини та додатковим акцентом на рослини з великими запасаючими акцепторними тканинами, такими як насіння та інші вуглецьзапасаючі тканини (наприклад, картопля, касава та солодка картопля).
ПРИКЛАДИ
Деякі варіанти здійснення даного винаходу будуть описані докладніше за допомогою наступних прикладів. Приклади слугують лише для сприяння повнішому опису вибраних варіантів здійснення даного винаходу, та їх не слід вважати такими, що обмежують обсяг даного 60 винаходу жодним чином.
Приклад 1. Трансформація Агабрідорзів
Конструкції, одержані для модуляції антенного комплексу Агарідорзіз трансформовували в рослини із застосуванням протоколів, розроблених Веспоїй та колегами (Весіпоїа еї аї., 1993) та Сіоцодйи ї Вепі (Сіоцдйп апа Вепі, 1998). Коротко, автори даного винаходу вирощували рослини
Агарідорзі5, доки вони не починали квітнути. Одержували штам Адгобасіегішт ішптегасіеп5 (наприклад, І! ВА4004), який несе ген, що становить інтерес, на бінарному векторі. Велику культуру в рідкому середовищі, яка росла протягом ночі, вирощували за 28-302С в ІВ з антибіотиком відбору для відбору щодо бінарної плазміди. Адгобрасіегшт осаджували центрифугуванням та ресуспендували до АбО0-1 у 595 розчині сахарози (якщо він був свіжоприготовленим, то автоклавування було не потрібне) у середовищі Мурасіге та Скуга (М5) з половинною концентрацією. Перед зануренням додавали 5іЇмеї І-77 з концентрацією 0,05 95 (500 мкл/л) та добре перемішували. Надземні частини рослини занурювали в розчин з
Адгобрасієегішт на 5 хвилин. Занурені рослини розміщували під темним ковпаком або кришкою протягом ночі, щоб підтримати високу вологість (за необхідності рослини клали на бік). Рослини продовжували вирощувати звичайним чином. Сухе насіння збирали та проводили відбір щодо трансформантів із застосуванням ПЛР.
Приклад 2. Процедура трансформації Сатеїїпа
Конструкції, одержані для модуляції антенного комплексу Агабрідорзі5, трансформовували в рослини із застосуванням протоколів, розроблених І и та Капа (І и апа Капо, 2008). Вирощували рослини Сатеїїпа, доки вони не починали квітнути. Одержували штам Адгобасіегійт
Іштеїасіеп5е І ВА4004, який несе ген, що становить інтерес, на бінарному векторі. Велику культуру в рідкому середовищі, яка росла протягом ночі, вирощували за 28-302С в ІВ з антибіотиком відбору для відбору щодо бінарної плазміди. Адгорасіегішт центрифугували та ресуспендували до АбО0-1 у 5 95 розчині сахарози (якщо він був свіжоприготовленим, то то автоклавування було не потрібне) у М5 з Ж» концентрацією. Перед зануренням додавали Зіїмеї
ІЇ-77 з концентрацією 0,05 95 (500 мкл/л) та добре перемішували. Стакан з ресуспендованою культурою Адгобасієгіа вміщали у вакуумну сушарку висотою 310 мм. Від однієї до двох рослин
Сатеїїпа вміщали в сушарку. Рослини обережно нахиляли, щоб вони могли втиснутися в сушарку, та вміщали частину з квітками в рідку культуру. Застосовували вакуум, щоб знизити
Зо атмосферний тиск на приблизно 95 95. Через 5 хвилин оброблені рослини розміщували під темним ковпаком або кришкою протягом ночі, щоб підтримати високу вологість (за необхідності рослини можна покласти на бік), та рослини продовжували вирощувати звичайним чином.
Збирали сухе насіння та проводили відбір щодо трансформантів
Приклад 3. Одержання конструкції для трансформації Сатеїїпа
Фрагмент гена Сао Сатеїйпа зайпа клонували із застосуванням КТ-РСК, використовуючи загальну РНК, виділену з листків Сатеїпа, як шаблон. Праймери були основані на послідовності гена Сао Агарідорбвів.
На основі одержаної послідовності сконструювали 2 різні вектори та їх вводили в модифіковану плазміду рСатбіа1301, яка несла ген стійкості до канаміцину (Кап) бактерій та ген стійкості до гігроміцину (пріїї) рослин. Схематичне зображення векторів наведене на ФІГ. 4.
Вектор рСатбріа1301САОізЗйпогі (рСатбгіа1301МЕ САОКМАЇ5) містить 272 п. о. з послідовності
Сао Сатеїнпа, за якими йде інтрон з Сао Агабрідорзі5 та зворотно комплементарна послідовність до послідовності Сатеїїпа. рсСАтбріа1ЗО1 САОЇопд (рСатбріа1301МЕСАОРНКІЇ) містив 750 п. о. з послідовності Сао Сатеїіпа, 2 інтрони Агабідорзі5 та зворотно комплементарну послідовність до послідовності Сатеїїпа. У цьому векторі ген Сао був під контролем специфічного для листків промотора САВІ. Конструкцію одержували так, щоб ділянку геномної сенсової/антисенсової послідовності, яка охоплює 2 екзони генів САО з інтронами від А. (Пайійапа під контролем специфічного для листків промотора САВІ, застосовували для одержання плазміди САО КМАЇ на основі плазміди рСатбріа!30, яка несе ген стійкості до канаміцину (Кап) бактерій та ген стійкості до гігроміцину (пріч) рослин. Вектор рСатбріа1зЗО1САОіЗПогі (рСатрьгіа!301МЕСАОКМАЇ5) містив 272 п. о. з послідовності Сао Сатеїїпа, за якими йде інтрон з гена Сао Агарідорзі5 та зворотно комплементарна послідовність до послідовності Сатеїіпа. рСатбіа!ЗзО1 СА опд (рСатріа1ї!301МЕСАОКМАЇ; ФІГ. 4, нагорі) містив 750 п. 0. 3 послідовності Сао Сатеїнпа, 2 інтрони Агарідорзізта зворотно комплементарну послідовність до послідовності Саптеїїпа. Трансформація лінії Зипезоп Сатеїйпа займа векторами рСатбіа1їЗзЗО1САОізЗпогі або рСатбріа13З01САОЇїЇ опд приводила до появи трансгенних рослин з нокдауном гена Сабо.
Спочатку мутантів піддавали скринінгу на основі стійкості до гігроміцину. Потім імовірних трансформантів підтверджували за допомогою ПЛР-аналізу щодо вмісту правильних 60 послідовностей.
Зменшений розмір антен підтверджували наступним чином. Зменшена флуоресценція трансгенних рослин (ФІГ. 8) та блакитний нативний гель-електрофорез з використанням зеленого барвника (ФІГ. 10) вказували на зменшення суперкомплексів фотосистеми ІІ (розміру антен).
Приклад 4. Трансформація лінії спіогіпа Агарідорзі5 із застосуванням способу ПогаІ-дір
Для трансформації використовували лінію спіогіпа СпІ-3 Агарідорзіє. Цю лінію СпІ-3 було одержано шляхом індукованого рентгенівськими променями мутагенезу САО (хлорофіл А- оксигенази) та її отримували з Центру з дослідження біологічного ресурсу АгаБбідорвів
Університету штату Огайо.
Для даної процедури застосовували спрощений протокол трансформації Агарідорзі5, який був розроблений біеме Сіоцудп та Апагемж/ Вепі (1998) з Іллінойського Університету, Урбана-
Шампейн. Він описаний нижче як такий, що виконували для даної трансформації. 1. Вирощували здорові рослини Агарідорзі5, доки вони не починали квітнути. Квітконоси підрізали для стимуляції розростання великої кількості вторинних квітконосів. 2. Одержували лінію Адгобасіегішт Ішптеїасіеп5, яка несла ген, що становить інтерес, на бінарному векторі. Вирощували велику рідку культуру за 282С у рідкому бульйоні І игіа Вегапі (І.В) з антибіотиками для відбору щодо бінарних плазмід.
З. Осаджували центрифугування Адгорасіегішт, ресуспендували до АбО0-0,8-10 у середовищі Мурасіге и Скуга (М5) з 5 95 сахарози. 4. Додавали 5іїмеї І-77 (сополімер силоксану та поліалкіленоксиду; поверхнево-активна речовина) з концентрацією 0,05 95 та добре перемішували. 5. Занурювали суцвіття рослини в розчин з Адгобасіегішт та залишали протягом 5 хвилин. б. Рослини, піддані занурюванню, розміщали в темряві та накривати ковпаком, щоб підтримати високу вологість протягом 16-24 годин. 7. Повертали трансформовані рослини до нормальних умов вирощування. Вирощували рослини протягом 2-3 тижнів, доки вони не дозрівали та не ставали готовими до збору стручків. 8. Проводили відбір трансформантів із застосуванням флуоресценції або маркера стікості до антибіотиків.
Конструкція вектора. Плазміду для 5ікМА-сайленсінгу гена хлорофіл а-оксигенази
Зо (СаохрвВ110-САО-МАВІ1-сар-по5) конструювали із застосуванням стратегії з геномною сенсовою послідовністю/антисенсовою послідовністю кКДНК. Звертаючись зараз до ФІГ. 15, де зображена конструкція для трансформації Агарідорзі5 з одержанням лінії, як описано в прикладі 4. Вказана фізична карта Ті-плазміди Адгобасіегіцт рЬ110-САО-МАВ-сар-по5. Кістяк /РБ110 використовували для розташування гена САО АгаБбідорзі5 з КЕ (світлочутливим елементом)
Спатудотопав, злитим на 5'-кінці гена Сао Агарідорзіз, під керуванням нативного промотора
САО (САО-рго) та термінатора САС (САО-їегт) Агабідорзіє; а також гена МАВІ (з
Спіатудотопавх), під керуванням залежного від світла промотора сар та термінатора пов).
Умовна позначка І В/КВ Т-ОМА вказує на лівий/правий край. КЕ (5'ЄССАСАСССССОИС-3") (ЗЕО ІЮО 27) слугує сайтом зв'язування для МАВ 1, щоб забезпечити можливість контролю експресії, що може індукуватися світлом.
Приклад 5. Конструювання рослин Сатеїіпа із застосуванням 5ікМА для зниження рівня СП
Б шляхом модуляції гена Сао
Фоновою лінією рослин була лінія ЗХипезоп Сатеїїпа, що характеризувалася нокаутом генів
Сао. Оскільки послідовність гена Сао С. 5аїїма була невідомою, для ампліфікації гена Сао С. 5айма застосовували праймери, гомологічні послідовності Сао А. ІПайапа, для даної ПЛР застосовували кДНК С. 5аїїма, одержану із загальної РНК за допомогою азоегірі, та наступні прямий (АТОААСОССОССОТОТТТАСТ) та зворотний (СОСТТСАОСОСААТОТСТССА) праймери. Одержаний продукт ПЛР клонували із застосуванням набору для клонування ТА
Вішпі та секвенували шість варіантів гена Сао. Одержані послідовності застосовували для розробки та синтезу касети 5ікМА під контролем специфічного для листків промотора САВІ, який розміщували в модифікованому векторі рСатбіа1301 із застосуванням сайтів рестрикції
ЕсоРГІ та НіпаїП. На ФІГ. 4 докладно зображені конструкції, які застосовували для трансформації лінії С. заїїма.
Утворення та скринінг трансгенних ліній з БікМА для САО. З метою утворення ліній з вікМА для САО С. заїїма (лінію Зипезоп) трансформували із застосуванням методу ПогаїІ-аїр з вакуумною інфільтрацією Трансформовані рослини вирощували до дозрівання та одержане насіння піддавали скринінгу на середовищі М5. Чашки з агаром доповнювали 25 мкг/мл гігроміцину у ролі агента відбору. Паростки, стійкі до гігроміцину, переносили у грунт. Для визначення наявності послідовності 5іІКМА загальну ДНК рослини екстрагували Із 60 застосуванням набору Оіадеп та застосовували як шаблон для ПЛР. Наїяність трансгена підтверджували за допомогою ПЛР із застосуванням прямого (5") та зворотного (3") праймерів, які гібридизуються з промотором Сабріі та термінатором Мо5 відповідно. Рослини покоління ТЗ або більш пізнього, яких вирощували за контрольованих тепличних умов, застосовували для наступних експериментів.
Визначення вмісту хлорофілу. Для визначення концентрації хлорофілу а та хлорофілу р листові диски площею приблизно 5 мм2 вирізали та гомогенізували в 1 мл 80 95 ацетону із застосуванням гомогенізатора Веадреаег. Зразки центрифугували в мікроцентріфузі за максимальної швидкості протягом З хв. та супернатанти використовували для визначення концентрацій хлорофілу згідно з рівнянням Агпоп (Агпоп, 1949).
Вимірювання флуоресценції хлорофілу. Флуоресценцію хлорофілу а вимірювали на відокремлених листках, розміщених на вологому фільтрувальному папері із застосуванням
Напау РіпотСат ЕС 1000-Н (Рпоюп Зузіетв5, Драсов, Чеська Республіка). Листки адаптували до темряви протягом 20 хв. та визначали мінімальну флуоресценцію (Бо) вимірюючи світлові імпульси (620 нм) за низької інтенсивності. Потім застосовували насичувальні імпульси білого світла протягом 0,8 секунд (с) (4000 ммоль фотонів м-20-1) для визначення максимальної флуоресценції в адаптованому до темряви стані (Біт). Потім листки піддавали впливу актинічного білого світла з параметрами 500 мкмоль м-20-1 протягом 300 с, з подальшою темновою релаксацією протягом 300 с. Максимальну флуоресценцію в адаптованому до світла (Ет") стані визначали із застосуванням серії імпульсів насичувального білого світла протягом 0,8 с. Значення МРО розраховували як (Ет-Ет"Угт".
Виділення мембран тилакоїдів. Виділення мембран тилакоїдів здійснювали згідно з (дагмі,
З., Зцогв5а, М., РаакКагіпеп, М. б Аго, Е.М. Оріїтігей паїїме де! зувівтзв ог зерагаїоп ої ІШуїаКоід ргоївіп сотріехев: помеї! зирег-апа теда-сотрієхе5. Пе Віоспетіса! уЧоштаї 439, 207-214 (2011)), з невеликими модифікаціями. Усі стадії здійснювали у темряві за 4 "С. Свіжі листки Сатеїїйпа перемелювали в подрібнювачі з крижаним буфером для подрібнювання (50 мМ Нерез/КОН (рн 7,5), 330 мМ сорбіту, 2 мМ ЕОТА, 1 мМ МаосІіг, 5 мМ аскорбату та 0,05 95 В5А) та фільтрували крізь 2 шари Мігасіоїй. Суспензію швидко центрифугували за 500 д і 4 "С протягом 30 с.
Супернатант центрифугували за 10000 д протягом 10 хв. Осад ресуспендували в буфері для створення осмотичного шоку (50 мМ Нерез/КОН (рн 7,5), 5 мМ сорбіту та 5 мМ Мосіг), після
Зо чого центрифугували за 10000 д і 4 "С протягом 10 хв. Залишки буфера для створення осмотичного шоку видаляли шляхом суспендування осаду в буфері для зберігання (50 мМ
Нерез/КОН (рн 7,5), 100 мм сорбіту та 10 мМ Масіг), після чого центрифугували за 10000 д протягом 10 хв. Наприкінці, осад з тилакоїдів суспендували в малій аліквоті буфера для зберігання. Концентрацію хлорофілу визначали у водному 80 95 розчині ацетону згідно з Агпоп,
БІ. Соррег Епгутез іп Ізоїаїєд СНіогоріазі5. РоїурпепоЇохідазе іп Веїа Миїдагів. Ріапі рпузіоіїоду 24, 1-15 (1949).
Визначення швидкості фотосинтезу. Вимірювання газообміну виконували за допомогою газоаналізатора відкритого типу ГІ-6400 (1і-Сог). Криві залежності фотосинтезу від світла одержували шляхом підвищення інтенсивності світла від 0 до 2000 мкмоль фотонів м-2с-1.
Еталонну концентрацію СО2 встановлювали як 400 мкмоль СО2 моль-ї в повітрі. Листки підтримували за температури 25 "С та відносній вологості 50 95. Вимірювання здійснювали на повністю розкритих листках (8-10 листки знизу) рослин віком 3,5 тижня.
