CN114364788A - 用于靶向固氮以改良植物性状的基因靶标 - Google Patents

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Abstract

公开了一种经基因工程改造的细菌，其具有在一种或多种选自以下的基因中的修饰：NAC、ptsH、iaaA、gltA、pga、sdiA、fimA1、fimA2、fimA3、fimA4、wzxE、bolA、iscR、fhuF、sodA、sodB、sodC、FNR、arcA、arcB、rpoS、sbnA、treA、treB、phoP、phoQ、yjjPB、ychM、dauA、actP、yusV1、yieL1、yieL2、yieL3、yieL4、pgaB、rafA、melA、uidA、manA、abfA、abnA、lacZ和yusV2。还提供了使用所述经基因工程改造的细菌为植物提供固定氮的方法，以及包含所述细菌的组合物。

Description

用于靶向固氮以改良植物性状的基因靶标
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年4月24日提交的美国临时申请号62/838,158的优先权，所述临时申请以全文引用的方式并入本文。
技术领域
本公开涉及经基因工程改造的细菌菌株及其组合物。此类细菌菌株及其组合物可用于向植物提供固定氮。
背景技术
植物通过共享的代谢组与微生物组相连。在特定作物性状与潜在代谢组之间的多维关系的特点是具有许多局部最大值的景象。出于多种原因(诸如出于作物优化)，通过改变微生物组对代谢组的影响，从较差的局部最大值优化到另一个代表更好的性状可能是令人期望的。需要采用经济、环境和社会可持续的农业和粮食生产方法来满足不断增长的全球人口的需求。联合国粮食及农业组织预计，到2050年，粮食总产量必须增加70％才能满足不断增长的人口的需求，这一挑战因多种因素而加剧，所述多种因素包括淡水资源减少、对可耕地的竞争增加、能源价格上涨、投入成本增加以及作物可能需要适应更干燥、更热和更极端的全球气候的压力。
所关注的领域之一是改善固氮。氮气(N2)是地球大气的主要组分。此外，元素氮(N)是构成生物体的许多化学化合物的重要组分。然而，许多生物体不能直接使用N2来合成生理过程(诸如生长和繁殖)中使用的化学物质。为了利用N2，N2必须与氢结合使用。氢与N2的结合被称为固氮。固氮，无论是化学地还是生物地实现，都需要大量的能源投资。在生物系统中，称为固氮酶的酶催化导致固氮的反应。固氮研究的一个重要目标是将此表型扩展到非豆科植物，特别是重要的农艺禾本科植物，诸如小麦、水稻和玉米。尽管在理解根瘤菌与豆科植物之间固氮共生的发展方面取得了巨大进展，但利用该知识在非豆科作物上诱导固氮根瘤的途径尚不清楚。同时，随着对增加粮食产量的需求不断增加，提供充足的氮补充来源(诸如肥料)的挑战将继续增加。
发明内容
本公开提供了一种经基因工程改造的细菌，其具有在选自以下的基因中的修饰：NAC、ptsH、iaaA、gltA、pga、sdiA、fimA1、fimA2、fimA3、fimA4、wzxE、bolA、iscR、fhuF、sodA、sodB、sodC、FNR、arcA、arcB、rpoS、sbnA、treA、treB、phoP、phoQ、yjjPB、ychM、dauA、actP、yusV1、yieL1、yieL2、yieL3、yieL4、pgab、rafA、melA、uidA、manA、abfA、abnA、lacZ和yusV2。在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌具有在选自以下的基因中的修饰：NAC、gltA、pga、ptsH、fimA1、fimA2、fimA3、fimA4、iscR、tonB、yusV1、yusV2、yusV3、yusV4、sbnA、fhuF、sodA、sodB和sodC。在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌具有在选自以下的基因中的修饰：NAC、gltA、pga、ptsH、fimA1、fimA2、fimA3、fimA4、sodA、sodB和sodC。在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌具有在选自以下的基因中的修饰：iscR、tonB、yusV1、yusV2、yusV3、yusV4、sbnA和fhuF。
在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌是经基因工程改造的固氮细菌。在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌是属间的。
在一些实施方案中，经基因工程改造的微生物是非属间的。在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌能够在外源氮的存在下固定大气氮。在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌包括在固氮基因网络中的修饰。在一些实施方案中，在固氮基因网络中的修饰包括在NifA、NifL、NifH或其任何组合中的修饰。在一些实施方案中，NifA中的修饰导致NifA表达增加。在一些实施方案中，NifL中的修饰导致NifL表达降低。在一些实施方案中，NifH中的修饰导致NifH表达增加。在一些实施方案中，固氮基因网络中的修饰导致Nif簇基因的表达增加。在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌包括在氮同化基因网络中的修饰。在一些实施方案中，氮同化基因网络中的修饰包括GlnE中的修饰。在一些实施方案中，GlnE中的修饰导致GlnE活性降低。在一些实施方案中，氮同化基因网络中的修饰导致amtB活性降低。
本公开提供了一种增加植物中源自大气的氮的量的方法，其中所述方法包括使所述植物与本文所述的多种经基因工程改造的细菌接触的步骤。在一些实施方案中，所述接触步骤包括将多种经基因工程改造的细菌施用于植物的种子。在一些实施方案中，所述接触步骤包括将多种经基因工程改造的细菌施用于植物的幼苗。在一些实施方案中，所述接触步骤包括将多种经基因工程改造的细菌以液体制剂形式施用于植物。在一些实施方案中，所述接触步骤包括在植物种植之后但在收获之前将多种经基因工程改造的细菌施用于所述植物。在一些实施方案中，所述接触步骤包括将多种经基因工程改造的细菌作为拌种剂施用于植物。在一些实施方案中，所述接触步骤包括在发芽后一个月与八个月之间将多种经基因工程改造的细菌施用于植物。在一些实施方案中，所述接触步骤包括在发芽后两个月与八个月之间将多种经基因工程改造的细菌施用于植物。在一些实施方案中，所述接触步骤包括在发芽后一个月与三个月之间将多种经基因工程改造的细菌施用于植物。在一些实施方案中，所述接触步骤包括在发芽后三个月与六个月之间将多种经基因工程改造的细菌施用于植物。在一些实施方案中，植物是谷类植物。在一些实施方案中，植物是玉米植物。在一些实施方案中，植物是水稻植物。在一些实施方案中，植物是小麦植物。在一些实施方案中，植物是大豆植物。
本公开提供一种组合物，所述组合物包含种子和种子包衣；其中所述种子包衣包含多种如本文所述的经基因工程改造的细菌。在一些实施方案中，种子是谷类种子。在一些实施方案中，种子选自由以下组成的组：玉米种子、小麦种子、水稻种子、大豆种子、黑麦种子和高粱种子。
本公开提供了一种组合物，所述组合物包含植物和多种本文所述的经基因工程改造的细菌。在一些实施方案中，植物是幼苗。在一些实施方案中，植物是谷类植物。在一些实施方案中，植物选自玉米、水稻、小麦、大豆、黑麦和高粱。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用并入，就如每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入本文的程度一样。此外，国际公开号WO 2019/084342的公开内容以全文引用的方式并入本文。
附图说明
在所附权利要求中列出了本发明的新型特征。参考以下列出说明性实施方案的详细描述可获得对本发明特征和优点的更好理解，其中利用了本发明的原理，并且其中附图为：
图1A-B描绘了固氮细菌的富集和分离。(A)使用Nfb琼脂平板来分离固氮细菌的单菌落。(B)在Balch管中浇铸的半固体Nfb琼脂。箭头指向富集固氮细菌的菌膜。
图2描绘了代表性的nifH PCR筛选。在该筛选中，在约350bp处观察到两个菌落的阳性条带。较低的条带代表引物二聚体。
图3描绘了来自CRISPR-Cas选择性诱变的菌落的PCR筛选的实例。用对nifL基因座特异的引物筛选CI006菌落。预计野生型PCR产物为约2.2kb，而突变体预计为约1.1kb。筛选的十个菌落中有七个明确显示出所需的缺失。
图4A-B描绘了各种菌株的体外表型。在补充有0mM(图4A)或5mM(图4B)磷酸铵的固氮培养基中生长的菌株CI137的突变体的乙炔还原测定(ARA)活性。将所有菌株与137-2084(亲本菌株)进行比较。
图5A-B提供了来自图4A-B的菌株的铵排泄总量(图5B)和跨时间的铵排泄概况(图5A)。将所有菌株与137-2084(亲本菌株)进行比较。
图6A-B描绘了各种菌株的体外表型。在补充有0mM(图6A)或5mM(图6B)磷酸铵的固氮培养基中生长的菌株CI137的突变体的ARA活性。将所有菌株与137-2084(亲本菌株)进行比较。
图7A-B提供了来自图6A-B的菌株的铵排泄总量(图7B)和跨时间的铵排泄概况(图7A)。将所有菌株与137-2084(亲本菌株)进行比较。
图8A-B描绘了各种菌株的体外表型。在补充有0mM(图8A)或5mM(图8B)磷酸铵的固氮培养基中生长的菌株CI137的铁载体基因突变体的ARA活性。将所有菌株与137(亲本菌株)进行比较。
图9A-B提供了来自图8A-B的菌株的铵排泄总量(图9B)和跨时间的铵排泄概况(图9A)。将所有菌株与137(亲本菌株)进行比较。
图10A-B描绘了各种菌株的体外表型。在补充有0mM(图10A)或5mM(图10B)磷酸铵的固氮培养基中生长的菌株CI137的铁载体基因突变体的ARA活性。将所有菌株与137-2084(亲本菌株)进行比较。
图11A-B提供了来自图10A-B的菌株的铵排泄总量(图11B)和跨时间的铵排泄概况(图11A)。将所有菌株与137-2084(亲本菌株)进行比较。
图12A-B描绘了各种菌株的体外表型。在补充有0mM(图12A)或5mM(图12B)磷酸铵的固氮培养基中生长的菌株CI137的氧耐受基因突变体的ARA活性。将所有菌株与137(亲本菌株)进行比较。
图13A-B提供了来自图12A-B的菌株的铵排泄总量(图13B)和跨时间的铵排泄概况(图13A)。将所有菌株与137(亲本菌株)进行比较。
图14A-B描绘了各种菌株的体外表型。在补充有0mM(图14A)或5mM(图14B)磷酸铵的固氮培养基中生长的菌株CI137的氧耐受基因突变体的ARA活性。将所有菌株与137-2084(亲本菌株)进行比较。
图15A-B提供了来自图14A-B的菌株的铵排泄总量(图15B)和跨时间的铵排泄概况(图15A)。将所有菌株与137-2084(亲本菌株)进行比较。
图16A-B描绘了各种菌株的体外表型。在补充有0mM(图16A)或5mM(图16B)磷酸铵的固氮培养基中生长的菌株CI1021的铁载体基因突变体的ARA活性。将所有菌株与1021(亲本菌株)进行比较。
图17A-B提供了来自图16A-B的菌株的铵排泄总量(图17B)和跨时间的铵排泄概况(图17A)。将所有菌株与1021(亲本菌株)进行比较。
图18A-B描绘了各种菌株的体外表型。在补充有0mM(图18A)或5mM(图18B)磷酸铵的固氮培养基中生长的菌株CI1021的铁载体基因突变体的ARA活性。将所有菌株与1021-1615(亲本菌株)进行比较。
图19A-B提供了来自图18A-B的菌株的铵排泄总量(图19B)和跨时间的铵排泄概况(图19A)。将所有菌株与1021-1615(亲本菌株)进行比较。
图20A-B描绘了各种菌株的体外表型。在补充有0mM(图20A)或5mM(图20B)磷酸铵的固氮培养基中生长的菌株CI1021的氧耐受基因突变体的ARA活性。将所有菌株与1021(亲本菌株)进行比较。在1％氧气下进行测定。
图21A-B提供了来自图20A-B的菌株的铵排泄总量(图21B)和跨时间的铵排泄概况(图21A)。将所有菌株与1021(亲本菌株)进行比较。在1％氧气下进行测定。
图22A-B描绘了各种菌株的体外表型。在补充有0mM(图22A)或5mM(图22B)磷酸铵的固氮培养基中生长的菌株CI1021的氧耐受基因突变体的ARA活性。将所有菌株与1021-1615(亲本菌株)进行比较。在1％氧气下进行测定。
图23A-B提供了来自图22A-B的菌株的铵排泄总量(图23B)和跨时间的铵排泄概况(图23A)。将所有菌株与1021-1615(亲本菌株)进行比较。在1％氧气下进行测定。
图24A-B描绘了各种菌株的体外表型。在补充有0mM(图24A)或5mM(图24B)磷酸铵的固氮培养基中生长的菌株CI137的NAC基因突变体的ARA活性。
图25A-B提供了来自图24A-B的菌株的铵排泄总量(图25B)和跨时间的铵排泄概况(图25A)。
图26A-B描绘了各种菌株的体外表型。在补充有0mM(图26A)或5mM(图26B)磷酸铵的固氮培养基中生长的菌株CI1021的NAC基因突变体的ARA活性。GlnA操纵子上调使在ΔnifL::Prm2菌株中的固氮增加了约2-3倍。GlnA操纵子上调使在wt 1021菌株中的固氮增加了约200倍。
图27A-B提供了来自图26A-B的菌株的铵排泄总量(图27B)和跨时间的铵排泄概况(图27A)。GlnA操纵子上调使氮排泄量在wt下增加了约90倍，并且在抑制背景下增加了3倍。
具体实施方式
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析定义的基因座(loci或locus)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含一种或多种经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可以间杂有非核苷酸组分。聚合之后可以进一步修饰多核苷酸，诸如通过与标记组分缀合。
“杂交”是指一种反应，其中一种或多种多核苷酸反应形成复合物，所述复合物通过在核苷酸残基的碱基之间的氢键合而稳定。氢键合可以通过沃森-克里克(WatsonCrick)碱基配对、Hoogstein结合或根据碱基互补性以任何其他序列特异性方式发生。所述复合物可以包含形成双链体结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单条自杂交链、或这些的任何组合。杂交反应可以构成更广泛过程中的一个步骤，诸如PCR的起始、或核酸内切酶对多核苷酸的酶促切割。与第一序列互补的第二序列被称为第一序列的“互补序列”。如应用于多核苷酸的术语“可杂交的”是指多核苷酸形成复合物的能力，所述复合物通过在杂交反应中核苷酸残基的碱基之间的氢键合而稳定。
“互补性”是指核酸通过传统的沃森-克里克或其他非传统类型与另一个核酸序列形成氢键的能力。互补性百分比表示可以与第二核酸序列形成氢键(例如沃森-克里克碱基配对)的核酸分子中的残基的百分比(例如，10个中的5个、6个、7个、8个、9个、10个分别为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。“完全互补”意味着核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数量的连续残基氢键合。如本文所用，“基本上互补”是指在8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的互补性程度，或者是指在严格条件下杂交的两个核酸。序列同一性(诸如出于评估互补性百分比的目的)可以通过任何合适的比对算法来测量，所述任何合适的比对算法包括但不限于Needleman-Wunsch算法(参见例如，可在万维网上从ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html获得的EMBOSS Needle比对器，任选地使用默认设置)、BLAST算法(参见例如，可从blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi获得的BLAST比对工具，任选地使用默认设置)、或Smith-Waterman算法(参见例如，可在万维网上从.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html获得的EMBOSS Water比对器，任选地使用默认设置)。可以使用所选算法的任何合适的参数(包括默认参数)来评估最佳比对。
通常，杂交的“严格条件”是指与靶序列具有互补性的核酸主要与靶序列杂交并且基本上不与非靶序列杂交的条件。严格条件通常是序列依赖性的，并且根据许多因素而变化。通常，序列越长，该序列与其靶序列特异性地杂交的温度越高。在Tijssen(1993),Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-HybridizationWith Nucleic Acid Probes第I部分,第二章“Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assay”,Elsevier,N.Y.中详细描述了严格条件的非限制性实例。
一般而言，“序列同一性”是指两个多核苷酸或多肽序列的各自准确的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的对应关系。通常，用于确定序列同一性的技术包括确定多核苷酸的核苷酸序列和/或确定由其编码的氨基酸序列，并且将这些序列与第二个核苷酸或氨基酸序列进行比较。可以通过确定它们的“同一性百分比”来比较两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)。两个序列(无论是核酸序列还是氨基酸序列)的同一性百分比可以计算为在两个比对序列之间的精确匹配数除以较短序列的长度再乘以100。在一些情况下，测试序列和参考序列(无论是核酸序列还是氨基酸序列)的同一性百分比可以计算为在两个比对序列之间的精确匹配数除以参考序列的长度再乘以100。例如，还可以通过使用可从美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)获得的高级BLAST计算机程序(包括2.2.9版)比较序列信息来确定同一性百分比。BLAST程序基于Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268(1990)的比对方法，并且如在Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877(1993)；以及Altschul等人,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997)中所讨论。简而言之，BLAST程序将同一性定义为相同比对符号(通常是核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短序列中的符号总数。该程序可以用于确定被比较的蛋白质全长上的同一性百分比。提供默认参数以优化使用短查询序列的搜索，例如，在blastp程序中。该程序还允许使用SEG过滤器来屏蔽如通过Wootton和Federhen,Computers and Chemistry 17:149-163(1993)的SEG程序所确定的查询序列的片段。所需序列同一性程度的范围为大约80％至100％及其间的整数值。通常，所公开序列与所要求保护的序列之间的同一性百分比为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％。
如本文所用，“表达”是指多核苷酸从DNA模板转录(诸如转录成mRNA或其他RNA转录物)的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和所编码的多肽可以被统称为“基因产物”。如果多核苷酸源自基因组DNA，则表达可以包括在真核细胞中对mRNA的剪接。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可在本文中互换用于指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链或支链，其可以包含经修饰的氨基酸，并且其可以间杂有非氨基酸。该术语还涵盖已经被修饰的氨基酸聚合物。例如，具有二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作(诸如与标记组分缀合)的氨基酸聚合物。如本文所用的术语“氨基酸”包括天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸及D或L光学异构体、以及氨基酸类似物和肽模拟物。
如本文所用，术语“约”与术语“大约”同义使用。说明性地，关于量的术语“约”的使用表示略微超出所引用值的值，例如正或负0.1％至10％。
术语“生物学纯的培养物”或“基本上纯的培养物”是指本文所述的细菌物种的培养物，其不含有足以干扰培养物复制或通过正常细菌学技术检测到的量的其他细菌物种。
“植物生产力”通常是指作为植物生长原因的植物生长或发育的任何方面。对于粮食作物，诸如谷物或蔬菜，“植物生产力”可以指从特定作物收获的谷物或水果的产量。如本文所用，提高的植物生产力泛指提高出于各种目的收获的谷物、果实、花或其他植物部分的产量；提高包括茎、叶和根在内的植物部分的生长；促进植物生长；维持叶中叶绿素含量高；增加果实或种子数量；增加果实或种子单位重量；由于减少氮肥使用而减少NO2排放；以及植物生长和发育的类似改善。
粮食作物内部和周围的微生物可能影响那些作物的性状。可能受微生物影响的植物性状包括：产量(例如，谷物生产、生物量产生、果实发育、花定形(flower set))；营养(例如，氮、磷、钾、铁、微量营养素获取)；非生物胁迫管理(例如，耐旱、耐盐、耐热)；以及生物胁迫管理(例如，害虫、杂草、昆虫、真菌和细菌)。改变作物性状的策略包括：增加关键代谢物浓度；微生物对关键代谢物影响的时间动态变化；将微生物代谢物的产生/降解与新的环境线索联系起来；减少负代谢物；以及改善代谢物或基础蛋白质的平衡。
如本文所用，“控制序列”是指操纵子、启动子、沉默子或终止子。
在一些实施方案中，本公开的基因的天然或内源控制序列被一种或多种属内控制序列替代。
如本文所用，“引入”是指通过现代生物技术引入，而不是自然发生的引入。
在一些实施方案中，本公开的细菌已经被修饰，使得它们不是天然存在的细菌。
在一些实施方案中，本公开的细菌以每克植物鲜重或干重至少103个菌落形成单位(cfu)、104cfu、105cfu、106cfu、107cfu、108cfu、109cfu、1010cfu、1011cfu或1012cfu的量存在于植物中。在一些实施方案中，本公开的细菌以每克植物鲜重或干重至少约103cfu、约104cfu、约105cfu、约106cfu、约107cfu、约108cfu、约109cfu、约1010cfu、约1011cfu或约1012cfu的量存在于植物中。在一些实施方案中，本公开的细菌以每克植物鲜重或干重至少103至109、103至107、103至105、105至109、105至107、106至1010、106至107cfu的量存在于植物中。在一些实施方案中，本公开的细菌以每克植物鲜重或干重至少约103至约109、约103至约107、约103至约105、约105至约109、约105至约107、约106至约1010、约106至约107cfu的量存在于植物中。
