CN115058444A - 一种黄曲霉毒素菌株及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种黄曲霉毒素菌株及其构建方法与应用，其中，构建方法包括步骤：采用原生质体转化法将敲除载体pAoG转化至米曲霉菌株A.oryzae 2351中，构建营养缺陷型菌株；构建RafA基因异源表达载体pEX1‑RafA，以及StuA基因异源表达载体pEX2B‑StuA；采用原生质体转化法将所述RafA基因异源表达载体pEX1‑RafA或StuA基因异源表达载体pEX2B‑StuA转化至所述营养缺陷型菌株中，构建制得黄曲霉毒素菌株。本发明探索了黄曲霉毒素合成调控基因RafA和StuA在拥有完整黄曲霉毒素合成同源基因簇的米曲霉中异源表达，在限氮条件下培养异源表达菌株2351‑RafA以及2351‑StuA，探究其黄曲霉毒素的分泌情况，这为研究菌株营养胁迫响应打下基础，从而为构建高产黄曲霉毒素以及其他次级代谢产物工业菌株提供技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种黄曲霉毒素菌株及其构建方法与应用。
背景技术
米曲霉(Aspergillus oryzae)是一种广泛应用于传统酿造行业的丝状真菌，主要用于清酒和酱油的生产。因其具有分泌各种水解酶(淀粉酶、蛋白酶等)的显著潜力，近年来被广泛用作异源表达的宿主以提高各种水解酶及次级代谢产物的产量。
近年来大量研究表明米曲霉和黄曲霉同属黄曲霉亚属，两者的基因组在编码区显示极高的相似性。系统发育分析中，米曲霉源于黄曲霉一个分支的单系分支，并且通过驯化，米曲霉逐渐从黄曲霉中解毒和分化出来。尽管如此，对于拥有完整黄曲霉毒素合成同源基因簇的米曲霉不分泌黄曲霉毒素这一现象仍未找到合理的解释。近年来大量的黄曲霉毒素合成调控因子的发现，为研究者探究拥有完整黄曲霉毒素合成同源基因簇的米曲霉却不分泌毒素提供了新方向。
基于此，米曲霉驯化过程中黄曲霉毒素合成调控基因的演化以及调控基因能否在拥有完整黄曲霉毒素合成同源基因簇的米曲霉中发挥功能作用以调控毒素分泌需要更深一步的研究。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种黄曲霉毒素菌株及其构建方法与应用，旨在解决现有米曲霉不能分泌黄曲霉毒素的问题。
本发明的技术方案如下：
一种黄曲霉毒素菌株的构建方法，其中，包括步骤：
采用原生质体转化法将敲除载体pAoG转化至米曲霉菌株A.oryzae2351中，构建营养缺陷型菌株；
构建RafA基因异源表达载体pEX1-RafA，以及StuA基因异源表达载体pEX2B-StuA；
采用原生质体转化法将所述RafA基因异源表达载体pEX1-RafA或StuA基因异源表达载体pEX2B-StuA转化至所述营养缺陷型菌株中，构建制得黄曲霉毒素菌株。
所述黄曲霉毒素菌株的构建方法，其中，构建RafA基因异源表达载体pEX1-RafA的步骤包括：
以含黄曲霉毒素合成调控基因RafA的质粒为模板，设计对应RafA引物并克隆基因RafA，所述基因RafA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，所述RafA引物的核苷酸序列为SEQ IDNO.2-3；
将所述基因RafA与表达载体pEX1通过酶切和酶连处理，构建RafA基因异源表达载体pEX1-RafA。
所述黄曲霉毒素菌株的构建方法，其中，构建StuA基因异源表达载体pEX2B-StuA的步骤包括：
以含黄曲霉毒素合成调控基因StuA的质粒为模板，设计对应StuA引物并克隆基因StuA，所述基因StuA的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，所述StuA引物的核苷酸序列为SEQ IDNO.5-6；
将所述基因StuA与表达载体pEX2B通过酶切和酶连处理，构建StuA基因异源表达载体pEX2B-StuA。
一种黄曲霉毒素菌株，其中，采用本发明所述黄曲霉毒素菌株的构建方法制得。
一种黄曲霉毒素菌株的应用，其中，将本发明构建方法制得的黄曲霉毒素菌株用于生产黄曲霉毒素。
有益效果：本发明探索了黄曲霉毒素合成调控基因RafA和StuA在拥有完整黄曲霉毒素合成同源基因簇的米曲霉中异源表达，在限氮条件下培养异源表达菌株2351-RafA以及2351-StuA，探究其黄曲霉毒素的分泌情况，这为研究菌株营养胁迫响应打下基础，从而为构建高产黄曲霉毒素以及其他次级代谢产物工业菌株提供技术支持。
附图说明
图1为为本发明一种黄曲霉毒素菌株的构建方法流程图。
图2为限氮培养条件下，原始米曲霉菌株A.oryzae 2351与本发明构建的异源表达菌株2351-RafA、2351-StuA的表型结果对比图。
图3为限氮培养条件下，原始米曲霉菌株A.oryzae 2351与本发明构建的异源表达菌株2351-RafA、2351-StuA的菌落直径对比图。
图4为限氮培养条件下，原始米曲霉菌株A.oryzae 2351与本发明构建的异源表达菌株2351-RafA、2351-StuA的孢子数量对比图。