Блакитний нативний гель-електрофорез. Тилакоїди, які містять 8 мкг хлорофілу, солюбілізували протягом 5 хв. за допомогою додавання рівного об'єму буфера, що містить а- додецилмальтозид за концентрації 2 95 вага/об'єм. Додавали 1/10 об'єму буфера для зразків, який містить Зегма-ВіІпе б, та зразок центрифугували у мікроцентріфузі протягом 10 хв. за максимальної швидкості. Комплекси тилакоїдів розділяли протягом 6 годин за 4 "С на 4-12 95 гелі Тгіз-гліцин із застосуванням системи Момех Міпісеї! з постійним струмом 6 мА.
Електронна мікроскопія. Збирали листки Сатеїйпа 5айма віком З тижні та фіксували в какодилатному буфері, що містив 2,5 95 глутаральдегіду. Післяфіксаційну обробку, заливку та виготовлення зрізів проводили як описано раніше (Кіедег апа Саззеї5, 1999). Зрізи завтовшки 100 нм візуалізували за допомогою мікроскопа Рпйірв5/РЕЇ Т-12 за 80 кВ (виготовлення зрізів та візуалізацію виконували у Головному центрі електронної мікроскопії Університету Вандербільта,
Нешвілл, Теннесі). Для вимірювання товщини мембран та просвітів тилакоїдів використовували
Ітаде». П'ять зрізів хлоропластів використовували для аналізу кожного зразка, що полагав у вимірювання мембран тилакоїдів, та п'ятнадцять зрізів хлоропластів на зразок використовували для підрахунку гранул крохмалю.
Проходження світла крізь листки. Проходження крізь листки світла з довжиною хвилі від 400 нм до 700 нм визначали за допомогою спектрометра ВГ АСК-Сотеї СХВА-58-50 (ЄгеїЇатМеї Іпс.). бо У ролі джерела світла використовували максимальне сонячне випромінювання опівдні.
Експеримент повторювали в трьох повторах.
На ФІГ. 16 А-С можна побачити, що ступінь зменшення СІ Б визначає фенотип рослини.
ФІГ. 16А представляє схематичне зображення генної конструкції, що застосовується для індукції 5івнМА-сайленсінгу генів САО в С. займа. Екзони представлені прямокутниками, а інтрони як літери М. На ФІГ. 168 наведене порівняння фенотипів росту рослин дикого типу та трансгенних рослин віком три тижні. Рослини з антенами малого-середнього розміру (СК І-І), що відповідають співвідношенню СТІ а/ь 4-5, характеризуються більш сильним ростом порівняно як з рослинами дикого типу (М/Т), так і з рослинами з антенами між великого-середнього розміру (СВ Н-Ї, співвідношення СТІ а/б 6-9) та дуже великого розміру (СК МУ-Н, співвідношення СНІ а/р вище за 10). Вимірювальна лінійка, 10 см. На ФІГ. 16С наведене порівняння розміру повністю розвинених стручків у ліній МУТ, СЕ І-І, СА Н-Ї та СК У-Н. Розвиток стручків у ліній СЕ. Н-І та СК
М-Н не порушений, у той час як стручки СК М-Н є набагато меншими у дозрілому стані.
Вимірювальна лінійка, 1 см.
Трансгенні рослини демонструють діапазон фенотипів на основі ступеня зниження вмісту спі р
Оскільки С. займа являє собою алогексаплоїдну рослину, всі варіанти гена Сао клонували та секвенували, щоб переконатися, що їх послідовності були достатньою мірою схожими, щоб на них націлювалася одна 5ікМА-конструкція. Геномні сенсові/"антисенсові конструкції, які охоплюють перші 2 екзони генів Сас з інтронами А. ІПаїійапа під контролем специфічного для листків промотора САВІ, застосовували для одержання плазміди з вікМА для САО. Рослини С. займа трансформували за допомогою методу Пога!1-дір із застосуванням вакуум-інфільтрації та піддавали скринінгу щодо стійкістю до гігроміцину. Рослини Т1, стійкі до дії гігроміцину, висаджували та піддавали скринінгу щодо зменшеного співвідношення СТІ а/Ю. Співвідношення
Сп а/5 варіювалося від 4 до 19. Для подальших експериментів обирали лінії САО-5івМА (покоління х»Т3), які мали широкий діапазон співвідношень Сп а/б та розмір антен, щоб продемонструвати залежність продуктивності рослини від ступеня зменшення антен.
Трансгенні рослини розподіляли на три різні групи згідно з їх співвідношеннями СТІ а/р та фенотипами росту: мале-середнє співвідношення СП а/б "СК 1-1" (спі а/--4-5), високе-середнє співвідношення СТІ а/5 "СК Н-ї" (спі а/6-6-8) та дуже високе співвідношення СІ а/ь "СК м-н"
Зо (СПІ а/ьо-9 та вище). Типові фенотипи для кожної групи показані на ФІГ. 16.
Рослини СК 1-І з помірним зменшенням розміру антен характеризуються підвищеною швидкістю фотосинтезу
Фенотипічні характеристики трансгенних ліній пов'язували зі швидкістю їхнього фотосинтезу.
Конкретно, вимірювали залежність швидкості фіксації СО2 від інтенсивності світла у рослин С. займа, які вирощували за контрольованих тепличних умов. Порівняно з рослинами УТ у трансгенів СК Н-ІЇ швидкість фотосинтезу була зменшена на 10-15 95 для всіх діапазонів інтенсивності світла. У трансгенів СК М-Н швидкість фотосинтезу була значно послаблена, що узгоджувалося з їх патерном затриманого росту. Не дивно, що також мало місце невелике зменшення швидкості фотосинтезу у лінії з найкращою продуктивністю СЕК 1-І| за низької інтенсивності світла. Це є передбачуваним результатом для рослин з усіченими антенами за умов обмеженого світла, за яких фотохімічні процеси не є насиченими. Однак, важливо те, що за умов високоінтенсивного світла справжня швидкість фотосинтезу в даній лінії на 17 95 перевищувала таку в рослин УУТ.
Рослини СК-Ї! характеризуються стійкими МРО, подальше зменшення розміру антен послаблює МРО
Трансгенні рослини СЕК зі зменшеним розміром антен все ще були здатні здійснювати ефективне нефотохімічне гасіння (МРО). У загальному сенсі МРО стосується різних механізмів розсіювання енергії, які знижують утворення шкідливих активних форм кисню, які утворюються за умов надлишкового світла, коли фотохімічні процеси насичуються. Відомо, що мутанти, в яких відсутні СНІ Б, білки І НСІЇ або в яких проявляються зміни у топологічній організації антен
РБІЇ, зазнають сильного зниження МРО), що вказує на складний механізм участі антенних білків в їх активації (Комас5, Ї. еї аі/.). Відсутність світлозбирального комплексу СР24 негативно впливає на структуру та функцію мембран гран хлоропластів вищих рослин. ТНе Ріапі сеї! 18, 3106-3120 (2006); де Віапсні, 5., БаіОвіо, Ї., Тодпоп, С., МогозіпоНо, Т. 5 Вавві, АВ. Міпог апіеппа ргоївєїп5 СР2А апа СР2Бб анесі Ше іпівгасіоп5 реїмуєеп рпоїозузіет ІІ зибипіїв апа їШйе еіестоп Мапзроті гаїє іп дгапа тетбгапез ої Агарідорзів5. Те Ріапі сеї! 20, 1012-1028 (2008).
Існує кілька відомих компонентів МРО. Найшвидший компонент, ДЕ, звичайно розвивається в межах декількох секунд - хвилин після впливу високоїнтенсивного світла. Існує доказ, що існують щонайменше два різні механізми гасіння, що сприяють ДЕ, обидва з яких залежать від бо зростання трансмембранного градієнта протонів: 1) зеаксантин (7еа)-залежне МРО,
асоційоване з дезоксидацією віолаксантіна за допомогою ксантофілового циклу, та 2) Р5р5- залежний механізм, який діє на антенні комплекси ІНСІЇ, що веде до функціонально відокремленних антен та швидкої та оборотної зміни організації мембран гран (Вейегіє, М. еї аї.
Моп-іпдисеа адівзосіайоп ої ап апівсєппа Пеїего-оїїдотег і5 пеєдей г поп-рпоїоспетіса! доепспіпа іпаисіоп. Те дошгпаї ої Віоіодіса! Спетівігу 284, 15255-15266 (2009)).
Порівнювали МРО у адаптованих до темряви рослин УТ та мутантів СК. Актинічне світло з інтенсивністю 800 мкмоль м-2с0-1 застосовували для максимізації ДЕ, в той же час мінімізуючи фотоінгібування. Вимірювання продемонстрували, що характер МРО у трансгенів збігався з рівнем зменшення вмісту СПІ Б. Порівняно з рослинами М/УТ МРО було на 15 95 вище у лінії СЕ. І -
І та відповідно зниженим у СК Н-Ї та СКЕМ-Н (ФІГ. 175). Звертаючись зараз до ФІГ. 17А,, на ній зображено зображені криві залежності фотосинтезу від насичення світлом у М/Т, СК І-І, СА Н-Ї та СК МУ-Н. Усі експерименті здійснювали з рослинами віком 3,5 тижня. Результати являють собою середнє значення -5Е від щонайменше 5 незалежних експериментів. На ФІГ. 17В зображене нефотохімічне гасіння (МРО) у МТ, СК І-І, СА Н-Ї та СК М-Н. Листки піддавали впливу актинічного світла протягом 150 с (800 /моль фотонів м-2с-1; біла смужка), з подальшою темновою релаксацією протягом 150 с (чорна смужка). Результати являють собою середнє значення х5Е від 10 незалежних вимірювань.
ФІГ. 18 - Порівняння структури тилакоїдів та складу комплексу РИ у рослин УМТ та трансгенних організмів СК. На панелях 18а-18п представлені електронні мікрофотографії мембран тилакоїдів від ліній дикого типу та СЕ, одержані за допомогою трансмісійної електронної мікроскопії. Листки рослин дикого типу та СЕ І-І, СА Н-Ї, та СЕ М-Н віком три тижні фіксували негайно через З год. після початку світлової фази фотоперіоду росту та готували для трансмісійної електронної мікроскопії. Зрізи хлоропластів показані для рослин дикого типу (панелі а-є, СА 1-І (Б-), СА Н-Ї (с-9) та СК М-Н (а-й)). Лінійки на верхній та нижній панелях мають довжину 50 нм та 100 нм відповідно.
Точка переходу фотосинтетичної ефективності пов'язана з складом суперкомплексу РБІЇ
Для визначення того, чи корелює різке падіння продуктивності рослини зі значними змінами в організації світлозбирального суперкомплексу, аналізували склад світлозбиральних суперкомплексів з мембран тилакоїдів із застосуванням блакитного нативного РАСЕ (ВМ-
Зо РАСЕ), методики яку звичайно застосовують для визначення характеристик комплексів білків інтактних мембран. Для відслідковування потенційної мінливості у суперкомплексах РОЇ автори даного винаходу виділяли мембрани тилакоїдів з рослин дикого типу та усіх ліній СЕК та солюбілізували їх обробкою м'яким детергентом із застосуванням а«-додецилмальтозиду. Після розділення за умов ВМ-РАСЕ без денатурації спостерігали 7 основних смужок, які містили хлорофіл (див. ФІГ. 18іпт). Чотири верхні смужки на гелі були різними формами суперкомплексів
РОЇ. У вищих рослини найбільший відзначений суперкомплекс, ЗС1, складається з димерної корової частини (С2), двох тримерів І НСІЇ (5), міцно зв'язаних з комплексом, та ще двох тримерів, що являють собою помірно зв'язані тримери (тример М) (Сапйаїті, 5., Коигії, Б.,
Кегеїспе, 5., ВоеКета, Е.). 5 Стосе, А. ЕРипсійопа! агспітесіиге ої піднег ріапі рпоїозувівст ІЇ зирегсотріехе5. ЕМВО доштпаї 28, 3052-3063 (2009); ВоеКета, Е.9., Мап Вооп, Н., Мап Вгеєтеп,
УР. в Оеккетг, 9У.Р. зиргатоїесшіаг огдапігайноп ої рпоїозузієт ІІ апа її Ідні-Нагуевіїпуд апіеппа іп рапіану зоїЇшбіїй2ейа рпоїозузієет ІЇ тетбгапевз. Еигореап уоштпаї ої Віоспетівігу / РЕВ5 266, 444- 452 (1999); ОеККег апа ВоєКета, 2005)). Більш дрібні комплекси визначені як С252М (5502),
С252 (503) та С25 або 52М, базуючись на попередньому дослідженні.
Кількість суперкомплексів, що містять М-тримери, а також неприкріплені І-тримери, зменшується зі збільшенням співвідношення спі а/б. Перехід від лінії СК 1-Ї до лінії СЕ Н-Ї відповідав майже повному зникненню цих суперкомплексів вищого порядку, а також І -тримерів.
Отже, щоб компенсувати зменшення вмісту СПІ Б рослини Сатеїїпа переважно зменшували кількість субодиниць НС, які звичайно утворюють більш слабкі зв'язки, що могло сприяти збереженню ефективності фотосинтезу шляхом підтримання сильно сполучених антенних комплексів.
Укладання мембран тилакоїдів у стопки змінюється під час модифікації антен
Розглядали організацію хлоропластів у рослин С. 5аїйма М/Т, а також у трансгенних ліній з різних рівнями Сп а/рб за допомогою трансмісійної електронної мікроскопії (ТЕМ) для визначення того, як впливав вміст І НСІЇ та склад суперкомплексів на укладання тилакоїдів у стопки.
Раніше було описано, що в мутантів з дефіцитом СП 5 спостерігається порушене утворення гран на прикладі різних рослин, як сої (Н., М. еї аІ. Спагасієгігацноп ої (Ше Агарідорзів І(Ваїапа тиїапі рер2 улісп асситшиіаїез аїміпу! спіогорпуїІв. Ріапі є Сеї! Рпузіоіоду 46, 467-473 (2005)) або бо Агарідорзіз (К.ММ. КесК еї аІ, 1970). Кількість тилакоїдів на грану в ліній СК поступово зменшувалась паралельно зі зниженням рівнів СІ б, що відповідало попереднім спостереженням. Цікаво, що зміни структури мембран тилакоїдів у гранах не були прямо пропорційними для трансгенних рослин, що характеризуються діапазоном співвідношень СП а/ю. Рослини з дещо зниженим рівнем СТІ Б (СК І-І) характеризувались дещо більш товстими подвійними мембранами та підвищеним розміром просвіту порівняно як з рослинами дикого типу, так і мутантами СК Н-ІЇ. Менш сильно здавлена структура мембран може пояснюватися збільшеною швидкістю фотосинтезу, оскільки вона сприяєтиме дифузії розчинних компонентів електрон-транспортного ланцюга, розташованих в просвіті, таких як пластоціанін, та перегрупуванню компонентів фотосинтетичного апарату. Рослини СК Н-Ї зі співвідношеннями
СНІ а/ь 6-7, навпаки, мали тоншу та більш компактну подвійну мембрану тилакоїдів порівняно з рослиною дикого типу та мутанта СК І-І, що могло негативно впливати на дифузію розчинних носіїв електрон-транспортного ланцюга.
Лінії СК-ІЇ демонструють підвищений вихід в польових умовах
Для аналізу виходу біомаси та насіння у ліній СК за природних умов автори даного винаходу проводили польовий експеримент у малому масштабі в Небрасці. Рослини з найвищим співвідношенням СТІ а/ю5 не були включені в дослідження, оскільки наші попередні дані продемонстрували, що вони не продукують добре розвинених стручків з насінням. Автори даного винаходу збирали зразки листків від рослини віком 4 тижні, щоб охарактеризувати співвідношення СТІ а/р у листків різних ярусів. Результати показані в таблиці 1. Як для рослин
МТ, так для ліній СК спостерігали зміну значення СІ а/б у верхніх, серединних та нижніх листках. Однак, варто відзначити, що у всіх трансгенних організмів СК співвідношення СПІ а/р були вищими у листках всіх рівнів ярусів порівняно з відповідними значеннями для рослини дикого типу. У листках верхнього ярусу рослини УУТ характеризувалися співвідношеннями СПІ а/ь 3,250,1, СК-/ | характеризувалися співвідношеннями 5,020,3, СК-НІ характеризувалися співвідношеннями 5,6:0,1, а СК У-Н характеризувалися співвідношеннями 7,0:0,4.