在一些实施方案中，本公开的细菌以约103cfu至约1020cfu的量存在于植物中。例如，约103cfu至约1015cfu、约103cfu至约1010cfu、约103cfu至约105cfu、约1015cfu至约1020cfu、约1010cfu至约1020cfu、或约105cfu至约1020cfu。本公开的肥料和外源氮可以包含以下含氮分子：铵、硝酸盐、亚硝酸盐、氨、谷氨酰胺等。本公开的氮源可以包括无水氨、硫酸铵、尿素、磷酸氢二铵、脲醛(urea-form)、磷酸二氢一铵、硝酸铵、氮溶液、硝酸钙、硝酸钾、硝酸钠等。
如本文所用，“外源氮”是指在非氮限制条件下存在的土壤、田地或生长培养基中容易获得的非大气氮，包括氨、铵、硝酸盐、亚硝酸盐、尿素、尿酸、铵酸等。
如本文所用，“非氮限制条件”是指可在土壤、田地和/或培养基中以大于约4mM氮的浓度获得的非大气氮，如以下文献所公开的：Kant等人(2010.J.Exp.Biol.62(4):1499-1509)，以引用的方式并入本文。
如本文所用，“引入的遗传物质”意指添加到受体基因组中并作为受体基因组的组分保留的遗传物质。
在一些实施方案中，固氮和同化基因调节网络包含编码基因的多核苷酸和指导、调节和/或调节微生物固氮和/或同化的非编码序列，并且可以包含nif簇(例如，nifA、nifB、nifC、……、nifZ)的多核苷酸、编码氮调节蛋白C的多核苷酸、编码氮调节蛋白B的多核苷酸、gln簇(例如glnA和glnD)的多核苷酸序列、draT和氨转运蛋白/渗透酶。在一些实施方案中，Nif簇可以包括NifB、NifH、NifD、NifK、NifE、NifN、NifX、hesA和NifV。在一些实施方案中，Nif簇可以包括NifB、NifH、NifD、NifK、NifE、NifN、NifX、hesA和NifV的子集。
在一些实施方案中，本公开的肥料包含按重量计至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的氮。
在一些实施方案中，本公开的肥料包含按重量计至少约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的氮。
在一些实施方案中，本公开的肥料包含按重量计约5％至约50％、约5％至约75％、约10％至约50％、约10％至约75％、约15％至约50％、约15％至约75％、约20％至约50％、约20％至约75％、约25％至约50％、约25％至约75％、约30％至约50％、约30％至约75％、约35％至约50％、约35％至约75％、约40％至约50％、约40％至约75％、约45％至约50％、约45％至约75％、或约50％至约75％的氮。
在一些实施方案中，相对于尚未暴露于本公开的细菌的对照植物，测量在植物中固氮的增加和/或1％或更多的氮产生的增加。相对于对照细菌，测量所有的细菌活性(例如，如本文所述的任何细菌活性，包括细菌的固氮活性、细菌的氮同化活性、细菌的植物定殖活性、细菌的氨排泄活性和细菌的铁摄取活性)增加或降低。相对于对照植物，测量所有的植物生产力或特性增加或减少(例如，植物生长、产量、NO2排放和氮摄取的增加或减少)。
如本文所用，“组成型启动子”是在大多数条件下和/或在大多数发育阶段期间有活性的启动子。在生物技术中使用的表达载体中使用组成型启动子有几个优点，诸如：高水平产生用于选择转基因细胞或生物体的蛋白质；高水平表达报告蛋白或可评分标记，从而允许容易地检测和定量；高水平产生作为调节转录系统一部分的转录因子；产生需要在生物体中普遍存在的活性的化合物；和产生在所有发育阶段期间所需的化合物。非限制性示例性组成型启动子包括CaMV 35S启动子、鸦片启动子、泛素启动子、醇脱氢酶启动子等。
如本文所用，“非组成型启动子”是在某些条件下、在某些类型的细胞中和/或在某些发育阶段期间有活性的启动子。例如，组织特异性、组织优先的、细胞类型特异性、细胞类型优先的、诱导型启动子和受发育控制的启动子是非组成型启动子。受发育控制的启动子的实例包括优先启动在某些组织中的转录的启动子。
如本文所用，“诱导型”或“抑制型”启动子是受化学或环境因素控制的启动子。可能影响诱导型启动子转录的环境条件的实例包括厌氧条件、某些化学物质、光的存在、酸性或碱性条件等。
如本文所用，“组织特异性启动子”是仅在某些组织中启动转录的启动子。与基因的组成型表达不同，组织特异性表达是基因调节的几个相互作用水平的结果。因此，在本领域中有时优选的是使用来自同源或密切相关物种的启动子以在特定组织中实现转基因的有效且可靠的表达。这是从科学和专利文献中均发现的特定组织中分离出大量组织特异性启动子的主要原因之一。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指在单个核酸片段上的核酸序列的缔合，使得一个核酸序列的功能受另一个核酸序列调节。例如，当启动子能够调节编码序列的表达时(即编码序列在启动子的转录控制下)，启动子与编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义方向与调节序列可操作地连接。在另一个实例中，本公开的互补RNA区域可以直接地或间接地可操作地连接到靶mRNA的5'、或靶mRNA的3'、或靶mRNA内，或者第一互补区在靶mRNA的5'并且其互补序列在3'。
一般而言，术语“遗传修饰”或“基因中的修饰”是指相对于参考多核苷酸(诸如参考基因组或其部分、或参考基因或其部分)，引入多核苷酸序列中的任何变化。遗传修饰可以被称为“突变”，并且包含遗传修饰的序列或生物体可以被称为“遗传变体”或“突变体”。遗传修饰可以具有任何数量的影响，诸如增加或减少一些生物活性，包括基因表达、代谢和细胞信号传导。可以将遗传修饰专门引入靶位点，或随机引入。
本本文提供了一种经基因工程改造的细菌，期具有在选自以下的基因中的修饰：NAC、ptsH、iaaA、gltA、pga、sdiA、fimA1、fimA2、fimA3、fimA4、wzxE、bolA、iscR、fhuF、sodA、sodB、sodC、FNR、arcA、arcB、rpoS、sbnA、treA、treB、phoP、phoQ、yjjPB、ychM、dauA、actP、yusV1、yieL1、yieL2、yieL3、yieL4、pgab、rafA、melA、uidA、manA、abfA、abnA、lacZ和yusV2。在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌具有在选自以下的基因中的修饰：NAC、gltA、pga、ptsH、fimA1、fimA2、fimA3、fimA4、iscR、tonB、yusV1、yusV2、yusV3、yusV4、sbnA、fhuF、sodA、sodB和sodC。在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌具有在选自以下的基因中的修饰：NAC、gltA、pga、ptsH、fimA1、fimA2、fimA3、fimA4、sodA、sodB和sodC。在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌具有在选自以下的基因中的修饰：iscR、tonB、yusV1、yusV2、yusV3、yusV4、sbnA和fhuF。本文所述的细菌可以用于改善植物氮摄取的方法中。这样的方法可以包括使植物与多种细菌接触的步骤。还提供了组合物，所述组合物含有呈种子包衣的形式或与植物组合的多种细菌。与在鉴定的基因中缺乏修饰的细菌相比，在鉴定的基因中有修饰的细菌可以表现出以下中的一种或多种：固氮增加、氨排泄增加、定殖增加、铁转运增加、氧耐受性增加和/或干燥耐受性增加。
固氮的调节
可以通过使用本文所述的经基因工程改造的细菌改良的一种性状是固氮。虽然一些内生菌具有在纯的培养物中固氮所必需的遗传学，但基本的技术挑战是谷类和禾本科植物的野生型内生菌使在施肥田地中固氮停止。化学肥料的施用和在田间土壤中残留的氮水平表明微生物会关闭固氮的生化途径。需要改变固氮调节网络的转录和翻译后水平，以开发一种能够在肥料的存在下将氮固定和转移到玉米中的微生物。因此，在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌含有固氮调节网络的一个或多个基因的修饰。
为了利用元素氮(N)进行化学合成，生命形式将大气中可用的氮气(N2)与氢在称为固氮的过程中结合。并非所有生物体都能够进行固氮。相反，固氮仅限于含有进行固氮的遗传机制的固氮生物(diazatroph)(固定大气氮气的细菌和古细菌)。因此，在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌是固氮生物。由于生物固氮的能量密集型性质，固氮生物已经进化出对nif基因簇的复杂而严格的调节，nif基因簇编码负责响应于环境氧和可用氮进行固氮的机制。为了增加固氮作用，需要增加Nif簇基因的表达。Shamseldin(2013.GlobalJ.Biotechnol.Biochem.8(4):84-94)公开了nif基因及其产物的详细描述，并且以引用的方式并入本文。因此，在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌的固氮调节网络中的修饰导致一个或多个Nif簇基因的表达增加。
在变形菌中，固氮调节集中的σ54-依赖性增强子结合蛋白NifA周围，NifA是nif簇的正转录调节子，其激活将导致Nif簇基因表达增加。因此，在一些实施方式中，经基因工程改造的细菌固氮网络中的修饰包括对NifA的修饰，这在一些实施方案中导致NifA表达增加。活性NifA的细胞内水平受两个关键因素控制：nifLA操纵子的转录，以及通过与NifL的蛋白质-蛋白质相互作用抑制NifA活性，NifL的激活将导致Nif簇基因的表达降低。因此，在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌固氮网络中的修饰包括对NifL的修饰，这在一些实施方案中导致NifL表达降低。
除了调节nif基因簇的转录外，许多固氮生物已经进化出直接翻译后修饰和抑制固氮酶本身(称为固氮酶关闭)的机制。这是在氮过量条件下由Fe蛋白(NifH)的ADP核糖基化介导的，这会破坏其与MoFe蛋白复合物(NifDK)的相互作用并消除固氮酶活性。为了避免固氮酶关闭，需要增加可用的NifH以与MoFe蛋白质复合物相互作用。因此，在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌固氮网络中的修饰包括对NifH的修饰，这在一些实施方案中导致NifH表达增加。
固氮也可能对细胞内或细胞外的氨、尿素或硝酸盐水平作出反应。避免氮同化以避免其对固氮网络的反馈影响是可取的。因此，在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌含有在氮同化基因网络中的修饰。
通过降低amtB蛋白的表达水平，可以减少从环境中摄取的氨。没有细胞内氨，内生菌就无法感测高水平的氨，从而阻止了固氮基因的下调。因此，在一些实施方案中，氮同化基因网络中的修饰包括对amtB的修饰，这在一些实施方案中导致amtB的表达降低。任何设法进入细胞内隔室的氨都被转化为谷氨酰胺。细胞内谷氨酰胺水平是氮感测的主要指标。降低细胞内谷氨酰胺水平会防止细胞感测环境中的高水平铵。这种效果可以通过增加谷氨酰胺酶的表达水平来实现，谷氨酰胺酶是一种将谷氨酰胺转化为谷氨酸的酶。此外，也可以通过降低谷氨酰胺合酶(一种将氨转化为谷氨酰胺的酶)来减少细胞内谷氨酰胺。在固氮生物中，固定的氨快速被同化为谷氨酰胺和谷氨酸，用于细胞过程。氨同化的破坏可能使的固定的氮转移，从而作为氨从细胞中输出。固定的氨主要通过由glnA编码的谷氨酰胺合成酶(GS)同化为谷氨酰胺，并且随后通过谷氨酰胺酮戊二酸转氨酶(GOGAT)同化为谷氨酰胺。在一些实例中，glnS编码谷氨酰胺合成酶。GS受GS腺苷酰转移酶(GlnE)的翻译后调节，GlnE是一种由glnE编码的双功能酶，分别通过其腺苷酰转移酶(AT)和腺苷酰去除(AR)结构域的活性催化GS的腺苷酸化和去腺苷酸化。在氮限制条件下，glnA被表达，并且GlnE的AR结构域使GS去腺苷化，使其具有活性。为了破坏氨同化并允许固定的氮从细胞中输出，需要降低GlnE的这种活性。因此，在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌在氮同化基因网络中的修饰包括在GlnE中的修饰，这在一些实施方案中导致GlnE的活性降低。
依赖于磷酸烯醇丙酮酸的糖磷酸转移酶系统(PTS)是细菌中主要的碳水化合物转运系统。PTS在糖底物跨细胞膜转移的同时催化它们的磷酸化。来自磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的磷酰基基团被酶I转移到磷酸载体蛋白HPr上，并且然后磷酸-HPr将其转移到PTS EIIA结构域上。磷酸载体蛋白HPr由ptsH基因编码。在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌的修饰是ptsH基因中的修饰，诸如调节ptsH表达的启动子的取代。在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌在ptsH基因中的修饰导致糖转运增加。在一些实施方案中，修饰导致磷酸载体蛋白HPr的上调。
由iaaA编码的L-天冬酰胺酶(LA)催化天冬酰胺氨基酸降解为氨和天冬氨酸。在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌修饰是iaaA基因中的修饰。在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌在iaaA基因中的修饰导致氨同化减少和/或氨排泄增加。在一些实施方案中，修饰导致L-天冬酰胺酶的上调。
由gltA基因编码的柠檬酸合酶(E.C.2.3.3.1)参与柠檬酸循环的第一步。它催化来自乙酰辅酶A的二碳乙酸残基与四碳草酰乙酸盐的一个分子的缩合反应以形成六碳柠檬酸盐。在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌的修饰是gltA基因中的修饰，诸如gltA基因的缺失。在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌在gltA基因中的修饰导致氨排泄增加。
赋予新的微生物表型的方法可以在转录、翻译和翻译后水平上执行。转录水平包括启动子的变化(诸如改变σ因子亲和力或转录因子的结合位点，包括启动子的全部或部分的缺失)或改变转录终止子和衰减子。翻译水平包括核糖体结合位点的变化和mRNA降解信号的变化。翻译后水平包括使酶的活性位点突变和改变蛋白质-蛋白质相互作用。这些变化可以通过许多方式实现。通过将天然核糖体结合位点(RBS)或启动子与强度/效率较低的另一个进行交换，可以实现表达水平的降低(或完全消除)。ATG起始位点可以交换为GTG、TTG或CTG起始密码子，这导致编码区翻译活性的降低。表达的完全消除可以通过敲除(缺失)基因的编码区来完成。对开放阅读框(ORF)进行移码可能将导致沿ORF过早终止密码子，从而产生无功能的截短产物。框内终止密码子的插入也将类似地产生无功能的截短产物。也可以完成在N或C末端添加降解标签，以降低特定基因的有效浓度。
相反，可以通过使用更强的启动子来实现本文所述基因的表达水平增加。为了确保在高氮水平条件(或任何其他条件)下的高启动子活性，可以获得在高氮水平条件下的整个基因组的转录谱，并且可以从该数据集中选择具有所需转录水平的活性启动子来替代弱的启动子。弱起始密码子可以用ATG起始密码子交换，以获得更好的翻译起始效率。弱核糖体结合位点(RBS)也可以交换为具有更高翻译起始效率的不同RBS。此外，还可以进行位点特异性诱变来改变酶的活性。
增加植物中发生的固氮水平可以导致作物生产所需的化学肥料量的减少，并且减少温室气体排放(例如，氧化亚氮)。
增加固氮活性
固氮酶是负责催化固氮的酶。在各种固氮细菌中发现了三种类型的固氮酶：钼(Mo)固氮酶、钒(V)固氮酶和纯铁(Fe)固氮酶。固氮酶是由组分I(也称为双氮酶)和组分II(也称为双氮酶还原酶)组成的双组分系统。组分I是钼固氮酶中的MoFe蛋白、钒固氮酶中的VFe蛋白和纯铁固氮酶中的Fe蛋白。组分II是含有铁硫(Fe-S)簇的Fe蛋白。
改变辅助因子的供应可以增加固氮作用。辅因子供应可能受到铁摄取的影响。铁摄取可能受到tonB转运系统的影响。在一些情况下，影响铁摄取可以通过上调tonB转运系统基因来实现。tonB转运系统基因的一些实例包括但不限于tonB和exbAB。在一些情况下，铁摄取可能受到铁载体的影响，铁载体会增加微生物和植物中的铁摄取。在一些情况下，影响铁摄取可以通过上调铁载体生物合成基因来实现。铁载体生物合成基因的一些实例包括但不限于yhfA、yusV、sbnA、fiu、yfiZ和fur。可以调节铁可用性的其他基因修饰包括iscR和fhuF。
增加固氮也可以通过增加nif簇基因的表达来实现。可以通过多种不同的方式实现nif簇基因表达的增加。在一些实施方案中，可以通过在nifHDK或nifDK操纵子上游插入强启动子来增加nif簇的转录。在一些实施方案中，通过增加基因组中基因的拷贝数来实现nif簇基因表达的增加。可以将这些额外的基因拷贝置于天然启动子或强组成型启动子的控制之下。
增加固氮的另一种方式是通过增加nif簇转录来增加每个细胞的固氮酶数量。可以通过增加nifA转录来增加Nif簇转录。在一些情况下，nif簇转录可能受到增加基因组中nifA基因的拷贝数的影响。
可以通过增加NifA翻译来增加Nif簇转录。在一些情况下，可以通过增加nifA基因中核糖体结合位点的强度来增加NifA翻译。
也可以通过表达在NifA突变体形式的控制下的簇来增加Nif簇转录。可以通过对基因进行诱变并鉴定翻译效率已增加的突变体或表达活性增加的相应蛋白质的突变体来获得NifA的突变体形式。
也可以通过改变细胞的氧敏感性来实现增加的固氮。氧敏感性可能受到减少氧感测的影响。在一些情况下，减少氧感测可能是通过破坏氧感测基因。氧感测基因的一些实例包括但不限于nifT/fixU、fixJ和fixL。可以修饰以改变氧敏感性的其他基因包括sodA、sodB、sodC、FNR、arcA和arcB。
在一些情况下，可以通过促进细胞色素bd介导的呼吸保持细胞溶质氧水平低来影响氧敏感性。在一些情况下，氧敏感性可能受到上调编码细胞色素bd氧化酶的基因和/或敲除替代性细胞色素系统的影响。编码细胞色素bd基因的基因的一些实例包括但不限于cydABX、cydAB和cydX。在一些情况下，可以通过改变细胞中的氧化还原平衡来保护固氮酶免于氧化。可以通过ROS清除来改变氧化还原平衡。完成ROS清除的一种策略是上调相关基因。ROS清除基因的一些实例包括但不限于grxABCD、trxA、trxC和tpx。
在一些情况下，氧敏感性可能受到清除游离氧的影响。在一些情况下，可以通过上调细菌血红蛋白基因来实现游离氧的清除。血红蛋白基因的实例包括但不限于glbN。在一些情况下，清除游离氧可以通过上调编码高亲和力血红素铜cbb3型氧化酶的fixNOPQ基因来实现。
在一些情况下，对nifA的修饰可能有利于增加固氮酶表达。在一些情况下，修饰nifA以增加细胞中的nifA基因拷贝数可能是有益的。可以通过在组成型表达启动子前插入多个拷贝的nifA基因来增加nifA基因拷贝数。在一些情况下，将一个nifA基因拷贝附加到一个或多个管家操纵子上可以增加细胞中nifA基因的总数。在一些情况下，可以用于这种增加固氮酶表达的过程的菌株可能包括但不限于水拉恩菌(Rahnella aquatilis)和变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)菌株。
在一些情况下，对固氮酶操纵子的修饰可能有利于增加固氮酶表达。在一些情况下，上调固氮酶操纵子以增加固氮酶转录可能是有益的。在一些情况下，当细菌定殖于根际时有活性的来自细菌内部的启动子可以插入固氮酶操纵子前面以上调固氮酶操纵子。在一些情况下，可以缺失固氮酶操纵子内的nifL以上调固氮酶操纵子。在一些情况下，可以缺失固氮酶操纵子内的nifA以上调固氮酶操纵子。在一些情况下，可以缺失固氮酶操纵子内的nifA和nifL以上调固氮酶操纵子。在一些情况下，可以将多个启动子直接放置在nifHDK基因前面，以规避nifA转录控制。在一些情况下，可以用于这种增加固氮酶表达的过程的菌株可能包括但不限于水拉恩菌和变栖克雷伯菌菌株。
在一些情况下，对glnE的修饰可能有利于增加铵排泄。在一些情况下，可以改变glnE的AR结构域上的保守天冬氨酸-氨基酸-天冬氨酸(DXD)基序。表示为“X”的氨基酸指示该氨基酸可以是任何氨基酸，包括天然存在的氨基酸(例如，a-氨基酸)、非天然氨基酸、经修饰的氨基酸和非天然氨基酸。它还可以包括D-和L-氨基酸两者。在一些情况下，改变glnE的AR结构域上的保守DXD残基可以用于去除glnE的去腺苷酸化活性。在一些情况下，glnE的AR区域中的DXD基序上的D残基可能被替换。在一些情况下，替换glnE的AR区域中DXD基序上的D残基可以使GlnB结合位点保持完整，从而允许调节腺苷酸化活性，同时降低或阻止AR活性。在一些情况下，可以用于这种增加铵排泄的过程的菌株可能包括但不限于水拉恩菌、Kosakonia sacchari和变栖克雷伯菌菌株。
通过同化增加固氮
可以通过减少微生物中的氮同化来增加提供给微生物相关植物的氮量。因此，在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌包括在氮同化网络中的修饰，其在一些实施方案中导致细菌的氮同化减少。在这里，同化可能受到氨排泄率的影响。通过靶向氨同化，可以增加氮的可用性。在一些情况下，可以通过降低排泄后氨的再摄取率来影响氨同化。为了降低排泄后氨的再摄取率，可以敲除任何相关基因。氨再摄取基因的实例包括但不限于amtB。因此，在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌包括在氮同化基因网络中的修饰，该修饰导致amtB的表达降低。
氮同化控制蛋白(NAC)是在氮限制生长条件下产生的一种LysR型转录调节子(LTTR)。NAC可以激活σ70依赖性基因的转录，该基因的产物为细胞提供氨或谷氨酸。NAC还可以阻遏其产物利用氨及其自身转录的基因。在变栖克雷伯菌中NAC由oxyR基因编码。在一些实施方案中，经基因工程改造的细菌修饰是在oxyR基因中的修饰，诸如修饰，诸如调节oxyR表达的启动子的取代或者oxyR基因的全部或部分的缺失。在一些实施方案中，在oxyR基因中的经基因工程改造的细菌修饰导致氨排泄增加。
在一些情况下，同化可能受到植物摄取率的影响。通过靶向植物氮同化基因和途径，可以增加氮的可用性。在一些情况下，可以通过接种固N植物生长促进微生物来改变植物对氨的同化。可以进行筛选以鉴定在植物中诱导氨同化的微生物。
通过定殖增加固氮
增加微生物的定殖能力可以增加提供给植物的固定氮的量。可以通过改变承载能力(在根表面上的微生物的丰度)和/或微生物适应性来影响定殖。在一些情况下，可以通过改变有机酸转运来影响承载能力和微生物适应性。可以通过上调相关基因来改善有机酸转运。有机酸转运基因的实例包括但不限于dctA。有机酸转运基因的其他实例包括yjjPB、ychM、dauA和actP。
例如，定殖能力可能受到凝集素表达的影响。凝集素表达的增加可以帮助微生物粘附在植物根部。凝集素基因的实例可以包括但不限于fhaB和fhaC。