图5为限氮培养条件下，原始米曲霉菌株A.oryzae 2351与本发明构建的异源表达菌株2351-RafA、2351-StuA的生物量对比图。
图6为限氮培养条件下，原始米曲霉菌株A.oryzae 2351与本发明构建的异源表达菌株2351-RafA、2351-StuA的黄曲霉毒素分泌量对比图。
图7为原始米曲霉菌株A.oryzae 2351与本发明构建的异源表达菌株2351-RafA、2351-StuA侵染玉米种子结果对比图。
图8为原始米曲霉菌株A.oryzae 2351与本发明构建的异源表达菌株2351-RafA、2351-StuA侵染花生种子结果对比图。
图9为实施例3中编码黄曲霉毒素合成途经相关酶的差异表达基因的表达水平图。
图10为实施例3中差异表达基因GO注释分类统计图。
图11为实施例3中差异表达基因KEGG通路富集散点图，其中，A为2351-ΔpyrG_vs_2351-StuA的差异表达基因KEGG通路富集散点图，B为2351-ΔpyrG_vs_2351-RafA的差异表达基因KEGG通路富集散点图，C为2351-RafA_vs_2351-StuA的差异表达基因KEGG通路富集散点图。
具体实施方式
本发明提供一种黄曲霉毒素菌株及其构建方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1，图1为本发明提供的一种黄曲霉毒素菌株的构建方法流程图，如图所示，其包括步骤：
S10、采用原生质体转化法将敲除载体pAoG转化至米曲霉菌株A.oryzae 2351中，构建营养缺陷型菌株；
S20、构建RafA基因异源表达载体pEX1-RafA，以及StuA基因异源表达载体pEX2B-StuA；
S30、采用原生质体转化法将所述RafA基因异源表达载体pEX1-RafA或StuA基因异源表达载体pEX2B-StuA转化至所述营养缺陷型菌株中，构建制得黄曲霉毒素菌株。
具体来讲，本发明探索了黄曲霉毒素合成调控基因RafA和StuA在拥有完整黄曲霉毒素合成同源基因簇的米曲霉中异源表达，在限氮条件下培养异源表达菌株2351-RafA以及2351-StuA，探究其黄曲霉毒素的分泌情况，这为研究菌株营养胁迫响应打下基础，从而为构建高产黄曲霉毒素以及其他次级代谢产物工业菌株提供技术支持。
在一些实施方式中，所述营养缺陷型菌株的构建主要包括步骤：获取敲除载体pAoG质粒，采用原生质体转化法将所述敲除载体pAoG转化至米曲霉菌株A.oryzae 2351中，之后挑取阳性转化子，最后通过5-FOA筛选培养和特异性引物进行PCR反应验证，得到纯合敲除菌株，即营养缺陷型菌株。在本实施例中，所述米曲霉菌株A.oryzae 2351购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，且所述米曲霉菌株A.oryzae 2351具有完整的黄曲霉毒素生物合成同源基因簇。
在一些实施方式中，构建RafA基因异源表达载体pEX1-RafA的步骤包括：以含黄曲霉毒素合成调控基因RafA的质粒为模板，设计对应RafA引物并克隆基因RafA，所述基因RafA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，所述RafA引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2-3；将所述基因RafA与表达载体pEX1通过酶切和酶连处理，构建RafA基因异源表达载体pEX1-RafA。在本实施例中，所述含黄曲霉毒素合成调控基因RafA的质粒购买于genscript公司。
在一些实施方式中，构建StuA基因异源表达载体pEX2B-StuA的步骤包括：以含黄曲霉毒素合成调控基因StuA的质粒为模板，设计对应StuA引物并克隆基因StuA，所述基因StuA的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，所述StuA引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.5-6；将所述基因StuA与表达载体pEX2B通过酶切和酶连处理，构建StuA基因异源表达载体pEX2B-StuA。在本实施例中，所述含黄曲霉毒素合成调控基因StuA的质粒购买于genscript公司。
在一些实施方式中，还提供一种黄曲霉毒素菌株，其采用本发明所述黄曲霉毒素菌株的构建方法制得。
在一些实施方式中，一种黄曲霉毒素菌株的应用，将本发明构建方法制得的黄曲霉毒素菌株用于生产黄曲霉毒素。
下面通过具体实施例对本发明做进一步的解释说明：
实施例1
异源表达菌株2351-RafA以及2351-StuA的构建：
1、使用原生质体转化法将敲除载体pAoG转化至具有完整的黄曲霉毒素生物合成同源基因簇的米曲霉菌株A.oryzae 2351中，构建营养缺陷型菌株；
