CN116004697A - 一种异源产虫草素的米曲霉工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种异源产虫草素的米曲霉工程菌及其构建方法与应用,其中,构建方法包括步骤:基于蛹虫草基因组构建基因CCM‑04436异源表达载体和基因CCM‑04436异源表达载体,将所述基因CCM‑04436异源表达载体和基因CCM‑04437异源表达载体转化至米曲霉中,构建得到异源产虫草素的米曲霉工程菌。本发明将米曲霉菌株作为异源表达宿主工程菌株,通过将基因CCM‑04436异源表达载体和基因CCM‑04437异源表达载体分别转化至米曲霉双缺陷型营养菌株(A.oryzaeΔpyrGΔHis)中得到转化子AO1和AO2,再以AO1为背景菌株转化基因CCM‑04437异源表达载体得到同时转化两个基因的转化子AO12,在重组构建的米曲霉中实现异源合成虫草素。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,特别涉及一种异源产虫草素的米曲霉工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
丝状真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)是一种好气性丝状真菌,归属于半知菌亚门丝孢纲曲霉属的一种常见菌种。目前米曲霉被广泛应用于食品行业方面,米曲霉作为酱油发酵及清酒酿造的使用菌种已有近千年的历史,被美国FDA和WHO认定为安全生产菌株。其次就是米曲霉具有较强产生和分泌大量蛋白的能力,与大肠杆菌和酵母相比,米曲霉具有强大的翻译后修饰功能,如糖基化、蛋白酶的切割和二硫键的形成等修饰。现如今国内外对于米曲霉的应用主要在基因调控,外源蛋白表达和次级产物开发等方面。基因组学和现代遗传改造技术的发展与应用,对米曲霉基因功能的研究,提高了米曲霉在工业上的应用潜力。
代谢工程米曲霉作为常用的工程菌株,具有生物安全、发酵周期短、适于大规模工业生产等优点,在生产有价值和复杂的天然产物方面可能比当前的异源平台更具优势。目前,在米曲霉中已经实现了多种代谢产物的异源合成,例如来自红曲霉的柠檬绿素生物合成基因簇在米曲霉中转录,首次报道引入整个基因簇在米曲霉中次生代谢产物异源产生。米曲霉可用作从细菌合成聚酮化合物的替代宿主,即使是那些需要有毒或非天然底物的细菌。目前已有研究表明虫草素生物合成必需基因CCM-04436和CCM-04437在酿酒酵母中表达能产生虫草素。虽然酿酒酵母中外源生物合成虫草素的含量较低,但随着虫草素的生物合成和调控机制的阐明,对蛹虫草中虫草素生物合成必需基因进行异源表达在工程菌株米曲霉中,是代谢产物异源产生的可行途径。
因此,现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种异源产虫草素的米曲霉工程菌及其构建方法与应用,旨在解决现有米曲霉不能产生虫草素的问题。
本发明的技术方案如下:
一种异源产虫草素的米曲霉工程菌的构建方法,其中,包括步骤:
以蛹虫草基因组中的CCM-04436基因为模板设计第一引物,根据所述第一引物从所述蛹虫草基因组中扩增得到CCM-04436克隆片段,所述CCM-04436克隆片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.1,所述第一引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2-3;
将所述CCM-04436克隆片段与载体pEX1同源重组,得到基因CCM-04436异源表达载体;
以蛹虫草基因组中的CCM-04437基因为模板设计第二引物,根据所述第二引物从所述蛹虫草基因组中扩增得到CCM-04437克隆片段,所述CCM-04437克隆片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.4,所述第二引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.5-6;
将所述CCM-04437克隆片段与载体pEX2D同源重组,得到基因CCM-04437异源表达载体;
将所述基因CCM-04436异源表达载体和基因CCM-04437异源表达载体分别转化至米曲霉双缺陷型营养菌株中,构建得到异源产虫草素的米曲霉工程菌AO1和AO2,再以AO1为背景菌株转化基因CCM-04437异源表达载体得到同时转化两个基因的转化子AO12。
一种异源产虫草素的米曲霉工程菌,其中,采用本发明所述异源产虫草素的米曲霉工程菌的构建方法制得。
一种异源产虫草素的米曲霉工程菌的应用,其中,将本发明构建方法制得的异源产虫草素的米曲霉工程菌用于生产虫草素。
有益效果:本发明将米曲霉菌株作为异源表达宿主工程菌株,通过将基因CCM-04436异源表达载体和基因CCM-04437异源表达载体分别转化至米曲霉双缺陷型营养菌株(A.oryzaeΔpyrGΔHis)中得到转化子AO1和AO2,在以AO1为背景菌株转化基因CCM-04437异源表达载体得到同时转化两个基因的转化子AO12,在重组构建的米曲霉中实现异源合成虫草素。