Таблиця 1
Співвідношення СТІ а/Ь у листках різних рівней ярусу в рослин УЛ та СК І-І, а також двох ліній СК Н-Ї, які вирощували у польових дослідженнях і
У рослини, що вирощуються як густий полог, доступність світла є головним обмежувальним фактором для збільшення нетто-фотосинтезу. Як показано на ФІГ. 7, світлопропускання через
Зо окремий листок значно збільшується під час зменшенням розміру антен. Взагалі, за довжини хвилі світла від 400 нм до 700 нм листки рослин дикого типу пропускали на 36 95 менше світла порівняно з листками зі співвідношенням СІ а/б 4,3 (лінія СК-1І). Отже, таке підвищене пропускання світла може приводити до збільшеного накопичення біомаси.
Виходи насіння та біомаси підсумовані в таблиці 2. Мала місце точка переходу, за якої збільшення СП а/6 більше не мало переваг щодо продуктивності, що збігалося з нашими попередніми спостереженнями. Взагалі, трансгенні організми СК-ЇІ, які підтримували свої співвідношення СПЇ а/б у листках верхнього ярусу близько 5, мали більший вихід насіння (125 95) та збільшення загальної сухої ваги біомаси (240 95) порівняно з рослинами дикого типу.
До збільшення виходу насіння приводило підвищення кількості стручків, у той час як кількість насінин на стручок та вага окремої насінини залишалися такими ж, що вказує на те, що рослина реагують на збільшення первинного продукту фотосинтезу підвищенням цвітіння та подальшим утворенням насіння та стручків (таблиця 2).
Навіть невелике подальше збільшення співвідношення СпІ а/5 було шкідливим, приводило до різкого падіння продуктивності, що збігається з нашими попередніми спостереженнями. Вже у лінії СК зі значенням СП а/ь 5,6 спостерігали 33 95 зниження виходу насіння та 18 95 зниження біомаси порівняно з рослинами УМТ. У ліній СЕ з рівнями СП а/ь 7 у лситках верхнього ярусу вихід насіння падав саме на 40 95, а загальна суха вага біомаси на 60 95 порівняно з рослинами
МЛ (див. таблицю 2).
Таблиця 2
Вихід у рослин УМТ та СК І-І, а також у двох ліній СК Н-Ї, які вирощували у польових дослідженнях. (Значення являють собою середнє значення плюс стандартна помилка, що оцінювали на 30 рослинах)
Збільшення/зменшення ваги насіння (г) порівняно п/Ла 25 до -33 Фо -61 95 з рослиною М/Т (90
Збільшення/зменшення ваги рослини (г) порівняно п/Ла 44 до -18 Фо -40 90 з рослиною УТ (95) рослину
У даному прикладі конструювали рослини Сатеїймпа заїїма з діапазоном співвідношень СпІ а/Ю, що приводило до діапазону розмірів фотосинтетичних антен. Рослини з дещо зменшеними антенами порівняно з рослинами дикого типу характеризувалися збільшеною фотосинтетичною здатністю за високої інтенсивності світла, якщо аналіз проводили на рослинах віком 4 тижні.
Крім того, підвищене пропускання світла крізь листки рослин з дещо зменшеним розміром антен упродовж дня створює можливість для підвищення загального фотосинтезу рослин у листках всіх ярусів.
Хоча даний винахід був детально описаний з конкретним посиланням на дані переважні варіанти здійснення, інші варіанти здійснення можуть досягати тих самих результатів.
Наприклад, нуклеїнові кислоти, що кодують білок, можуть відповідати специфічній ЗЕО ІЮ МО, але можуть також охоплювати зміни, що допускаються у зв'язку з виродженістю генетичного коду. Варіації та модифікації за даним винаходом будуть очевидними для фахівця в даній галузі, та передбачено охоплення всіх таких модифікацій та еквівалентів у формулі винаходу, що додається. Повні розкриття усіх посилань, заявок, патентів та публікацій, наведених вище, тим самим включені шляхом посилання.
ПРОЦИТОВАНІ ПОСИЛАННЯ
Наступні посилання та інші документи, процитовані у даному документі, але не наведені в даному розділі, у тій мірі, в якій вони забезпечують ілюстративні процедур та інші подробиці, що доповнюють ті, які викладені у даному документі, конкретно включені у даний документ шляхом посилання.
ПАТЕНТНІ ДОКУМЕНТИ США
4535060 5391725 5610042 4940935 5424200 5614395 5034323 5428147 5614399 5164316 5447858 5633435 5188642 5464765 5633441 5196525 5508184 5593874 5231020 5508468 5614395 5254801 5523311 5627061 5283184 5527695 5659122 5302523 5538880 5780708 5322783 5538877 5981840 5322938 5550318 6118047 5352605 5563055 6232526 5359142 5658772 2003/0221211 5378619 5591616 2004/0029283 5384253 5608144
ІНШІ ПАТЕНТНІ ДОКУМЕНТИ
ЕР 0 342 926 МО 99/32619 МО 01/29058,
МО 92/117598 МО 00/44914. МО 02/055692,
МО 95/06128 МО 00/44895, МО 02/44321,
МО 97/04103 МО 00/63364 М/02005/054439,
МО 97/41228 МО 00/01846, М/о2005/110068
МО 99/07409 МО 01/36646, МО2013/016267
МО 99/60129 МО 01175164,
ІНШІ ПУБЛІКАЦІЇ
А, М., БАТТА, 5. К. 5 РАТТА, К. 2010. ВАМА іпіепегепсе іп аезідпіпд ігапздепіс стор5. СІМ сторв, 1, 207-13.
АІЇ Т5СНИЇ, 5. Е., СІЗН, МУ. МІ ЕВ, М/., МУЕН5, Е. МУ. а ПІРМАМ, 0. 9. 1990. Вавіс Іосаї аїїдптепі 5еагсн сої. ) Мої Віої, 215, 403-100.
АІЇ Т5СНИЇ, 5. Г., МАООЕМ, Т. Г., БСНАЕЕЕНВ, А. А., 7НАМИ, ., 2-НАМИ, 2., МІ ЕВ, МУ. в
ПРМАМ, 0. 9. 1997. Сарреа ВІ А5Т апа РБІ-ВІ А5Т: а пем/ депегаїйоп ої ргоївїп даїаразе 5еагсп ргодгатв. Мисівїс Асіа5 Нев, 25, 3389-402.
ВЕСНТОГО, М., БП І, У. а РЕП ЕТІЕВ, С. 1993. Іп ріапіа Аагорасієтгійт-теаіаїєйд депе мапеїег Бу іп Яйгаїоп ої адийї Агарідорвів ІНаійапа ріапі5. С А Асай 5сі Раїгів, І Ме бсіепсев, 316, 1194-1199.
ВГАМКЕМЗ5НІР, В. Е. 2010. Еапу емоїшіоп ої рпоїозупіпевів. Ріапі Рпувіої, 154, 434-8.
СНАТТОРАЮНМУАМ, 5., АМС, І. Н., РОЕМТЕ, Р., ОЕМИ, Х. МУ. в М/ЕЇ, М. 1998. Агабідорвів
БАР ргоївїп НУ аїгесну іпіегасів мій ІДупі-гезропвіме рготоїегв5 іп теаіаїйпад ІднІ сопіго! ої депе ехргезвіоп. Ріапі Сеїї, 10, 673-83.
СІ ОШСН, 5. 9. 5 ВЕМТ, А. РЕ. 1998. Ріогаї дір: а зітрійей теїной г Аагорасієтгійт-теавіаїва їапетоптайоп ої Агарідорзів ІНаїіапа. Ріапі У, 16, 735-43.
СОМАМ, 0., ФАШІ5ЗЕМ, М. в НЕММІС, І. 2013. Тгапвсетірі ргоїййпу іп Агабідорвзів мйй депоте
Шіпу тісгоаітауз. Мешод5 Мої Віої, 1067, 35-49.
СОМИ, І., ВАМ, Р. А., СОХ, 0., ІМ, 5., ВАВВЕТТО, В., НАВІВ, М., НБИ, Р. 0., ММИ, Х., ЛАМИ,
МУ., МАВАВАРРІМІ, Г.Д. А. 4 НАМИ, Б. 2013. Мийіріех депоте епдіпеегпа изіпа СВІБРА/Сав зузієт5. Зсіепсе, 339, 819-23.
РОАМЕОНО, 0. а., РВІСЕ, у. А., МСКІМ, 5. М. 45 БАВСННРІЕЇ 0, М. ГІ. 2003. Гідні-нагуевіїпа сотріех депе ехргезвіоп і сопігоПей Бу роїй ігапзосгіріопа! апа розі-шгапзсгіріопа! теспапізт5 дигіпуд рпоїоассіїтайоп іп Спіатудотопаз геіпРагайїії. Рнузіоіодіа Ріапіагит, 118, 193-205.
ЕВЕАНАНО, 5., РІМА2АІ, сх. 6. ММОГІ МАМ, Р. А. 2008. Тпе адаупатісв ої рпоїозупіпевів. Аппи
Вем Сепеї, 42, 463-515.
ЕОІАМІ, М., СІСАМ, А. М., РАЮРОМ, 0. 9У., НАВА5НІМА, 5. 4 НІММЕВО5СН, А. сх. 1991. еоог, а ігапвіайнопаї гергез5ог ої Ше ССМА депе, паз а депегаї їшпеїйоп іп їйе іпійайноп ої ргоїєїп
Зо зупіпезів іп Засспаготусез сегемізіає. Мої! Сеї! Віої, 11, 3203-16.
СА), Т., «ЕНЗВАСН, С. А. 5 ВАВВА5, С. Е., ЗВО 2013. 2ЕМ, ТАГЕМ, апа СВІБРА/Савз-разеа теїпод5 Тог депоте епдіпеегіпд. Тгтепав Віоїесппої, 31, 397-405.
ЛМК5-ВОВЕВНТООМ, 5. а МОМИВА, М. 1982. Вірозотаї! ргоїєїп 54 асібв іп Мап5 аз а їгапзіайопаї! гергеззог ю гедшате ехргезвіоп ої Ше аІрна орегоп іп ЕвсПегіснпіа сої. / Васіегіої, 151, 193-202.
УО МІК, б. Е. 5 МІ! ЕН, Е. 5. 1995. ВМА-ргоївіп іпіегасіп5 ої Те расієтіорнаде АВ69 ВедА іапзіайопаї! гергеззог ргоївіп. Мисівїс Асіаз Зутр 5ег, 256-7.
КАІЕСЕВ-ГІ5АКАМ, А., РОРЕ2АМ, С. а ТАЕВ5Т, А. 2008. Біпдієї охудеп ргодисійп іп рпоїозувієт ЇЇ апа геїагей ргоїесіїоп теспапізт. Рпоїозупій Незв, 98, 551-64.
ГЕМІАТАМ, М., АІКАМ, М., ГЕЗНКОУМІТ2, 0. в ЕГОНЕА, В. 2013. Сепоте-міде вигуеу ої соїд вігез5 гедшайей айїегтаїме 5ріїсіпд іп Агабідорвів Шаїйапа м/йн ійпо тісгоатау. РГо5 Опе, 8, е66511.
ГО, б. в КАМИ, у. 2008. Сепегаїйоп ої іапздепіс ріапів ої а роїепійа! оїзеейд стор Сатеїїпа займа Бу Аагорасієтгійт-теаіаїеа ігапетоптаїоп. Ріапі Сеї! Вер, 27, 273-8.
МАТБИОКА, М., ТАВА, У., ЕШЛМИиВА, Т. 4 КАМО-МОВАКАМІ, У. 1993. Тівзйе-5ресіїйс Іані- геашаїей ехргевзвіоп дігесієд ру Ше рготоїєї ої а С4 депе, таїі7е ругимаїе, оппорпозрНаїє аїкіпазе, іп а СЗ ріапі, гісе. Ргос Маї! Асай 5сі О 5 А, 90, 9586-90.
МІМАСАМУА, У. 6 ТАКАНАЗНІ, У. 2004. Зтисітштге, тТипсіоп апа аззетрбіу ої Рпоїозузієт ІЇ апа їв Попі-нагмевзіїпа ргоївіп5. Рпоюзупій Нез, 82, 241-63.
МИ ЕВ, Р., І, Х. Р. а МІМОСІ, К. К. 2001. Моп-рпоїоспетіса! доепспіпуд. А гезропзе Ю ехсез5 ДНІ епегду. Ріапі Рнпувзіої, 125, 1558-66.
МО5БЗаМиа, У. Н., МОВВЕ, Ї., ЕП Е5, І., СІ АБ, С., НАМІ- ТОМ, М., РІМК, А., КАНМАММ, Ш.,
КАРАЛОСІ ОШ, А., МОГИ ІМЕАИХ, С. МУ., НІРРІ ЕН, М., МІСКЕЇ ЗЕМ, .)., МІХОМ, Р. У. 5 КАОБЗЕ, 0. 2005. МАВІ і5 ап АМА біпаїпод ргоївїп іпхоїмейд іп Ше Іднпі-гедшаїеа айегепіа! ехргезвіоп ої Те
І дпі-Нагмезіїпуд апіеппа ої Спіатудотопазв геїіпнагайії. Ріапі Сеїї, 17, 3409-21.
МЕАГЕ, Р. У. а МЕ ІЗ, А. 1986. Аїда! рпоїозупійеїйс тетргапе сотрієхе5 апа Ше рпоїозупіпевів-ітадіапсе сигуе. А сотрагізоп ої Іпі-адаріайоп гезропзе5 іп Спатудотопав5 геіппагайії (Спіогорпуїа). У Рпусоіоду, 22, 531-538.
РОЇ ГЕ, у., КАМАКАСІНІ, 5., УМ, Е.-5., МАБОБА, Т. 5 МЕГІ5, А. 2002. Тгипсаїєйд спіогорнНуїЇ апієппа 5і2е ої Ше рпоїозузієт5-А ргасіїсаї тешой іо ітргоме тістоаїда! ргодиссіїмйу апа Нуйгодеп ргодисійоп іп таз сипйиге. Іпі! у Нуагодеп Епегау, 27, 1257-1264.
РОГІЕ, У. Е., ВЕМЕМАММ, У. В., ТАМАКА, А. 4 МЕГІ5, А. 2000. Рпоозупінеїйс аррагайцв5 огдапіганоп апа їТпсіоп іп Ше мій їуре апа а сПпіогорнуї! р-Іеєз5 тшапі ої Спіаатудотопав5 геіппагаійї. Оерепдепсе оп саїбоп 5оийгсе. Ріапіа, 211, 335-44.
РОЇТЕ, 9. Б. М/., МІМОСІ, К. К. а МЕГІ5, А. 2001. Арзепсе ої І цівїпй, Міоіїахапініпй: апа
Меохапійіпй Айесів Ше Рипсійпа! СПіогорнуї! Апівппа 5і2е ої РНоїозувієт-ї! Биї пої їШЩаї ої
Рпоїозузіет-Ї іп їйе Стееп Ада Спіатудотопаз геіпнагайії. Ріапі СеїІ Рпузіоіоду, 42, 482-491.
ВЕЕСК, а. В., ОЕ НАЕМ, С., ТЕП ЕВ, 0. б., ОООГІТТІ ЕЕ, В. Е., РІТСН, МУ. М., ОІСКЕВЗОМ,
А. Е.. СНАМВОМ, Р., МСГ АСНІАМ, А. О0., МАВСОГІАЗН, Е., УЧОКЕ5, Т. Н. 6. ЕТ АЇ. 1987. "Нотоіоду" іп ргоївіп5 апа писівїс асідв: а їегтіпоїоду тидаїе апа а улау оці ої її. Сеї!, 50, 667.
ЗАССОМАММО, Г., ГОШЗНІМ, С., УАМ, Е., РОМКАХ, Е., АВТАТ, К. 5 СООГМІМ, Е. В. 1999.
Тне ЗТАВ ргоївїп ОКІ-6 із а їмапзіайопаї! гергеззог. Ргос Маї! Асай Зсі 0 5 А, 96, 12605-10.
ЗСНИЇІ 7, а. а ЗСНІВМЕН, В. 1979. Рііпсіріеєє ої Ргоївїп Бігисійге, Мем Моїк, Зрігіпдег.