2、利用购自于genscript公司的含黄曲霉毒素合成调控基因RafA和StuA的质粒为模板，克隆基因RafA以及StuA，特征为全长1635bp以及2370bp，对应核苷酸序列为SEQ IDNO.1-2；将上述克隆基因RafA以及StuA扩增后先与PMD19-T载体相连，送测序正确无误后，再将目的片段酶切下来与表达载体相连，通过酶切和酶连进行的连接转化实验，成功构建了RafA和StuA基因异源表达载体pEX1-RafA和pEX2B-StuA；
3、采用PEG介导的原生质体转化方法，将pEX1-RafA和pEX2B-StuA各自分别导入营养缺陷型菌株A.oryzae 2351中，挑取阳性转化子，通过特异性引物进行PCR反应验证获得了异源表达菌株2351-RafA以及2351-StuA。
实施例2
1)、限氮条件下米曲霉表型：
在不同硝酸钠浓度的CD固体培养基中，将实施例1中构建的异源表达菌株2351-RafA、2351-StuA以及初始米曲霉菌株A.oryzae 2351制备成孢子液，按相同量3μL进行点板，30℃恒温培养箱培养3天，结果如图2所示，从图2可以看出三个菌株的菌落并未因氮源浓度变化而发生明显变化，但异源表达菌株的菌落明显大于对照菌株。
2)、不同处理下米曲霉孢子数的测定：
对限氮条件培养下的样品，培养3天后，用500μL的无菌水刮洗，剧烈涡旋使其孢子囊打散，双层滤纸过滤，并使用血球计数板计算孢子个数，测定孢子浓度，每种样品3个重复，结果如图3所示，从图3可以看出对照菌株2351-ΔpyrG高于异源表达菌株2351-RafA，但两者的孢子数量远低于异源表达菌株2351-StuA。这表明StuA基因的转入有利于菌株分生孢子的产生。3)、不同处理下生长直径的测定：
对限氮条件培养下的样品，培养3天后，利用十字交叉法测定其生长直径每种样品3个重复，结果如图4所示，从图4可以看出，三个菌株的菌落直径并未因氮源浓度变化而发生明显变化，对照菌株2351-ΔpyrG的菌落小于异源表达菌株2351-RafA和2351-StuA。
4)、限氮条件下异源表达工程菌生物量测定：
对限氮条件下培养3天的样品进行采集，工作台内将菌丝体收集到离心管中，烘箱烘至恒重，使用分析天平测量其干重，每种样品3个重复，结果如图5所示，从图5可以看出限氮培养条件下，三个菌株的生物量随氮源浓度的降低而降低，其中对照菌株2351-ΔpyrG的生物量随氮源浓度的降低最为明显，与对照相比，轻度限氮使得菌株生物量下降一半以上。此外与对照菌株相比，同一氮源浓度下异源表达菌株的生物量显著降低，2351-StuA菌株比菌株2351-RafA产生物量更少，这一结果表明StuA基因的转入对菌株生物量的影响更大。
5)、异源表达工程菌中黄曲霉毒素检测：
对限氮条件下培养3天的样品进行采集，每种样品采集3个重复，超净工作台内将菌丝体收集到离心管中，封口，置于液氮中冻干，放于-80℃冰箱保存，随后青岛科创质量检测有限公司进行黄曲霉毒素测定，结果如图6所示，从图6可以看出异源表达菌株都能够分泌黄曲霉毒素，其中2351-StuA菌株毒素分泌量高于菌株2351-RafA，这也与先前文献报告StuA基因更能够调控黄曲霉毒素的分泌一致，并且毒素产量与氮源浓度呈负相关，表明这两个调控因子与氮源浓度可以发挥协同作用来调控毒素分泌。
6)、异源表达菌株2351-RafA以及2351-StuA侵染玉米及花生种子，检测异源表达菌株的侵染能力：
筛选大小、重量相符的玉米及花生种子；超净工作台内用75％酒精浸泡灭菌1-2分钟，之后用无菌水冲洗2次；玉米及花生种子转移至装有相同浓度工程菌孢子液的大离心管中浸泡，封口，置于80rpm摇床，30分钟；小平板上铺无菌滤纸，然后在滤纸加1mL无菌水；将与孢子液混匀的种子转移至滤纸上，封口，放于30℃恒温培养箱培养3、6和9天；第3、6和9天，观察对照菌株以及异源表达工程菌侵染状况，结果如图7和图8所示，从图7-图8可以看出菌株2351-StuA的强侵染能力。
实施例3
检测RafA和StuA基因的mRNA表达模式：
利用SEQ ID NO.1-2所示基因RafA和StuA的核苷酸序列作为设计探针引物的保守区段，调取其对应序列的引物序列SEQ ID NO.3-4以及SEQ ID NO.5-6，分别对2351-RafA以及2351-StuA样品进行Rt-PCR，然后检测该基因在菌株中的表达；样品的RNA经过逆转录后所得cDNA；其步骤如下：提取菌株的总RNA，检测RNA浓度和完整性，然后进行cDNA文库构建，上机检测进行转录组测序。结果如9所示，从图9可以看出，异源表达菌株2351-RafA以及2351-StuA的转录组测序发现在黄曲霉毒素合成途径中鉴定的差异表达基因的表达量有不同程度的上调或下调。黄曲霉毒素合成途经中鉴定了48个编码黄曲霉毒素合成相关酶的差异表达基因，其中表达量上调的基因编码的酶大多参与合成黄曲霉毒素前体杂色曲霉素以及直接参与黄曲霉毒素的合成。此外，异源表达菌株2351-StuA中编码黄曲霉毒素合成相关酶的差异表达基因表达量上调个数多于2351-RafA。
进一步地，对上述差异表达基因进行GO富集分析，结果如图10所示，从图10可以看出，差异表达基因主要分布于膜与膜部分，主要参与代谢过程以及细胞过程，以及主要行使催化和结合等分子功能。