内生菌进入的增加可能影响定殖能力。例如，植物细胞壁降解酶(CDWE)可能影响内生菌进入。增加CDWE表达和/或分泌可能增加微生物的定殖和内生菌进入。CDWE的一些实例包括但不限于聚半乳糖醛酸酶和纤维素酶。聚半乳糖醛酸酶基因的一个实例是pehA。在一些情况下，可以通过向酶提供输出信号来增加聚半乳糖醛酸酶和纤维素酶的输出。CDWE的其他实例包括但不限于木聚糖酶、木葡聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶、α-阿拉伯糖苷酶、β-半乳糖苷酶和β-葡糖醛酸酶。示例性木聚糖酶包括yieL1、yieL2、yieL3、yieL4和pgab。示例性α-半乳糖苷酶包括rafA和melA。示例性β-葡糖醛酸酶包括uidA。示例性甘露聚糖酶包括manA。示例性α-阿拉伯糖苷酶包括abfA和abnA。示例性β-半乳糖苷酶包括lacZ。
改变承载能力可能导致提供给相关植物的氮量增加。生物膜形成可能影响承载能力。在一些情况下，小RNA rsmZ可能影响承载能力。小RNA rsmZ是生物膜形成的负调节子。在一些情况下，可以通过缺失或下调rsmZ来促进生物膜形成，从而导致rsmA(次级代谢的正调节子)的翻译增加和生物膜形成。
在一些情况下，可以通过增强菌株粘附在根表面上的能力来影响生物膜形成。在一些情况下，可以通过上调大粘附蛋白来促进生物膜形成。大粘附蛋白的实例包括但不限于lapA。
在一些情况下，承载能力可能受到群体感测的影响。在一些情况下，可以通过增加AHL生物合成基因的拷贝数来增强群体感测。
在一些情况下，根际的定殖可能受到根系质量的影响。例如，根系质量可能受到微生物IAA生物合成的影响。微生物的IAA生物合成增加可能刺激根系生物量的形成。在一些情况下，可以通过IAA生物合成基因的上调(在一定水平范围内)来影响IAA生物合成。IAA生物合成基因的实例包括但不限于ipdC。
在一些情况下，乙烯信号传导可以在植物中诱导系统抗性并影响微生物的定殖能力。乙烯是一种植物信号传导分子，其基于植物组织和乙烯水平引发广泛的反应。根系乙烯反应的流行模型是暴露于胁迫的植物通过产生一个小的乙烯峰来快速反应，该乙烯峰启动植物的保护性反应，例如编码防御性蛋白质的基因的转录。如果胁迫持续存在或强烈，通常几天后会出现第二个大得多的乙烯峰。这第二个乙烯峰诱导可能导致对植物生长和存活显著抑制的诸如衰老、萎黄和脱落等过程。在一些情况下，促进植物生长的细菌可以通过产生生长素IAA来刺激根部生长，后者在根部中刺激小的乙烯反应。同时，细菌可以通过产生减缓植物中的乙烯产生的酶(ACC脱氨酶)来阻止第二个大的乙烯峰，从而保持有利于刺激根部生长的乙烯水平。在植物中诱导系统抗性可能受到细菌IAA的影响。在一些情况下，可以通过IAA生物合成基因的上调(在一定水平范围内)来刺激IAA生物合成。生物合成基因的实例包括但不限于ipdC。
在一些情况下，定殖可能受到ACC脱氨酶的影响。ACC脱氨酶可以通过将ACC分流到副产物来减少根部中的乙烯产生。在一些情况下，可以通过上调ACC脱氨酶基因来影响ACC脱氨酶。ACC脱氨酶基因的一些实例包括但不限于dcyD。
在一些情况下，定殖可能受到承载能力和/或微生物适应性的影响。例如，承载能力和/或微生物适应性可能受到海藻糖过量产生的影响。海藻糖过量产生可以增加干旱耐受性。在一些情况下，影响海藻糖过量产生可以通过上调(在一定水平范围内)海藻糖生物合成基因来实现。海藻糖生物合成基因的一些实例包括但不限于otsA、otsB、treZ和treY。在一些情况下，otsB的上调也可以增加固氮活性。
在一些情况下，承载能力可能受到根部附着的影响。根部附着可能受到表多糖分泌的影响。在一些情况下，可以通过上调表多糖生产蛋白来影响表多糖分泌。表多糖生产蛋白的一些实例包括但不限于yjbE和pssM。在一些情况下，可以通过上调纤维素生物合成来影响表多糖分泌。纤维素生物合成基因的一些实例包括但不限于acs基因和bcs基因簇。
在一些情况下，承载能力和/或微生物适应性可能受到真菌抑制的影响。真菌抑制可能受到几丁质酶的影响，几丁质酶可以分解真菌细胞壁并且可以导致对根际真菌的生物防治。在一些情况下，影响真菌抑制可以通过几丁质酶基因的上调来实现。几丁质酶基因的一些实例包括但不限于几丁质酶1类和chiA。
在一些情况下，有效的铁摄取可以帮助微生物在根际存活，在那里它们与其他土壤微生物和植物竞争铁摄取。在一些情况下，高亲和力螯合(铁载体)和转运系统可以通过1)确保微生物获得足够的铁和2)减少竞争物种的铁库来帮助提高根际能力。增加微生物这样做的能力可以增加其在根际中的竞争适应性。在一些情况下，可以通过上调铁载体基因来影响铁摄取。铁载体基因的一些实例包括但不限于yhfA、yusV、sbnA、fiu、yfiZ和fur。yusV基因的实例包括但不限于yusV1和yusV2。在一些情况下，铁摄取可能受到tonB转运系统的影响。在一些情况下，可以通过上调tonB转运系统基因来影响铁摄取。tonB转运系统基因的一些实例包括但不限于tonB和exbAB。
在一些情况下，承载能力和/或微生物适应性可能受到氧化还原平衡和/或ROS清除的影响。氧化还原平衡和/或ROS清除可能受到细菌谷胱甘肽(GSH)生物合成的影响。在一些情况下，可以通过上调细菌谷胱甘肽生物合成基因来影响细菌谷胱甘肽(GSH)生物合成。细菌谷胱甘肽生物合成基因的一些实例包括但不限于gshA、gshAB和gshB。
在一些情况下，氧化还原平衡可能受到ROS清除的影响。在一些情况下，可以通过上调过氧化氢酶来影响ROS清除。过氧化氢酶基因的一些实例包括但不限于katEG和Mn过氧化氢酶。
在一些情况下，生物膜形成可能受到磷信号传导的影响。在一些情况下，可以通过改变磷信号传导基因的表达来影响磷信号传导。磷信号传导基因的一些实例包括但不限于phoR和phoB。
在一些情况下，承载能力可能受到根部附着的影响。根部附着可能受到表面活性素(surfactin)生物合成的影响。在一些情况下，影响表面活性素生物合成可以通过上调表面活性素生物合成以改善生物膜形成来实现。表面活性素生物合成基因的实例包括但不限于srfAA。
在一些情况下，定殖和/或微生物适应性可能受到承载能力、与其他微生物的竞争和/或来自其他微生物的作物保护的影响。在一些情况下，与其他微生物的竞争和/或来自其他微生物的作物保护可能受到群体感测和/或群体淬灭的影响。群体淬灭可以通过抑制潜在致病性/竞争性细菌的群体感测来影响定殖。在一些情况下，影响群体淬灭可以通过插入和/或上调编码群体淬灭酶的基因来实现。群体猝灭基因的一些实例包括但不限于ahlD、Y2-aiiA、aiiA、ytnP和attM。在一些情况下，参与群体淬灭的酶(诸如Y2-aiiA和/或ytnP)的修饰可能有利于定殖。在一些情况下，Y2-aiiA和/或ytnP的上调可以导致细胞外酰基高丝氨酸内酯(AHL)的水解。aiiA是N-酰基高丝氨酸内酯酶，它是一种分解高丝氨酸内酯的酶。分解AHL可以阻止或减缓竞争性革兰氏阴性细菌的群体信号传导能力。在一些情况下，可以用于这种增加定殖的过程的菌株可能包括但不限于水拉恩菌、Kosakonia sacchari和变栖克雷伯菌菌株。
在一些情况下，承载能力和/或微生物适应性可能受到根瘤菌毒素生物合成的影响。根瘤菌毒素生物合成可以通过抑制ACC合酶来减少根部中的乙烯产生。在一些情况下，影响根瘤菌毒素生物合成可以通过上调根瘤菌毒素生物合成基因来实现。
在一些情况下，承载能力可能受到根部附着的影响。根部附着可能受到表多糖分泌的影响。在一些情况下，影响表多糖分泌可以通过缺失mucA产生超类粘蛋白突变体来实现。
在一些情况下，根部附着可能受到吩嗪生物合成的影响。在一些情况下，影响吩嗪生物合成可以通过上调吩嗪生物合成基因以改善生物膜形成来实现。
在一些情况下，根部附着可能受到环状脂肽(CLP)生物合成的影响。在一些情况下，影响环状脂肽(CLP)生物合成可以通过上调CLP生物合成以改善生物膜形成来实现。在一些情况下，承载能力和/或竞争可能受到抗生素合成的影响。抗生素合成可以增加抗生素产量以杀死竞争性微生物。在一些情况下，增加抗生素产量可以通过挖掘基因组中的抗生素生物合成途径和上调来实现。
在一些情况下，定殖可能受到干燥耐受性的影响。在一些情况下，对rpoE的修饰可能有利于定殖。在一些情况下，rpoE的上调可以导致胁迫耐受性基因和途径的表达增加。在一些情况下，可以使用独特的可切换启动子来上调rpoE。在一些情况下，可以使用阿拉伯糖启动子来上调rpoE。rpoE是一种类似于phyR的σ因子。当表达时，rpoE可以导致多个胁迫耐受性基因的上调。由于胁迫耐受性酶在定殖周期期间不可用，因此可以使用可切换的启动子。在一些情况下，启动子在生物量生长期间和/或在种子包衣期间可以是有活性的。在一些情况下，可以使用其中糖或化学物质可以在生物量生长的对数阶段掺入的可切换启动子，但也可以在微生物的一种或多种其他应用期间使启动子不开启。在一些情况下，rpoE可以被上调，同时也可以下调rseA。在一些情况下，可以用于这种增加定殖的过程的菌株可能包括但不限于水拉恩菌、Kosakonia sacchari和变栖克雷伯菌菌株。
在一些情况下，定殖可能受到干燥耐受性的影响。在一些情况下，对rseA的修饰可能有利于定殖。在一些情况下，可以使用独特的可切换启动子来下调rseA。在一些情况下，可以使用阿拉伯糖启动子下调rseA。rseA是一种与rpoE共表达的抗σ因子。在一些情况下，所述酶仍然相互结合，这可能降低或禁用rpoE用作转录因子的能力。然而，在胁迫条件期间，resA可以被切割并且rpoE可以自由地上/下调节胁迫耐受性基因。通过打破与rpoE的共转录，可以独立滴定rpoE和resA的水平，这可能有助于优化工程改造的菌株的定殖。其他可以改善干燥耐受性的基因修饰包括rpoS、treA、treB、phoP、phoQ和rpoN中的修饰。在一些情况下，可以用于这种增加定殖的过程的菌株可能包括但不限于水拉恩菌、Kosakoniasacchari和变栖克雷伯菌菌株。
其他可以改善定殖的基因修饰包括pga、SdiA、fimA1、fimA2、fimA3、fimA4、wzxE和bolA中的修饰。
细菌种群的产生
细菌的分离
可以通过从天然植物的表面或组织中提取微生物来获得可用于本文公开的方法和组合物中的微生物。可以通过研磨种子以分离微生物来获得微生物。可以通过在不同的土壤样品中种植种子并从组织中回收微生物来获得微生物。此外，可以通过用外源微生物接种植物并确定哪些微生物出现在植物组织中来获得微生物。植物组织的非限制性实例可以包括种子、幼苗、叶、插枝、植物、鳞茎或块茎。
获得微生物的方法可以是通过从土壤中分离细菌。可以从各种土壤类型中收集细菌。在一些实例中，土壤可以通过诸如高肥力或低肥力、水分水平、矿物质水平和各种种植实践等性状来表征。例如，土壤可以参与作物轮作，其中在连续的种植季节在同一土壤中种植不同的作物。在同一土壤上连续生长不同的作物可以防止某些矿物质的不成比例消耗。可以从生长在选定土壤中的植物中分离细菌。可以在生长的2-6周时收获幼苗植物。例如，在一轮收获中可以收集至少400个分离株。土壤和植物类型揭示植物表型以及条件，这些允许某些表型的下游富集。
可以从植物组织中分离微生物以评估微生物性状。处理组织样品的参数可以变化，以分离不同类型的关联微生物，诸如根际细菌、附生菌或内生菌。可以将分离物在无氮培养基中培养以富集进行固氮的细菌。可替代地，可以从全球菌株库中获得微生物。
在植物中，进行分析以评估微生物性状。在一些实施方案中，可以通过对DNA和RNA进行高通量处理来处理植物组织以进行筛选。此外，非侵入性测量可以用于评估植物特性，诸如定殖。可以在逐株植物的基础上获得对野生微生物的测量。也可以使用中通量方法在田间获得对野生微生物的测量。可以随时间连续进行测量。可以使用的模型植物系统包括但不限于狗尾草(Setaria)。
可以通过植物系统中微生物的转录谱分析筛选植物系统中的微生物。通过转录谱分析进行筛选的实例包括使用定量聚合酶链反应(qPCR)、用于转录物检测的分子条形码、下一代测序和使用荧光标记物进行微生物标记的方法。可以测量影响因素以评估温室中的定殖，包括但不限于微生物组、非生物因素、土壤条件、氧气、水分、温度、接种条件和根系定位。可以通过用如本文所述的IRMS或NanoSIMS测量15N气体/肥料(稀释物)来评估细菌中的固氮。NanoSIMS是高分辨率二次离子质谱法。NanoSIMS技术是一种研究生物样品的化学活性的方式。可以在细胞、亚细胞、分子和元素水平上研究驱动微生物代谢的氧化反应的还原催化作用。NanoSIMS可以提供大于0.1μm的高空间分辨率。NanoSIMS可以检测诸如13C、15N和18O等同位素示踪剂的使用。因此，NanoSIMS可以用于细胞中的化学活性氮。
可以将自动化温室用于植物分析学。响应微生物暴露的植物度量包括但不限于生物量、叶绿体分析、CCD相机、体积断层扫描测量。
富集微生物种群的一种方式是根据基因型。例如，用靶向引物或特异性引物进行聚合酶链反应(PCR)测定。为nifH基因设计的引物可以用于鉴定固氮生物，因为固氮生物在固氮的过程中表达nifH基因。还可以通过独立于单细胞培养的方法和趋化性引导的分离方法来富集微生物种群。可替代地，可以通过在选择培养基上培养微生物来进行微生物的靶向分离。为所需性状富集微生物种群的有计划的方法可以由生物信息学数据指导并在本文中进行描述。
使用生物信息学富集具有固氮能力的微生物
生物信息学工具可以用于鉴定和分离根际细菌，所述根际细菌根据它们进行固氮的能力进行选择。具有高固氮能力的微生物可以促进植物的有利性状。用于鉴定此类根际细菌的生物信息学分析模式包括但不限于基因组学、宏基因组学、靶向分离、基因测序、转录组测序和建模。
基因组学分析可以用于鉴定固氮根际细菌并使用如本文所述的下一代测序方法和微生物版本对照确认突变的存在。
宏基因组学可以用于使用定殖预测算法鉴定和分离固氮根际细菌。元数据还可以用于鉴定在环境和温室样品中的工程改造的菌株的存在。
转录组测序可以用于预测导致固氮表型的基因型。此外，转录组数据用于鉴定改变基因表达的启动子。可以结合全基因组序列(WGS)分析转录组数据，以产生代谢和基因调节网络模型。
微生物的驯化
从自然界中分离的微生物可以经历驯化过程，其中微生物被转化为一种可遗传追踪和可鉴定的形式。驯化微生物的一种方式是工程改造具有抗生素抗性的微生物。工程改造抗生素抗性的过程可以从确定野生型微生物菌株的抗生素敏感性开始。如果细菌对抗生素敏感，那么抗生素可以成为抗生素抗性工程改造的良好候选者。随后，可以使用重组工程改造方法将抗生素抗性基因或反选择自杀载体整合到微生物的基因组中。反选择自杀载体可以由所关注的基因的缺失、选择标记和反选择标记sacB组成。反选择可以用于将天然微生物DNA序列与抗生素抗性基因进行交换。中通量方法可以用于同时评价多种微生物，从而允许平行驯化。替代性的驯化方法包括使用归巢核酸酶来防止自杀载体序列环出或获得插入载体序列。
可以通过多种方法(包括电穿孔和化学转化)将DNA载体引入细菌中。标准的载体文库可以用于转化。基因编辑方法的一个实例是CRISPR之前的Cas9测试，以确保Cas9在微生物中的活性。
微生物的非转基因工程改造
可以通过定向进化获得具有有利性状的微生物种群。直接进化是一种方法，其中模拟自然选择的过程以朝着用户定义的目标进化蛋白质或核酸。直接进化的一个实例是当随机突变被引入微生物种群中时，选择具有最有利性状的微生物，并且所选择的微生物继续生长。根际细菌中最有利的性状可以是固氮。基于每次迭代之后的选择过程，定向进化的方法可以是迭代和自适应的。
可以产生具有高固氮能力的根际细菌。这些根际细菌的进化可以通过引入遗传修饰来进行。可以通过聚合酶链反应诱变、寡核苷酸定向诱变、饱和诱变、片段改组诱变、同源重组、CRISPR/Cas9系统、化学诱变及其组合引入遗传修饰。这些方法可以将随机突变引入微生物种群中。例如，可以通过寡核苷酸定向诱变使用合成DNA或RNA产生突变体。可以使用质粒上所含的工具产生突变体，所述质粒后来被熟化。可以使用来自具有改良的性状的其他物种的文库来鉴定所关注的基因，所述改善的性状包括但不限于改善的固氮特性、改善的谷物定殖、增加的氧敏感性、增加的固氮和增加氨排泄。可以使用诸如Geneious或Platypus设计软件等软件基于这些文库设计属内基因。可以借助机器学习来设计突变。可以借助代谢模型来设计突变。突变的自动设计可以使用a la Platypus来完成，并将指导RNA进行Cas定向诱变。
可以将属内基因转移到宿主微生物中。此外，也可以将报告系统转移到微生物中。报告系统表征启动子，确定转化成功，筛选突变体并充当阴性筛选工具。
携带突变的微生物可以通过连续传代进行培养。微生物菌落含有微生物的单一变体。在自动菌落挑选机和液体处理机的帮助下筛选微生物菌落。具有基因重复和拷贝数增加的突变体表达所需性状的更高基因型。
基于固氮选择促进植物生长的微生物
可以使用各种测定筛选微生物菌落以评估固氮。测量固氮的一种方式是通过一种测量氮排泄的单一发酵测定。替代性的方法是乙炔还原测定(ARA)，随着时间的推移进行在线采样。可以在微管阵列的高通量板中进行ARA。可以用活的植物和植物组织进行ARA。在ARA测定中，培养基配方和培养基氧浓度可以变化。另一种筛选微生物变体的方法是通过使用生物传感器。NanoSIMS和拉曼(Raman)显微分光镜检查的使用可以用于研究微生物的活性。在一些情况下，还可以使用生物反应器中的发酵方法培养和扩增细菌。生物反应器被设计成提高细菌生长的稳健性并降低细菌对氧的敏感性。将中高TP板基微发酵器用于评价氧敏感性、营养需求、固氮和氮排泄。也可以将细菌与竞争性或有益微生物共培养，以阐明隐藏的途径。流式细胞术可以用于使用化学、比色或荧光指示剂筛选产生高水平氮的细菌。可以在存在或不存在氮源的情况下培养细菌。例如，可以将细菌与谷氨酰胺、氨、尿素或硝酸盐一起培养。
微生物育种
微生物育种是一种系统地鉴定和改善物种在作物微生物组中的作用的方法。该方法包括三个步骤：1)通过绘制植物-微生物相互作用图并预测与特定表型相关的调节网络来选择候选物种，2)通过调节网络和基因簇的物种内交叉对微生物表型进行实际和可预测的改进，以及3)筛选和选择产生所需作物表型的新微生物基因型。为了系统地评估菌株的改善，创建了将微生物群落的定殖动态与关键物种的遗传活动联系起来的模型。所述模型用于预测遗传目标育种，并提高选择微生物组编码的农艺相关性状改良的频率。
可以通过连续传代来生产细菌以改良植物性状(例如固氮)。除了鉴定能够向一种或多种植物赋予一种或多种改良性状的细菌和/或组合物之外，还可以通过选择具有受微生物菌群影响的特定改良性状的植物来产生这种细菌。一种生产细菌以改良植物性状的方法包括以下步骤：(a)从第一种植物的组织或土壤中分离细菌；(b)将遗传修饰引入一种或多种细菌中以产生一种或多种变体细菌；(c)将多株植物暴露于变体细菌；(d)从多株植物之一的组织或土壤中分离细菌，其中从中分离细菌的植物相对于多株植物中的其他植物具有改良的性状；和(e)用从具有改良性状的植物(步骤(d))中分离的细菌重复步骤(b)至(d)。步骤(b)至(d)可以重复任意次数(例如，一次、两次、三次、四次、五次、十次或更多次)，直到植物中的改良性状达到所需水平。此外，多株植物可以是超过两株植物，诸如约10至约20株植、或约20株或更多株、约50株或更多株、约100株或更多株、约300株或更多株、约500株或更多株、或约1000株或更多株植物。
除了获得具有改良性状的植物之外，还获得了包含细菌的细菌种群，所述细菌包含引入一个或多个基因(例如，调节固氮的基因)中的一个或多个遗传修饰。通过重复上述步骤，可以获得包括与所关注的植物性状相关的种群中的最适当成员的细菌种群。可以鉴定该种群中的细菌并确定它们的有益特性，诸如通过遗传和/或表型分析。可以对步骤(a)中的分离细菌进行遗传分析。表型和/或基因型信息可以使用包括以下的技术获得：植物起源的化学组分的高通量筛选、包括遗传物质高通量测序在内的测序技术、差异展示技术(包括DDRT-PCR和DD-PCR)、核酸微阵列技术、RNA测序(全转录组鸟枪法测序)和qRT-PCR(实时定量PCR)。获得的信息可以用于获得关于存在的细菌的身份和活性的群落谱分析信息，诸如系统发生分析或对编码rRNA操纵子或其他分类信息基因座组分的核酸的基于微阵列的筛选。分类信息基因座的实例包括16S rRNA基因、23S rRNA基因、5S rRNA基因、5.8S rRNA基因、12S rRNA基因、18S rRNA基因、28S rRNA基因、gyrB基因、rpoB基因、fusA基因、recA基因、coxl基因、nifD基因。US20140155283中描述了用于确定种群中存在的分类群的分类学分析的示例性过程。细菌鉴定可以包括表征一种或多种基因或一个或多个信号传导途径(诸如与固氮途径相关的基因)的活性。在不同细菌物种之间的协同相互作用(其中两种组分由于它们的组合而使预期效果增加了超过加合量)也可以存在于细菌种群中。
遗传修饰可以是选自由以下组成的组的基因：nifA、nifL、ntrB、ntrC、glnA、glnB、glnK、draT、amtB、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB和nifQ。遗传修饰可以是编码具有选自由以下组成的组的功能的蛋白质的基因中的修饰：谷氨酰胺合成酶、谷氨酰胺酶、谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶、转录激活因子、抗转录激活因子、丙酮酸黄素氧还蛋白氧化还原酶、黄素氧还蛋白或NAD+-二氮-还原酶aDP-D-核糖基转移酶。遗传修饰可以是导致以下中的一项或多项的突变：NifA或谷氨酰胺酶的表达或活性增加；NifL、NtrB、谷氨酰胺合成酶、GlnB、GlnK、DraT、AmtB的表达或活性降低；GlnE的腺苷酰去除活性降低；或GlnD的尿苷酰去除活性降低。引入遗传修饰可以包括在靶位点处插入和/或缺失一个或多个核苷酸，诸如1个、2个、3个、4个、5个、10个、25个、50个、100个、250个、500个或更多个核苷酸。引入本文所公开的方法的一种或多种细菌中的遗传修饰可以是敲除突变(例如，缺失启动子、插入或缺失以产生过早终止密码子、缺失整个基因)，或者可以是清除或消除蛋白质结构域的活性(例如，影响活性位点的点突变，或缺失编码蛋白质产物相关部分的基因的一部分)，或者它可以改变或消除靶基因的调节序列。也可以插入一个或多个调节序列，包括异源调节序列和在与引入遗传修饰的细菌相对应的细菌物种或属的基因组内发现的调节序列。此外，可以基于基因在细菌培养物中或在植物组织内的表达水平来选择调节序列。遗传修饰可以是特异性地引入靶位点的预定遗传修饰。遗传修饰可以是在靶位点内的随机突变。遗传修饰可以是一个或多个核苷酸的插入或缺失。在一些情况下，在将细菌暴露于植物以评估性状改良之前，将多个不同的遗传修饰(例如，2个、3个、4个、5个、10个或更多个)引入一个或多个分离的细菌中。多个遗传修饰可以是上述类型中的任何一种，相同或不同的类型，以及任何组合。在一些情况下，连续引入多个不同的遗传修饰，在第一个分离步骤之后引入第一个遗传修饰，在第二个分离步骤之后引入第二个遗传修饰，以此类推，从而在赋予相关植物上日益增多的改良性状的细菌中积累多个遗传修饰。