ТАМАКА, ВА., КОБНІМО, м., БЗАМ/А, 5., ІЗНІСОНВО, 5., ОКАБА, К. а ТАМАКА, А. 2001.
Омегехргезвіоп ої спіогорНуїІйде а охудепазе (САС) епіагдев Ше апіеппа 5і7е ої рпоїозувзієт ІІ іп
Агарідорвзіз ІНаійапа. Ріапі у, 26, 365-73.
МАБ55, І. 5 СЗЕВН, К. 2009. Уапив-тасед спнагде гесотрбіпаїйопв іп рпоїозувієт ІІ рпоїоіппірйіоп.
Тгєепавз Ріапі 5сі, 14, 200-5.
МАМАСІЗАМУА, 5. в ЗНЕЕМ, у. 1998. ІпуоЇметепі ої таїе рої 7іпс їіпдег ргоївїнв іп їіз5це- зресіїс апа Іїдні-гедшіаїей депе ехргезвіоп. Ріапі Сеїї, 10, 75-89. 7НАМИ, РЕ. 2014. СВІБРА-Сав5 зувієтв апа теїнодз ог а(егіпд ехргезвіоп ої депе ргодисів.
И5 Раїепі Арріїсайоп 14/054,414. 4/15/2014.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 НМК, ІНК. «1205 ТРАНСГЕННІ РОСЛИНИ ІЗ СКОНСТРУЙОВАНОЮ РЕДОКС-ЗАЛЕЖНОЮ
МОДУЛЯЦІЄЮ ПІГМЕНТІВ ФОТОСИНТЕТИЧНИХ АНТЕННИХ КОМПЛЕКСІВ ТА
СПОСОБИ ЇХ ОДЕРЖАННЯ
«1305 32887У-1001РСТ2 «1405 РСТ/52015/ «1415 2015-11-12 «1505 2 62/078936 «1515 2014-11-12 «1605 27 «1705 РабепсІпПп версія 3.5 «2105 1 «2115» 645 «2125 БІЛОК «213» Хлорофіл а-оксигеназа (САО) Спіашудотопаз геіпПакавії «4005 1
Меє Гей Рго Аїа бек Іїей сбіп Агуд пув Аїа Аїа Аїа Уаі со1у с1у Агк4д 1 в; 10 15 б1у Ркго ТПг Авп о біп бБег Агуд Уаі Аїа Уаі Агуд Уаі1і бек Аза сСіп Рго 60 20 25 Зо пув бій Аза Рго Рго Аїа бек ТПг Рго Іїе Уаі1і сій Авр Рго біц 5ег 35 40 45
Тпув Рпе Агуд Агуд Тук с1у Ппув Нів Рпе сіу сіу Іїе Нів Ппув Іец 5ег 50 55 бо
Меє Авр Тер Гей Авр бек Уаі! Рго Агуд Уаі Акуд Уаі Агуд ТПг Був Авр 65 70 75 80 зек Агд біп Тїец Авр Авр Меє Іец біцш Іецй А1ї1а Уаї Гей Ап бій Агд 85 90 95
Тец А1ї1а с1у Агкд Гей бій Рго Тгр сбіп Аїа Агуд сбіп пуб Гец сбіц Туг 100 105 110
Тец Агд ув Агуд Агуд пув Ап Тер бі Агуд І1їе Рбе сій Тук Уаї ТЕПг 115 120 125
Акуд біп Авр Азїа Аза Аза ТПг їец Аїа Меє І1е сій бій Аїа Авп Агд 130 135 140
Зо пув Маії біц бій бек Гей бек біц біц Аза Агуд сій Туз ТПг Аза Уаї 145 150 155 160 б1у Авр Гей Агуд Авр біп Гей сій бек Гей Агуд Аїа сіп Уаі Аїа сіп
З5 165 170 175
Аа сбіп біц Агд Тец Азїа Меє ТПг біп бек Акд Уаі бій біп Авп Гей 180 185 190 біп Акд Уаії АвБп бій гей пув Аза бі Аїа ТПг ТБбг Гей біц Агд Меє 195 200 205
Акуд пув Аза бБег Авр Тец АвБр І1е їу5 б1п1 Агд сій Агуд Ії1е Аїа І1е 210 215 220 зек ТпПг Уаі Аїа А1їа Ппув с1іу Рго Аза бек бек бек бек бек Аза А1а 225 230 235 240
А1ї1а Уаі1і бек Аза Рго Аї1а ТПг бБег Аза ТПг ІТецй ТПг Уаї біц Агд Рго 245 250 255
Аза Аза ТПг ТБг оУаї Тс о біп біц Уаї Ркго бек ТПг бБег Тук с1у ТПг 260 265 270 60
Рго Уаі Авр Агд Аза Рго Агуд Агд бек ув Аї1а Аза І1е Агд Агд 5ег 275 280 285
Агуд сб1у Гей бій бек бек Меє сбіц Іїе сбіц біц с1у Гей Агд Авп Ріе 290 295 300
Тер Тук Рго Аїа сіц Рбе бек Аза Акуд Гей Рго Пув Авр ТПг Іецй Уаї 305 310 315 320
Ркго Рпе біц Іецшп Рпе б1у бій Рго Тгр Уаії Меє Рпе Агд Авр сій Гув 325 330 335 бі1у біп Ркго Бек Сув Іїе Агуд Авр сіц Сув Аза Ні Агуд с1у Сув Рго 340 345 350
Тецп бек Геип сіу Ппув Уаі1 Уаі1 сіш с1і1у біп Уа1! Меєсє Суб Рго Туг Нів 355 3З6о 365 с1у Тер біц Рбе Авп с1у Авр б1у Аїа Сув ТПг Пув Меєс Рго бек Тіг 370 375 380
Ркго Рпе Сув Агд АБп о Уаії сіу Уаі Азї1а Аза Гей Рго Сув Аїа сій Гув
Зо 385 390 395 400
Авр с1у Ропе І1е Тгр Уаії Тер Рго б1у Авр б1у Гей Рго Аїа бій ТЕГ 405 410 415
З5
Тец Рго Авр Рпе Аза біп Рго Рго бі сіу Рпе Гей Іїе Нібв Аїа с1іц 420 425 430
І1е Меє Уаї Авр Уаії Ркго Уаії сіц Ні сб1у Іїейп Гей Іїе бій Авп Гей 435 440 445
Тем Авр Гец Аїа Нів Аза Рго Робе ТПг Нів ТрПг бек ТПг Рре Аза Агд 450 455 460 б1у Тер Ркго Уаі Рго Авр Рпе Уаі Ппув Рпе Нів Аїа Ап пуб Аїа Іей 465 470 475 480 зек с1іу Робе Тгр Авр Рго Туг Рго І1е Авр Меє Аза Рпе сіп Рго Рго 485 490 495
Сув Меє ТПг Гей бек ТПг Іїе сіу Гей Аїа сіп Рго сіу Ппув І1е Меє 500 505 510 60
Акуд сіу УМаії ТБг Аза бек біп Сув Пув Авп о Нів ІТецйп Нів сіп Гей Нів
515 520 525
Уаї Сув Меє Рго Бек Ппув Ппув с1іу Нів ТПг Агд ІТец ІТецй Туг Ага Меє 530 535 540 зек Гей Авр Робе Тецй Рго Тгр Месє Агуд Ні Уаї Рго Рпе Іїе Авр Аг4д 545 550 555 560
І1е Тер пув біп Уаі А1ї1а Аїа сСіп Уаії Іец с1у сій Авр Гей Уаі1ї Іец 565 570 575
Уаї гейш б1у біп біп Авр Агкуд Меє Гей Агуд сіу біу Бек АвБп Тгр 5ег 580 585 590
Авп оРго Аза Ркго Туг Авр Пув Гецп Аїа Уа1і Агуд Туг Агд Агд Тгр Агд 595 бо 605
Авп осіу Уаі АвБп Аї1а бі1іц Уаії Аї1а Агкгд Уаі Агуд Аза с1у бій Рго Рго 610 615 620 век Авп Рго Уаі А1їа Меє бек Аїа бі1у бій Меє Рпе бек Уаі Ар с1іц 625 630 635 640
Зо
Авр АвБр Мес АБр АвБп 645
З5 «2105 2 «2115 657 «212» БІЛОК «213» Хлорофіл а-оксигеназа Уо1уох саксегі Її. падагієепвів 40 «4005 2
Меє гей Рго Аїа сіп Агд біп Сув Акуд ТБг бег Аза Сув бі1іп б1у Аг4д 1 5 10 15 45 сб1у І1е І1е бек Ппув Агуд ТПг Іїе Агуд Аза Ар Рпе Ппув Уаї Нів Аїа 20 25 30 50 зек Уаії бек біп біп Рго бек бек Авр Гув Рго бі біп біп Аїа Уаї 55 Рго Бек Іїе Маї біцш Авр Рго бій Аїа Гуз Рпе Агуд Акд Тук о1Уу Гув бо
Нів Рпе сіу сіу І1їе Нів Гув Гей Авп Гец Авр Тгр Теп сій Аїа Уаї (516) 65 70 75 80
Рго Агкуд Уаі Агкд Уаі Агуд ТПг Гпубв Авр бек Агуд біп Гей Авр сій Іей 85 90 95
Тец б1п Гей Аза Уаі гей Авп бій Агуд Гей Аїа с1іу Агд Гец бій Рго 100 105 110
Тгр біп Аїа Акуд біп пув Геп бій Тук Гей Агд Пув Акуд Агуд ГПув Авп 115 120 125
ТЕр біш Агуд І1їе Рбе сіц Тук Уа1 ТБг пув біп АБр Аї1а Азї1а Азїа ТПг 130 135 140
Тец А1ї1а Меє І1е сбіш біш Аза Авп Агуд Гпув Уаі біц б1іц Аза Гей 5ег 145 150 155 160 бі бі Аза Агуд бій Агуд ТБпг Аза Уаії с1у Авр Гей Агд біц сіп Іей 165 170 175 біп Уаі Гей сбіп Агуд біп Уаі1 сіп сіц Аза сіп сій Агд Гец сіп Іей 180 185 190
Зо ТПЕ біп Аїа Акуд Уаі! сбіц біп АвБп Гей Авзп Акуд Уаії АБп бій Геч Туз 195 200 205
А1їа сій Аїа Уаї сі1у Те б1й Агкд Месє Агд АБп б1у Агуд Меє с1у Щ1У 210 215 220
Авр Агуд пув пув біц Тец біп Уаі! Аза Аза Рго Уаі Аїа Уаі1і ТПг Аї1а 225 230 235 240
Аза Аза бек Аїа Аза Агуд Рго Аїа Уаі бек Аї1а ТПг Аза Уаі Аза сіц 245 250 255 зек УМаі Рго Аї1а Азїа І1е Уаії ТПг Уаї бій Рго Рго ТПг Агуд бек Туг 260 265 270
ТПЕ Рго Ап с1іу бек бек Авр с1іу ТПг бек Уа! Уаії Аза Рго Рго с1Уу 275 280 285
Акуд Агуд бег пув Уаі Азї1а І1е Агд Агуд б1у Агуд с1у Гей бій бек б5ег 290 295 300
Тец Авр Рпе сій Рго сіу Гей Агуд Авп Рпе Тер Туг Рго Аїа біц РБе 305 310 315 320 60 зек Аїа пув ІТец біу біп Авр ТПг Іец УМаії Рго Рпе сій Гей Рпе С1У 325 330 335 бій Рго Тгр УМаії Гей Рбе Агуд Авр бій Ппув с1у сбіп Рго Аїа Сув Ше 340 345 350
Ту Авр бій Сув Аза Нів Агкуд Аза Сув Рго Гей бек Ггец сіу пГув Уаї 355 3З6о 365
Ууаї б1іш с1у біп Уа1 Уа1 Сув Аїа Тук Нів сіу Тер б1іш Рбе АБп щу 370 375 380
Авр с1і1у Нів Сув ТПг Гуз Меє Рго бек ТП Рго Нів Сув Агд Авп Уаї 385 390 395 400 бі1у Маї Бек Аїа Гей Рго Сув Аза бій пув Авр сіу РіПе І1е Тгр Уаї 405 410 415
Тер Рго с1у Авр сбіу Гей Рго Аї1а біп ТПг Гей Рго Авр Рбе Аїа Агд 420 425 430
Рго Рго біц біу Рпе біп Уаі Ні5 Азїа бій І1ї1е Меє Уа1і Авр Уа1і Рго
Зо 435 440 445
Ууаї біш Нів сіу Гей Гей Месє бій Авзп Гец Гец АвБр Тец Аза Нів Аїа 450 455 460
З5
Ркго РіпПе ТПг Нів ТПг ТПг Тпг Рбе Аза Агуд сб1у Тгр Рго Уа1і Рго Авр 465 470 475 480
Рпе Уаї Ппув Рбе Ні ТП Авп Гув Іецй ІТецй бек с1у Туг Тер Авр Рго 485 490 495
Тук Рго Іїе Авр Меє Аїа Рре сбіп Рго Рго Сув Меєс Уаї Гей бек ТПг 500 505 510
І1Іе с1у Ггец Аза біп Ркго сі1у пуб І1е Меє Акуд сіу Уаі ТПг Аїа 5ег 515 520 525 біп Сув Гпув Авп о Нів Гей Нів Ссіп Гей Нів Уа1 Сув Меєсє Ркго бек Гув 530 535 540 пув б1у Нів ТПг Агуд Гей Гей Туг Агуд Меє бек Гей Авр Рпе Гей Рго 545 550 555 560 60
Тер Меє Акуд Тук Уаї Ркго Робе Іїе Авр пуб Уаі! Тгр Гув Авп Уаї Аїа
565 570 575 сбі1у бі1іп Уаї Гей с1у бій Авр Гей Уаі Гей Уаі Іец б1у б1п сіп Авр 580 585 590
Акуд Гей Ггец Агуд біу б1у АБп ТБг Тер бек АвБп Рго Аза Рго Тукг Авр 595 бо 605 пуб ІТеп Аї1а Уаі Агу Туг Агуд Агуд Тер Агуд АвБп о бег Уаії! бек Рго Авр 610 615 620 сб1у А1ї1а с1у Гей Авр б1іу Рго Аза Рго Гей Ап Рго Уаі Аїа Меє 5ег 625 630 635 640
А1ї1а сіу сій Меє Рре бек І1їе Авр бій АБр бій біп Авр Рго Агд Меє 645 650 655 сіп «2105 З «211» 463
Зо «2125 БІЛОК «213» Хлорофіл БрБ-синтаза на основі мРНК САО Рипаіїііїе11а ваіїіїпа «4005 З
Меє сбіп Бек Ппув Гей Тецй с1у Гей сіп Авр бій І1е бек бій Аїа Агд 1 5 10 15
Авр пув Гец Агуд ТПг бек б1п Аза Агд Уаі Аїа сбіп Авп Гей Ппув Агд 20 25 30
Ууаї Авр бій геш пув Аза сіц Аза Аза бек Іїейп бій Агуд Меє Агуд Іецй 35 40 45
А1їа бек бек бек бек ТПг Авр бБег ТПг Уаі бек І1ї1е Аїа 5Бег Агд Щ1У бо 50 сб1у А1ї1а Аї1а Уаі Аза Аїа ТПг ТПг бек Уаі Рго Авр Нів Уаії бій Агд 65 70 75 80 55 сі б1і1у І1е біп бек Акуд Уаі Акуд біу бек сіу Меє Аїа бек ТПг 5ег 85 90 95
Тук Рго Бек Нів Уаії Рго біп Рго бек біп Аї1а Уаі Агуд Акд с1у Рго 60 100 105 110
Тпув Ркго Гув Авр бБег Агуд Агуд Гей Агуд бБег бек Гей біц Гец бій Авр 115 120 125 сб1у Гей Агкуд Авп Рпе Тер Тукг Рго ТПг бі Рпе Аїа Ппув Ппув ІТец бій 130 135 140
Рго сіу Меє Мес Уаї Рго Рпе Авр Гей Рібе сіу Маії Рго Тер Уаі1! Іеєц 145 150 155 160
Рпе Агд Авр біц Ні бек Аза Ркго ТПг Сув І1е Ппув Авр Бек Сув Аї1а 165 170 175
Нів Агуд Аза Сув Рго Пец бек Гей сіу Ппув Уаі І1е АБп с1у Нів Уаї 180 185 190 біп Сув Рго Тук Нів сб1іу Тер бій Рпе Авр сіу бек сіу Аїа Сув ТЕГ 195 200 205
Тпув Меє Ркго бБег ТПг Агуд Меє Сув Нів сіу Уаі1 сіу Уаї Аза Аїа Іей 210 215 220
Зо Рго Сув Уаі бій Ппув Авр сіу Рпе Уаі Ткгр Уаї Тер Рго с1у Авр 01Уу 225 230 235 240
Ркго Рго Рго Авр Тецй Рго Рго Авр Ропе ТПг Аза Рго Рго Аїа с1у Туг
З5 245 250 255
Авр Уаі1 Ні Аза сбіцш І1е Меє Уаї Авр Уаії Рго Уаі сі Нів с1Уу ГІец 260 265 270
Тецп Меє бій Авп Гей Гей Ар Гей Аза Нів Аза Рго РоПе ТПг Нів ТЕПг 275 280 285
ТПг ТпПгЕ Рре Аза Агуд сіу Тгр Рго І1е Рго біц Азї1а Уаії Агуд РПпе Нів 290 295 300
А1їа ТпПг о пув Меє Іїец Аза с1у Авр Тгр Авр Рго Туг Рго І1е бек Мес 305 310 315 320 зек Рпе Авп о Рго Рго Сув І1їе Аїа Іецй бек ТПг Іїе с1у Гей бек сіп 325 330 335
Рго сі1у Ппув І1е Меє Акуд сіу Ту Гув Аї1а сій бій Сув Гпув Агд Нів 340 345 350 60