更进一步地，对上述差异表达基因进行KEGG通路富集分析，结果如图11所示，图11为差异表达基因KEGG通路富集散点图，其中，A为2351-ΔpyrG_vs_2351-StuA的差异表达基因KEGG通路富集散点图，B为2351-ΔpyrG_vs_2351-RafA的差异表达基因KEGG通路富集散点图，C为2351-RafA_vs_2351-StuA的差异表达基因KEGG通路富集散点图，图中每一个方块表示一个KEGG通路，纵坐标表示通路名称，横坐标为富集因子(Enrichment Factor)，表示差异基因中注释到某通路的基因比例与所有基因中注释到该通路的基因比例的比值。富集因子越大，表示差异表达基因在该通路中的富集水平越显著。方块的颜色代表qvalue，qvalue为多重假设检验校正之后的P value,qvalue越小，表示差异表达基因在该通路中的富集显著性越可靠；方块的大小表示通路中富集的基因数目，方块越大，表示基因越多。从图11可以看出，三个基因集中差异表达基因分别富集在β-丙氨酸代谢通路、苯丙胺酸代谢以及α-亚油酸代谢通路。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 深圳技术大学
<120> 一种黄曲霉毒素菌株及其构建方法与应用
<160> 6
<210> 1
<211> 1635
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 1
atggggccac ccagtttcac tcatgagcaa tatgagatga accccgggtt cgatgaagac 60
gaatcgattg aacaagcaac cctcgaatct tcgtccatgg tcgcagatga ggagatgatg 120
catatcacac aaaatggcaa ctatccgcga aaacgcaaac gaggcatgaa tgaggtaacc 180
gcgatgtcaa taagcgaaca ggaacatata ctgtatggcg accagctctt ggactacttc 240
atgacagtag gggatgctcc agaagcgaca cgaattcctc caccggagcc gccggccaac 300
ttccaggtgg accgttcaat agatgattca gggaacactg ctctccattg ggcttgtgcg 360
atgggtgatc tggagatagt aaaagatctg ctacggaggg gggcagatgt gaagacactc 420
tcagtacatg aagaaacgcc acttgtgcgt gcagttctat ttacaaacaa ctatgaaaag 480
aggacatttc cgccgctcct ggatttactc ctggacacag tatcattccg agactggttc 540
ggcgctacca tattccatca catagcagag accactcgaa gcaaaggcaa atggaagagc 600
tctcggtact attgtgaagt actgctcgac aaattacgag ttacttgtac gccagaggaa 660
atcgatgttc tgctatcctg ccaagactcc aatggagaca cggcagcttt ggttgctgct 720
cgaaatggtg catttcgcct ggttcacttg ctcctcacac attgctcgcg ggctggagat 780
ttagtaaata agaagggcga aacggctgcc agtatcactc aacgagcgaa tcagtctgac 840
cgacatatcc caccgccgcc ttcttctatc acgatgggta atgaccacat tgatggggaa 900
gctgctggcc caattaacgc cgatcaccaa tccgttgcgc cagcgcaaga cccctcccct 960
tccacctctg cactcctcac taagattggg gtaatcatgg ccgaggcgaa caagaaactt 1020
gccgttgggt acgggagctc caaggccaat cagccggatc cagacgacgt tgccaatcca 1080
gaggcgctat acgaacagct ggagctggat cggcagaaga ttcaacaaca aacagccgac 1140
ttggcggcga aggaaagcaa agaagagcac gtcgatgcac agttcgagcg ttacgaacag 1200
ctgaggagtc gctacgaatc gctactggaa cagattcagc acgcccgctt aagggagcgg 1260
attgcctcgt cgacattacc cacaaacgag gacgcgaact caacatcgac tgatcagaac 1320
aaattgctta ccgtctatca gttagcccga cgactgtgtt cggcgcaaaa agcacgacgt 1380