附图说明
图1为本发明一种异源产虫草素的米曲霉工程菌的构建方法流程图。
图2为pEX1和pEX2D载体图谱,A为pEX1该双元载体携带米曲霉pyrG表达盒和由PgpdA启动子控制的GFP基因;B为pEX2D该二元载体携带米曲霉His表达盒,由PgpdA启动子控制的DsRed基因。
图3为蛹虫草CCM-04436异源表达米曲霉载体的构建的电泳图。A:泳道1为pEX1质粒对照,泳道2、3为XhoⅠ单酶切pEX1质粒线性化片段;B:泳道1和2为蛹虫草CCM-04436基因扩增;C:阳性单克隆验证。
图4为蛹虫草CCM-04437异源表达米曲霉载体的构建的电泳图。A:泳道1为pEX2D质粒对照,泳道2、3为PmlⅠ单酶切pEX2D质粒线性化片段;B:泳道1和2为蛹虫草CCM-04437基因;C:阳性单克隆验证。
图5为蛹虫草CCM-04436/CCM-04437异源表达到米曲霉的电泳胶图。A:泳道1,9,17为野生型对照,泳道2~8为米曲霉突变体AO1使用His F/R引物进行背景验证;10~16为米曲霉突变体AO1使用GFP F/R引物验证;18~24为米曲霉突变体AO1使用SEQ ID NO.2-3引物验证;B:a:1~4为米曲霉突变体AO2使用引物His F/R引物进行验证;5~8为米曲霉突变体AO2使用DsRed F/R引物验证;b:1、3、5为野生型,2、4、6为米曲霉突变体AO2过表达CCM-04437其中一株菌株,分别使用His F/R、DsRed F/R、SEQ ID NO.5-6引物验证。
图6为蛹虫草虫草素合成基因CCM-04436和CCM-04437同时异源表达到米曲霉的验证电泳图。泳道1~4为米曲霉突变体AO12使用SEQ ID NO.2-3引物验证;泳道5~8为米曲霉突变体AO12使用SEQ ID NO.5-6引物验证。
图7为米曲霉转化子报告基因表达情况。A-C分别是AO1、AO2、AO12三株转化子的菌丝体在荧光显微镜下观察;A、B和C从左到右依次为白光视野、荧光视野和白光荧光叠加。
图8为虫草素保留时间(5.88min左右)。
图9为虫草素标准曲线。峰面积为横坐标(x),虫草素浓度为横坐标(y),制作标准曲线,线性回归方程为y=0.00009x+1.4114,R2=0.9995,线性范围为0~83μg/mL。
图10为米曲霉发酵液样品HPLC色谱图。A-D分别是空白对照和三株转化子AO1、AO2、AO12通HPLC检测虫草素含量,发现AO1和AO12均在5.88min左右显示虫草素的峰。
图11为米曲霉发酵液样品虫草素含量。AO1和AO12转化子虫草素含量分别为4.908μg/mL和6.436μg/mL。
具体实施方式
本发明提供一种异源产虫草素的米曲霉工程菌及其构建方法与应用,为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确,以下对本发明进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
请参阅图1,图1为本发明提供的一种异源产虫草素的米曲霉工程菌的构建方法流程图,如图所示,其包括步骤:
S10、以蛹虫草基因组中的CCM-04436基因为模板设计第一引物,根据所述第一引物从所述蛹虫草基因组中扩增得到CCM-04436克隆片段,所述CCM-04436克隆片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.1,所述第一引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2-3;
S20、将所述CCM-04436克隆片段与载体pEX1同源重组,得到基因CCM-04436异源表达载体;
S30、以蛹虫草基因组中的CCM-04437基因为模板设计第二引物,根据所述第二引物从所述蛹虫草基因组中扩增得到CCM-04437克隆片段,所述CCM-04437克隆片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.4,所述第二引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.5-6;
S40、将所述CCM-04437克隆片段与载体pEX2D同源重组,得到基因CCM-04437异源表达载体;
S50、将所述基因CCM-04436异源表达载体和基因CCM-04437异源表达载体分别转化至米曲霉双缺陷型营养菌株(A.oryzaeΔpyrGΔHis)中,构建得到异源产虫草素的米曲霉工程菌AO1和AO2,在以AO1为背景菌株转化基因CCM-04437异源表达载体得到同时转化两个基因的转化子AO12。
具体来讲,本发明将米曲霉菌株作为异源表达宿主工程菌株,通过将基因CCM-04436异源表达载体和基因CCM-04437异源表达载体分别转化至米曲霉双缺陷型营养菌株(A.oryzaeΔpyrGΔHis)中得到转化子AO1和AO2,在以AO1为背景菌株转化基因CCM-04437异源表达载体得到同时转化两个基因的转化子AO12,在重组构建的米曲霉中实现异源合成虫草素。