Тец Нів біп Гей Нів Уа1 Сув Меє Рго Бек Ппув сій сіу Нів ТБПг Агд 355 3З6о 365 їемч Гей Туг Агуд Меє бек Тей Авр Робе Тгр сіу Тер Аїа Гув Нів Уаї 370 375 380
Ркго Ріпе Уаї Авр Уаї Іецйп Тер ув їув І1ї1е Аї1а с1у сіп Уаі гей Щ1У 385 390 395 400 бі Авр Гей Уаі Гей Уаі1і гецй с1у біп сбіп Аїа Акуд Меє І1е с1у ФЩ1У 405 410 415
Авр Авр ТПг Тер о Сув ТП Рго Меєс Рго Туг Авр Гув Гей Аїа Уа1 Агд 420 425 430
Туг Агуд Агуд Тер Агуд АвБп о Меє Уаії Аїа Авр сб1у б1п Туєкє сі сбіц с1Уу 435 440 445 зек Ага Авп Агуд Сув ТПг бек біп Туг Авр бек Тгр Рго Авр Уаї1! 450 455 460 «2105 4
Зо «2115 297 «212» БІЛОК «213» Хлорофілід а-оксигеназа (САО) Мерпговеїштів ругітокгтів «4005 4
З5
А1їа Уа1 сіц Рре ТПг бек Агд Гец б1у Гув Авр І1їе Меє Уаі1і Рго Ріє 1 5 10 15 січ Сув Рпе бій сій бек Тгр Уаі! Гей Рбе Агд Авр бій АБр о1Уу Гув 20 25 30
А1їа сі1у Сув І1е їув Авр бій Сув Азїа Нів Агуд Аза Сув Рго Гей 5ег 35 40 45
Тец б1у ТпПг Уаі бій Авп сіу сбіп Аза ТПг Сув Аїа Тукг Нів с1у Тгр бо 50 біп Рпе бек ТПг сіу с1і1у бій Сув ТПг Ппув Іїе Рго бек Уаї С1у А1а 65 70 75 80 55
Акуд с1і1у Сув бек біу Уаі бі1у Уаі Агуд Аїа Меє Рго ТПг Уаі сіц сіп 85 90 95 (516) Авр сіу Меє І1ї1е Тгр І1е Тер Рго с1у Авр бій Гув Рго Аїа сі Нів 100 105 110
ІТ1е Рго Бек пув біц Маї Гей Рго Рго Аї1а с1у Нів ТПг Гец Нів А1а 115 120 125 бі І1е Уаї Гей Авр Уа1 Рго Уаі сі Нів сіу Гей Гей Ггец б1іц Авп 130 135 140
Тец Іїецп Авр Гей Аза Нів Аїа Рго Рпе ТПг Нів ТПг бек ТПг Рпе Аїа 145 150 155 160 пув б1і1у Тгр Аїа Уаі Рко бій Те УМаї пуб РПпе бек ТіПг Авр пув Уаї 165 170 175
Акуд Аза гец сіу б1у Аї1а Тер біц Рго Тук Рго Іїе Авр Меєс бек РіПе 180 185 190 біц Рко Рго Сув Меє Уа1і Гей бек ТПг Іїе сіу гей Аза сіп Рго 01Уу 195 200 205 пув Маії Авр Аїа сіу Уаі Агуд Аза бек біц Сув біцп Гув Нів Гецй Нів 210 215 220
Зо біп Гей Нів Уаії Сув Меє Рго бек с1іу Аїа сіу Ппув ТПг Агд Іецй Іей 225 230 235 240
ТУукг Агуд Меє Нів тей Авр Рпе Меє Ркго РпПе Тецй Ппуз Тук Уаі Рго 01Уу 245 250 255
Меє Нів Ггеи Уаі! Тер сіц Аза Меє Аза Авп біп Уаії Іец б1у сій Авр 260 265 270
Тец Агд Іїеип Уаі Ігеш сб1у біп сбіп Авр Агд Гей сіп Агд біу б1у Авр 275 280 285
Уаї Тер Бек Авп Рго Меє біц Туг Авр 290 295 «2105 Мм5 «2115» 299 «212» БІЛОК «213» Хлорофілід а-оксигеназа (САО) Мевовгідша уїгіде «4005 5
Авр бій Авр біу Агд Уаі А1ї1а Суб Іец Агуд Авр сій Сув Аїа Нів Аг4д 1 5 10 15 60
А1їа Сув Ркго Пец бек Іец б1у ТБПг Уаї біц АвБп б1у Нів Аїа ТПг Сув 20 25 30
Рго Тук Нів біу Тгр біп Туг Авр ТПг Авр б1у Ппув Сув ТПг Тув Меє 35 40 45
Рго біп ТБг Агд Тец Агуд Аза біп Уаі Агкуд Уаії Бек ТПг Гей Рго Уаї 50 з9 бо
Акуд бій Нів Авр біу Меє І1е Тр Уа1ії Тук Рго с1іу Бек Ап бій Рго 65 70 75 80
Рго сій Нів Гей Рго бек Рпе Гей Рго Рго бБег Авп Рпе ТПг Уаї Нів 85 90 95
А1їа сій Ггец Уаії Іец біц Маї Рго І1е б1цп Нів с1у Ге Меє І1е сіц 100 105 110
Авп оГечп Гей Авр Тец Аза Нів Аза Рго Робе ТПг Нів ТПг сій ТПг РБе 115 120 125
А1їа пув с1у Тер бек УМаі Рго Авр бек Уаі Авп Рпе Гпув Уаі Аза Аї1а
Зо 130 135 140 біп бек Гей Аза с1іу Нів Тер бій Рго Тук Рго Іїе бек Меє пув РІГе 145 150 155 160
З5 біц Рко Рго Сув Меє ТПг Іїе бек сій Іїе сіу Гей Аїа пуб Рго 01Уу 165 170 175 біп тей біш Аза с1у Ппув Рпе бек с1іу біц Сув Гув біп Нів ГІецй Нів 180 185 190 сіп Гей Нів УМаї Сув Меє Рго Аїа сіу сбіц с1у Агкуд ТіПг Агуд І1е Гей 195 200 205
Тук Акуд Меє Сув Гец Авр Рпе Аїа Нів Тгр Уаі Ппув Туг І1е Рго с1Уу 210 215 220
І1е біп Авп Уа! Тгр бек сіу Меєсє Азїа ТПпг сіп Уаі гейш с01у бій Авр 225 230 235 240
Тец Агд Іїеип Уаі бі б1у біп сбіп Авр Агуд Меє Іец Агуд сб1у Аїа Авр 245 250 255 60
ІТІе Тер Туг Авп Рго Уаії Аїа Туг Авр Гув Те сіу Уаі Агуд Туг Аг4д
260 265 270 зек Тер Агд Агд Аї1а Уаі бій Агуд Авп ТПг Агуд бБег Агуд Рпе Іе С1У 275 280 285 сбі1у б1п бій пув Гей Аїа Рго бі с1у Агд Авр 290 295 «2105 6 «2115 247 «212» БІЛОК «213» Спіашудотопаз геіпракаЯбії, нуклеїнова кислота-зв'язувальний білок «4005 6
Меє с1у бі біп гей Агд біп біп с1іу ТБг Уаї Гув Тер Рпе АБп Аза 1 в) 10 15
ТПг Ппув с1іу Ропе сіу Робе І1е ТПг Рго сіу б1у с1у с1у бій Авр Іей 20 25 30
Рпе Уаї Нів біп ТПг АвБп о І1е АвБп бек біц б1у Рпе Агуд Бек Гей Аг4д
Зо бі б1у бій Уаі Уаі бій Рпе сій Уаі бій Аза с1іу Рго АвБр с1у Аг4д бо 35 зек пув Аїа Маії АБп Уаії ТПг с1у Рго сіу сб1у Аза Аза Рго сбіц 01Уу 65 70 75 80
Аза Рго Агд АвБп Робе Агуд бі1у біу б1у Акд с1у Акуд с1у Агд Аїа Агд 40 85 90 95 сб1у А1ї1а Акуд сіу с1у Туг Аза Аза Аза Тук сіу Тук Рго біп Меє А1за 100 105 110 45
Ркго Маї Тук Ркго біу Тук Тук Роре Рпе Рго Аза Авр Рго ТПг с1у Агд 115 120 125 50 б1у Акуд сб1у Акуд с1у б1у Акуд с1у с1у Аїа Меє Рго Аїа Меє сіп с01Уу 130 135 140 55 Уаї Мес Рго сіу Уаі Аза Тук Рго сіу Меє Рго Месє сіу с1у Уа1 с1У 145 150 155 160
Меє сій Рго ТПг сіу сій Рго Бек сіу Гей біп Уаії Уаї Уаї Нів Авп 60 165 170 175
Тецп Ркго Тер бек Сув біп Тер сбіп сбіп Гей Ппув Авр о Нів РібПе Гув б1іци 180 185 190
ТЕр Агуд Уа1 сій Агуд Аїа Авр Уа1 Уаї Туг Авр Аїа Тгр б1у Агд 5ег 195 200 205
Агуд сб1у Рпе біу ТПг Маі Агуд Робе ТПг ТБбг Гув бій Авр Аїа Аїа ТЕПг 210 215 220
А1їа Сув Авр ГПув Тец АвБп АвБп бег біп І1е АвБр с1у Агу ТПг І1е 5ег 225 230 235 240
Уаї Агд гей Авр Агд Ріе Аїа 245 «2105 7 «2115 226 «212» БІЛОК «2135 Сп1ашудотопазв іпсекса, ймовірний нуклеїнова кислота-зв'язувальний білок, частковий «4005 7
Зо Меє с1у біц сбіп Гей Агуд біп біп сб1у ТПк Уаї Гуз Тгр Рре Ап А1а 1 5 10 15
ТПг Ппув с1у Рпе сіу Робе І1е ТПг Рго сіу сіу бі1у б1у 61 Авр Гей
З5 20 25 30
Рпе Уаї Нів біп ТБПг АвБп о І1е АвБп бек біц б1у Рпе Агуд бБег Іецй Агд 40 бі б1у бі Аза Уаі бій Рпе сій Уаі бій Аза с1у Рго Авр сб1у Агд бо 45 зек Мпув Аїа Уаі Авп Уаі ТПпг сі1у Рго Аї1а сб1у Аїа Аза Рго сбіц с01Уу 65 70 75 80 50 А1а Рго Акуд АБп Рпе Агуд сіу сіу с1у Акуд б1у Агд б1у Агд Аза Агд 85 90 95 сб1у А1ї1а Аку сіу с1у Туг Аїа Аза Аза Тук сіу Тук Рго біп Меє Аїа 55 100 105 110
Ркго Маї Тук Ркго біу Тук Тук Роре Робе Рго Аїа Авр Рго ТПг с1у Агд 115 120 125 60 б1у Акуд с1у Агуд сб1іу сб1у Акуд біу бі1у Аїа Меє Рго сі1у Меє сбіп щу 130 135 140
Уа1ї Мес Рго сіу Уаі Аза Тукг Рго сбіу Меє Рго Меє с1у с1у Уаі Щ1У 145 150 155 160
Меє сі АТа ТПг с1іу Авр Рго бек біу Гей біп Уаії Уаї Уа1і Нів Авп 165 170 175
Тецп Ркго Тер бек Сув біп Тер сбіп сбіп Гей Ппув Авр Нів РіПе Гпув б1іци 180 185 190
ТЕр Агуд Уа1 бій Агуд Аїа Авр Уаії Уа1ї Туг Авр Аїа Тгр б1у Агд 5ег 195 200 205
Акуд с1у Робе сіу ТПг Уаі Агуд Рбе ТПг ТПпг ув бій Авр Аїа Аїа Меє 210 215 220
А1т1а Сув 225 «2105 8
Зо «2115 242 «212» БІЛОК «2135 Мо1уох сакврекі її. падагієпзвів, нуклеїнова кислота-зв'язувальний білок «4005 8
Меє с1у бі біп Гей Агуд біп Агуд с1іу ТБг Уаї Гув Тер Рпе АБп Аза 1 5 10 15
ТПг пув с1іу Рпе сіу Робе І1е ТПг Рго біц сіу б1у б1у б1й Авр РБіГе 20 25 30
Рпе Уаії Нів біп ТПг Авп о І1е Авп бек Авр б1іу Рре Агуд бек Іеч Агд 35 40 45 бі б1у бі Аза Уаі бій Рпе сій Уаі бій Аза с1у Рго Авр сб1у Агд 50 з9 бо зек Мпув Аїа Уаі бек УМаії бек біу Рго бі1у б1у Бек Аїа Рго бій щу 65 70 75 80
Аза Рго Агд АБп Робе Агуд б1і1у біу б1у Акд б1у Агуд с1у Агд Аїа Аг4д 85 90 95 60 сб1у Аї1а Акуд с1іу Аза Туг Аза Аза Тук с1у Тук Рго біп Меєсє Рго Рго
100 105 110
Меє Тук Рго с1і1у Тук Тук Рібе Рпе Рго Аза Авр Рго ТПг б1у Акд щ1У 115 120 125
Акуд с1у Агуд б1іу Агуд біу бі1у Меєсє Рго І1е бі1іп с1у Меє І1е сбіп Щ1У 130 135 140
Ме Рго Тук Рго сіу Іїе Рго Іїе Рго сіу сіу Гец біц Рго ТПг щу 145 150 155 160 біц Рко бек сіу Гей біп Уаі1 Уаї Уа1і Нів Авп Гец Рго Тгр бек Сув 165 170 175 сбіп Тер біп біп Гей Пув Авр о Нів Рбе Ппуз бій Тер Акд Уаї бій Агд 180 185 190
Аза Авр Уаї Уаї Туг Авр А1ї1а Тгр б1у Акд бек Агуд с1у Рпе с1у ТЕГ 195 200 205
Ууаї Акуд Рпе Аїа ТПг пув біц Авр Азїа Аїа біп Аїа Сув бій Ппув Меє 210 215 220
Зо
Авп о Авп обект біп І1е Авр б1у Агд ТБПг І1е бек Уаі Агд Гей Авр Аг4д 225 230 235 240
З5
Рпе сіци 40 «2105 19 «2115 178 «212» БІЛОК «213» Рпувсотісге1і1а рабепе, прогнозований білок, частковий 45 «4005 9
Аа пув сіц ТБ б1у Гпув Маї Ппув Ткгр Рпе Авп бек бек Ппув с1у Ріе 1 5 10 15 50 б1у Рпе І1ї1е ТПг Рго Авр пув сіу с1у бій Авр Гей Ріе Уаї Нів сіп 20 25 30 55 ТПг Бек Іїе Нів Аїа сіц с1іу Рпбе Агуд бек Гей Агуд біц с1іу бій Уаї
Ууаї бі Рпе сіп Уа1 сій бек Бек бій Авр б1іу Агд ТПг Гув Аза Гей 60 50 з9 бо
А1їа Уа1 ТБПг б1і1у Рко б1у б1у Аїа Робе Уаі біп с1у Аза бек Туг Агд 65 70 75 80
Ак Авр с1іу Тук біу б1у Рго б1у Акд Сб1у Аї1а сС1у сі 01у сш1у щу 85 90 95
Агуд сб1іу Тпг Уа1! с1у б1у Аїа сб1у Акуд с1у Агд с1у Акуд біу с1у Агд 100 105 110 сі1у Маї с1у с1у Рпе Уаі с1у бій Агуд Бек сіу Аїа Аза сіу с1у бій 115 120 125
Акуд Тк Сув Туг Авп Сув б1у біц с1у с1у Нів І1їе Аїа Агд бій Сув 130 135 140 біп АвБп бій бек ТП б1у АБп Аза Агуд сбіп сіу сіу сіу сі1у с1у 1У 145 150 155 160 б1у Авп Агуд бек Сув Туг ТПг Сув с1іу біц Аїа с1у Ні Іейп Аїа Аг4д 165 170 175
Зо Авр Сув «2105 10
З5 «211» 444 «212» БІЛОК «2135 йеа шаув, невідомий білок «4005 10
Ме Аза Аза Аїа Аза Агд сбіп Агуд с1іу ТБг Уаї пуб Тер Рпе Авп Авр 1 5 10 15
ТП Ппув с1у Рпе сіу Рпе Іїе бек Рго бій Авр біу Бек бій Авр Гей 20 25 30
Рпе Уаї Нів біп бек бек І1ї1е Гув бек бій сіу Ропе Агуд бек Іецй А1а 35 40 45 сі б1у бій бій Уа1і бій Рбе бек Уаі Бек біц с1у Авр Авр с1у Агд 50 55 бо
ТПг пув Аза Уаї Авр Уаі! ТП сіу Рго Авр сіу Бек бБег Аїа бБег 01Уу 65 70 75 80 60 зек Агд Гец ІТец Ні Авр сб1у Аїа Тгр Агуд Рго Рпе Сув Іїе Рпе ТЕГ
85 90 95 ек ТПг Агд біп Рго бій біп Нів Агуд сіу бек сіу бБег Авр Агд Нів 100 105 110
Авр с1у с1у Авр Туг АвБп о Нів Рго Гув Рго біп Аїа І1е Аза Аїа 0Щ1У 115 120 125
А1їа Нів бек Гец Іец Іїецй ТПг Агуд Аїа Суб Гей бек Бек Ппув бек Рго 130 135 140
Ркго Рго бек Іец Аїа Уаї с1у Іец Іец бек Уаі Гей Аза сбіп Агд ТЕГ 145 150 155 160 с1у Рго ТПЕ Рго с1у ТПг ТПг сб1і1у бек А1ї1а Аза бек Гей бек с1у 5ег 165 170 175 зек Рго І1е бек ІГец б1у Рпе Авп о Рго ТПг бек Рпе Гей Рго РПе ГІецй 180 185 190 біп Тпг Аза Агуд Тер Гей Рго Сув Бек Авр Гей Аза ТПг бБекг бек бег 195 200 205