有多种分子工具和方法可用于引入遗传修饰。例如可以通过聚合酶链反应诱变、寡核苷酸定向诱变、饱和诱变、片段改组诱变、同源重组、重组工程改造、λred介导的重组、CRISPR/Cas9系统、化学诱变及其组合引入遗传修饰。引入遗传修饰的化学方法包括将DNA暴露于化学诱变剂，例如甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-亚硝基脲(EN U)、N-甲基-N-硝基-N'-亚硝基胍、4-硝基喹啉N-氧化物、二乙基硫酸酯、苯并芘、环磷酰胺、博来霉素、三乙基密胺、丙烯酰胺单体、氮芥、长春新碱、二环氧烷(例如二环氧丁烷)、ICR-170、甲醛、丙卡巴肼盐酸盐、环氧乙烷、二甲基亚硝胺、7,12-二甲基苯并蒽、苯丁酸氮芥、六甲基磷酸酰胺、双硫丹(bisulfan)等。辐射突变诱导剂包括紫外线辐射、γ-辐射、X射线和快中子轰击。还可以使用例如三甲基补骨脂素用紫外光将遗传修饰引入核酸中。随机或靶向插入可移动DNA元件(例如转座元件)是另一种产生遗传修饰的合适方法。可以在无细胞体外系统中例如使用聚合酶链反应(PCR)技术(诸如易错PCR)在扩增期间将遗传修饰引入核酸中。可以使用DNA改组技术(例如，外显子改组、结构域交换等)在体外将遗传修饰引入核酸中。由于细胞中DNA修复酶的缺乏，也可以将遗传修饰引入核酸中，例如，细胞中存在编码突变DNA修复酶的突变基因预计会在细胞基因组中产生高频率的突变(即，约1个突变/100个基因至1个突变/10,000个基因)。编码DNA修复酶的基因的实例包括但不限于Mut H、Mut S、Mut L和Mut U，以及它们在其他物种中的同源物(例如，MSH 1 6、PMS 1 2、MLH 1、GTBP、ERCC-1等)。例如在Stemple(2004)Nature5:1-7；Chiang等人(1993)PCR Methods Appl 2(3):210-217；Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751；以及美国专利号6,033,861和6,773,900中提供了引入遗传修饰的各种方法的实例描述。
引入微生物中的遗传修饰可以被分类为转基因的、顺式基因的(cisgenic)、基因组内的、属内的、属间的、合成的、进化的、重排的或SNP。
可以将遗传修饰引入微生物内的许多代谢途径中，以引起上述性状的改良。代表性途径包括硫摄取途径、糖原生物合成、谷氨酰胺调节途径、钼摄取途径、固氮途径、氨同化、氨排泄或分泌、氮摄取、谷氨酰胺生物合成、厌氧氨氧化(annamox)、磷酸盐增溶、有机酸转运、有机酸产生、凝集素产生、活性氧自由基清除基因、吲哚乙酸生物合成、海藻糖生物合成、植物细胞壁降解酶或途径、根部附着基因、表多糖分泌、谷氨酸合酶途径、铁摄取途径、铁载体途径、几丁质酶途径、ACC脱氨酶、谷胱甘肽生物合成、磷信号传导基因、群体淬灭途径、细胞色素途径、血红蛋白途径、细菌血红蛋白样途径、小RNA rsmZ、根瘤菌毒素生物合成、lapA粘附蛋白、AHL群体感测途径、吩嗪生物合成、环状脂肽生物合成、和抗生素产生。
CRISPR/Cas9(成簇的规则间隔短回文重复序列)/CRISPR相关(Cas)系统可以用于引入所需的突变。CRISPR/Cas9通过使用CRISPR RNA(crRNA)来引导对入侵核酸的沉默，为细菌和古细菌提供针对病毒和质粒的适应性免疫。Cas9蛋白(或其功能等同物和/或变体，即Cas9样蛋白)天然地含有DNA核酸内切酶活性，该核酸内切酶活性取决于该蛋白与两种天然存在或合成的RNA分子(称为crRNA和tracrRNA)(也称为引导RNA)的缔合。在一些情况下，两个分子共价连接以形成单个分子(也称为单引导RNA(“sgRNA”))。因此，Cas9或Cas9样蛋白与靶向DNA的RNA(该术语涵盖双分子引导RNA构型和单分子引导RNA构型两者)缔合，后者激活Cas9或Cas9样蛋白并将蛋白质引导至靶核酸序列。如果Cas9或Cas9样蛋白保留其天然酶促功能，它将切割靶DNA以产生双链断裂，这可能导致基因组改变(即编辑：缺失、插入(当存在供体多核苷酸时)、替换等)，从而改变基因表达。Cas9的一些变体(所述变体涵盖在术语Cas9样中)已被改变，使得它们的DNA切割活性降低(在一些情况下，它们切割靶DNA的单链而不是双链，而在其他情况下它们已严重降低至没有DNA切割活性)。用于引入遗传修饰的CRISPR系统的进一步示例性描述可见于例如美国专利号8,795,965。
作为一种循环扩增技术，聚合酶链反应(PCR)诱变使用诱变引物以引入所需的突变。通过变性、退火和延伸的循环进行PCR。在通过PCR扩增之后，突变DNA的选择和亲本质粒DNA的去除可以通过以下方式完成：1)在PCR期间用羟甲基化的dCTP替代dCTP，随后用限制酶消化以便仅去除非羟甲基化的亲本DNA；2)同时诱变抗生素抗性基因和研究基因，将质粒改变为不同的抗生素抗性，新的抗生素抗性有利于此后选择所需的突变；3)在引入所需的突变之后，通过仅切割甲基化DNA的限制酶Dpnl消化亲本甲基化模板DNA，由此回收诱变的未甲基化的链；或4)在另外的连接反应中环化突变的PCR产物，以提高突变DNA的转化效率。示例性方法的进一步描述可见于例如美国专利号7,132,265、6,713,285、6,673,610、6,391,548、5,789,166、5,780,270、5,354,670、5,071,743以及美国公开号2010/0267147。
寡核苷酸定向诱变(也称为定点诱变)通常利用合成的DNA引物。这种合成引物含有所需的突变，并与突变位点周围的模板DNA互补，因此它可以与所关注的基因中的DNA杂交。突变可以是单个碱基变化(点突变)、多个碱基变化、缺失或插入，或这些的组合。然后使用DNA聚合酶延伸单链引物，所述DNA聚合酶复制基因的其余部分。如此复制的基因含有突变的位点，变栖然后可以作为载体导入宿主细胞中并进行克隆。最后，可以通过DNA测序选择突变体，以检查它们是否含有所需的突变。
可以使用易错PCR引入遗传修饰。在此技术中，在缺乏序列复制保真度的条件下使用DNA聚合酶扩增所关注的基因。结果是扩增产物在序列中含有至少一个错误。当基因被扩增并且反应所得的产物在与模板分子相比时在序列中含有一个或多个改变时，所得的产物与模板相比被诱变。引入随机突变的另一种手段是将细胞暴露于化学诱变剂，诸如亚硝基胍或甲磺酸乙酯(Nestmann,Mutat Res 1975年6月；28(3):323-30)，并且然后从宿主中分离出含有该基因的载体。
饱和诱变是随机诱变的另一种形式，其中尝试在特定位点或基因的狭窄区域产生所有或几乎所有可能的突变。在一般意义上，饱和诱变包括在诱变处理待诱变的确定多核苷酸序列(其中待诱变的序列的长度为例如从15个至100,000个碱基)中的一整套诱变盒(其中每个盒的长度为例如1-500个碱基)内。因此，将一组突变(例如范围从1个至100个突变)引入每个待诱变的盒中。在应用一轮饱和诱变期间，待引入一个盒中的一组突变可以与待引入第二个盒中的第二组突变不同或相同。此类分组通过特定密码子的缺失、添加、分组和特定核苷酸盒的分组来举例说明。
片段改组诱变(也称为DNA改组)是一种快速传播有益突变的方式。在改组过程的一个实例中，DNA酶用于将一组亲本基因片段化成例如长度为约50-100bp的片段。随后是没有引物的聚合酶链反应(PCR)——具有足够重叠同源序列的DNA片段将彼此退火，并且然后由DNA聚合酶延伸。在一些DNA分子达到亲本基因的大小之后，允许进行几轮这种PCR延伸。然后可以通过另一个PCR扩增这些基因，这次添加设计成补充链末端的引物。引物可以在其5'末端添加另外的序列，诸如连接到克隆载体中所需的限制酶识别位点的序列。在美国公开号2005/0266541中提供了改组技术的另外实例。
同源重组诱变涉及在外源DNA片段与靶向多核苷酸序列之间的重组。在发生双链断裂之后，断裂的5'端周围的DNA部分在称为切除的过程中被切除。在随后的链侵入步骤中，断裂的DNA分子的悬垂3'端然后“侵入”未断裂的相似或相同的DNA分子。所述方法可以用于缺失基因，去除外显子，添加基因和引入点突变。同源重组诱变可以是永久性的或有条件的。通常，还提供重组模板。重组模板可以是另一个载体的组分，包含在单独的载体中，或作为单独的多核苷酸提供。在一些实施方案中，重组模板被设计成用作同源重组(诸如在被位点特异性核酸酶产生切口或切割的靶序列内或附近)中的模板。模板多核苷酸可以是任何合适的长度，诸如约或超过约10个、15个、20个、25个、50个、75个、100个、150个、200个、500个、1000个或更多个核苷酸的长度。在一些实施方案中，模板多核苷酸与包含靶序列的多核苷酸的一部分互补。当最佳比对时，模板多核苷酸可能与靶序列的一个或多个核苷酸重叠(例如约或超过约1个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或更多个核苷酸)。在一些实施方案中，当模板序列和包含靶序列的多核苷酸最佳比对时，模板多核苷酸的最近核苷酸在距靶序列的约1个、5个、10个、15个、20个、25个、50个、75个、100个、200个、300个、400个、500个、1000个、5000个、10000个或更多个核苷酸内。可用于同源重组方法中的定点核酸酶的非限制性实例包括锌指核酸酶、CRISPR核酸酶、TALE核酸酶和大范围核酸酶。对于此类核酸酶的使用的进一步描述，参见例如美国专利号8,795,965和美国公开号2014/0301990。
可以将主要产生点突变和短缺失、插入、颠换和/或转换的诱变剂(包括化学诱变剂或辐射)用于产生遗传修饰。诱变剂包括但不限于甲磺酸乙酯、甲磺酸甲酯、N-乙基-N-亚硝基脲、三乙基密胺、N-甲基-N-亚硝基脲、丙卡巴肼、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、硫酸二乙酯、丙烯酰胺单体、美法仑、氮芥、长春新碱、二甲基亚硝胺、N-甲基-N'-硝基-亚硝基胍、亚硝基胍、2-氨基嘌呤、7,12-二甲基-苯并蒽、环氧乙烷、六甲基磷酸酰胺、双硫丹、二环氧烷(二环氧辛烷、二环氧丁烷等)、2-甲氧基-6-氯-9[3-(乙基-2-氯-乙基)氨基丙基氨基]吖啶二盐酸盐和甲醛。
引入基因修饰可能是一个不完全的过程，因此经处理的细菌种群中的一些细菌携带了所需的突变，而另一些则没有。在一些情况下，需要施加选择压力以便富集携带所需遗传修饰的细菌。传统上，成功遗传变异的选择涉及对于或针对遗传修饰所赋予或消除的一些功能进行选择，诸如在插入抗生素抗性基因或消除能够将非致死化合物转化为致死代谢物的代谢活动的情况下。还有可能基于多核苷酸序列本身施加选择压力，使得仅需要引入所需的遗传修饰(例如，在也不需要选择标记的情况下)。在这种情况下，选择压力可以包括切割缺乏被引入靶位点的遗传修饰的基因组，使得选择有效地针对寻求被引入遗传修饰的参考序列。通常，切割发生在靶位点的100个核苷酸内(例如，距靶位点75个、50个、25个、10个或更少个核苷酸内，包括在靶位点处或靶位点内的切割)。切割可以由选自由以下组成的组的位点特异性核酸酶指导：锌指核酸酶、CRISPR核酸酶、TALE核酸酶(TALEN)或大范围核酸酶。除了没有提供用于同源重组的模板之外，这样的过程类似于在靶位点增强同源重组的过程。因此，缺乏所需遗传修饰的细菌更有可能经历切割，如果所述切割不加以修复，则会导致细胞死亡。然后可以分离在选择中存活的细菌用于暴露于植物以评估改良性状的赋予。
CRISPR核酸酶可以用作位点特异性核酸酶以将切割引导至靶位点。通过使用Cas9杀死非突变细胞，可以获得对突变微生物的改善的选择。然后用突变的微生物接种植物以重新确认共生并产生进化压力以选择有效的共生体。然后可以从植物组织中重新分离微生物。用于针对非变体进行选择的CRISPR核酸酶系统可以使用与上文关于引入遗传修饰所述的那些相似的元件，不同之处在于没有提供用于同源重组的模板。因此，针对靶位点的切割增强了受影响细胞的死亡。
用于在靶位点处特异性地诱导切割的其他选项，诸如锌指核酸酶、TALE核酸酶(TALEN)系统和大范围核酸酶是可用的。锌指核酸酶(ZFN)是通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的人工DNA核酸内切酶。ZFN可以被工程改造为靶向所需的DNA序列，并且这使得锌指核酸酶能够切割独特的靶序列。当引入细胞中时，ZFN可以用于通过诱导双链断裂来编辑细胞中的靶DNA(例如，细胞的基因组)。转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)是通过将TAL(转录激活因子样)效应DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的人工DNA核酸内切酶。TALEN可以快速地工程改造为结合实际上任何所需的DNA序列，并且当引入细胞中时，TALEN可以用于通过诱导双链断裂来编辑细胞中的靶DNA(例如，细胞的基因组)。大范围核酸酶(归巢核酸内切酶)是以大的识别位点(12至40个碱基对的双链DNA序列)为特征的脱氧核糖核酸内切酶。大范围核酸酶可以用于以高度靶向的方式替换、清除或修饰序列。通过蛋白质工程改造修饰它们的识别序列，可以改变靶向序列。大范围核酸酶可以用于修饰所有基因组类型，无论是细菌、植物还是动物，并且通常被分组为四个家族：LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、His-Cyst盒家族和HNH家族。示例性归巢核酸内切酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。
可以将本公开的方法用于引入或改善多种所需性状中的一种或多种。可以引入或改良的性状的实例包括：根生物量、根长、高度、枝条长度、叶数、水分利用效率、总生物量、产量、果实大小、谷物大小、光合作用速率、对干旱的耐受性、热量耐受性、盐分耐受性、对线虫胁迫的抗性、对真菌病原体的抗性、对细菌病原体的抗性、对病毒病原体的抗性、代谢物水平和蛋白质组表达。理想的性状(包括高度、总生物量、根和/或枝条生物量、种子发芽、幼苗存活、光合效率、蒸腾速率、种子/果实数量或质量、植物籽粒或果实产量、叶的叶绿素含量、光合速率、根长或它们的任何组合)可以用于测量生长，并且与在相同条件下生长的参考农业植物(例如，没有改良性状的植物)的生长速率进行比较。
在一些实施方案中，待引入或改良的性状是固氮，如本文所述。在一些实施方案中，待引入或改良的性状是铵排泄、定殖、铁转运、氧耐受性、干燥耐受性或它们的组合。在一些实施方案中，相对于在鉴定的基因中缺乏修饰的细菌，铵排泄增加、定殖增加、铁转运增加、氧耐受性增加和干燥耐受性增加中的一种或多种。在一些情况下，与在土壤中的相同条件下生长的缺乏引入或改良的性状的参考农业植物相比，由本文所述的方法产生的植物表现出至少约5％，例如至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约75％、至少约80％、至少约80％、至少约90％、或者至少100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％或更大的性状差异。例如，与在土壤中的相同条件下生长的参考农业植物相比，由本文所述的方法产生的植物可以表现出至少约5％，例如至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约75％、至少约80％、至少约80％、至少约90％、或者至少100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％或更大的固氮量的增加。在另外的实例中，与在土壤中的相似条件下生长的参考农业植物相比，由本文所述的方法产生的植物表现出至少约5％，例如至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约75％、至少约80％、至少约80％、至少约90％、或者至少100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％或更大的性状差异。在一些实施方案中，与在土壤中的相似条件下生长的参考农业植物相比，在本文所述的植物中发生的固氮的量、和/或氨排泄、定殖、铁转运、氧耐受性和干燥耐受性中的一种或多种的增加使用如本文所述的测定进行测量。例如，可以通过乙炔还原(AR)测定来测量固氮的量。
可以在包括应用一种或多种生物或非生物应激物的条件下评估待改良的性状。应激物的实例包括非生物胁迫(诸如热胁迫、盐胁迫、干旱胁迫、冷胁迫和低营养胁迫)和生物胁迫(诸如线虫胁迫、昆虫食草胁迫、真菌病原体胁迫、细菌病原体胁迫和病毒病原体胁迫)。
通过本公开的方法和组合物改良的性状可以是固氮，包括在先前不能固氮的植物中。在一些情况下，根据本文所述的方法分离的细菌产生1％或更多(例如2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或更多)的植物氮，这可以代表与在引入任何遗传修饰之前从第一株植物中分离的细菌相比固氮能力增加了至少2倍(例如，3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍或更多倍)。在一些情况下，细菌产生5％或更多的植物氮。在将引入遗传修饰、暴露于多株植物以及从具有改良性状的植物中分离细菌重复一次或多次(例如1次、2次、3次、4次、5次、10次、15次、25次或更多次)之后，可以实现所需水平的固氮。在一些情况下，在补充有谷氨酰胺、氨或其他化学氮源的肥料的存在下，可以实现增强水平的固氮。用于评估固氮程度的方法是已知的，其实例在本文中有描述。
微生物育种是一种系统地鉴定和改善物种在作物微生物组中的作用的方法。该方法包括三个步骤：1)通过绘制植物-微生物相互作用图并预测与特定表型相关的调节网络来选择候选物种，2)通过调节网络和基因簇的物种内交叉对微生物表型进行实际和可预测的改进，以及3)筛选和选择产生所需作物表型的新微生物基因型。为了系统地评估菌株的改善，创建了将微生物群落的定殖动态与关键物种的遗传活动联系起来的模型。所述模型用于预测遗传目标育种，并提高选择微生物组编码的农艺相关性状改良的频率。
固氮
可以将本文公开的经基因工程改造的细菌用于增加在植物中的固氮的方法，所述方法包括使植物与多种细菌接触的步骤。在一些实施方案中，细菌在植物中产生1％或更多的氮(例如2％、5％、10％或更多)，这在一些实施方案中代表与没有细菌的植物相比至少2倍的固氮能力。细菌可以在补充有谷氨酰胺、尿素、硝酸盐或氨的肥料的存在下产生氮。经基因工程改造的细菌可以包括任何数量和任何组合的本文所述的任何遗传修饰，包括上文所提供的实例。可以将遗传修饰引入选自由以下组成的组的基因：中：nifA、nifL、ntrB、ntrC、谷氨酰胺合成酶、glnA、glnB、glnK、draT、amtB、谷氨酰胺酶、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB和nifQ。遗传修饰可以是导致以下中的一项或多项的突变：nifA或谷氨酰胺酶的表达或活性增加；nifL、ntrB、谷氨酰胺合成酶、glnB、glnK、draT、amtB的表达或活性降低；GlnE的腺苷酰去除活性降低；或GlnD的尿苷酰去除活性降低。引入本文所公开的方法的一种或多种细菌中的遗传修饰可以是敲除突变或者其可以消除靶基因的调节序列，或者其可以包含异源调节序列的插入(例如在同一细菌物种或属的基因组内发现的调节序列的插入)。可以基于基因在细菌培养物中或在植物组织内的表达水平来选择调节序列。遗传修饰可以通过化学诱变产生。可以将植物暴露于生物或非生物应激物。
在本文所述的植物中发生的固氮的量可以以多种方式(例如通过乙炔还原(AR)测定)测量。乙炔还原测定可以在体外或在体内进行。特定细菌为植物提供固定氮的证据可以包括：1)植物总N在接种后显著增加，优选地伴随植物中N浓度的增加；2)接种后在N限制条件下氮缺乏症状得到缓解(这应包括干物质增加)；3)通过使用15N方法(其可以是同位素稀释实验、15N2还原测定或15N自然丰度测定)记录N2固定；4)固定的N掺入植物蛋白质或代谢物中；和5)所有这些影响在未接种的植物或在接种了接种菌株突变体的植物中均未观察到。
野生型固氮调节级联可以表示为数字逻辑回路，其中输入O2和NH4 +通过NOR门，其输出除ATP以外还进入AND门。在一些实施方案中，本文所公开的方法在调节级联中的多个点上破坏了NH4 +对该回路的影响，使得微生物甚至可以在受精田间中产生氮。然而，本文所公开的方法还设想改变ATP或O2对所述回路的影响，或用细胞中的其他调节级联替代所述回路，或改变除固氮以外的遗传回路。基因簇可以被重新工程改造以在异源调节系统的控制下产生功能性产物。通过清除基因簇编码序列内外的天然调节元件并用替代性调节系统替换它们，复杂遗传操纵子和其他基因簇的功能性产物可以被控制和/或转移到异源细胞(包括与天然基因所来源的物种不同的物种的细胞)中。一旦重新工程改造，合成的基因簇就可以由遗传回路或其他诱导型调节系统控制，从而根据需要控制产物的表达。表达盒可以被设计成用作逻辑门、脉冲发生器、振荡器、开关或存储设备。受控表达盒可以与启动子连接，使得表达盒用作环境感测器，诸如氧气、温度、接触、渗透压力、膜压力或氧化还原感测器。
例如，可以从nif基因簇中清除nifL、nifA、nifT和nifX基因。可以通过密码子随机化编码每个氨基酸序列的DNA来设计合成基因。执行密码子选择，指定密码子使用使得与天然基因中的密码子使用尽可能不同。扫描所提议序列的任何不需要的特征，诸如限制酶识别位点、转座子识别位点、重复序列、σ54和σ70启动子、隐藏的核糖体结合位点和不依赖ρ(rho)的终止子。选择合成核糖体结合位点以匹配每个相应天然核糖体结合位点的强度，诸如通过构建其中基因起始密码子(从-60至+90)周围的150bp与荧光基因融合的荧光报告质粒。这种嵌合体可以在Ptac启动子的控制下表达，并通过流式细胞术测量荧光。为了产生合成核糖体结合位点，使用150bp(-60至+90)的合成表达盒产生报告质粒文库。简而言之，合成表达盒可以由随机DNA间隔区、编码RBS文库的简并序列和每个合成基因的编码序列组成。筛选多个克隆以鉴定与天然核糖体结合位点最匹配的合成核糖体结合位点。由与天然操纵子相同的基因组成的合成操纵子因此被构建并测试功能互补。US20140329326中提供了合成操纵子的进一步示例性描述。
细菌物种
可以从任何来源获得可用于本文所公开的方法和组合物中的微生物。在一些情况下，微生物可以是细菌、古细菌、原生动物或真菌。本公开的微生物可以是固氮微生物，例如固氮细菌、固氮古细菌、固氮真菌、固氮酵母或固氮原生动物。可用于本文所公开的方法和组合物中的微生物可以是形成孢子的微生物，例如形成孢子的细菌。在一些情况下，可用于本文所公开的方法和组合物中的细菌可以是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。在一些情况下，细菌可以是厚壁菌门(Firmicute phylum)的形成内生孢子的细菌。在一些情况下，细菌可以是固氮生物。在一些情况下，细菌可能不是固氮生物。
本公开的方法和组合物可以与古细菌(例如，热自养甲烷嗜热杆菌(Methanothermobacter thermoautotrophicus))一起使用。