在一些实施方式中,还提供一种异源产虫草素的米曲霉工程菌,其采用本发明所述异源产虫草素的米曲霉工程菌的构建方法制得。
在一些实施方式中,还提供一种异源产虫草素的米曲霉工程菌的应用,将本发明构建方法制得的异源产虫草素的米曲霉工程菌用于生产虫草素。
下面通过具体实施例对本发明做进一步的解释说明:
实施例1
异源产虫草素的米曲霉工程菌的构建:
1、以蛹虫草基因组中的CCM-04436基因为模板设计第一引物,根据所述第一引物从所述蛹虫草基因组中扩增得到CCM-04436克隆片段,所述CCM-04436克隆片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.1,所述第一引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2-3,在扩增过程中,Taq酶PCR条件为预变性:95℃5min;变性:94℃30sec;退火:54℃30sec;延伸:72℃1000bp/min;34次循环;再延伸:72℃10min;16℃10min;
2、以相应的限制性内切酶XhoⅠ对pEX1质粒进行单酶切制备,将所述CCM-04436克隆片段与线性化载体pEX1(如图2所示)使用重组酶采用一步连接法进行同源重组,得到基因CCM-04436异源表达载体(如图3所示),重组连接反应条件为PRC仪50℃反应15min,4℃保温10min;
3、以蛹虫草基因组中的CCM-04437基因为模板设计第二引物,根据所述第二引物从所述蛹虫草基因组中扩增得到CCM-04437克隆片段,所述CCM-04437克隆片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.4,所述第二引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.5-6,在扩增过程中,Taq酶PCR条件为预变性:95℃5min;变性:94℃30sec;退火:54℃30sec;延伸:72℃1000bp/min;34次循环;再延伸:72℃10min;16℃10min;
4、以相应的限制性内切酶PmlⅠ对pEX2D质粒进行单酶切制备,将所述CCM-04437克隆片段与线性化载体pEX2D(如图2所示)使用重组酶采用一步连接法进行同源重组,得到基因CCM-04437异源表达载体(图4所示),重组连接反应条件为PRC仪50℃反应15min,4℃保温10min;
5、将所述基因CCM-04436异源表达载体和基因CCM-04437异源表达载体转化的农杆菌感受态,并在相应抗性LB培养基中培养至OD600为1.0~1.5(28℃ 200r/min);预诱导:1mL菌液与9mL液体IM培养基(含40mmol/L的MES和200μmol/L的AS)混合,28℃、200r/min摇6h至OD600为0.6~0.8;共培养:取100μL预诱导液与100μL的孢子液(浓度约为1×107个/mL)混合涂到IM(含40mmol/L的MES和200μmol/L的AS)固体培养基上,22℃,暗培养48~60h。在米曲霉菌丝出来之前加入对应的筛选培养基筛选转化子(含孢噻肟钠300μg/mL,用于除农杆菌),22℃培养7~10d。
6、筛选培养基上长出来的单克隆菌落,通过枪头挑取少量菌丝置于含50μL无菌水的1.5mL离心管中,微波炉高火加热7~8min,放置冰上5min,快速提取DNA,通过PCR扩增,检测转化子阳性克隆。所用引物为His F/R、GFP F/R、DsRed F/R,KOD酶PCR条件为预变性:95℃3min;变性:98℃10sec;退火:54℃30sec;延伸:68℃1000bp/min;34次循环;再延伸:68℃10min;16℃10min;构建得到异源产虫草素的米曲霉工程菌。
实施例2
米曲霉工程菌的构建
1、以蛹虫草基因组中的CCM-04436基因为模板设计第一引物,根据所述第一引物从所述蛹虫草基因组中扩增得到CCM-04436克隆片段,所述CCM-04436克隆片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.1,所述第一引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2-3,在扩增过程中,Taq酶PCR条件为预变性:95℃5min;变性:94℃30sec;退火:54℃30sec;延伸:72℃1000bp/min;34次循环;再延伸:72℃10min;16℃10min;
2、将所述CCM-04436克隆片段与载体pEX1同源重组,得到基因CCM-04436异源表达载体;
3、将所述基因CCM-04436异源表达载体转化至米曲霉中,构建得到异源产虫草素的米曲霉工程菌AO1(如图5所示)。
实施例3
米曲霉工程菌的构建