Зо зек Аза Рго бек бек Рго Рго Агд бек ІТецй Аза Рго бБег Аїа Рго Рго 210 215 220
З5
Тпув Ггув Аза Те Іїе сіу Аза бек ТПг сіу бек ТПг сСіу І1е Аїа ТЕПг 225 230 235 240
Ззек бек бі1у Аї1а сб1у Аїа Аїа Меє бек Акуд бек АБп Тгр Гей бег Агд 245 250 255
Тер Уа1 бек бек Сув бБег Авр Авр Аїа пуб ТПг Азїа Рпе Аза Аїа Уаї 260 265 270
ТПг Уа1 Ркго Гей Гец Туг біу бек бек Ггец Аїа біцп Рго Гпув Бек Ше 275 280 285
Ркго Бек Ппув бек Меє Тук Рго ТПг Рре Авр Уаі с1у Авр Агуд Іїе ГІец 290 295 300
Аа сій пув Уаї бек Тук І1їе Рбе Агд АБр Рго сій Іїе бБег Авр Іе 305 310 315 320 (516) Уаї І1ї1е Рбе Агуд Аза Рго Рго сіу гейш сіп Уаі Тук с1у Тук бек 5ег 325 330 335 б1у Авр Уаії Рпе Іїе пув Акуд Уаі Уаі Аїа пув сіу с1у Авр Тук Уаї 340 345 350 бі Маії Агкуд Авр с1у Ппув Гей Рпе Уаі Авп сіу Уа1 Уаї сбіп АБр б1іц 355 3З6о 365
Авр Рпе Уаії Гец біц Ркго Нів Авп Тук бій Меє сій Рго Уа1і Іец Уаї 370 375 380
Рго сіц сіу Тук Маії Рпе Уаії Гей с1у Авр АБп Агуд Ап Авп бек Ріре 385 390 395 400
Авр Бек Нів АвБп о Тгр б1у Рго Гец Рго Уаі Агуд АБп І1е Уаі1і с1у Агд 405 410 415 зек Іїе Ггец Агд Туг Тер Рго Ркго бек Гув І1е АБп Авр ТПг І1е Туг 420 425 430 бі Рко Авр Уаі Бек Агд Гей ТПг о Уа1і Рго Бек 5ег 435 440
Зо «2105 11 «2115 197 «212» БІЛОК «213» Огула вагіуа, група бСаропіса
З5 «4005 11
Меє Азїа бек бій Акуд Уа1і пув с1і1у ТПкг Уаї пув Тгр Рпбе АвБр Аїа ТПг 1 5 10 15 40
Тпув б1у Рпе сіу Рпе Іїе ТПг Рго Авр Авр сіу с1іу біц Авр Іецй РБе 20 25 30 45
Уаї Нів сбіп Бек бек Гей пуб Бек Авр сіу Туг Агд бек Те Авп Авр с1у Авр Уаії Уаї сій Рібе бек Уа1і сіу бек б1у Авп Авр б1у Агд Тіг 50 55 бо пув Азї1а Уаї Авр Уаі ТПг Аїа Рго сіу сіу с1у Аїа Гей ТПг с1у 01У 65 70 75 80 зек Агуд Рго бек біу б1у б1у Авр Агд сб1у Ту с1у с1у сШ1у сш1у щу 85 90 95 60 сбі1у б1у Агкуд Ту с1у б1у Авр Агуд сіу Тук сіу сіу сіу сі1у с1у 1У 100 105 110
Тук б1у с1у с1у Авр Агуд сіу Тук сіу с1іу сбіу сб1у с1у Тук с1у 01У 115 120 125 сі1у б1у сб1у сіу сіу Бек Агуд Аїа Сув Туг Ппув Сув сСіу біц біц с1Уу 130 135 140
Нів Меє Аза Агуд Авр Сув бек сбіп сіу сбіу сбіу б1у б1у б1у С1у Туг 145 150 155 160 сі1у б1у с1у с1у с1у с1у Туг Акуд сі1іу с1у сіу сі1у сіу сі1у с1у 1У 165 170 175 сі1у б1у Сув Тук Авп Сув сіу бій ТПг сіу Нів І1е Аїа Агд бій Сув 180 185 190
Рго Бек Пув ТПг Туг 195 «2105 12
Зо «211» 139 «212» БІЛОК «2135 Спіогеі1і1а уагіарі1їїв «4005 12
З5
Меє Аза Аза Аза пув Аза ТПг сіу ТПг Уаї Ппув Тгр б1у Тук с1Уу РПе 1 5 10 15
І1їе ТПг Ркго Авр бек сіу с1іу бій Авр Тей Рпе Уаії Нів сіп Тібг А1а 20 25 30
І1е Уаї бек біц б1у Рпе Агуд бек Іец Агкд бій с1у бі Рго Уа1 сіц 35 40 45
Рпе Ріпе Уаї біцш ТПг бек Авр Авр б1у Агкд сбіп пув Аїа Уа1 Авп Уаї бо 50
ТП б1у Рго Авп сіу Аїа Аза Рго сіц сбі1у Аїа Рго Агд Агд сбіп РБе 65 70 75 80 55
Авр Авр с1іу Туг б1у Аї1а сб1у сіу сіу б1у б1у бек Тукє бШ1у шу щу 85 90 95 (516) Рпе сіу сі1у сбі1у сб1у сіу с1у б1у Аг9д Акуд сбіу сб1у с1у Акд с1іу 01Уу 100 105 110 сі1у б1у Тук с1у с1у с1у сі1у Тук с1у с1у с1у Туг Авр сбіп с1у 01У 115 120 125
Тук сб1у с1у біп Рго Рго І1е Аїа Сув Авп Меє 130 135 «2105 13 «2115» 182 «212» БІЛОК «213» Бе1адіпеі1і1а тоеі1епдогсїїіїії, гіпотетичний білок «4005 13
Мен АзТа бек Рго Аза Авр Аза пув Акуд ТПг біу Гуз УМаї Гув Тер РПе 1 5 10 15
Ап оУа1! ТБг пув б1у Рпе б1у Робе І1е ТПг Рго Авр Авр с1у Бек сіц 20 25 30 біц Гей Рпе Уаі Нів сбіп бек Аза І1ї1е Рпе Аїа сій сіу Рібе Агд 5ег
Зо Тем Акуд сбіц сб1у сій Іїе Маї бій Ррбе бек Уаі сій біп с1у бій Авр бо біп Акуд Меє Агуд Аза Аїа Ар Уаі ТПг с1іу Рго Авр сіу бек Нів Уаї 35 65 70 75 80 біп б1у Азїа Рго Бек Бек Рпе сіу бБег Агуд сіу сіу сіу сіу с1у 1У 85 90 95 40 сб1у Акд с1у с1у Агуд б1у Агкуд Аїа сіу сіу с1у Авр Авп Рго І1е Уаї 100 105 110 45
Сув Тук Авп Сув Авп біц Аїа сіу Нів Уа1і Бек Агуд Авр Сув пув Туг 115 120 125 50 сіп б1іп бі с1у с1у с1у сбіу с1у сіу сб1у с1у с1у с1у б1у Ада Щ1У 130 135 140
Ркго Рго бек бі1іу Агд Акуд сі1іу сбіу б1у Аї1а с1у с1у сіу Бек 0Ш1у щу 55 145 150 155 160 сбі1у б1у Акуд сіу Сув Рпе ТПг Сув с1у Аїа сбіп сіу Нів І1е 5ег Агд 165 170 175 60
Авр Сув Рго Бек Авп Туг «2105 14 «211» 208 «212» БІЛОК «2135 УіБгі15 уіпіїєка, білок 3 з доменом холодового шоку «4005 14
Меє Аза сбіп бій Акуд бег ТБг сбіу Уаі1 Уа1ї Агд Тгр Роре б5ег АБр сіп 1 5 10 15 пув б1у Рпе сіу Рпе Іїе ТПг Рго АБп бі сіу с1у бій Авр Гей РБІе 20 Уа1ї Нів сбіп бек бек І1їе Ппув бек Авр сіу Рпе Акд бек Гей с1у с1ци сбі1у бій ТпПг Уаі бі Рпе сіп Іїе Уаі гейш с1у бій Авр б1у Агд ТПг 25 50 55 бо пу Азї1а Уаї Авр Уаі ТПг сіу Рго Авр сіу Бек бек Уаї біп сіу б5ег 65 70 75 80
Зо ув Агуд Авр АБп Ту сіу сіу с1у сіу с1у сі1у сі1у І1е А1а бек с1ци 85 90 95
З5 сій Іїе Мес Аза Аїа Аза Аїа Аїа Уаї Уаі Уаі сій біц Азїа с1ц Аї1а 100 105 110 40 сі Маї Уаї Іїе Рго Аїа Уаії Аїа Уаії Аїа Уаї Уаї І1е ТПг Уа1ї Уаї1ї 115 120 125
І1е Меє сіу ТБПг Тгр Іїешп с1у І1е Аза Іїецй Тгр Гув Аза Аза Аїа Гей 45 130 135 140
Уаї сі1у Бек Уаі Уаі1 Аїа сіц Уаії біцш Азї1а Уаії сі с1у Гей Уа1 Аї1а 145 150 155 160
Ууаї Аїа Уаі Авр Аза ТПг ТПг Уаі Авр Агуд пуб біу І1е Іецп Іеп сіци 165 170 175
Ап Аза Гей ТПг Іец ТПг Нів Агуд Авр бі с1і1у пув Агуд біу Уаї І1е 180 185 190 (516) Уаї Тук І1їе Гей Рбе Рібе Рго Аза бек бек Ппув І1їе Рібе РоПе Рго Уаї 195 200 205
«2105 15 «2115» 231 «2125 БІЛОК «2135 Тгібісцют аєвсіуцю, білок 3 з доменом холодового шоку «4005 15
Меє с1у біц Агуд Уаї їув сб1у ТБПг Уаї Ппув Тер Рпбе Авп Уаї ТПкг Гув 1 5 10 15 сб1у Рпе сі1у Рпе Іїе Бек Рго Авр Авр біу біу б1іцп Авр Гей РпПе Уаї
Нів біп бек Аїа І1ї1е пуб Бек Авр сіу Тут Агд бек Тецй АБп бій Авп 20
Авр Аза Уаї сіц Рбе б1цп І1ї1е І1е ТПг с1у Авр Авр б1у Агд ТПг Гу бо 25
Аза Бек Авр Уа! ТПг Аза Рго сіу сбіу б1у А1ї1а Гей бек с1і1у сіу бБег 65 70 75 80
Зо Агуд Рго с1у біц б1у с1у с01у Авр Агкуд сб1і1у б1у Агд с1у с1у Тук 01Уу 85 90 95 сі1у б1у с1у сі1у с1у Тук сіу с1у сі1у с1у сі1у с1у Тук сіу с1у 1У
З5 100 105 110 сі1у б1у с1у Тук с1у с1у сіу сі1у с1у с1у Тук сіу сіу с1у с1у Туг 115 120 125 40 сі1у б1у сі1у сі1у с1у сб1і1у с1у Акуд с1у Сув Тук Ппув Сув б1у б1іц Авр 130 135 140 45 бі1у Нів І1їе бек Агуд Авр Сув Рго сіп сіу сіу сіу сіу сі1у с1у 1У 145 150 155 160 50 Тук сб1у сі1у с1у сіу Тук сбіу б1у сіу сі1у сб1і1у б1у б1у Агд січ Сув 165 170 175
Тук Ппув Сув с1у біц біц сб1у Ні І1е б5ег Агуд Авр Сув Рго біп Щ1У 55 180 185 190 сі1у б1у с1у с1у с1у Тук сі1у с1у сі1у с1у с1у Акуд сіу сіу с1у 1У 195 200 205 60 сі1у б1у сб1у с1у Сув РПпе бек Сув сіу бій бек сіу Нів Рібе 5ег Агд 210 215 220 січ Сув Рго АвБп Гув Аїа Нів 225 230 «2105 16 «211» 135 «212» БІЛОК «2135 Скурбоврогідіцют рагуцют Іома ІІ, РНК-зв'язувальний домен холодового шоку з ОВ-складчастою структурою, частковий «4005 16 біц Гпув Рго Іїе Ппув Геш Уа1 Ппув Меє Рго Гей бек біу Уаї Сув Гув 1 5 10 15
ТЕр Рпе Авр бек ТПг пуб б1у Рпе сіу Роре І1е ТПг Рго АвБр Ар 1У 20 25 30 зек бій Авр І1їе Рпе Уаії Нів сіп сіп Авп І1е Ппув Уаі сій с1у РПе
Акуд бБег Ггец Аїа біп АвБр бій Агкд Уаі сб1іп Тукє бій І1е бій ТБбг Авр
Зо 50 55 бо
Авр пув с1у Агд Агуд їув Азїа Уаії Авп Уаії бек с1у Рго АвБп с1у Аїа 65 70 75 80
З5
Ркго Уаії Ппув б1у Авр Агуд Агуд Агуд б1у Агкд б1у Агуд с1у Агд с1у Агд 85 90 95 40 сбі1у Меє Акуд с1у Агуд б1у Акуд с1іу с1у Агуд сб1у Акуд с1іу Робе Тукг біп 100 105 110 45 Авп обіп Азп обіп бек біп Рго біп бек біп біп сбіп Рго Уаії бек ТПг 115 120 125 сіп бек біп Рго Уаї Аїа Нів 130 135 «2105 17 «211» 301 «2125 БІЛОК «213» Агарідорвів Епаіїіїапа, білок 3 домену холодового шоку «4005 17 (516) Месє Аїа Меє сій Авр біп бек Аїа Аза Агуд бек І1їіе с1у Ппув Уаї 5ег 1 5 10 15
ТЕр Рпе бек Авр біу пуб бі1іу Тук біу Роре І1е ТПг Рго АвБр Ар 1У 20 25 30 сбі1у бій бій Гей Рпе Уа1 Нів Ссіп бек Бек Іїе Уа1! бек Авр сб1у РБПе 35 40 45
Акуд Бек Гей ТПг Іец б1у бій бек Уаі сбіц Тук б1п І1е Аїа Гец с1У 50 55 бо
Бек Авр с1іу Пув ТПг пув Аїа чІ1їе сій Уаі! ТПг Аза Рго сіу с1і1у 01уУу 65 70 75 80 зек Гец Авп о Гув Гув бій АвБп бек бек Агуд сіу Бек біу б1у Авп Сув 85 90 95
Рпе Авп Сув біу біц Маї сі1у Нів Меєсє Аїа Гуз Авр Сув АБвр 01у Щ1У 100 105 110 зек сіу біу Ппув бек Рпе бі1іу сбіу сбіу б1у б1у Агд Акд бек сб1і1у 01У 115 120 125
Зо сі б1у бій Сув Тук Меє Сув с1у Авр Уаі1і сіу Нів Рібе Аїа Агд Авр 130 135 140
Сув Агкгуд біп бек сіу біу б1у АвБп бек сіу сбіу сб1у с1у с1у с1у 01У 145 150 155 160
Акуд Ркго Сув Тук бек Сув бі1у біц Уаї с1у Ні Іейп Аїа Гпув Авр Сув 165 170 175
Акуд с1і1у с1і1у бек біу б1у АБп Агуд Тує с1у б1і1у с1ї1у с1у с1у Акд с1У 180 185 190 зек сіу б1і1у Авр бі1у Сув Тук Меє Сув бі1у с1у Уа1і с1у Нів Робе Аї1а 195 200 205
Ак Авр о Сув Агуд біп Авп обіу б1у с1у Авп Уаі сіу сіу сіу сіу б5ег 210 215 220
ТПЕ Сув Тук ТПг Сув сі1у сіу Маї сіу Нів Іїе Аїа Ппуз Уаї Сув ТПг 225 230 235 240 зек Мпув І1е Рго бек бі1у сі1у сіу б1у б1у б1у Агуд Аїа Сув Тук с1іц 60 245 250 255
Сув б1у сб1у ТП с1у Нів Ггец Аза Агуд Авр Сув Авр Агуд Агд біу бег 260 265 270 бі1у бек бек сіу сіу сбіу сіу с1іу Бек Авп Пув Сув Ропе І1е Сув 01У
275 280 285 пув біц б1у Нів Рпе Аїа Агу бій Сув ТіПг бек Уаї Аїа 290 295 30о
«2105 18 «2115 13
«2125 ДНК
«213» Спіашудоштопав геіпракабії, консенсусна послідовність ІНСВМІ
«4005 18 дсЕдддасас сдс 13
«2105 19
«2115 13 «2125 ДНК
«213» Спіашудоштопав геіпракабії, консенсусна послідовність ІНСВМ2
«4005 19 дсдасасссс сдс 13
«2105 ч20
«2115 13
«2125 ДНК «213» Спіашудоштопав геіпракабії, консенсусна послідовність ІНСВМЗ
«4005 20 чдсЕддассас се 13
«2105 21
«2115 13
«2125 ДНК
«213» Спіашудоштопав геіпракавії, консенсусна послідовність ІНСВМ4
«4005 21 дссеЕдасссс сда 13 «2105 22
«2115 13
«2125 ДНК
«213» Спіашудоштопав геіпракЯбії, консенсусна послідовність ІНСВМ5 «4005 22 дсаєсасссс сда 13
«2105 23 60 «2115 13
«2125 ДНК