gccgccgtca aagatctcgc ccaacaaacg gcagatgcgg gtgttagcac taagtttgat 1440
gttcatcgga agctcgtgtc actcgctaca gggctgaaag aagaagaact agatcccatg 1500
gctgccgaac tagtagagac cttggagttt gaccgaatga acggaaaagg tgcagggggc 1560
gagtcccccg agccagaacc ccaggggtca gcgacttttt ctctccctgg acctcccgtg 1620
tctgtcgatg cttag 1635
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 2
ctcgagatgg ggccacccag tttcact 27
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 3
tacgtaagca tcgacagaca cgggaggt 28
<210> 4
<211> 2350
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 4
atgcttcctt gctgcgaacc gttaccccta caaaccgaaa agctggagct gccgtcgatt 60
tcccaggtcc acaccagagg tcctgttgat attccctggt ataatcacca cgctgctgag 120
agaccattat tgtctggtga caaactaccg gctctcagtt taccgacggc ctcgcagccg 180
ccaatctcgg gccagtccta ccggaccagc tacgaagagg cctcggcatc ccataacgcg 240
agtgcgcgga caagcctatc cggaaccgca cccgtcatca acgaggccag gagccccccg 300
cagtctgcgg acttagcggc tggtggtcag ggccggctct ctctggattc ttccgctcca 360
caggagtttt ccatcccaca aaacaccgtg ggggatagct actataccaa tccgacggca 420
attggcagca tgaatcatac acaaccatac atggatgtcc actcatcgca tttgtcatcg 480
gcacagccct atgcttcaca ggcggccact gctggtggaa tcgctcatta cccccagtat 540
catcagcaac cgcctgtatt gcagccggcg tccactactt atggccccgc cagttcctat 600
caatacgcgt atcctggcgg tgtcacatcg tcccaacctg gcccgcaacc tcccacaaca 660
tcagtgagca gccaggtccc agctcagctg ttaccactgc cagttaccag ccacactgtt 720
gcacctgcgg gatacggaaa caataccgga acgcctatgc aaggctacgt gtacgatgct 780
acaggtcaag tagctccgcc cggtgccaaa ccacgggtca cagccacctt gtgggaggac 840
gaaggcagcc tttgctacca ggttgaagct agaggggtct gtgttgcccg ccgagaagat 900
aatcatatga taaacggaac caaactgctc aacgttgctg gcatgactag aggtcgccgc 960
gacgggattc tcaagagcga aaaggttcgt catgtagtca agattggtcc aatgcatctc 1020
aaaggagttt ggatcccatt tgagcgtgcc ttggagtttg ccaacaaaga gaagatcacc 1080
gaccttttgt accctttgtt tgtgcacaat atcggaggtc ttctgtacca tcccactaac 1140
cagacccgga caaacatggt tgtgcaggaa tcgcagcaac ggcggttaga aggtcctcaa 1200
gccacgcggg cttcgcaggg gccacagccc cctgctttgc accatcacca ctcgctacaa 1260
actccggttc catcgcacat gtctcagccc cacgcaatga cgtctcagtc tgctgccagg 1320
cctggtcttg atcgcgccca cactttcccg accccccctg ctagcgcgtc cagtctcatg 1380