1、以蛹虫草基因组中的CCM-04437基因为模板设计第二引物,根据所述第二引物从所述蛹虫草基因组中扩增得到CCM-04437克隆片段,所述CCM-04437克隆片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.4,所述第二引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.5-6,在扩增过程中,Taq酶PCR条件为预变性:95℃5min;变性:94℃30sec;退火:54℃30sec;延伸:72℃1000bp/min;34次循环;再延伸:72℃10min;16℃10min;
2、将所述CCM-04437克隆片段与载体pEX2D同源重组,得到基因CCM-04437异源表达载体;
3、将所述基因CCM-04437异源表达载体转化至米曲霉中,构建得到米曲霉工程菌AO2(如图5所示)。
实施例4
以上述得到的AO1为背景菌株转化基因CCM-04437异源表达载体得到同时转化两个基因的米曲霉工程菌AO12(如图6所示)。
样品液体发酵:分别挑取异源表达米曲霉菌株(AO1,AO2,AO12)及未作任何处理的米曲霉原始菌株A.oryzaeΔpyrGΔHis(其中未作处理的原始菌株作空白对照),置于DPY(分别添加His、Uri/Ura、AO12不需添加额外营养成分)液体培养基中30℃,150r/min振荡培养,培养2天的米曲霉,经擦镜纸过滤,收集滤液。
对异源表达米曲霉菌株(AO1,AO2,AO12)的报告基因表达情况进行测试,结果如图7所示,图7中A-C分别是AO1、AO2、AO12三株转化子的菌丝体在荧光显微镜下观察图片,A、B和C从左到右依次为白光视野、荧光视野和白光荧光叠加。
HPLC样品的制备:液体发酵收集滤液经0.22μm滤膜过滤后置于样品瓶中。
测定虫草素含量的液相色谱条件:色谱柱:C18(4.6×150mm,5μm),柱温:35.0℃,进样体积10μL,流动相:A:甲醇;B:水。等度洗脱:12%甲醇+88%水。检测器为紫外(UV),波长260nm。
如图8和9所示,通过标准曲线和虫草素标准品的保留时间可知,保留时间在5.88min左右是虫草素的峰。如图10和11所示,液体发酵滤液样品经HPLC分析检测在保留时间为5.88min左右,CCM-04436在米曲霉工程菌株得到转化子AO1显示虫草素的峰,发酵液中虫草素含量为4.908μg/mL,同时异源表达CCM-04436和CCM-04437在米曲霉工程菌株得到转化子AO12显示虫草素的峰,其发酵液中虫草素含量为6.436μg/mL。因此,异源表达CCM-04436、同时表达CCM-04436和CCM-04437在米曲霉均能检测到虫草素的峰。
应当理解的是,本发明的应用不限于上述的举例,对本领域普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换,所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 深圳技术大学
<120> 一种异源产虫草素的米曲霉工程菌及其构建方法与应用
<160> 6
<210> 1
<211> 2379
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 1
atggccatga acgagaacgc ttatccgact acatttccat cctttgaacg ggaaaatcac 60
cgtgatgcat tgcgtcaacc ctttgacccg gcgtttcgac gcacctggtc gaatggggtg 120
gccctccgac agctcgtcga cttcgcacga ccgaccgtgg ccaaccacac catgtcgtat 180
gccctgattg agtactgtct tagccgcctg ccgatgcagc acctggagcg gctgggacag 240
ctcaagattc ccgtcgagct tcacgcagcc ccctttcagt acctgcagaa gcaccaccgc 300
gcctgtggct ttgactgggt ggagcgcttc gtctggcgaa cccacgatct gcacaagccc 360
tacaattttc tccgcccgga actgctcctg gcgcaggaat ccggctcaca gaggatcgtc 420
gccctcctca ccatcatgcc tggggaagac tacatccgcc actatgcgag catcctcgag 480
gtcgcgcagc acgacggcgc aatctcctcg catcacggac cgatccgctg cgtgctgtat 540
ccgcacctca cgcagtccat gatggcctgg acaggactga cagagctctc cctcagcgtt 600
gagcctggcg atattctgat tctcggcttc gtcgccgagc tgctccctcg gtttgcttct 660