在一些情况下，可以为有用的细菌包括但不限于放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)、酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)、酸土芽孢杆菌(Bacillusacidoterrestris)、土壤芽孢杆菌(Bacillus agri)、鲇泽芽孢杆菌(Bacillus aizawai)、白色乳芽孢杆菌(Bacillus albolactis)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、蜂房芽胞杆菌(Bacillus alvei)、氨基解葡糖芽孢杆菌(Bacillus aminoglucosidicus)、噬胺芽胞杆菌(Bacillus aminovorans)、溶淀粉芽胞杆菌(Bacillus amylolyticus)(也称为溶淀粉类芽胞杆菌(Paenibacillus amylolyticus))、解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、解硫胺素芽胞杆菌(Bacillus aneurinolyticus)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、产氮芽胞杆菌(Bacillus azotoformans)、栗褐芽胞杆菌(Bacillus badius)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)(同义词：Bacillus endorhythmos、Bacillus medusa)、角质孢子芽孢杆菌(Bacillus chitinosporus)、环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、内寄生芽孢杆菌(Bacillusendoparasiticus)、苛求芽胞杆菌(Bacillus fastidiosus)、坚硬芽胞杆菌(Bacillusfirmus)、库尔斯塔克芽孢杆菌(Bacillus kurstaki)、栖乳芽孢杆菌(Bacilluslacticola)、乳病芽孢杆菌(Bacillus lactimorbus)、乳芽孢杆菌(Bacillus lactis)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)(也称为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus))、灿烂芽胞杆菌(Bacillus lautus)、缓死芽孢杆菌(Bacilluslentimorbus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、Bacillus maroccanus、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、Bacillusmetiens、蕈状芽胞杆菌(Bacillus mycoides)、纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)、杀线虫芽孢杆菌(Bacillus nematocida)、黑色芽孢杆菌(Bacillus nigrificans)、黑芽孢杆菌(Bacillus nigrum)、泛养芽孢杆菌(Bacillus pantothenticus)、金龟子芽孢杆菌(Bacillus popillae)、冷解糖芽孢杆菌(Bacillus psychrosaccharolyticus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)、史氏芽孢杆菌(Bacillussmithii)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、单鞭毛芽孢杆菌(Bacillus uniflagellatus)、日本短根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)(以前的侧孢芽孢杆菌(Bacilluslaterosporus))、铁杉下色杆菌(Chromobacterium subtsugae)、食酸代尔夫特菌(Delftiaacidovorans)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、抗生素溶杆菌(Lysobacterantibioticus)、产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)、蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillusalvei)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、金龟子类芽孢杆菌(Paenibacilluspopilliae)(以前的金龟子类芽孢杆菌)、凝聚成团泛菌(Pantoea agglomerans)、穿刺巴斯德氏菌(Pasteuria penetrans)(以前的穿刺芽孢杆菌(Bacillus penetrans))、Pasteuriausgae、胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)(以前的胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora))、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、致金色假单胞菌(Pseudomonas aureofaciens)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)(以前称为洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia))、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、Pseudomonas proradix、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、嗜虫沙雷菌(Serratia entomophila)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、哥伦比亚链霉菌(Streptomyces colombiensis)、鲜黄链霉菌(Streptomyces galbus)、高氏链霉菌(Streptomyces goshikiensis)、灰绿链霉菌(Streptomyces griseoviridis)、淡紫链霉菌(Streptomyces lavendulae)、Streptomyces prasinus、沙拉西链霉菌(Streptomyces saraceticus)、委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、发光致病杆菌(Xenorhabdus luminescens)、嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)、圆红球菌(Rhodococcus globerulus)AQ719(NRRL登录号B-21663)、芽孢杆菌属物种AQ175(ATCC登录号55608)、芽孢杆菌属物种AQ 177(ATCC登录号55609)、芽孢杆菌属物种AQ178(ATCC登录号53522)和链霉菌属物种菌株NRRL登录号B-30145。在一些情况下，细菌可以是圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、肺炎克雷伯菌(Klesiella pneumoniae)、维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinelandii)、球形红杆菌(Rhodobacter spharoides)、荚膜红杆菌(Rhodobacter capsulatus)、沼泽红杆菌(Rhodobcter palustris)、深红红螺菌(Rhodosporillum rubrum)、豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)或菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)。
在一些情况下，细菌可以是梭菌属(Clostridium)的物种，例如巴斯德梭菌(Clostridium pasteurianum)、拜季林斯基梭菌(Clostridium beijerinckii)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。
在一些情况下，与本公开的方法和组合物一起使用的细菌可以是蓝细菌(cyanobacteria)。蓝细菌属的实例包括鱼腥藻属(Anabaena)(例如鱼腥藻属物种PCC7120)、念珠藻属(Nostoc)(例如点状念珠藻(Nostoc punctiforme))或集胞藻属(Synechocystis)(例如集胞藻属物种PCC6803)。
在一些情况下，与本公开的方法和组合物一起使用的细菌可以属于门绿菌门(Chlorobi)，例如微温绿菌(Chlorobium tepidum)。
在一些情况下，与本公开的方法和组合物一起使用的微生物可以包含与已知NifH基因同源的基因。已知NifH基因的序列可以在以下中找到：例如Zehr实验室NifH数据库(在万维网上zehr.pmc.ucsc.ed u/nifH_Database_Public/上，2014年4月4日)或Buckley实验室NifH数据库(在万维网上css.cornell.edu/faculty/buckley/nifh.htm，以及Gab y,John Christian和Daniel H.Buckley."A comprehensive aligned ni fH genedatabase:a multipurpose tool for studies of nitrogen-fixingbacteria."Database2014(2014):bau001.)。在一些情况下，与本公开的方法和组合物一起使用的微生物可以包含编码多肽的序列，其中所述多肽与在Zehr实验室NifH数据库(在万维网上zehr.pmc.ucsc.ed u/nifH_Database_Public/,2014年4月4日)中的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、96％、98％、99％或超过99％的序列同一性。在一些情况下，与本公开的方法和组合物一起使用的微生物可以包含编码多肽的序列，其中所述多肽与在Buckley实验室NifH数据库(Gaby,John Christian,and Daniel H.Buckley."A comprehensive aligned nifH gene database:a multipurpose tool for studiesofnitrogen-fixing bacteria."Database 2014(2014):bau001.)中的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、96％、98％、99％或超过99％的序列同一性。
可以通过以下方式获得可用于本文所公开的方法和组合物中的微生物：从天然植物的表面或组织中提取微生物；研磨种子以分离微生物；在不同的土壤样品中种植种子并从组织中回收微生物；或用外源微生物接种植物并确定哪些微生物出现在植物组织中。植物组织的非限制性实例包括种子、幼苗、叶、插枝、植物、鳞茎或块茎。在一些情况下，从种子中分离细菌。处理样品的参数可以变化以分离不同类型的关联微生物，诸如根际细菌、附生菌或内生菌。细菌也可以源自贮藏室，诸如环境菌株保藏中心，而不是最初从第一株植物中分离而来。通过以下方式可以对微生物进行基因分型和表型分型：对分离的微生物的基因组进行测序；分析植物中群落的组成；表征群落或分离微生物的转录组功能；或使用选择性或表型培养基筛选微生物特征(例如，固氮或磷酸盐增溶表型)。可以通过序列数据；表型数据；植物数据(例如，基因组、表型和/或产量数据)；土壤数据(例如，pH、N/P/K含量和/或大量土壤生物群落)；或这些的任何组合来获得选定的候选菌株或种群。
本文所述的细菌和产生细菌的方法可以适用于能够在叶表面、根表面或植物组织内部有效地自我繁殖而不诱导破坏性植物防御反应的细菌，或对植物防御反应具有抗性的细菌。可以通过在不添加氮的培养基中培养植物组织提取物或叶表面洗液来分离本文所述的细菌。然而，细菌可以是不可培养的，即，使用本领域已知的标准方法不知道是可培养的或是难以培养的。本文所述的细菌可以是内生菌或附生菌或栖息在植物根际的细菌(根际细菌)。在将引入遗传修饰、暴露于多株植物以及从具有改良性状的植物中分离细菌重复一次或多次(例如1次、2次、3次、4次、5次、10次、15次、25次或更多次)之后获得的细菌可以是内生的、附生的或根际的。内生菌是进入植物内部而不会引起疾病症状或引发共生结构形成的生物体，并且具有农学意义，因为它们可以增强植物生长并改善植物的营养(例如，通过固氮)。细菌可以是种子传播的内生菌。种子传播的内生菌包括与草或植物的种子相关或从其来源的细菌，诸如在成熟、干燥、未损伤(例如，没有裂缝、可见的真菌感染或过早发芽)的种子中发现的种子传播的内生菌。种子传播的细菌内生菌可以与种子表面关联或从种子表面来源；可替代地，或另外，它可以与(例如，表面灭菌种子的)内部种子隔室关联或从(例如，表面灭菌种子的)内部种子隔室来源。在一些情况下，种子传播的细菌内生菌能够在植物组织内(例如在种子内部)复制。此外，在一些情况下，种子传播的细菌内生菌能够在干燥条件下存活。
根据本公开的方法分离的或用于本公开的方法或组合物中的细菌可以包含多种不同的细菌分类群的组合。举例来说，细菌可以包括变形菌(Proteobacteria)(诸如假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、窄食单胞菌属(Stenotrophomonas)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、根瘤菌属(Rhizobium)、草螺菌属(Herbaspirillum)、成团泛菌属(Pantoea)、沙雷菌属(Serratia)、拉恩菌属(Rahnella)、固氮螺菌属(Azospirillum)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)、固氮菌属(Azotobacter)、杜擀氏菌属(Duganella)、代尔夫特菌属(Delftia)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiun)、大豆根瘤菌属(Sinorhizobium)和嗜盐单胞菌属(Halomonas))、厚壁菌门(Firmicutes)(诸如芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、乳杆菌属、支原体属(Mycoplasma)和醋酸杆菌属(Acetabacterium))和放线菌属(诸如链霉菌属、红球菌属(Rhodacoccus)、细杆菌属(Microbacterium)和短小杆菌属(Curtobacterium))。本公开的方法和组合物中使用的细菌可以包括两种或更多种物种的固氮细菌聚生体。在一些情况下，细菌聚生体的一种或多种细菌物种可以固氮。在一些情况下，细菌聚生体的一种或多种物种可以促进或增强其他细菌固氮的能力。固定氮的细菌和增强其他细菌固定氮的能力的细菌可以是相同的或不同的。在一些实例中，当与不同的细菌菌株组合，或在某个细菌聚生体中时，细菌菌株能够固定氮，但是不能在单一培养物中固定氮。可以在固氮细菌聚生体中发现的细菌属的实例包括但不限于草螺菌属、固氮螺菌属(Azospirillum)、肠杆菌属(Enterobacter)和芽孢杆菌属。
可以通过本文所公开的方法产生的细菌包括固氮菌属物种、短根瘤菌属(Bradyrhizobium)物种、克雷伯菌属(Klebsiella)物种和中华根瘤菌属(Sinorhizobium)物种。在一些情况下，细菌可以选自由以下组成的组：维涅兰德固氮菌、日本短根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、肺炎克雷伯菌和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)。在一些情况下，细菌可能属于属肠杆菌属或拉恩菌属。在一些情况下，细菌可能属于弗兰克菌属(Frankia)或梭菌属。属梭菌属的细菌的实例包括但不限于丙酮丁醇梭菌、巴斯德梭菌、拜季林斯基梭菌、产气荚膜梭菌和破伤风梭菌。在一些情况下，细菌可以属于属类芽孢杆菌属，例如产氮类芽孢杆菌(Paenibacillus azotofixans)、北方类芽孢杆菌(Paenibacillus borealis)、坚韧类芽孢杆菌(Paenibacillus durus)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、蜂房芽胞杆菌(Paenibacillus alvei)、溶淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus)、坎皮纳斯类芽孢杆菌(Paenibacillus campinasensis)、千叶类芽孢杆菌(Paenibacilluschibensis)、解葡糖类芽孢杆菌(Paenibacillus glucanolyticus)、伊利诺伊类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)、幼虫类芽孢杆菌(Paenibacillus larvae)亚种幼虫、幼虫类芽孢杆菌亚种尘埃(Pulvifaciens)、灿烂类芽孢杆菌(Paenibacillus lautus)、浸麻类芽孢杆菌、马阔里类芽孢杆菌(Paenibacillus macquariensis)、马阔里类芽孢杆菌、饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)、皮尔瑞俄(Paenibacillus peoriae)或多粘类芽孢杆菌。
在一些实例中，根据本公开的方法分离的细菌可以是以下分类群中的一种或多种的成员：无色杆菌属(Achromobacter)、酸硫杆状菌属(Acidithiobacillus)、食酸菌属(Acidovorax)、嗜酸菌属(Acidovoraz)、不动杆菌属(Acinetobacter)、游动放线菌属(Actinoplanes)、Adlercreutzia、气球菌属(Aerococcus)、气单胞菌属(Aeromonas)、阿菲彼亚杆菌属(Afipia)、壤霉菌属(Agromyces)、屈曲杆菌属(Ancylobacter)、节杆菌属(Arthrobacter)、Atopostipes、固氮螺菌属(Azospirillum)、芽孢杆菌属、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)、博斯氏菌属(Bosea)、短根瘤菌属(Bradyrhizobium)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、短波单胞杆菌属(Brevundimonas)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、Candidatus Haloredivivus、柄杆菌属(Caulobacter)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、纤维弧菌属(Cellvibrio)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、梭菌属、珊瑚株菌属(Coraliomargarita)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、贪铜菌属(Cupriavidus)、短小杆菌属(Curtobacterium)、丛毛单胞菌属(Curvibacter)、异常球菌属(Deinococcus)、代尔夫特菌属(Delftia)、德库菌属(Desemzia)、德沃斯氏菌属(Devosia)、独岛杆菌属(Dokdonella)、戴氏菌属(Dyella)、水栖菌属(Enhydrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、埃希氏菌属/志贺菌属(Escherichia/Shigella)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、铁球状菌属(Ferroglobus)、Filimonas、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、黄色土源菌属(Flavisolibacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、寒冷杆菌属(Frigoribacterium)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、盐棒菌属(Halobaculum)、嗜盐单胞菌属(Halomonas)、盐简菌属(Halosimplex)、草螺菌属(Herbaspirillum)、薄层菌属(Hymenobacter)、克雷伯菌属、考克氏菌属(Kocuria)、科萨克氏菌属(Kosakonia)、乳杆菌属(Lactobacillus)、勒克菌属(Leclercia)、伦茨氏菌属(Lentzea)、藤黄色杆菌属(Luteibacter)、藤黄单胞菌属(Luteimonas)、Massilia、中间根瘤菌属(Mesorhizobium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、细杆菌属、微球菌属、(Microvirga)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、诺卡尔菌属(Nocardia)、大洋棒菌属(Oceanibaculum)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、Okibacterium、寡养菌属(Oligotropha)、稻田土壤菌属(Oryzihumus)、Oxalophagus、类芽孢杆菌属、Panteoa、成团泛菌属、污泥单胞菌属(Pelomonas)、Perlucidibaca、植物杆菌属(Plantibacter)、多核杆菌属(Polynucleobacter)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、棒状丙酸菌(Propioniciclava)、假棍状杆菌属(Pseudoclavibacter)、假单胞菌属、假诺卡菌属(Pseudonocardia)、假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、青枯属(Ralstonia)、(Rheinheimera)、根瘤菌属、红球菌属(Rhodococcus)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、玫瑰色半光合菌属(Roseateles)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、塞巴鲁德氏菌属(Sebaldella)、沉积物芽盹杆菌属(Sediminibacillus)、沉积物杆状菌属(Sediminibacterium)、沙雷菌属、志贺菌属(Shigella)、申氏杆菌属(Shinella)、中华根瘤菌属、中华孢囊菌属(Sinosporangium)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、鞘氨醇盒菌属(Sphingopyxis)、鞘氨醇孢菌属(Sphingosinicella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、寡养单胞菌属(25Stenotrophomonas)、寡养单胞菌属(Strenotrophomonas)、链球菌属、链霉菌属、憎叶菌属(Stygiolobus)、硫磺球形菌属(Sulfurisphaera)、塔特姆菌属(Tatumella)、Tepidimonas、热单胞菌属(Thermomonas)、硫杆菌属(Thiobacillus)、贪噬菌属(Variovorax)、WPS-2genera incertae sedis、黄单胞菌属(Xanthomonas)和Zimmermannella。