«213» Спіашудоштопав геіпракабії, консенсусна послідовність ІНСВМб «4005 23 дссадасссс сда 13 «2105 24 «2115 13 «212» ДНК «213» Спіашудоштопав геіпракавії, консенсусна послідовність ІНСВМ8 «4005 24 дсдасасссс сдс 13 «2105 225 «2115 13 «212» ДНК «213» Спіашудоштопав геіпракабії, консенсусна послідовність ІНСВМ9 «4005 25
Ессаєассас се 13 «2105 026 «2115 13 «212» ДНК «213» Спіашудоштопав геіпПпакасії, С5ОрОБ5
Коо) «220» «221» інша ознака «222» (5)..(5) «223» п являє собою а, с, ч або Є «4005 26 дссапассас сдс 13 «2105 27 «2115 13 «212» ДНК «213» Спіашудоштопаз геіпракасії; ІВБЕ (світлочутливий елемент) «4005 27 дссадасссс сдс 13

Claims (5)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Генетично модифікована рослина, в якій нативний ген хлорофіл а-оксидази має пригнічену експресію та яка здатна модулювати склад своїх фотосинтетичних антенних комплексів у відповідь на збільшення або зменшення інтенсивності світла шляхом модуляції співвідношення хлорофілу а та хлорофілу Б (СП а/б), завдяки чому має місце збільшення співвідношення СП а/ь у складі антенних комплексів у верхньому ярусі (висока інтенсивність світла), порівняно зі співвідношенням СТІ а/б у складі антенних комплексів у верхньому ярусі рослин дикого типу, які вирощують за тих самих умов, та зменшення співвідношення СП а/б у нижньому ярусі (низька інтенсивність світла) генетично модифікованої рослини, порівняно зі співвідношенням СТІ а/б у верхньому ярусі генетично модифікованої рослини, де генетично модифікована рослина містить ДНК-конструкцію, що містить гетерологічну послідовність контролю експресії, функціонально 60 пов'язану з полінуклеотидною послідовністю, що кодує хлорофіл а-оксидазу, та де послідовність контролю експресії взаємодіє з редоксо-залежним модулятором, що реагує на зміни інтенсивності навколишнього світла, де редокс-залежний модулятор вибраний з МАВІ, осрІ2 та СІ 0-1.
2. Генетично модифікована рослина за п. 1, де нативний ген хлорофіл а-оксидази інактивований із застосуванням процедури, вибраної з геномного редагування, опосередкованого СКІЗРЕК/Са5 9, інактивації генів, опосередкованої ТАГЕМ, хімічного мутагенезу, сполученого з ТІ ІМ, інсерційного мутагенезу, сполученого з ПЛР;-скринінгом щодо виявлення подій вставки в нативному гені хлорофіл а-оксидази, інактивації гена шляхом РНК- інтерференції (РНКІ).
3. Генетично модифікована рослина за п. 1, де гетерологічна послідовність контролю експресії містить мотив консенсусної послідовності домену холодового шоку (50005), функціонально пов'язаний з полінуклеотидною послідовністю, що кодує САО.
4. Генетично модифікована рослина за п. 3, де мотив послідовності домену холодового шоку функціонально пов'язаний з промотором.
5. Генетично модифікована рослина за п. 4, де промотор вибраний з групи, яка складається з промотору рзаб, актину, убіквітину, В-тубуліну, РЕ-1а та 355.
б. Генетично модифікована рослина за п. 1, де ДНК-конструкція містить зворотно комплементарну послідовність щодо полінуклеотидної послідовності, що кодує хлорофіл а- оксидазу, та при цьому послідовність контролю експресії являє собою тканиноспецифічний промотор, який реагує на зміни інтенсивності навколишнього світла.
7. Генетично модифікована рослина за п. 6, де тканиноспецифічний промотор являє собою САВІ або МКЬсз5.
8. Генетично модифікована рослина за п. 1, яка вибрана з групи, яка складається з проса, кукурудзи (маїсу), сорго, ячменю, вівса, рису, жита, тефу, тритикале, пшениці, дикого рису, амаранту, різновидів квасолі, різновидів сочевиці, бобу звичайного, люпину, різновидів арахісу, різновидів нуту, різновидів голубиного гороху, різновидів сої, різновидів гірчиці, ріпаку (каноли), сафлору, соняшнику, льону, ятрофи, конопель, Агабрійорзіх, Сате/Іпа, маку, дерев (тополі, верби, евкаліпта, південного бука, платана, ясена), Мізсапійив, світчграсу, очерету, канаркової трави, очерету гігантського, різновидів буряку, цукрового сорго, цукрової тростини, різновидів картоплі, різновидів солодкої картоплі, касави, різновидів маслини.
9. Генетично модифікована рослина за п. 8, яка являє собою Сате/іпа.
10. Спосіб одержання генетично модифікованої рослини, де нативний ген хлорофіл а-оксидази має пригнічену експресію у генетично модифікованій рослині, та генетично модифікована рослина здатна модулювати співвідношення СП а/б у своєму антенному комплексі у відповідь на навколишнє сонячне світло, який включає стадії: а) трансформація рослини, де нативний ген хлорофіл а-оксидази має пригнічену експресію, за допомогою гетерологічної полінуклеотидної послідовності, що містить послідовність контролю експресії, функціонально пов'язану з полінуклеотидною послідовністю, що кодує хлорофіл а- оксидазу, де послідовність контролю експресії взаємодіє з редоксо-залежним модулятором, що реагує на зміни інтенсивності навколишнього світла, де редоко-залежний модулятор вибраний з МАВІ, 5С02 та 01 0-1; та р) відбір генетично модифікованої рослини, здатної модулювати розмір антен у відповідь на зміни інтенсивності світла, завдяки чому має місце збільшення співвідношення СТІ а/р у складі антенних комплексів у верхньому ярусі (висока інтенсивність світла), порівняно зі співвідношенням СТІ а/б у складі антенних комплексів у верхньому ярусі рослин дикого типу, які вирощують за тих самих умов, та зменшення співвідношення СП а/б у нижньому ярусі (низька інтенсивність світла) генетично модифікованої рослини, порівняно зі співвідношенням СТІ а/б у верхньому ярусі генетично модифікованої рослини.
11. Спосіб за п. 10, де гетерологічна полінуклеотидна послідовність містить послідовність, що націлюється на певну тканину.
12. Спосіб одержання генетично модифікованої рослини зі здатністю до модулювання співвідношення СТІ а/б у своєму антенному комплексі у відповідь на навколишнє сонячне світло, який включає стадії: а) одержання генетично модифікованої рослини, де ендогенний ген хлорофіл а-оксидази в генетично модифікованій рослині має пригнічену експресію; Б) трансформація генетично модифікованої рослини за допомогою гетерологічної полінуклеотидної послідовності, що кодує модифіковану хлорофіл а-оксидазу, де експресія модифікованої хлорофіл а-оксидази контролюється змінами інтенсивності навколишнього світла, де послідовність контролю експресії взаємодіє з редокс-залежним модулятором, що реагує на зміни інтенсивності навколишнього світла, де редоко-залежний модулятор вибраний з 60 МАВІ, 5С02 та 01 0-1; та с) відбір генетично модифікованої рослини, здатної модулювати розмір антен у відповідь на зміни інтенсивності світла, завдяки чому має місце збільшення співвідношення СТІ а/р у складі антенних комплексів у верхньому ярусі (висока інтенсивність світла), порівняно зі співвідношенням СТІ а/б у складі антенних комплексів у верхньому ярусі рослин дикого типу, які вирощують за тих самих умов, та зменшення співвідношення СП а/б у нижньому ярусі (низька інтенсивність світла) генетично модифікованої рослини, порівняно зі співвідношенням СТІ а/б у верхньому ярусі генетично модифікованої рослини.
13. Спосіб за п. 12, де гетерологічна полінуклеотидна послідовність містить промотор, функціонально пов'язаний з консенсусною послідовністю домену холодового шоку.
14. Спосіб за п. 13, де послідовність домену холодового шоку вибрана з групи, яка складається з ЗЕО ІЮ МО: 18-26.
15. Спосіб за п. 12, де гетерологічний полінуклеотид містить промотор, функціонально пов'язаний з модифікованою хлорофіл а-оксидазою, вибраний з промотора рзхар, актину, убіквітину, б-тубуліну, 355 та РК1-а. Свіспю у : ЩО й Вей ко Вхій ко ох ю ЙО Свіюкни Цих У Со ї реакції альна | 2 Ї ! ; й |, і з є і . : у й / фаза С фіксація вуглецю (05) СНО бу корі о ЗВО 600 лі Вибулісня нео ве (аг ЗОН ння В ; 7 БА ЗАпре- | Пика ши | Калюзмеа б(Р) (З г (У (8) ЗАТВ : ще ох ; у 13-Дифосфегліетає - ВІМАВЕНІ б МАЕ" храза 3: М Ко) | 5 (В регежерація дав 0:08; ! акцепттора СО, Т з кверальнеєід-л фосфат базах; (Ки МІВ) відновлення в: Гвукоза тя іно органічні спонухи Бехій
Фіг.
; . Швидкість захоплення А « Швавнакесть захохпзення свили свіхля дорівнює її переввху є певвдюють швнакості перенесення Градієне ря, У 0 перенесення електронів спектронів розміру антени СТЯГ «ох Наллвжок | ве їх З ОВ БК | ян захопленої енероїї ? . З й Ж. и ж втрачається яж зепло цен З тр т-- та флуовреспеннія шини В АН АННА АР А В с ее -- у щ у о--- . ОО ще . ке сх ке їз не їх і у ен но чо їх я сен І . 2 о Я пай іван ініжллннн о : : М Ан не т т т Х пр ду АНТИ бан Ко іл, ії КУ ще ЕЕ я Оптиматько дих свисюної конкуретиї Сухуиматьна ефективнісю» (затіневі конкуренти) збирання світла в імикучьтрах монохульу рах
Фіг.2 Свіа Ст СН Сн У З ! о СН Н сна сно НН сно ре Б ех Б У Бе 7» з йо: з й СНаз-с і; СНо- З х Ї ІН Сена х р 2 у Ї І Сон х шия ші г ч шигля Кк и М СВ кокснуеназа Кк е М Кк ке Ух х а м А « 2 вн Ме д- НВ рай ВН, Му - НВ ; , й --45 5 5 С - ч ; й х Що ке й й хх НЯ ж й н - М М ї й хь М М Мі ЩЕ И-- сна НУ м ЩО сна чу й з й о сна Е о сно ї і з Н з, 0-сн.- сне ня с0- СНУ - СН Нн-- -ч - о | - в; ОСаеН О-С О- 26и30 | ОСови зо ОСНа ОСНа
Фіг.З
Довга ВС САС Ніч (МОЗ) 1 Еш ст р до АВ Промотор САВІ й Термінатор Мах Есопк9009) рСатріа ТИ МЕСАОКМАЯ. Промотор ГО67 п. в. САМУ З0Ж ХА ; тачка рій Х 7 Сату ЛК початку (стійкість до і реплікант з тігромщинну) ВУЗІ ів Капо точка початку репліювиї вВК323 Фіг4А Праомотев СА ВІ ЕсоВІ М 0 САОК . Прометор СУМУ 35 п-- - Інтран з САС Атаб кір А Сх Коротка ВС САС мой -Ніодін (1239) Жтійкість шк Термжівтор Моз -х КяВ пит у Сату ЗУТВ ІВ й ат рСатріа 1307 МЕСАОКНАЗ Кап У точи початку ренлікації ше ря Точка початку репліквни з рі
Фіг.48
СВ айв «он САС А-СВІ а/б, З , -«--САОІ 7-А(Сп ах шо -а. САС 9-5ІСТ ай 12) Е К-ї 20 й К шия Га їу Х и я В 5 15- Е Е З ю- / Я а-а-- п що 5 леї БО к 0 т ' ' Й в 1000 2000 3000 інтененвність світла, мзікмоль.