ggcatcacca accaggggag ctcctatgag tggggtaacc aaggaatgaa ctcgggtgtt 1440
cctaacacac aacctctatc gattgacacg acattgagta acgcacgatc gatgcctacc 1500
actccggcca cgacgccccc aggcagtaat atgcaaggga tgcaagcata tcagagtcag 1560
tccggatacg ataactcgaa atcgtactac tcagccgctc ctccgtccca ccctcaatat 1620
gctccccagc aacccttgac ccagcctatg gctccttacg gccagactat gcccgccaat 1680
acgtatatca agaacgacat ggcgcctccg acggcaagga cttcaggggg accatcagat 1740
gtagagcaag ctgatgtgaa ggctgaccgt tacgcccaaa ctaatgggca cgttagcaat 1800
ggagcgggtg agcctgtacc cgagcatgag cctgagtacg tgcaacatga tagtgcaggc 1860
tataacacca accgcggatc ttacacatac actaccaacc cttctgttgg aagcttggcg 1920
ggtgatcatt ctcaactcgc gtctgatatg tctggctccc cctcgcaaca gaacgggtcc 1980
ggacgcatga ctccccgtac tagcggggcg cctccccaat gggcctcggg atacaatacg 2020
cctccccgat ccgctgctgt cagcagcctc tacaatagcg tcagcgaaac tcgcggtgcg 2080
tcggcgaacg gaacgactga taattactct gtggcgtcga atccagcacc gggttactcg 2140
acggggatga acggaccttt ggggtcagga aagcgtatgc gggaggatga tgatgtggac 2200
caaatcgttc gaccagacag tcggggtgcg gaatatgaga gcaagcgccg gaagactctg 2260
actgaagcga cggttggtgg tccggttgga ggagtaccac ttggattaca gccgatgaag 2320
gccggtggtg ttatggctcg ccgccggtaa 2350
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 5
cacgtgatgc ttccttgctg cgaaccg 27
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 6
cttaagccgg cggcgagcca taac 24
Claims (5)
1.一种黄曲霉毒素菌株的构建方法，其特征在于，包括步骤：
采用原生质体转化法将敲除载体pAoG转化至米曲霉菌株A.oryzae 2351中，构建营养缺陷型菌株；
构建RafA基因异源表达载体pEX1-RafA，以及StuA基因异源表达载体pEX2B-StuA；
采用原生质体转化法将所述RafA基因异源表达载体pEX1-RafA或StuA基因异源表达载体pEX2B-StuA转化至所述营养缺陷型菌株中，构建制得黄曲霉毒素菌株。
2.根据权利要求1所述黄曲霉毒素菌株的构建方法，其特征在于，构建RafA基因异源表达载体pEX1-RafA的步骤包括：
以含黄曲霉毒素合成调控基因RafA的质粒为模板，设计对应RafA引物并克隆基因RafA，所述基因RafA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，所述RafA引物的核苷酸序列为SEQ IDNO.2-3；
将所述基因RafA与表达载体pEX1通过酶切和酶连处理，构建RafA基因异源表达载体pEX1-RafA。
3.根据权利要求1所述黄曲霉毒素菌株的构建方法，其特征在于，构建StuA基因异源表达载体pEX2B-StuA的步骤包括：
以含黄曲霉毒素合成调控基因StuA的质粒为模板，设计对应StuA引物并克隆基因StuA，所述基因StuA的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，所述StuA引物的核苷酸序列为SEQ IDNO.5-6；
将所述基因StuA与表达载体pEX2B通过酶切和酶连处理，构建StuA基因异源表达载体pEX2B-StuA。
4.一种黄曲霉毒素菌株，其特征在于，采用权利要求1-3任一所述黄曲霉毒素菌株的构建方法制得。
5.一种黄曲霉毒素菌株的应用，其特征在于，将权利要求1-3任一构建方法制得的黄曲霉毒素菌株用于生产黄曲霉毒素。
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