细菌可以获得自任何一般陆地环境，包括其土壤、植物、真菌、动物(包括无脊椎动物)和其他生物群，包括沉积物、水、以及湖泊和河流生物群；获得自海洋环境，其生物群和沉积物(例如海水、海泥、海洋植物、海洋无脊椎动物(例如海绵动物)、海洋脊椎动物(例如鱼))；陆地和海洋岩石圈(风化层和岩石，例如破碎的地下岩石、沙子和粘土)；冰冻圈及其融水；大气(例如，过滤后的空气尘埃、云和雨滴)；城市、工业和其他人造环境(例如，在混凝土、路边排水沟、屋顶表面和道路表面上积累的有机物质和矿物质)。
获得细菌的植物可以是具有一种或多种所需性状的植物，例如在特定环境中或在某些感兴趣的条件下自然生长的植物。举例来说，某种植物可以在高盐度的沙土或沙粒中、或在极端温度下、或在缺水的情况下自然生长，或者其可以抵抗环境中存在的某些害虫或疾病，并且其对于在此类条件(特别是如果它们是例如在特定地理位置唯一可用的条件时)下种植经济作物可能是理想的。进一步举例来说，细菌可以收集自在此类环境中生长的经济作物，或更具体地收集自在任何特定环境中生长的作物中最好地显示感兴趣的性状的个体作物植物：例如，在限盐土壤中生长的作物中生长最快的植物、或暴露于严重虫害或疾病流行的作物中受损最少的植物、或具有所需数量的某些代谢物和其他化合物(包括纤维含量、油含量等)的植物、或显示所需的颜色、味道或气味的植物。细菌可以收集自感兴趣的植物或在感兴趣的环境中出现的任何材料，包括真菌和其他动物和植物生物群、土壤、水、沉积物和如先前所述的其他环境元素。
可以从植物组织中分离细菌。这种分离可以从植物中任何合适的组织(包括例如根、茎和叶以及植物生殖组织)发生。举例来说，从植物中分离的常规方法通常包括对感兴趣的植物材料(例如根或茎的长度、叶子)进行无菌切除，用适当的溶液(例如2％次氯酸钠)进行表面灭菌，然后将植物材料置于营养培养基上供微生物生长。可替代地，可以在无菌液体(通常是水)和液体悬浮液中压碎表面灭菌的植物材料，包括散布在合适的固体琼脂培养基或培养基(该培养基可以或可以不是选择性的(例如，仅含有植酸作为磷的来源))表面上的压碎的植物材料的小块。这种方法对于形成分离菌落的细菌特别有用，可以单独挑选以分离营养培养基板，并通过熟知的方法进一步纯化为单一物种。可替代地，植物根或叶样品不能进行表面灭菌，而只能轻轻清洗，从而在分离过程中包括表面栖息的附生微生物，或者可以通过印记和剥离在琼脂培养基的表面上的小块的植物根、茎或叶并且然后如上所述分离单独的菌落来单独分离附生微生物。例如，这种方法对细菌特别有用。可替代地，可以在不洗掉附着在根部的少量土壤的情况下处理根部，从而包括在植物根际定殖的微生物。否则，可以将粘附在根上的土壤去除、稀释并铺展到合适的选择性和非选择性培养基的琼脂上，以分离根际细菌的单独菌落。
水拉恩菌和Enterobacter sacchari的生物纯的培养物于2015年7月14日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC；国际保藏机构)(Manassas,VA,USA)，并且分别指定ATTC专利保藏指定号PTA-122293和PTA-122294。这些保藏是根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约和实施细则(布达佩斯条约(Budapest Treaty))的规定进行的。
组合物
包含根据本文所述的方法产生的和/或具有如本文所述的特征的细菌或细菌种群的组合物可以是液体、泡沫或干燥产品的形式。在一些实例中，包含细菌种群的组合物可以是干粉、粉末和水的浆液或可流动的种子处理剂的形式。
所述组合物可以在生物反应器(诸如连续搅拌罐反应器、分批反应器)和在农场制造。在一些实例中，所述组合物可以储存在容器(诸如罐或小型货舱)中。在一些实例中，组合物可以储存在选自由以下组成的组的物体内：瓶、罐、安瓿、包装、器皿、袋、盒、箱、信封、纸板箱、容器、筒仓、运输容器、卡车床和/或机箱。
组合物还可以用于改善植物性状。在一些实例中，可以将一种或多种组合物包被到种子上。在一些实例中，可以将一种或多种组合物涂覆到幼苗上。在一些实例中，可以将一种或多种组合物包被到种子的表面上。在一些实例中，可以将一种或多种组合物作为种子表面上方的层包被。在一些实例中，包被到种子上的组合物可以呈液体形式、呈干燥产品形式、呈泡沫形式、呈粉末和水的浆液形式或为可流动的种子处理剂。在一些实例中，可以通过用一种或多种组合物喷洒、浸渍、包衣、包囊和/或撒粉种子和/或幼苗来将一种或多种组合物施用至种子和/或幼苗上。在一些实例中，可以将多种细菌或细菌种群包被到植物的种子和/或幼苗上。在一些实例中，细菌组合中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或超过十种细菌可以选自以下属中的一种：食酸菌属、土壤杆菌属(Agrobacterium)、芽孢杆菌属、伯克霍尔德菌属、金黄杆菌属、短小杆菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、甲基杆菌属、类芽孢杆菌属、成团泛菌属、假单胞菌属、青枯菌属、糖芽孢杆菌属(Saccharibacillus)、鞘氨醇单胞菌属和寡养单胞菌属。
在一些实例中，内生菌组合中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或超过十种细菌和细菌种群选自以下科中的一种：芽孢杆菌科(Bacillaceae)、伯克霍尔德菌科(Burkholderiaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、类芽孢杆菌科(Paenibacillileae)、假单胞菌科(Pseudomonnaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、鞘氨醇单胞菌科(Sphingomonadaceae)、黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)、Cladosporiaceae、日规壳菌科(Gnomoniaceae)、螺旋藻(Incertae sedis)、毛球壳科(Lasiosphaeriaceae)、Netriaceae和假球壳科(Pleosporaceae)。
在一些实例中，内生菌组合中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或超过十种细菌和细菌种群选自以下科中的一种：芽孢杆菌科、伯克霍尔德菌科、丛毛单胞菌科、肠杆菌科、黄杆菌科、甲基杆菌科、微杆菌科、类芽孢杆菌科、假单胞菌科、根瘤菌科、鞘氨醇单胞菌科、黄单胞菌科、Cladosporiaceae、日规壳菌科、螺旋藻、毛球壳科、Netriaceae假球壳科。
组合物的实例可以包括用于商业上重要的农业作物(例如高粱、芸苔、番茄、草莓、大麦、水稻、玉米和小麦)的种子包衣。组合物的实例还可以包括用于玉米、大豆、芸苔、高粱、土豆、水稻、蔬菜、谷物和油籽的种子包衣。如本文所提供的种子可以是遗传修饰的生物体(GMO)的、非GMO的、有机的或常规的。在一些实例中，可以将组合物喷洒在植物地上部分，或通过插入种植植物种子的犁沟中、浇灌土壤或将根浸入组合物的悬浮液中而施用至根部。在一些实例中，可以将组合物以维持细胞活力和人工接种和定殖宿主植物的能力的合适方式脱水。细菌物种可以以108至1010CFU/ml之间的浓度存在于组合物中。在一些实例中，组合物可以补充有痕量金属离子，诸如钼离子、铁离子、锰离子或这些离子的组合。如本文所述的组合物的实例中的离子浓度可以在约0.1mM与约50mM之间。组合物的一些实例也可以与载体一起配制，所述载体诸如β-葡聚糖、羧甲基纤维素(CMC)、细菌细胞外聚合物质(EPS)、糖、动物乳或其他合适的载体。在一些实例中，可以将泥炭或种植材料用作载体，或者可以将其中组合物被包埋在生物聚合物中的生物聚合物用作载体。
可以将包含本文所述的细菌种群的组合物包被在种子表面上。因此，还考虑了包含用本文所述的一种或多种细菌包被的种子的组合物。可以通过将细菌种群与多孔的、化学惰性的颗粒载体混合来形成种子包衣。可替代地，可以将组合物直接插入种植种子的犁沟中或喷洒到植物叶子上或通过将根浸入组合物的悬浮液中来施用。可以将有效量的组合物用于填充与具有活细菌生长的植物的根部相邻的底土区域，或填充具有活细菌生长的植物的叶子。一般而言，有效量是足以产生具有改良性状(例如所需固氮水平)的植物的量。
可以使用农业上可接受的载体来配制本文所述的细菌组合物。可用于这些实施方案的制剂可以包括选自由以下组成的组的至少一种成员：增粘剂、微生物稳定剂、杀真菌剂、抗细菌剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、抗复合剂、除草剂、杀线虫剂、杀昆虫剂、植物生长调节剂、肥料、杀鼠剂、干燥剂、杀细菌剂、营养素或其任何组合。在一些实例中，组合物可以是货架稳定的。例如，任何本文所述的组合物可以包括农业上可接受的载体(例如，一种或多种肥料(诸如非天然存在的肥料)、粘合剂(诸如非天然存在的粘合剂)以及杀虫剂(诸如非天然存在的杀虫剂))。非天然存在的粘合剂可以是例如聚合物、共聚物或合成蜡。例如，任何本文所述的包衣种子、幼苗或植物可以在种子包衣中含有这样的农业上可接受的载体。在任何本文所述的组合物或方法中，农业上可接受的载体可以是或可以包括非天然存在的化合物(例如，非天然存在的肥料、非天然存在的粘合剂(诸如聚合物、共聚物或合成蜡)或非天然存在的杀虫剂)。下面描述农业上可接受的载体的非限制性实例。农业上可接受的载体的另外实例在本领域中是已知的。
在一些情况下，将细菌与农业上可接受的载体混合。载体可以是固体载体或液体载体，并且呈各种形式，包括微球、粉末、乳液等。载体可以是赋予多种性质(例如增加的稳定性、润湿性或分散性)的许多种载体中的任何一种或多种。润湿剂诸如天然或合成的表面活性剂(其可以为非离子或离子表面活性剂)或它们的组合可以包含在组合物中。油包水乳液还可以用于配制包括分离细菌的组合物(参见例如美国专利号7,485,451)。可以制备的合适制剂包括可湿性粉剂、颗粒剂、凝胶剂、琼脂条或丸粒、增稠剂及类似物、微囊化颗粒及类似物、液体诸如水性流动剂、水性悬浮液、油包水乳剂等。制剂可以包括谷物或豆类产品，例如磨碎的谷物或豆类、从谷物或豆类来源的肉汤或面粉、淀粉、糖或油。
在一些实施方案中，农业载体可以是土壤或植物生长培养基。可以使用的其他农业载体包括水、肥料、基于植物的油、保湿剂或它们的组合。可替代地，农业载体可以是固体，诸如硅藻土、壤土、硅土、藻酸盐、粘土、膨润土、蛭石、种子壳、其他植物和动物产品、或组合(包括颗粒、丸粒或悬浮液)。任何上述成分的混合物也被考虑作为载体，诸如但不限于在壤土、沙子或粘土等中的pesta(面粉和高岭土)、基于琼脂或面粉的丸粒。制剂可以包括用于细菌的食物来源，诸如大麦、大米或其他生物材料(诸如种子、植物部分、甘蔗渣、来自谷物加工的外皮或茎、磨碎的植物材料或来自建筑工地垃圾的木材、锯末或来自纸张回收的小纤维、织物或木材。
例如，肥料可以用于帮助促进种子、幼苗或植物的生长或为其提供营养。肥料的非限制性实例包括氮、磷、钾、钙、硫、镁、硼、氯化物、锰、铁、锌、铜、钼和硒(或其盐)。肥料的另外实例包括一种或多种氨基酸、盐、碳水化合物、维生素、葡萄糖、NaCl、酵母提取物、NH4H2PO4、(NH4)2SO4、甘油、缬氨酸、L-亮氨酸、乳酸、丙酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、KH酒石酸盐、木糖、来苏糖和卵磷脂。在一个实施方案中，制剂可以包括增粘剂或粘合剂(adherent)(称为粘合剂(adhesive agent))以帮助将其他活性剂粘合到物质(例如种子的表面)上。此类药剂可用于将细菌与可以含有其他化合物的载体(例如，非生物的控制剂)组合以产生包衣组合物。此类组合物有助于在植物或种子周围产生包衣以维持微生物和其他药剂与植物或植物部分之间的接触。在一个实施方案中，粘合剂选自由以下组成的组：藻酸盐、树胶、淀粉、卵磷脂、刺芒柄花素、聚乙烯醇、碱金属刺芒柄花素(alkali formononetinate)、橙皮素、聚乙烯醋酸酯、脑磷脂、阿拉伯树胶(Gum Arabic)、黄原胶、矿物油、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、阿拉伯半乳聚糖、甲基纤维素、PEG 400、壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚丙烯腈、甘油、三乙二醇、醋酸乙烯酯、结冷胶、聚苯乙烯、聚乙烯、羧甲基纤维素、印度树胶、以及聚氧乙烯-聚氧丁烯嵌段共聚物。
在一些实施方案中，粘合剂可以是例如蜡(诸如巴西棕榈蜡、蜂蜡、中国蜡、紫胶蜡、鲸蜡、小烛树蜡、蓖麻蜡(castor wax)、小冠巴西棕榈蜡(ouricury wax)和米糠蜡)、多糖(例如,淀粉、糊精、麦芽糊精、藻酸盐和壳聚糖)、脂肪、油、蛋白质(例如明胶和玉米醇溶蛋白)、阿拉伯树胶(gum arables)和虫胶。粘合剂可以是非天然存在的化合物，例如聚合物、共聚物和蜡。例如，可以用作粘合剂的聚合物的非限制性实例包括：聚乙烯乙酸酯、聚乙烯乙酸酯共聚物、乙烯乙酸乙烯酯(EVA)共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物、纤维素(例如，乙基纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素和羧甲基纤维素)、聚乙烯吡咯烷酮、氯乙烯、偏二氯乙烯共聚物、木素磺酸钙、丙烯酸共聚物、聚乙烯丙烯酸酯、聚环氧乙烷、丙烯胺聚合物和共聚物、聚羟乙基丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺单体和聚氯丁二烯。
在一些实例中，粘合剂、抗真菌剂、生长调节剂和杀虫剂(例如，杀昆虫剂)中的一种或多种是非天然存在的化合物(例如，以任何组合)。农业上可接受的载体的另外实例包括分散剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮/乙烯乙酸酯PVPIVA S-630)、表面活性剂、粘合剂和填充剂。
制剂还可以含有表面活性剂。表面活性剂的非限制性实例包括氮表面活性剂共混物，诸如Prefer 28(Cenex)、Surf-N(US)、Inhance(Brandt)、P-28(Wilfarm)和Patrol(Helena)；酯化种子油包括Sun-It II(AmCy)、MSO(UAP)、Scoil(Agsco)、Hasten(Wilfarm)和Mes-100(Drexel)；并且有机硅表面活性剂包括Silwet L77(UAP)、Silikin(Terra)、Dyne-Amic(Helena)、Kinetic(Helena)、Sylgard 309(Wilbur-Ellis)和Century(Precision)。在一个实施方案中，表面活性剂以0.01％v/v至10％v/v之间的浓度存在。在另一个实施方案中，表面活性剂以0.1％v/v至1％v/v之间的浓度存在。
在某些情况下，制剂包括微生物稳定剂。这样的药剂可以包括干燥剂，其可以包括可归类为干燥剂的任何化合物或化合物的混合物，而不管所述一种或多种化合物是否以它们实际上对液体接种剂具有干燥作用的这种浓度使用。此类干燥剂与所使用的细菌种群理想地相容，并且应当促进微生物种群在种子上施用时存活和干燥时存活的能力。合适的干燥剂的实例包括海藻糖、蔗糖、甘油和甲二醇中的一种或多种。其他合适的干燥剂包括但不限于非还原糖和糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)。引入制剂中的干燥剂的量可以在约5％至约50％重量/体积的范围内，例如在约10％至约40％之间、在约15％至约35％之间或在约20％至约30％之间。在一些情况下，制剂含有诸如杀真菌剂、抗细菌剂、除草剂、杀线虫剂、杀昆虫剂、植物生长调节剂、杀鼠剂、杀细菌剂或营养素等药剂是有利的。在一些实例中，药剂可以包括提供针对种子表面传播病原体的保护的保护剂。在一些实例中，保护剂可以提供一定水平的对土壤传播的病原体的控制。在一些实例中，保护剂可能主要在种子表面上有效。
在一些实例中，杀真菌剂可以包括可以抑制真菌生长或杀死真菌的化合物或药剂，无论是化学的还是生物的。在一些实例中，杀真菌剂可以包括可以抑制真菌或杀真菌的化合物。在一些实例中，杀真菌剂可以是保护剂或主要在种子表面上有效的药剂，提供针对种子表面传播病原体的保护并提供一定水平的对土壤传播病原体的控制。保护性杀真菌剂的非限制性实例包括克菌丹、代森锰、福美双或咯菌腈。
在一些实例中，杀真菌剂可以是系统性杀真菌剂，其可以被吸收到出苗的幼苗中并抑制或杀死宿主植物组织内部的真菌。用于种子处理的系统性杀真菌剂包括但不限于以下各项：腈嘧菌酯、萎锈灵、精甲霜灵、甲霜灵、噻苯咪唑、肟菌酯、以及各种三唑类杀真菌剂(包括苯醚甲环唑、种菌唑、戊唑醇和灭菌唑)。精甲霜灵和甲霜灵主要用于靶向水霉真菌腐霉菌属(Pythium)和疫霉属(Phytophthora)。取决于植物物种，一些杀真菌剂优于其他杀真菌剂，这是因为致病真菌物种敏感性的细微差异或者是因为杀真菌剂分布或植物敏感性的差异。在一些实例中，杀真菌剂可以是生物防治剂，诸如细菌或真菌。此类生物体可以寄生于病原真菌上，或分泌毒素或可以杀死或以其他方式阻止真菌生长的其他物质。任何类型的杀真菌剂(尤其是通常用于植物上的杀真菌剂)都可以用作种子组合物中的防治剂。
在一些实例中，种子包衣组合物包含具有抗细菌特性的防治剂。在一个实施方案中，具有抗细菌特性的防治剂选自本文别处描述的化合物。在另一个实施方案中，化合物是链霉素、土霉素、奥索利酸或庆大霉素。可以用作种子包衣组合物的一部分的抗细菌化合物的其他实例包括基于双氯酚和苯甲醇半缩甲醛的那些(来自ICI的
Figure BDA0003316941220000631
或来自ThorChemie的
Figure BDA0003316941220000632
RS和来自Rohm&Haas的
Figure BDA0003316941220000633
MK 25)和异噻唑啉酮衍生物诸如烷基异噻唑啉酮和苯并异噻唑啉酮(来自Thor Chemie的
Figure BDA0003316941220000634
MBS)。
在一些实例中，生长调节剂选自由以下组成的组：脱落酸、甲草胺、ancymidol、6-苄氨基嘌呤、芸苔素内酯、仲丁灵、矮壮素(矮壮素氯化物)、氯化胆碱、环烷基酰苯胺、丁酰肼、调呋酸、噻节因、2,6-二甲基嘌呤、乙烯利、氟节胺(flumetralin)、呋嘧醇、嗪草酸甲酯、调吡脲、赤霉酸、抗倒胺、吲哚-3-乙酸、马来酸酰肼、氟草磺、甲哌嗡(甲哌嗡氯化物)、萘乙酸、N-6-苄基腺嘌呤、多效唑、调环酸、三硫代磷酸酯、2,3,5-三-碘代苯甲酸、抗倒酯(trinexapac-ethyl)和烯效唑。生长调节剂的另外非限制性实例包括芸苔素类固醇、细胞分裂素(例如，激动素和玉米素)、植物生长素(例如，吲哚乙酸和吲哚乙酰天冬氨酸)、黄酮类化合物和异黄酮类化合物(例如，刺芒柄花素和香叶木素)、植物抗毒素(phytoaixins)(例如，大豆抗毒素(glyceolline))，以及植物抗毒素诱导的寡糖(例如，果胶、壳多糖、壳聚糖、聚半乳糖醛酸和寡聚半乳糖醛酸)和赤霉素。此类药剂与施用过制剂的的农业种子或幼苗理想地相容(例如，它不应对植物的生长或健康有害)。此外，所述药剂理想地是一种不会引起人类、动物或工业用途的安全问题(例如，没有安全性问题，或者所述化合物足够不稳定以致于源自该植物的商品植物产品含有可忽略量的所述化合物)。
线虫类拮抗生物防治剂的一些实例包括ARF18；30线虫捕捉菌属(Arthrobotrys)物种；黑毛菌属(Chaetomium)物种；柱孢属(Cylindrocarpon)物种；外瓶霉属(Exophilia)物种；镰刀菌属(Fusarium)物种；胶霉属(Gliocladium)物种；被毛孢菌属(Hirsutella)物种；刀孢轮枝菌属(Lecanicillium)物种；单顶孢属(Monacrosporium)物种；漆斑菌属(Myrothecium)物种；新赤壳属(Neocosmospora)物种；拟青霉属(Paecilomyces)物种；普可尼亚菌属(Pochonia)物种；壳多孢属(Stagonospora)物种；泡囊丛枝菌根真菌(vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)物种；巴斯德氏菌属(Pasteuria)物种、短芽孢杆菌属物种；假单胞菌属物种；和根际细菌。特别优选的线虫类拮抗生物防治剂包括ARF18、少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)、指状节丛孢菌(Arthrobotrys dactyloides)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、异丝藻柱孢霉(Cylindrocarpon heteronema)、甄氏外瓶霉(Exophilia jeanselmei)、嗜鱼外瓶霉(Exophilia pisciphila)、黄曲霉镰刀菌(Fusarium aspergilus)、腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)、链孢粘帚霉(Gliocladium catenulatum)、粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)、雌狐粘帚霉(Gliocladium vixens)、洛斯里被毛孢(Hirsutella rhossiliensis)、明尼苏达被毛孢(Hirsutella minnesotensis)、蜡蚧轮枝菌(Lecanicillium lecanii)、掘氏单顶孢(Monacrosporium drechsleri)、Monacrosporium gephyropagum、疣孢漆斑菌(Myrotehcium verrucaria)、侵管新赤壳菌(Neocosmospora vasinfecta)、淡紫拟青霉菌(Paecilomyces lilacinus)、厚垣普可尼亚菌(Pochonia chlamydosporia)、异皮壳多孢(Stagonospora heteroderae)、菜豆壳多孢(Stagonospora phaseoli)、泡囊丛枝菌根真菌、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、穿刺巴斯德氏菌(Pasteuriapenetrans)、多刺巴斯德氏菌(Pasteuria thornei)、牡荆碱巴斯德氏菌(Pasteurianishizawae)、分支巴斯德氏菌(Pasteuria ramosa)、(Pastrueia usage)、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)菌株G4、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和根际细菌。
营养素的一些实例可以选自氮肥，包括但不限于尿素、硝酸铵、硫酸铵、无压氮溶液、水性氨、无水氨、硫代硫酸铵、硫包衣尿素、尿素-甲醛、IBDU、聚合物包衣尿素、硝酸钙、脲醛(Ureaform)和亚甲基尿素；磷肥诸如磷酸氢二铵、磷酸二氢一铵、聚磷酸铵、浓过磷酸盐和三重过磷酸盐；以及钾肥诸如氯化钾、硫酸钾、硫酸镁钾、硝酸钾。此类组合物可以在种子包衣组合物内作为游离盐或离子存在。可替代地，可以将营养素/肥料络合或螯合以提供随时间持续释放。