ctcgtgccca ccgcgcgagt cattgggcga caagacgcgc agtactacgg tcttgtccgg 720
cttgagctcc gcccggggct cgtcttcagc ctcatcggtg ccaagtacag ctactggggc 780
aacctaggcg ggcgcgtcgt ccgggagctg gccgcccgca gaccgcgcgc catctgctac 840
attgctaagc agggcaccct cctgtcgccg ggcgacatcc accgcacaat ctactcgccc 900
acccggtact gcgtctttga caagggccaa gcctgctggc acggagacga tcactcagcc 960
ctgcccatca acccactctc atcgagattc cccacatttg atcgcggcct gcatgtgtcg 1020
acgcccacca tcgtggagca ggatgtcgac tttcggacac aagtggaggc ccatggcgct 1080
tcctccgttg ataacgaatt ggcgcagatg gcaagagcgc tcacggacgt gcatgaagag 1140
aacccctcga tggagcgcgt ccagttactg cctctcatgt tcattaccga ctatctccga 1200
cgcccggaag agctgggaat gacagtgccg ttcgacctta catcgcgcaa cgaaactgtg 1260
catcgcaaca aggaattgtt cctggccagg tctgcccacc tggttctgga agcttttaac 1320
gtcatcgagc gccccaaggc catcatagtg gggacgggat atggtgtcaa gaccattctg 1380
ccagccctgc agaggcgcgg agttgaagtc gttggattgt gcggcggtcg tgaccgtgcc 1440
aagacggagg ccgcggggaa caaacacggt ataccatgca ttgatgtctc tttggccgaa 1500
gtgcaagcaa ctcacggcgc caatctgctc tttgtcgctt ctccgcacga taagcatgct 1560
gctcttgtcc aggaggccct tgacctcggc ggctttgaca ttgtatgcga gaagccactt 1620
gccttggaca tggcaacgat gcgacatttt gccaatcaat cacaaggctc ctctcagctg 1680
cgcttgatga accaccctct ccgcttctac ccgccgctca ttcagctcaa ggcggcctcc 1740
aaagaaccaa gcaacattct ggccattgac attcagtact tgactcggcg gctgtccaag 1800
ctcacccatt ggagcgctgg cttctccaaa gccgccggag gaggcatgat gctagccatg 1860
gccactcatt tcctcgatct catcgaatgg ctcacgagtt cgtcactcac cccggcctcg 1920
gtgcaagaca tgtccacatc gaactcgatt ggtccgctac cgaccgaaga tgctggagcc 1980
accaagactc ccgatgtcga gtcggccttc cagatgaacg gctgctgcgg cctgtccaca 2040
aagtactcgg tggactgtga cggtgctgca gacactgaac tattttccgt cacgctccgt 2100
cttgacaatg agcacgagct tcgatttatc cagagaaagg gaagccctgt tctgctggaa 2160
cagcgcctcc ctggccgaga atggttgccg ctcaaggttc attgggagca gcgcgtgcga 2220
gagggctcgc cgtggcaaat ctccttccag tactttgcgg aagaactggt cgaggcaatc 2280
tgcatgggaa caaggtcggc gtttgcggac aaagccacag ggttcagcga ctatgctaga 2340
caagtcggcg tctttggatc caaggtgggc atagcctga 2379
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 2
gagcagacat caccctcgag atggccatga acgagaacgc 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 3