Фіг.5 б з ТЯ Нижні є 5 . ІННИ тя Верхні в ) ше МТ 7 4 б Розашування ЄШлювниняа листка. дистків зізразка інврмалізовано де УКХ о,8511Х) Днкнії тини - верхні 1,88 11Х) о САбітниЖв ох) САС? верхні 0,74(04Х)
Фіг.
шен САС ТЗ (СН айебі - -- САС їгісн ал бі БЕ З БОБИ Как тя МТАСНІ айреЗі 2 здоени- 7 х ст МТУ(СМІ а/беЗ) 250БзО1 Ї ше Е зоб - і Хе її дО ТОБ і ча В ТЕНи і я 5.ЛОЕзОЮ Щі ро й Ж Обов 00- з м 400 450 500 550600 650 Девжина хнилі, ни
Фіг.7 7 СА 1 а Вилив свіиля Її с Наилив свила с
Фіг.8А Фіг Вплня світла і хв Вплнвосвітла З хв.
Фіг.8С Фіг.80 ав- р -е-- МИСТ вве) щі р -- САОІВ (СМ айбе13) з и Мне: САОЙ (СН а/б) во и 2-0 ек САОЇВІСМаюев) 4- Х -- СА (Спрайвий о Й а іш 24880 Час, хв.
Фіг.9
Мутіяева, -Єуперкамилекси РААЛНОСЯ . - Мономер ІНОЗ МТ САС ФІіг.10 сення свіча ФІігЛТА САТ Спа -
о ФіІглЛІв ФІГ
І ранул крехувино на зріз м нин ПУ
48 . САО-7-4 4 Т САО-8-1 Й ЗО засо є ВИН З- Коня с ЕК З о : СИ Оля М Ми ше 3 - їв шо ж ОА з З А ПОД й 05 ЗУ и Фіг110 АЕадЖВждЮЮддМжжжажаАаАаАаАаАаАаАж ж жна нн А оєг Л щ ж ж ж жа а а а аю ХХ КОС В КУ ОХ АХ УМ со Фіг12 МОМ КК Є ОВ ЖЕ МО ПКУ В Хе Ж Ме с що с я я о Вс В Ст айбхв Св алеа фіг із
2в- МЕ і с і і В. і в- - об» ва кое
БЕ. СО - а- ; чн : Вага рослини Вагастручка Фіг14А во я - 8) ча "ОЇ 8. 9 Ж Й сне їх ння - иа сх Кількість стручків Вага на стручок
Фіг.146 тод АвенЗ) Кап Ж ІНЕ Точка початку -Хтаї 1196 реплікзнії 2 г АОрТоА о ) Єант Ве з ра -ВБУСІ (2829) и САС-Тетт рВ110-САО-МАВТ сав-пов : Точка ночатку 1302 по. Й ренпліканні ВерЕЇ (3412) Авіві (3834) Празматар Са МАВ Огап (4587 Васі (4876)- Термінзтор Мох щ й я Промотв р У ТОМА ВВ, Озне Терчінатвр Мах
Фіг.15
Касетадля НА САС о с Ше НИ о НН я НЕК о ВО ни Помер сСенсова нина САС Анінсенсювакитка Терупнатр
А
5. па НЕ а в, я се СК я свя клан сп вон Фан спражшнта є : сн вав ві КУунНж У ва вав»
Фіг.16 -г а 2 дао те-оВі ше ж ов ВИШ Ен Вк ра інн. -о-а ск ня я в чив. - г ке С. -- САУН -е чо ж - й
Ж о. сшвах сх т оноіДіх тенвох я шоковнкюя хо тай БЕ М пиши пиши Мишнн Я Зі В о ї 50 1006 1506 20юс т Опроміцення, зкмольфотенів мс" Євігле Жемрява в! --- бор гм но ДЕ на А зи ектя -йй «З - Мт
Жов. ди Ат що й що -- св ні Я Й де жсМ н-е: СВ ян ок: й с ДИ Я о їоо 20ю 300 Час Фіг17 с є ФІГЛВА Фіг 188 Фіг.186 Фіг180 фіг 18Е Фіг Ффіг.186 Фіг вн ут 5 СНІ св Ун ж й 8 Й й : Е б. сення Ффіг.181І Мт С СК св ц- СО сен їв. ! ЕЕ Ю- -о гов- що това п у
Фіг.185.)
Мт і5- СВІ СВ НА й а СКУ Е в 10- Фіг Кк Мт
Б. Кл сві СВ На
4. | СО СВУ 8 я о по.
Фіг.181. ут сті Сеня сн ши уві Ко Тример НС о Фіг 8М
UAA201705754A 2014-11-12 2015-11-12 Трансгенна рослина з модифікованою редокс-залежною модуляцією пігментів фотосинтетичних антенних комплексів та спосіб її одержання UA124449C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462078936P 2014-11-12 2014-11-12
PCT/US2015/060448 WO2016077624A1 (en) 2014-11-12 2015-11-12 Transgenic plants with engineered redox sensitive modulation of photosynthetic antenna complex pigments and methods for making the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA124449C2 true UA124449C2 (uk) 2021-09-22

Family

ID=54705850

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201705754A UA124449C2 (uk) 2014-11-12 2015-11-12 Трансгенна рослина з модифікованою редокс-залежною модуляцією пігментів фотосинтетичних антенних комплексів та спосіб її одержання

Country Status (6)

Country Link
US (3) US10745708B2 (uk)
EP (1) EP3218497A1 (uk)
AU (2) AU2015346281B2 (uk)
CA (1) CA2974716A1 (uk)
UA (1) UA124449C2 (uk)
WO (1) WO2016077624A1 (uk)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3218497A1 (en) * 2014-11-12 2017-09-20 NMC Inc. Transgenic plants with engineered redox sensitive modulation of photosynthetic antenna complex pigments and methods for making the same
CN109628439B (zh) * 2018-12-11 2022-02-08 沈阳农业大学 一种促进番茄叶绿素合成及光合效率的基因及应用
BR112023001853A2 (pt) * 2020-07-31 2023-02-23 Inari Agriculture Tech Inc Célula de planta de milho transgênico, semente de planta de milho transgênico, planta de milho transgênico, método para obter uma população a granel de sementes, método para obter uma semente de milho híbrido, molécula de dna, produto de planta de milho transgênico processado, amostra biológica, molécula de ácido nucleico adaptada para detecção de dna genômico, método para detectar uma célula de planta de milho compreendendo o lócus transgênico, método para excisar um lócus transgênico, métodos para modificar e produzir uma célula de planta de milho transgênico e calo de planta de milho transgênico
CN112251417A (zh) * 2020-10-21 2021-01-22 扬州大学 拟南芥叶绿素b合成基因CAO在番茄中的应用
CN115777376B (zh) * 2023-01-10 2023-04-18 赣江新区活草生物科技有限公司 一种通过降低叶绿素a二级激发态提高光合效率的方法

Family Cites Families (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4535060A (en) 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
US5428147A (en) 1983-04-15 1995-06-27 Mycogen Plant Science, Inc. Octopine T-DNA promoters
US5447858A (en) 1984-04-13 1995-09-05 Mycogen Plant Sciences, Inc. Heat shock promoter and gene
CA1313830C (en) 1985-08-07 1993-02-23 Dilip Maganlal Shah Glyphosate-resistant plants
DE3642829A1 (de) 1986-08-23 1988-05-05 Hoechst Ag Resistenzgen gegen phosphinothricin
EP0270496B1 (de) 1986-12-05 1993-03-17 Ciba-Geigy Ag Verbessertes Verfahren zur Transformation von pflanzlichen Protoplasten
US5322938A (en) 1987-01-13 1994-06-21 Monsanto Company DNA sequence for enhancing the efficiency of transcription
US5164316A (en) 1987-01-13 1992-11-17 The University Of British Columbia DNA construct for enhancing the efficiency of transcription
US5359142A (en) 1987-01-13 1994-10-25 Monsanto Company Method for enhanced expression of a protein
US5196525A (en) 1987-01-13 1993-03-23 University Of British Columbia DNA construct for enhancing the efficiency of transcription
DE19775050I2 (de) 1987-08-21 2010-12-16 Syngenta Participations Ag Benzothiadiazole und ihre Verwendung in Verfahren und Mitteln gegen Pflanzenkrankheiten.
US5614395A (en) 1988-03-08 1997-03-25 Ciba-Geigy Corporation Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof
DE68918494T2 (de) 1988-05-17 1995-03-23 Lubrizol Genetics Inc Pflanzliches Ubiquitinpromotorsystem.
DE69034081T2 (de) 1989-03-24 2004-02-12 Syngenta Participations Ag Krankheitsresistente transgene Pflanze
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5231020A (en) 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US5633441A (en) 1989-08-04 1997-05-27 Plant Genetic Systems, N.V. Plants with genetic female sterility
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US4940935A (en) 1989-08-28 1990-07-10 Ried Ashman Manufacturing Automatic SMD tester
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
ES2150900T3 (es) 1989-10-31 2000-12-16 Monsanto Co Promotor para plantas transgenicas.
US5391725A (en) 1989-12-08 1995-02-21 New York University Medical Center Organ-specific plant promoter sequences
US5658772A (en) 1989-12-22 1997-08-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Site-specific recombination of DNA in plant cells
US5641876A (en) 1990-01-05 1997-06-24 Cornell Research Foundation, Inc. Rice actin gene and promoter
WO1991010725A1 (en) 1990-01-22 1991-07-25 Dekalb Plant Genetics Fertile transgenic corn plants
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
US5254801A (en) 1990-12-03 1993-10-19 Monsanto Company Heterologous dominant conditional lethal gene which is a phosphonate monoester hydrolase and use thereof in plants
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
AU1871492A (en) 1991-03-29 1992-11-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois, The Production fo transgenic soybean plants
US5610042A (en) 1991-10-07 1997-03-11 Ciba-Geigy Corporation Methods for stable transformation of wheat
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
EP0604662B1 (en) 1992-07-07 2008-06-18 Japan Tobacco Inc. Method of transforming monocotyledon
AU670316B2 (en) 1992-07-27 1996-07-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. An improved method of (agrobacterium)-mediated transformation of cultured soybean cells
US5527695A (en) 1993-01-29 1996-06-18 Purdue Research Foundation Controlled modification of eukaryotic genomes
US6118047A (en) 1993-08-25 2000-09-12 Dekalb Genetic Corporation Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction
US5362865A (en) 1993-09-02 1994-11-08 Monsanto Company Enhanced expression in plants using non-translated leader sequences
US5538887A (en) 1994-02-18 1996-07-23 Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority Cell culture apparatus having smooth surface for cell growth thereon
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
FR2736926B1 (fr) 1995-07-19 1997-08-22 Rhone Poulenc Agrochimie 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutee, gene codant pour cette proteine et plantes transformees contenant ce gene
AR006928A1 (es) 1996-05-01 1999-09-29 Pioneer Hi Bred Int Una molecula de adn aislada que codifica una proteina fluorescente verde como marcador rastreable para la transformacion de plantas, un metodo para laproduccion de plantas transgenicas, un vector de expresion, una planta transgenica y celulas de dichas plantas.
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
TW589189B (en) 1997-08-04 2004-06-01 Scras Kit containing at least one double-stranded RNA combined with at least one anti-viral agent for therapeutic use in the treatment of a viral disease, notably of viral hepatitis
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US6307123B1 (en) 1998-05-18 2001-10-23 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for transgene identification
GB9827152D0 (en) 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
WO2000044914A1 (en) 1999-01-28 2000-08-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
AU781598B2 (en) 1999-04-21 2005-06-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
US6232526B1 (en) 1999-05-14 2001-05-15 Dekalb Genetics Corp. Maize A3 promoter and methods for use thereof
US6603061B1 (en) 1999-07-29 2003-08-05 Monsanto Company Agrobacterium-mediated plant transformation method
WO2001029058A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
GB9927444D0 (en) 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
DE10100586C1 (de) 2001-01-09 2002-04-11 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens
DK1309726T4 (en) 2000-03-30 2019-01-28 Whitehead Inst Biomedical Res RNA Sequence-Specific Mediators of RNA Interference
CZ308053B6 (cs) 2000-12-01 2019-11-27 Max Planck Gesellschaft Izolovaná molekula dvouřetězcové RNA, způsob její výroby a její použití
BR0307253A (pt) 2002-01-30 2004-12-14 Arborgen Llc Construtos de dna, sistema de expressão, métodos de supressão da expressão de um gene alvo numa célula, célula de planta transformada, planta transgênica e kit de supressão de expressão genética
AR039717A1 (es) 2002-06-21 2005-03-09 Monsanto Technology Llc Construcciones de arn de intrones cadena doble y usos de las mismas
US20050166289A1 (en) 2003-12-01 2005-07-28 North Carolina State University Small interfering RNA (siRNA)-mediated heritable gene manipulation in plants
CN102524294B (zh) 2004-04-09 2018-04-06 孟山都技术有限公司 用于在植物中控制昆虫侵袭的组合物和方法
WO2013016267A2 (en) 2011-07-22 2013-01-31 Donald Danforth Plant Science Center Plants and algae capable of modulating antenna size based on light intensity
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
EP3218497A1 (en) * 2014-11-12 2017-09-20 NMC Inc. Transgenic plants with engineered redox sensitive modulation of photosynthetic antenna complex pigments and methods for making the same

Also Published As

Publication number Publication date
US10745708B2 (en) 2020-08-18
US20220204982A1 (en) 2022-06-30
EP3218497A1 (en) 2017-09-20
AU2022201411A1 (en) 2022-03-24
US20210071190A1 (en) 2021-03-11
AU2015346281B2 (en) 2021-12-02
US11111497B2 (en) 2021-09-07
CA2974716A1 (en) 2016-05-19
US20170356001A1 (en) 2017-12-14
AU2015346281A1 (en) 2017-06-22
WO2016077624A1 (en) 2016-05-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8455713B2 (en) Plants with improved morphogenesis and method of constructing the same
US11111497B2 (en) Transgenic plants with engineered redox sensitive modulation of photosynthetic antenna complex pigments and methods for making the same
CN108949806A (zh) 转基因植物细胞及生产转基因植物的方法
CN109477118A (zh) 具有增加的光合效率和生长的转基因植物
ES2763413T3 (es) Procedimientos y composiciones para prolongar la vida útil de productos vegetales
ES2750530T3 (es) Medios y procedimientos para producir rendimiento en plantas
Li et al. Molecular cloning and characterization of violaxanthin de-epoxidase (CsVDE) in cucumber
AU2014287556A1 (en) Abiotic stress resistance
US20160138038A1 (en) Methods and Compositions for Improvement in Seed Yield
CN112601452A (zh) 绿藻的bestrophin碳酸氢盐转运蛋白
CN106749580B (zh) 植物耐盐相关蛋白TaPUB15-D及其编码基因与应用
US20190338302A1 (en) Transgenic land plants comprising a putative transporter protein of an edible eukaryotic algae
CN105483154B (zh) Ots1蛋白及其编码基因在调控植物对aba耐受性中的应用
MX2011009378A (es) Plantas tolerantes a la sequia y metodos que implican el uso de genes que codifican polipeptidos de la familia de dedos de zinc ring de tipo c3hc4.
AU2018283286B2 (en) Genetically engineered land plants that express a plant CCP1-like mitochondrial transporter protein
JPWO2006057306A1 (ja) ストレス耐性及び／又は生産性を改良したイネ科植物、及びその作出方法
CN116157526A (zh) 提高c3植物的生产率
US20140259220A1 (en) Manipulating phb genes for plant biomass accumulation and yield
Gea et al. Introduction of Hd3a gene in IPB CP1 potato cultivar through Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation under the control of use 35S CaMV promoter
US20240052002A1 (en) Tomato-derived sijul gene regulating phloem development and use thereof
JP2006020601A (ja) ストレス耐性を改良したイモ類、及びその作出方法
CA2903206A1 (en) Guard cell expression cassettes compositions and methods of use thereof
CN109337885A (zh) 球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB、A亚基BbCNA在棉花和烟草育种中的应用
BR122024010129A2 (pt) Vetor de expressão, célula bacteriana contendo o mesmo, e usos de plantas, parte, célula ou semente de uma planta
KR20140049127A (ko) 잎, 줄기 또는 이들 모두에 특이적 프로모터, 이를 포함하는 발현 벡터, 이에 의한 형질 전환 식물체 및 이의 제조방법