杀鼠剂的一些实例可以包括选自由以下物质组成的组：2-异戊酰茚满-1,3-二酮、4-(喹噁啉-2-基氨基)苯磺酰胺、α-氯乙醇、磷化铝、安妥(antu)、氧化亚砷、碳酸钡、双鼠脲、溴鼠灵、溴敌隆、溴鼠胺、氰化钙、氯醛糖、氯敌鼠、胆骨化醇、氯灭鼠灵、克鼠灵、杀鼠醚、杀鼠嘧、鼠得克、噻鼠灵、敌鼠、麦角钙化醇、氟鼠灵、氟乙酰胺、氟鼠啶、氟鼠啶盐酸盐、氰化氢、碘代甲烷、林旦、二磷化三镁、甲基溴化物、鼠特灵、毒鼠磷、磷化氢、磷、鼠完、亚砷酸钾、灭鼠优、红海葱苷、亚砷酸钠、氰化钠、氟乙酸钠、士的宁、硫酸铊、华法林和磷化锌。
在液体形式(例如溶液或悬浮液)中，可以将细菌种群混合或悬浮在水或水性溶液中。合适的液体稀释剂或载体包括水、水性溶液、石油馏出物或其他液体载体。
固体组合物可以通过将细菌种群分散在适当分开的固体载体之中和之上来制备，所述固体载体诸如泥炭、小麦、麸皮、蛭石、粘土、滑石、膨润土、硅藻土、漂白土、巴氏消毒的土壤等。当此类制剂用作可湿性粉剂时，可以使用生物相容性分散剂，诸如非离子、阴离子、两性离子或阳离子分散剂和乳化剂。
配制时使用的固体载体包括例如矿物载体诸如高岭土、叶蜡石、膨润土、蒙脱石、硅藻土、酸性白土、蛭石和珠光体；以及无机盐诸如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、尿素、氯化铵和碳酸钙。此外，可以使用有机细粉，诸如小麦粉、麦麸和米糠。液体载体包括植物油(诸如大豆油和棉籽油)、甘油、乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、聚丙二醇等。
细菌种群在作物上的应用
本文所述的细菌或细菌种群的组合物可以在犁沟中、在滑石粉中或作为种子处理施用。在一些实施方案中，本文所述的细菌或细菌种群的组合物可以间接施用于植物。在一些实施方案中，本文所述的细菌或细菌种群的组合物可以作为拌种剂施用。间接地和/或作为拌种剂施用细菌或细菌种群可以包括将细菌或细菌种群施用于沿着植物侧旁的浅犁沟或带或在植物周围的圆圈中。可以将组合物或细菌种群以散装、小散装、袋装或以滑石粉的形式施用于种子包装。
可以在种植植物种子之后但在收获之前施用本文所述的细菌或细菌种群的组合物。例如，组合物或细菌种群可以在发芽后一个月与八个月之间(包括发芽后二个月与八个月之间、一个月与三个月之间以及三个月与六个月之间)施用。
种植者可以根据常规方式、双行、或不需要耕作的方式种植处理过的种子并使作物生长。可以使用控制漏斗或单独的漏斗分配种子。也可以使用加压空气或手动分配种子。可以使用可变速率技术进行种子放置。此外，可以使用可变速率技术来施用本文所述的细菌或细菌种群。在一些实例中，可以将细菌施用于玉米、大豆、芸苔、高粱、土豆、水稻、蔬菜、谷物、假谷物和油籽的种子上。谷物的实例可以包括大麦、福尼奥米(fonio)、燕麦、长芒苋(palmer’s grass)、黑麦、珍珠粟、高粱、斯佩尔特小麦(spelt)、画眉草、黑小麦和小麦。假谷物的实例可以包括面包坚果(breadnut)、荞麦、香蒲、奇亚籽(chia)、亚麻、谷粒苋、hanza、奎藜籽(quinoa)和芝麻。在一些实例中，种子可以是遗传修饰生物体(GMO)的、非GMO的、有机的或常规的。
另外，可以使用添加剂诸如微肥、PGR、除草剂、杀昆虫剂和杀真菌剂对作物进行处理。添加剂的实例包括作物保护剂，诸如杀昆虫剂、杀线虫剂、杀真菌剂；增强剂，诸如着色剂、聚合物、造粒剂、底漆和消毒剂；以及其他药剂，诸如接种剂、PGR、软化剂和微量营养素。PGR可以是影响根部生长、开花或茎伸长的天然或合成植物激素。PGR可以包括植物生长素、赤霉素、细胞分裂素、乙烯和脱落酸(ABA)。
所述组合物可以与液体肥料组合施用于犁沟中。在一些实例中，可以将液体肥料保存在罐中。NPK肥料含有钠、磷和钾等大量营养素。
所述组合物可以改善植物性状，诸如促进植物生长、保持叶子中的高叶绿素含量、增加果实或种子数量、以及增加果实或种子单位重量。可以将本公开的方法用于引入或改善多种所需性状中的一种或多种。可以引入或改良的性状的实例包括：根生物量、根长、高度、枝条长度、叶数、水分利用效率、总生物量、产量、果实大小、谷物大小、光合作用速率、对干旱的耐受性、热量耐受性、盐分耐受性、对低氮胁迫的耐受性、氮利用效率、对线虫胁迫的抗性、对真菌病原体的抗性、对细菌病原体的抗性、对病毒病原体的抗性、代谢物水平、代谢物水平的调节、蛋白质组表达。理想的性状(包括高度、总生物量、根和/或枝条生物量、种子发芽、幼苗存活、光合效率、蒸腾速率、种子/果实数量或质量、植物籽粒或果实产量、叶的叶绿素含量、光合速率、根长或它们的任何组合)可以用于测量生长，并且与在相同条件下生长的参考农业植物(例如，没有引入和/或改良性状的植物)的生长速率进行比较。在一些实例中，理想的性状(包括高度、总生物量、根和/或枝条生物量、种子发芽、幼苗存活、光合效率、蒸腾速率、种子/果实数量或质量、植物籽粒或果实产量、叶的叶绿素含量、光合速率、根长或它们的任何组合)可以用于测量生长，并且与在相似条件下生长的参考农业植物(例如，没有引入和/或改良性状的植物)的生长速率进行比较。
宿主植物的农艺性状可以包括但不限于以下：与从没有所述种子处理制剂的种子生长而来的植物等值线相比，改变的油含量、改变的蛋白质含量、改变的种子碳水化合物组成、改变的种子油组成和改变的种子蛋白质组成、化学耐受性、寒冷耐受性、衰老延迟、抗病性、干旱耐受性、穗重、生长改善、健康增强、耐热性、除草剂耐受性、食草动物抗性、改善的固氮、改善的氮利用、改善的根部结构、改善的水分利用效率、增加的生物量、增加的根长、增加的种子重量、增加的芽长、增加的产量、在水分限制条件下增加的产量、籽粒质量、籽粒水分含量、金属耐受性、穗数、每穗籽粒数、豆荚数、营养增强、病原体抗性、害虫抗性、光合能力提高、耐盐性、保持绿色、活力提高、增加的成熟种子干重、增加的成熟种子鲜重、每株植物成熟种子数增加、叶绿素含量增加、每株植物豆荚数增加、每株植物豆荚长度增加、每株植物枯萎叶子数减少、每株植物严重枯萎叶子数减少和每株植物非枯萎叶子数增加、代谢物水平的可检测调节、转录物水平的可检测调节和蛋白质组的可检测调节。
在一些情况下，植物接种了细菌或细菌种群，所述细菌或细菌种群从与接种植物的植物要素相同的植物物种中分离出来。例如，通常在一个玉蜀黍(玉米)品种中发现的细菌或细菌种群与在其自然状态下缺乏所述细菌和细菌种群的另一个玉蜀黍品种的植物的植物要素相关联。在一个实施方案中，细菌和细菌种群源自作为接种植物的植物要素的相关植物物种的植物。例如，将通常在二倍体多年生类玉米(Zea diploperennis)(Iltis等人，二倍体多年生大刍草)中发现的细菌和细菌种群施用于玉蜀黍(玉米)，反之亦然。在一些情况下，植物接种了对于接种植物的植物要素而言异源的细菌和细菌种群。在一个实施方案中，细菌和细菌种群源自另一个物种的植物。例如，将通常在双子叶植物中发现的细菌和细菌种群施用于单子叶植物(例如，用大豆来源的细菌和细菌种群接种玉米)，反之亦然。在其他情况下，待接种到植物上的细菌和细菌种群源自正在进行接种的植物的相关物种。在一个实施方案中，细菌和细菌种群源自相关分类群，例如来自相关物种。另一物种的植物可以是农业植物。在另一个实施方案中，细菌和细菌种群是接种到任何宿主植物要素中的设计组合物的一部分。
在一些实例中，细菌或细菌种群是外源的，其中从与接种植物不同的植物中分离所述细菌和细菌种群。例如，在一个实施方案中，可以从与接种植物相同物种的不同植物中分离细菌或细菌种群。在一些情况下，可以从与接种植物相关的物种中分离所述细菌或细菌种群。
在一些实例中，本文所述的细菌和细菌种群能够从一种组织类型移动到另一种组织类型。例如，本发明在种子外部包被之后对植物成熟组织内的细菌和细菌种群的检测和分离证明了它们从种子外部移动到成熟植物的营养组织中的能力。因此，在一个实施方案中，细菌和细菌种群的群体能够从种子外部移动到植物的营养组织中。在一个实施方案中，包被在植物种子上的细菌和细菌种群能够在种子萌发成营养状态时定位于植物的不同组织。例如，细菌和细菌种群能够定位于植物中的任何一种组织，包括：根、不定根、种子根、根毛、枝条、叶、花、芽、雄穗、分生组织、花粉、雌蕊、子房、雄蕊、果实、匍匐茎、根茎、根瘤、块茎、毛状体、保卫细胞、水囊(hydathode)、花瓣、萼片、颖片、花轴、维管形成层、韧皮部和木质部。在一个实施方案中，细菌和细菌种群能够定位于植物的根和/或根毛。在另一个实施方案中，细菌和细菌种群能够定位于光合组织，例如植物的叶子和枝条。在其他情况下，细菌和细菌种群定位于植物的维管组织，例如木质部和韧皮部中。在仍另一个实施方案中，细菌和细菌种群能够定位于植物的生殖组织(花、花粉、雌蕊、子房、雄蕊、果实)。在另一个实施方案中，细菌和细菌种群能够定位于植物的根部、枝条、叶子和生殖组织。在仍另一个实施方案中，细菌和细菌种群定殖于植物的果实或种子组织。在仍另一个实施方案中，细菌和细菌种群能够定殖植物使得其存在于植物的表面中(即，其存在可检测地存在于植物外部或植物的外球上)。在仍其他实施方案中，细菌和细菌种群能够定位于植物的基本上所有或所有组织。在一些实施方案中，细菌和细菌种群不定位于植物的根部。在其他情况下，细菌和细菌种群并不定位于植物的光合组织。
还可以通过测量作物的相对成熟度或作物热单位(crop heating unit，CHU)来评估组合物的有效性。例如，可以将细菌种群施用于玉米，并且可以根据玉米粒的相对成熟度或玉米粒处于最大重量的时间来评估玉米生长。作物热单位(CHU)还可以用于预测玉米作物的成熟度。CHU通过测量作物生长的每日最大温度来确定热积累的量。
在实例中，细菌可以定位于植物中的任何一种组织，包括：根、不定根、种子根、根毛、枝条、叶、花、芽、雄穗、分生组织、花粉、雌蕊、子房、雄蕊、果实、匍匐茎、根茎、根瘤、块茎、毛状体、保卫细胞、水囊(hydathode)、花瓣、萼片、颖片、花轴、维管形成层、韧皮部和木质部。在另一个实施方案中，细菌或细菌种群能够定位于光合组织，例如植物的叶子和枝条。在其他情况下，细菌和细菌种群定位于植物的维管组织，例如木质部和韧皮部中。在另一个实施方案中，细菌或细菌种群能够定位于植物的生殖组织(花、花粉、雌蕊、子房、雄蕊或果实)。在另一个实施方案中，细菌和细菌种群能够定位于植物的根部、枝条、叶子和生殖组织。在另一个实施方案中，细菌或细菌种群定殖于植物的果实或种子组织。在仍另一个实施方案中，细菌或细菌种群能够定殖在植物上，使得其存在于植物表面。在另一个实施方案中，细菌或细菌种群能够定位于植物的基本上所有或所有组织。在一些实施方案中，细菌或细菌种群不定位于植物的根部。在其他情况下，细菌和细菌种群并不定位于植物的光合组织。
可以通过测量作物生长的各种特征来评估施用于作物的细菌组合物的有效性，所述特征包括但不限于种植比率、播种活力、根强度、干旱耐受性、植物高度、干枯(dry down)和测试重量。
植物物种
本文所述的方法和细菌适合用于多种植物中的任一种，诸如在属大麦属(Hordeum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)和小麦科(Triticeae)中的植物。合适植物的其他非限制性实例包括苔藓、地衣和藻类。在一些情况下，植物具有经济、社会和/或环境价值，诸如粮食作物、纤维作物、油料作物、在林业或纸浆和造纸工业中的植物、用于生物燃料生产的原料和/或观赏植物。在一些实例中，植物可以用于生产经济上有价值的产品，诸如谷粒、面粉、淀粉、糖浆、膳食、油、薄膜、包装、营养产品、果肉、动物饲料、鱼饲料、工业化学品的散装材料、谷物产品、加工过的人类食品、糖、酒精和/或蛋白质。作物植物的非限制性实例包括玉蜀黍、水稻、小麦、大麦、高粱、粟、燕麦、黑麦、黑小麦、荞麦、甜玉米、甘蔗、洋葱、番茄、草莓和芦笋。
在一些实例中，可以使用本文所公开的方法和组合物获得或改良的植物可以包括对农业、园艺、用于生产生物燃料分子和其他化学品的生物量和/或林业重要或感兴趣的植物。这些植物的一些实例可以包括菠萝、香蕉、椰子、百合、草香豌豆、苜蓿、粘果酸浆、甜瓜、鹰嘴豆、菊苣、三叶草、羽衣甘蓝、扁豆、大豆、烟草、马铃薯、甘薯、萝卜、卷心菜、油菜、苹果树、葡萄、棉花、向日葵、拟南芥、芸苔、柑橘(包括橙子、蜜桔、金橘、柠檬、酸橙、葡萄柚、橘子、橘柚、枸橼和柚子)、胡椒、豆类、生菜、柳枝稷(Panicum virgatum)(柳枝稷(switch))、双色高粱(Sorghum bicolor)(高粱、苏丹)、奇岗(Mi scanthus giganteus)(芒草(miscanthus))、甘蔗属(Saccharum)物种(能源蔗(energycane))、香脂杨(Populusbalsamifera)(杨树)、玉蜀黍(Zea ma ys)(玉米)、黄豆(Glycine max)(大豆)、欧洲油菜(Brassica napus)(芸苔(canola))、小麦(Triticum aestivum)(小麦(wheat))、陆地棉(Gossypium hirsutum)(棉花)、水稻(Oryza sativa)(水稻)、葵花(Helianthus annuus)(向日葵)、紫花苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿)、甜菜(Beta vulgaris)(糖用甜菜(sugarbeet))、珍珠粟(Pennisetum glaucum)(珍珠粟(pearl mille t))、黍属(Panicum)物种、高粱属(Sorghum)物种、芒属(Miscanthus)物种、甘蔗属(Saccharum)物种、蔗茅属(Erianthus)、杨属(Populus)物种、黑麦(Secale cereale)(黑麦(rye))、柳属(Salix)物种(柳树)、桉树属(Euc alyptus)物种(桉树)、小黑麦属(Triticosecale)物种(小麦属-25小麦X黑麦)、竹、红花(Carthamus tinctorius)(红花(safflower))、麻风树(Jatrop hacurcas)(麻风树(Jatropha))、蓖麻(Ricinus communis)(蓖麻(castor))、油椰(Elaeisguineensis)(油棕(oil palm))、海枣(Phoenix dactylifera)(椰枣树)、阔叶假槟榔(Archontophoenix cunninghamiana)(假槟榔(king palm))、金山葵(Syagrusromanzoffiana)(皇后葵(queen palm))、栽培亚麻(Linum usitatissimum)(亚麻(flax))、芥菜(Brassica juncea)、木薯(Ma nihot esculenta)(木薯(cassaya))、食用番茄(Lycopersicon esculentum)(番茄)、莴苣(Lactuca saliva)(生菜)、大蕉(Musaparadisiaca)(香蕉)、马铃薯(Solanum tuberosum)(土豆(potato))、甘蓝(Brassicaoleracea)(绿花椰菜、花椰菜、抱子甘蓝)、山茶(Camellia sinensis)(茶)、松草莓(Fragaria ananassa)(草莓)、可可树(Theobroma cacao)(可可)、阿拉伯咖啡(Coffeaarabica)(咖啡)、葡萄(Vitis vinifera)(葡萄(grape))、菠萝(An anas comosus)(菠萝(pineapple))、辣椒(Capsicum annum)(辣椒和甜椒)、洋葱头(Allium cepa)(洋葱)、甜瓜(Cucumis melo)(甜瓜(melon))、黄瓜(Cucumis sativus)(黄瓜(cucumber))、笋瓜(Cucurbita maxima)(南瓜(squash))、倭瓜(Cucurbita moschata)(南瓜(squash))、菠菜(Spinacea oleracea)(菠菜(spinach))、西瓜(Citrullus lanatus)(西瓜(watermelon))、咖啡黄葵(Abelmoschus esculentus)(秋葵(okra))、茄子(Solanum melon gena)(茄子(eggplant))、罂粟(Papaver somniferum)(鸦片罂粟(opium poppy))、东方罂粟(Papaverorientale)、欧洲红豆杉(Taxus baccata)、短叶红豆杉(Taxus brevifolia)、黄花蒿(Artemisia annua)、大麻(Cannabi s saliva)、喜树(Camptotheca acuminate)、长春花(Catharanthus roseus)、玫瑰红长春花(Vinca rosea)、正金鸡纳树(Cinchonaofficinalis)、秋水仙(Coichicum autumnale)、加利福尼亚藜芦(Veratrumcalifornica)、毛花洋地黄(Digitalis lanata)、紫花洋地黄(Digitalis purpurea)、薯蓣属(Dioscorea)物种、穿心莲(Andrographis paniculata)、颠茄(Atropa bellad onna)、曼陀罗(Datura stomonium)、小檗属(Berberis)物种、三尖杉属(Cephalotaxus)物种、草麻黄(Ephedra sinica)、麻黄属(Ephedra)物种、古柯(Erythroxylum coca)、雪花莲(Galanthuswornorii)、赛莨菪属(Sc opolia)物种、千层塔(Lycopodium serratum)(蛇足石杉(Huperzia serrat a))、石松属(Lycopodium)物种、蛇根萝芙木(Rauwolfia serpentina)、萝芙木属(Rauwolfia)物种、血根草(Sanguinaria canadensis)、莨菪属(Hyoscyamus)物种、金盏草(Calendula officinalis)、(Chrysanthemum par thenium)、小白菊(Chrysanthemum parthenium)、毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii)、菊蒿(Tanacetumparthenium)、银胶菊(Parthenium argentat um)(银胶菊(guayule))、橡胶树属(Hevea)物种(橡胶)、留兰香(Mentha spicata)(薄荷)、洋薄荷(Mentha piperita)(薄荷)、红木(Bixaorellana)、六出花属(Alstroemeria)物种、蔷薇属(Rosa)物种(玫瑰)、石竹(Dianthu scaryophyllus)(康乃馨)，碧冬茄属(Petunia)(牵牛花)、一品红(Poinset tiapulcherrima)(猩猩木(poinsettia))、烟草(Nicotiana tabacum)(烟草(to bacco))、羽扇豆(Lupinus albus)(白羽扇豆(lupin))、(Uniola paniculata)(燕麦)、大麦(Hordeumvulgare)(大麦(barley))和黑麦草属(Lolium)(黑麦(rye))。
在一些实例中，可以使用单子叶植物。单子叶植物属于泽泻目(Alismatales)、天南星目(Arales)、槟榔目(Arecales)、凤梨目(Bromeliale s)、鸭跖草目(Commelinales)、环花草目(Cyclanthales)、莎草目(Cyper ales)、谷精草目(Eriocaulales)、水鳖目(Hydrocharitales)、灯心草目(Ju ncales)、百合目(Lilliales)、茨藻目(Najadales)、兰目(Orchidales)、露兜树目(Pandanales)、禾本目(Poales)、帚灯草目(Restionales)、霉草目(Triuridales)、香蒲目(Typhales)和姜目(Zingiberales)。属于裸子植物纲的植物是苏铁目(Cycadales)、银杏目(Ginkgoales)、买麻藤目(Gnetales)和松目(Pinales)。在一些实例中，单子叶植物可以选自玉蜀黍、水稻、小麦、大麦和甘蔗。
在一些实例中，可以使用双子叶植物，包括属于以下目的那些：马兜铃目(Aristochiales)、菊目(Asterales)、Batales、桔梗目(Campanul ales)、白花菜目(Capparales)、石竹目(Caryophyllales)、木麻黄目(Cas uarinales)、卫矛目(Celastrales)、山茱萸目(Cornales)、岩梅目(Diapens ales)、Dilleniales、川绿断目(Dipsacales)、柿目(Ebenales)、杜鹃花目(Ericales)、杜仲目(Eucomiales)、大戟目(Euphorbiales)、豆目(Fabales)、山毛榉目(Fagales)、龙胆目(Gentianales)、牻牛儿苗目(Geraniales)、小二仙草目(Haloragales)、金缕梅目(Hamamelidales)、Middles、胡桃目(Juglandales)、唇形目(Lamiales)、樟目(Laurales)、玉蕊目(Lecythidales)、Leitneriales、Magniolales、锦葵目(Malvales)、杨梅目(Myricales)、桃金娘目(Myrtales)、睡莲目(Nymphaeales)、罂粟目(Papeverales)、胡椒目(Piperales)、车前草目(Plantaginales)、蓝雪目(Plumbaginales)、川薹草目(Podostemales)、花荵目(Polemoniales)、远志目(Polygalales)、蓼目(Polygonales)、报春花目(Primulales)、山龙眼目(Proteales)、大花草目(Rafflesiales)、毛茛目(Ranunculales)、鼠李目(Rhamnales)、蔷薇目(Rosales)、茜草目(Rubiales)、杨柳目(Salicales)、檀黄目(Santales)、无患子目(Sapindales)、瓶子草科(Sarraceniaceae)、玄参目(Scrophulariales)、山茶目(Theales)、昆蓝树目(Trochodendrales)、伞形目(Umbellales)、荨麻目(Urticales)和堇菜目(Violates)。在一些实例中，双子叶植物可以选自棉花、大豆、胡椒和番茄。
在一些情况下，待改良的植物不容易适应实验条件。例如，作物植物可能需要很长时间才能长到足以在多次迭代中连续评估改良的性状。因此，最初分离细菌的第一株植物和/或应用遗传操作的细菌的多株植物可以是模式植物，诸如在所需条件下更易于评价的植物。模式植物的非限制性实例包括狗尾草属(Setaria)、短柄草属(Brachypodium)和拟南芥属(Arabidopsis)。然后可以将根据本公开的方法使用模式植物分离的细菌的能力应用于另一种类型的植物(例如作物植物)以确认改良性状的赋予。
可以通过本文所公开的方法改良的性状包括植物的任何可观察特征，包括例如生长速率、高度、重量、颜色、味道、气味和植物产生一种或多种化合物的变化(包括例如代谢物、蛋白质、药物、碳水化合物、油和任何其他化合物)。还设想基于基因型信息选择植物(例如，包括响应于细菌的植物基因表达的模式，或鉴定遗传标记的存在，诸如与固氮增加相关的那些)。植物还可以基于某种特征或性状(诸如不希望的特征或性状)的缺失、阻抑或抑制而不是某种特征或性状(诸如所需特征或性状)的存在来选择。
实施例
本文提供的实施例描述了细菌分离、细菌和植物分析以及植物性状改良的方法。所述实施例仅用于说明目的，不应被解释为以任何方式进行限制。
实施例1：从植物组织中分离微生物
表层土获得自加利福尼亚州中部的各个农业区。收集了二十种具有不同质地特征的土壤，包括重粘土、泥炭粘土、粉粘土和砂壤土。各种田间玉米、甜玉米、传统玉米和番茄的种子被种植到每种土壤中，如下表中所示
表1.