atggtaccta cgtactcgag ggctatgccc accttggatc 40
<210> 4
<211> 1038
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 4
atgtcttgtc ctaccagcgc cggtgtcctc cagactcacc agctcctcaa tgacaacagc 60
atcttgattc gggatgaaat ctacggggag gagctggttt cggagccagt tctcgtagag 120
ctgctccaga gcgcagaggt tcagcgactt cagggcatct gccaacacgg agtcacggga 180
ttcttgggca tcacgccgcg tgtcacacgc ctcgagcatt cggtcggtgc atttatactc 240
gtgcgaagag tcggtgccgc gctcgacgag caagtcgcag ccctgctcca tgacatttct 300
cacaccactc tcagtcatgt cattgaccac gccctctcca agcctgggga gggaagctac 360
cacgaggtgc acaaggcgcg gtatctcaag acgacgcggc tgcccgacat tgtcgccaaa 420
cacggcatca gccagaaggt ttttgaagaa gagctgtttc cgctggtgga gatgccgtcg 480
cctcaactgt gcgccgaccg cctcgactac gctctacgcg acgccgtcag ctttggcaag 540
ctggccatgg aagacgcaca aaaggttgtc tcgtctctcc gggcatttcc gagtgcgaca 600
acggcccggc gtctgctcgt cctcgacgat gccgaggtcg ctctgacgct gtcccgcgca 660
tacacgacga cggacaagga tgtctggtcg aacccggccc acatcgacat gtacgagcgg 720
acgggccgcg tgattggcga gctggtcgag gccggctctg tcgaggacaa ggtgctgtgg 780
caggtctcgg acgccgagtt ttggacgatg ctccgccaag cagcgaaccc ggagcagcga 840
cgcgccattg agcggctgga aacggagggc gtcccagagg acgacggcct cgagctgcca 900
cactgcgcca agatccgcac tcttgaccca gacgtctggc cgcgagggga aaagcaaccg 960
gcgccgctgt ccattgtgtt gccgacgtgg ggaacggagc gacagcagta cattctgagc 1020
cgcacgcagc atcgatga 1038
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 5
cacagaaggc atttcacgtg atgtcttgtc ctaccagcgc 40
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 6
tccttaagca cgggcacgtg tcgatgctgc gtgcggctc 39
Claims (3)
1.一种异源产虫草素的米曲霉工程菌的构建方法,其特征在于,包括步骤:
以蛹虫草基因组中的CCM-04436基因为模板设计第一引物,根据所述第一引物从所述蛹虫草基因组中扩增得到CCM-04436克隆片段,所述CCM-04436克隆片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.1,所述第一引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2-3;
将所述CCM-04436克隆片段与载体pEX1同源重组,得到基因CCM-04436异源表达载体;
以蛹虫草基因组中的CCM-04437基因为模板设计第二引物,根据所述第二引物从所述蛹虫草基因组中扩增得到CCM-04437克隆片段,所述CCM-04437克隆片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.4,所述第二引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.5-6;
将所述CCM-04437克隆片段与载体pEX2D同源重组,得到基因CCM-04437异源表达载体;
将所述基因CCM-04436异源表达载体和基因CCM-04437异源表达载体分别转化至米曲霉双缺陷型营养菌株中,构建得到异源产虫草素的米曲霉工程菌AO1和AO2,再以AO1为背景菌株转化基因CCM-04437异源表达载体得到同时转化两个基因的转化子AO12。