Figure BDA0003316941220000761
表1：种植在具有不同特征的土壤中的作物类型和品种
在生长2-4周后将植物连根拔起，并用去离子水去除根表面上多余的土壤。去除土壤后，植物表面用漂白剂灭菌并在无菌水中用力漂洗。从植物上切下干净的1cm根部分，并将其置于含有3mm钢珠的磷酸盐缓冲盐水溶液中。通过用Qiagen TissueLyser II剧烈摇动溶液产生浆液。
将根和盐水浆液稀释并接种到各种类型的生长培养基上，以分离根际、内生、附生和其他植物相关的微生物。R2A和Nfb琼脂培养基用于获得单菌落，并且半固体Nfb培养基斜面用于获得固氮细菌种群。在半固体Nfb培养基斜面中孵育2-4周之后，收集微生物种群并在R2A琼脂上划线以获得单菌落，如图1A-B所示。将单菌落重悬于R2A和甘油的混合物中，进行PCR分析，并在-80℃下冷冻供以后分析。获得大约1,000个单菌落并命名为“分离的微生物”。
然后对分离株进行菌落PCR筛选以检测nifH基因的存在，以便鉴定固氮生物。将已被证明可检测筛选中超过90％的固氮生物的先前描述的引物组Ueda 19F/388R用于探测每个分离株中nif簇的存在(Ueda等人1995；J.Bacteriol.177:1414–1417)。挑取纯化分离株的单菌落，重悬于PBS中，并且用作菌落PCR的模板，如图2所示。对给出阳性PCR带的分离株的菌落进行重新划线，并且菌落PCR和重新划线过程重复两次以防止固氮生物的假阳性鉴定。纯化的分离株随后被命名为“候选微生物”。
实施例2：分离的微生物的表征
测序、分析和系统发育表征
将用515f-806r引物组对16S rDNA测序用于产生分离的微生物和候选微生物的初步系统发育同一性(参见例如Vernon等人；BMC Microbiol.2002Dec 23；2:39.)。微生物包括不同的属，包括：肠杆菌属、伯克霍尔德菌属、克雷伯菌属、短根瘤菌属、拉恩菌属、黄单胞菌属、Raoultella、成团泛菌属、假单胞菌属、短波单胞杆菌属、土壤杆菌属和类芽孢杆菌属，如表2所示。
Figure BDA0003316941220000781
表2：如通过深度16S rDNA测序确定的从番茄植物中分离的微生物的多样性。
随后，使用Illumina Miseq平台对39种候选微生物的基因组进行测序。使用QIAmpDNA mini试剂盒(QIAGEN)从纯培养物中提取基因组DNA，并通过第三方供应商(SeqMatic,Hayward)制备用于测序的总DNA文库。然后通过A5流水线进行基因组组装(Tritt等人2012；PLoS One 7(9):e42304)。基因被鉴定并注释，并且与固氮的调节和表达相关的那些基因被认为是诱变的靶标。
鉴定了两种微生物基础菌株，命名为CI137和CI1021，并且用于进一步测试各种基因突变对氮摄取的影响。CI137代表WT变栖克雷伯菌，并且CI1021代表WT Kosakoniapseudosacchari。
实施例3：候选微生物的诱变
具有Cas9选择的λred诱变
通过λred诱变和通过CRISPR-Cas选择产生候选微生物的突变体。敲除盒含有通过转录谱鉴定的内源性启动子和位于缺失靶标两侧的约250bp同源区域。用编码在阿拉伯糖诱导型启动子控制下的λred重组系统(exo、β、gam基因)和在IPTG诱导型启动子控制下的Cas9的质粒转化候选微生物。在所得转化体中诱导Red重组和Cas9系统，并制备用于电穿孔的菌株。随后将敲除盒和质粒编码的选择gRNA转化到感受态细胞中。在候选菌株CI006中nifL的缺失和调节nif操纵子转录的启动子的取代的示例性反应中，在平板接种在对Cas9质粒和gRNA质粒两者均具有选择性的抗生素上之后，所筛选的10个菌落中有7个显示出预期的敲除突变，如图3所示。
这种方法同样适用于修饰CI137和CI1021基础菌株，以创建表3中鉴定的突变型菌株。
实施例4：候选分子的体外表型分型
评估了外源氮对各种突变体中固氮酶生物合成和活性的影响。乙炔还原测定(ARA)(Temme等人2012；109(18):7085–7090)用于测量纯培养条件下的固氮酶活性。菌株在气密试管中生长，并且乙炔向乙烯的还原使用Agilent 6890气相色谱仪进行定量。在补充有0或5mM磷酸铵的固氮培养基中生长的候选微生物和对应候选突变体的ARA活性显示在图4A-B和图6A-B中。如图4A-B所示，相对于对照菌株，含有gltA基因缺失的菌株表现出增加的ARA活性。如图6A-B所示，相对于对照菌株，调节ptsH表达的启动子的取代导致ARA活性降低。
来自图4A-B和图6A-B的菌株还进行了氨排泄(AMM)测定，其中在固氮条件下通过在无氮培养基中培养细胞、将细胞沉淀并测量无细胞肉汤中的游离氨来测量随时间的氨排泄；较高的铵排泄水平表明较高的固氮和排泄。如图5A-B所示，相对于对照，gltA的缺失导致增加的铵排泄率(图5B)和总的铵排泄(图5A)。如图7B所示，相对于对照菌株，改变ptsH启动子导致铵排泄率增加。
实施例5：生物膜形成
生物膜形成可能影响提供给相关植物的氮的量。植物根部上生物膜形成的增加可以增加提供给植物的氮的量。
一些基因可以调节生物膜形成。例如，smZ可以是生物膜调节的负调节因子。突变smZ使得smZ的功能降低或消除，可以增加细菌中的生物膜形成。可以进行诱变以在具有增加的氮排泄和固定活性的菌株中突变smZ，以创建细菌的smZ突变体文库。
一些蛋白质可以促进生物膜形成。例如，包括lapA的大粘附蛋白可以促进生物膜形成。调节lapA表达的一种或多种启动子可以被上调，使得产生更多的lapA，如通过western印迹所检测的。可以被修饰以改变生物膜形成的另外的基因包括pga、sdiA、fimA1-A4、wzxE和bolA。
经修饰的菌株可以在溶原缓冲液(LB)中生长并接种到具有幼苗的土壤中。幼苗、土壤和细菌菌株可以在盆中、在田间、在室内或在室外。可以在春季、夏季、秋季或冬季种植幼苗。空气可以具有约0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的湿度。其可能是雨天、有雾、多云或晴天的。温度可以为约4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃。可以在黎明、早晨、中午、下午、黄昏、傍晚或晚上种植幼苗。可以让幼苗生长约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、20天或30天。时间过去之后，可以挖出植物，并且可以测量根部上的生物膜的量。
实施例6：氧敏感性
固氮酶的氧敏感性可能影响固氮、氮排泄或两者。降低固氮酶的氧敏感性可以增加固氮活性，增加氮排泄活性，或两者兼而有之。
为了评价这一假设，通过取代调节基因表达的启动子来过表达sodA、sodB和sodC基因。
对过表达菌株进行氧敏感性测定，其中可以在不同氧浓度的条件下进行AMM和ARA测定。结果显示在图12A-B、图13A-B、图14A-B、图15A-B、图20A-B、图21A-B、图22A-B和图23A-B中。为了进一步测试氧耐受性对固氮活性和氮排泄活性的影响，将创建在FNR、arcA和arcB基因中具有修饰的菌株，并使其在不同的氧条件下进行ARA和AMM测定。
实施例7：增加铁转运可能增加固氮
铁摄取途径可以是指细菌中能够将铁摄取到细胞中的代谢途径。铁可以用作辅助因子以促进固氮。增加细胞的铁摄取可能增加固氮、氮排泄或两者。
为了评价这一假设，分别在fhuF和iscR(分别为铁摄取的正调节因子和负调节因子)中创建遗传修饰。具体地，创建了含有iscR缺失或fhuF启动子的启动子取代的菌株，并测定了ARA和AMM活性。结果显示在图8A-B、图9A-B、图10A-B、图11A-B、图16A-16B、图17A-B、图18A-B和图19A-B中。iscR的缺失导致ARA活性增加(参见图8A-B、图10A-B、图16A-B和图18A-B)。
还可以构建变体文库，使得铁摄取途径中的一种或多种基因的启动子活性增加。Western印迹可以用于确定哪些菌株具有一种或多种铁摄取基因的增加的表达，并且这些菌株可以是感兴趣的变体。
为了筛选增加的铁摄取活性，可以将每个感兴趣的突变体或变体以及每个菌株的未突变亲本菌株接种到LB培养基中96孔板的三个孔中并在其中生长。一旦细胞达到OD＝0.8，就可以收获每个突变体的一个孔，使得细胞沉淀，洗掉多余的LB，并且将细胞重悬、裂解，并准备在96孔板中进行光谱分析。可以使用光谱法测量铁含量以确定样品中的基线铁含量。剩余的样品可以在LB或单独的LB中掺入作为FeSO4的铁，使得所添加的量是每个孔中总体积的10％或更少。可以包括0.1mM的乙酸(最终浓度)以帮助铁的溶解度。测定中每个孔中铁的最终浓度可以是10pM、100pM、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM或100μM中的一个，并且可以测试多于一个浓度。所述测定可以在1秒、10秒、30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟和60分钟中的一个或多个内进行。
首先，对于每个浓度，可以绘制作为时间函数的转运到每个细胞中的铁的量，以确定测定的最佳持续时间。最佳持续时间可以是其中尚未达到稳态且反应速率仍为线性的时间间隔。然后，对于最佳持续时间，可以绘制作为浓度函数的转运到每个细胞中的铁的量，并可以进行Michaelis-Menten分析。可以选择如通过Km比较所确定的与未突变和未经修饰的亲本菌株相比铁转运显著增加(p<0.05)的感兴趣的突变体菌株或变体用于进一步测定。
接下来，选择用于进一步测定的每个菌株可以进行如本文所述的AMM测定以及ARA测定以分别测量氮排泄和氮固定。这些突变或变体中的一种或多种可以增加这些细菌菌株中的一种或多种的AMM、ARA或两者。
实施例8：增加铁载体生物合成基因可能增加固氮
yhf铁载体或铁螯合分子可能影响细菌中的铁摄取。增加yhf铁载体的产生可以增加细菌中的铁摄取。铁载体基因(包括yhfA、yusV、sbnA、yfiZ、fiu和fur)中的修饰可能增加yhf铁载体的产生，这进而可能增加细胞中的铁摄取。这些修饰可能导致固氮或氮排泄增加。
为了评价铁载体基因表达的增加是否会改变固氮或氮排泄，通过取代调节基因表达的启动子来使sbnA、yusV1和yusV2过表达。然后对经修饰的菌株进行ARA和AMM测定。结果显示在图16A-B、图17A-B、图18A-B和图19A-B中。
可以对细菌细胞中的这些基因进行遗传修饰，使得这些修饰导致铁载体产生增加。为了鉴定此类修饰，可以在编码yhfA、yusV、sbnA、yfiZ、fiu或fur的基因的活性位点之中和周围进行诱变。可为每个基因构建突变体文库。然后可以筛选这些文库以增加铁载体产生。这些文库可以从野生型细胞创建，或者从已经被修饰以显示增加的固氮、增加的氮排泄或两者的细胞创建。为了筛选增加的铁载体产生，可以使每个突变体生长至OD＝0.8，并且然后掺入过量但无毒的铁载体前体并孵育30分钟或60分钟。可以将在分配的时间段之后产生的铁载体的量归一化，并且可以针对增加的铁转运筛选表现出增加的铁载体产生的菌株。
为了筛选增加的铁摄取活性，可以将每个感兴趣的突变体或变体以及每个菌株的未突变亲本菌株接种到LB培养基中96孔板的三个孔中并在其中生长。一旦细胞达到OD＝0.8，就可以收获每个突变体的一个孔，使得细胞沉淀，洗掉多余的LB，并且将细胞重悬、裂解，并准备在96孔板中进行光谱分析。可以使用光谱法测量铁含量以确定样品中的基线铁含量。剩余的样品可以在LB或单独的LB中掺入作为FeSO4的铁，使得所添加的量是每个孔中总体积的10％或更少。可以包括0.1mM的乙酸(最终浓度)以帮助铁的溶解度。测定中每个孔中铁的最终浓度可以是10pM、100pM、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM或100μM中的一个，并且可以测试多于一个浓度。所述测定可以在1秒、10秒、30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟和60分钟中的一个或多个内进行。
首先，对于每个浓度，可以绘制作为时间函数的转运到每个细胞中的铁的量，以确定测定的最佳持续时间。最佳持续时间可以是其中尚未达到稳态且反应速率仍为线性的时间间隔。然后，对于最佳持续时间，可以绘制作为浓度函数的转运到每个细胞中的铁的量，并可以进行Michaelis-Menten分析。可以选择如通过Km比较所确定的与未突变和未经修饰的亲本菌株相比铁转运显著增加(p<0.05)的感兴趣的突变体菌株或变体用于进一步测定。
接下来，选择用于进一步测定的每个菌株可以进行如本文所述的AMM测定以及ARA测定以分别测量氮排泄和氮固定。这些突变或变体中的一种或多种可以增加这些细菌菌株中的一种或多种的AMM、ARA或两者。
实施例9：增加干燥耐受性
提高干燥耐受性可以增加用于种子包衣的菌株的定殖，或对植物或田地的其他干燥应用。将创建包含与rpoE基因可操作地连接的阿拉伯糖启动子的经基因工程改造的微生物。还将产生含有对rpoS、treA、treB、phoP、phoQ和rpoN基因进行类似修饰的菌株。经基因工程改造的微生物和非工程改造的亲本对照将在补充有阿拉伯糖的培养基中培养48小时，然后进行干燥。干燥之后，每种工程改造和工程改造的菌株的一部分将在不含有阿拉伯糖的培养基中复活，并且将测定在24小时之后在培养基中的微生物数量。含有工程改造的菌株的培养基将比含有非工程改造的亲本菌株的培养基含有更多的微生物。
在适合于玉米种子发芽的条件下的温室中，将干燥的微生物施用于玉米种子并将所述玉米种子种植在缺乏阿拉伯糖的土壤中。4周之后将收获幼苗，并且评估在植物根部上的工程改造和非工程改造的微生物两者的菌落形成单位的数量。与暴露于非工程改造的亲本菌株的植物相比，暴露于工程改造的微生物的植物将与更多的微生物相关联。
实施例10：NAC基因突变体
为了评价NAC基因中的突变对固氮和氮排泄的影响，通过缺失基因或取代调节基因表达的启动子产生NAC基因敲除和过表达突变体。
对突变体菌株进行AMM和ARA测定。结果显示在图24A-B和图25A-B中。CI1021背景中NAC突变体的结果提供在图26A-B和图27A-B中。
表3：本文所述的菌株
Figure BDA0003316941220000851
Figure BDA0003316941220000861
Figure BDA0003316941220000871
Figure BDA0003316941220000881
Figure BDA0003316941220000891
Figure BDA0003316941220000901
Figure BDA0003316941220000911
Figure BDA0003316941220000921
Figure BDA0003316941220000931
在描述本发明的上下文中(尤其是在以下权利要求的上下文中)术语“一个/种(a)”和“一个/种(an)”以及“所述”的使用以及类似的提及应被解释为涵盖单数和复数两者，除非在本文另外地指示或明显地与上下文矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语(即，意味着“包括但不限于”)，除非另外地注解。除非本文另外指明，否则本文中值范围的列举仅仅意图用作个别地表示属于所述范围的各单独值的速记方法，并且犹如本文个别描述地那样将各单独值并入到本说明书中。例如，如果公开范围10-15，那么也公开11、12、13和14。除非本文中另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文中所描述的所有方法都可以按任何合适的顺序进行。本文所提供的任何以及所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅意图更好地说明本发明，并且除非另外要求，否则不会对本发明的范围施加限制。本说明书中的语言不应解释为将任何非要求的要素指示为实践本发明所必需。
虽然本发明的优选实施方案已在本文显示和描述，此类实施方案仅以举例的方式提供，这对本领域的技术人员将是显而易见的。在不偏离本发明的情况下本领域技术人员现将进行各种变型、变化和替换。应当理解可将本文描述的本发明实施方案的各种替代方案用于实施本发明。这意味着以下权利要求书限定本发明的范围并且这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构因此被涵盖。

Claims (40)

1.一种经基因工程改造的细菌，其包含在选自由以下组成的组的基因中的修饰：NAC、gltA、pga、ptsH、fimA1、fimA2、fimA3、fimA4、iscR、tonB、yusV1、yusV2、yusV3、yusV4、sbnA、fhuF、sodA、sodB、sodC、iaaA、sdiA、wzxE、bolA、FNR、arcA、arcB、rpoS、treA、treB、phoP、phoQ、yjjPB、ychM、dauA、actP、yieL1、yieL2、yieL3、yieL4、pgab、rafA、melA、uidA、manA、abfA、abnA和lacZ。
2.如权利要求1所述的经基因工程改造的细菌，其中所述经基因工程改造的细菌包含在选自由以下组成的组的基因中的修饰：NAC、gltA、pga、ptsH、fimA1、fimA2、fimA3、fimA4、iscR、tonB、yusV1、yusV2、yusV3、yusV4、sbnA、fhuF、sodA、sodB和sodC。
3.如权利要求1所述的经基因工程改造的细菌，其中所述经基因工程改造的细菌包含在选自由以下组成的组的基因中的修饰：NAC、gltA、pga、ptsH、fimA1、fimA2、fimA3、fimA4、sodA、sodB和sodC。
4.如权利要求1所述的经基因工程改造的细菌，其中所述经基因工程改造的细菌包含在选自由以下组成的组的基因中的修饰：iscR、tonB、yusV1、yusV2、yusV3、yusV4、sbnA和fhuF。
5.如权利要求1至4中任一项所述的经基因工程改造的细菌，其中所述经基因工程改造的细菌是经基因工程改造的固氮细菌。
6.如权利要求1至5中任一项所述的经基因工程改造的细菌，其中所述经基因工程改造的细菌是属间的。
7.如权利要求1至6中任一项所述的经基因工程改造的细菌，其中所述经基因工程改造的细菌为非属间的。
8.如权利要求1至7中任一项所述的经基因工程改造的细菌，其中所述经基因工程改造的细菌能够在外源氮的存在下固定大气氮。
9.如权利要求1至8中任一项所述的经基因工程改造的细菌，其中所述经基因工程改造的细菌还包含在固氮基因网络中的修饰。
10.如权利要求9所述的经基因工程改造的细菌，其中所述在固氮基因网络中的修饰包括在NifA、NifL、NifH或其任何组合中的修饰。
11.如权利要求10所述的经基因工程改造的细菌，其中所述在NifA中的修饰导致NifA的表达增加。
12.如权利要求10所述的经基因工程改造的细菌，其中所述在NifL中的修饰导致NifL的表达降低。
13.如权利要求10所述的经基因工程改造的细菌，其中所述在NifH中的修饰导致NifH的表达增加。
14.如权利要求9所述的经基因工程改造的细菌，其中所述在固氮基因网络中的修饰包括导致Nif簇基因表达增加的修饰。
15.如权利要求1至14中任一项所述的经基因工程改造的细菌，其中所述经基因工程改造的细菌还包含在氮同化基因网络中的修饰。
16.如权利要求15所述的经基因工程改造的细菌，其中所述在氮同化基因网络中的修饰包括在GlnE中的修饰。
17.如权利要求16所述的经基因工程改造的细菌，其中所述在GlnE中的修饰导致GlnE的活性降低。
18.如权利要求15所述的经基因工程改造的细菌，其中所述在氮同化基因网络中的修饰导致amtB的活性降低。
19.一种增加植物中源自大气的氮的量的方法，所述方法包括使所述植物与多种如权利要求1至18中任一项所述的经基因工程改造的细菌接触。
20.如权利要求19所述的方法，其中使所述植物与多种所述经基因工程改造的细菌接触包括将所述多种经基因工程改造的细菌施用于所述植物的种子。
21.如权利要求19所述的方法，其中使所述植物与多种所述经基因工程改造的细菌接触包括将所述多种经基因工程改造的细菌施用于所述植物的幼苗。
22.如权利要求19所述的方法，其中使所述植物与多种所述经基因工程改造的细菌接触包括将所述多种经基因工程改造的细菌以液体制剂形式施用于所述植物。
23.如权利要求19所述的方法，其中使所述植物与多种所述经基因工程改造的细菌接触包括在所述植物种植之后但在收获之前将所述多种经基因工程改造的细菌施用于所述植物。
24.如权利要求19所述的方法，其中使所述植物与多种所述经基因工程改造的细菌接触包括将所述多种经基因工程改造的细菌作为拌种剂施用于所述植物。
25.如权利要求19所述的方法，其中使所述植物与多种所述经基因工程改造的细菌接触包括在发芽后约一个月与约八个月之间将所述多种经基因工程改造的细菌施用于所述植物。
26.如权利要求25所述的方法，其中在发芽后约一个月与约八个月之间将所述多种经基因工程改造的细菌施用于所述植物包括在发芽后两个月与八个月之间将所述多种经基因工程改造的细菌施用于所述植物。
27.如权利要求25所述的方法，其中在发芽后约一个月与约八个月之间将所述多种经基因工程改造的细菌施用于所述植物包括在发芽后约一个月与约三个月之间将所述多种经基因工程改造的细菌施用于所述植物。
28.如权利要求25所述的方法，其中在发芽后约一个月与约八个月之间将所述多种经基因工程改造的细菌施用于所述植物包括在发芽后约三个月与约六个月之间将所述多种经基因工程改造的细菌施用于所述植物。
29.如权利要求19至28中任一项所述的方法，其中所述植物是谷类植物。
30.如权利要求19至28中任一项所述的方法，其中所述植物是玉米植物。
31.如权利要求19至28中任一项所述的方法，其中所述植物是水稻植物。
32.如权利要求19至28中任一项所述的方法，其中所述植物是小麦植物。
33.如权利要求19至28中任一项所述的方法，其中所述植物是大豆植物。
34.一种包含种子和种子包衣的组合物，其中所述种子包衣包含多种如权利要求1至18中任一项所述的经基因工程改造的细菌。
35.如权利要求34所述的组合物，其中所述种子是谷类种子。
36.如权利要求35所述的组合物，其中所述种子选自由以下组成的组：玉米种子、小麦种子、水稻种子、大豆种子、黑麦种子和高粱种子。
37.一种组合物，其包含植物和多种如权利要求1至18中任一项所述的经基因工程改造的细菌。
38.如权利要求37所述的组合物，其中所述植物是幼苗。
39.如权利要求37所述的组合物，其中所述植物是谷类植物。
40.如权利要求37所述的组合物，其中所述植物选自由以下组成的组：玉米、水稻、小麦、大豆、黑麦和高粱。
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