2.一种异源产虫草素的米曲霉工程菌,其特征在于,采用权利要求1所述异源产虫草素的米曲霉工程菌的构建方法制得。
3.一种异源产虫草素的米曲霉工程菌的应用,其特征在于,将权利要求1构建方法制得的异源产虫草素的米曲霉工程菌用于生产虫草素。
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Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109312335A (zh) * | 2016-01-11 | 2019-02-05 | 斯坦福大学托管董事会 | 嵌合蛋白和调节基因表达的方法 |
CN111093679A (zh) * | 2017-07-12 | 2020-05-01 | 瑞非生物科技有限公司 | 用于条件调控基因表达的方法和系统 |
CN113151017A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-07-23 | 浙江工业大学 | 过表达虫草素的重组蛹虫草 |
CN115058444A (zh) * | 2022-06-28 | 2022-09-16 | 深圳技术大学 | 一种黄曲霉毒素菌株及其构建方法与应用 |
WO2023056429A1 (en) * | 2021-09-30 | 2023-04-06 | The Trustees Of Dartmouth College | Anti-nmdar2b antibodies, antibody-drug conjugates, and chimeric antigen receptors, and compositions and methods of use |
-
2022
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Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109312335A (zh) * | 2016-01-11 | 2019-02-05 | 斯坦福大学托管董事会 | 嵌合蛋白和调节基因表达的方法 |
CN111093679A (zh) * | 2017-07-12 | 2020-05-01 | 瑞非生物科技有限公司 | 用于条件调控基因表达的方法和系统 |
CN113151017A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-07-23 | 浙江工业大学 | 过表达虫草素的重组蛹虫草 |
WO2023056429A1 (en) * | 2021-09-30 | 2023-04-06 | The Trustees Of Dartmouth College | Anti-nmdar2b antibodies, antibody-drug conjugates, and chimeric antigen receptors, and compositions and methods of use |
CN115058444A (zh) * | 2022-06-28 | 2022-09-16 | 深圳技术大学 | 一种黄曲霉毒素菌株及其构建方法与应用 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
YONGLIANG XIA 等: "Fungal Cordycepin Biosynthesis Is Coupled with the Production of the Safeguard Molecule Pentostatin", 《CELL CHEMICAL BIOLOGY》 * |
ZHENG 等: "Genome sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris, a valued traditional chinese medicine", 《GENOME BIOLOGY》 * |
刘文静: "虫草素生物合成关键酶基因克隆与分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库(电子期刊)》 * |
李鸿宇: "氧化还原调控蛹虫草菌虫草素代谢的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库(电子期刊)》 * |
鲍大鹏;万佳宁;卢绪志;余养朝;张光忠;茅文俊;王莹;周陈力;: "杂交技术培育金针菇尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株", 核农学报, no. 02 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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