CN117229934A - 一种合成类胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种合成类胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。所述基因工程菌以产类胡萝卜素的酵母工程菌株为出发菌，敲除了编码血红素依赖性低氧基因阻遏因子的基因ROX1，同时上调表达编码参与NADPH再生转录因子的基因STB5、编码液泡蛋白分选途径E类蛋白的基因DID2和编码在V‑ATP酶V0区组装中发挥作用的内质网蛋白的基因VOA1。本发明通过对类胡萝卜素合成途径外的基因表达进行组合调控，促进类胡萝卜素合成，显著提高类胡萝卜素的产量，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高效合成类胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
通过基因工程手段构建工程菌株，实现类胡萝卜素异源生物合成，已经获得了很大的进展。目前，多数研究通过改变类胡萝卜素合成途径酶的来源、活性和表达水平来促进类胡萝卜素的合成。但是，由于底盘生物具有复杂的代谢网络，类胡萝卜素的异源生物合成受到看似无关的基因的影响。
除了直接参与类胡萝卜素合成途径的基因之外，已有多种途径外的基因被报道对类胡萝卜素产量产生影响。例如，通过筛选酿酒酵母敲除文库，发现敲除转录因子编码基因ROX1或者减数分裂控制蛋白编码基因SSP1都能提高类胡萝卜素产量(Carotenoid-basedphenotypic screen of the yeast deletion collection reveals new genes withroles in isoprenoid production.Metabolic Engineering,2013,15:174-183)；在产异戊二烯的菌株中，敲除或者下调MPC3都能够使异戊二烯的产量提高约20％(通过综合调控构建高产异戊二烯酿酒酵母.浙江大学,2020)；随机诱变发现敲除细胞壁甘露糖蛋白编码基因DAN4能够促进虾青素合成(Astaxanthin overproduction in yeast by strainengineering and new gene target uncovering.Biotechnology for Biofuels,2018,11:230)；在产番茄红素酿酒酵母工程菌株中过表达转录因子STB5和线粒体NADH激酶POS5(Efficient production of lycopene in Saccharomyces cerevisiae by enzymeengineering and increasing membrane flexibility and NAPDH production.AppliedMicrobiology and Biotechnology,2019,103(1):211-223)和在产β-胡萝卜素酿酒酵母工程菌株中过表达超氧化物歧化酶SOD1(Transcriptome analysis reveals a promotionof carotenoid production by copper ions in recombinant Saccharomycescerevisiae.Microorganisms,2021,9(2):233)均能提高目标类胡萝卜素产量。这些研究结果均表明，在类胡萝卜素合成中，目标途径之外的基因在其中同样发挥了重要作用，不容忽视。
然而，这些途径外基因靶点之间是否存在相互作用，以及这些基因靶点的组合能否对不同类胡萝卜素的产量带来正面影响，仍需进一步探讨。实际研究中发现，简单地将两个或多个有利的基因操作组合在一起有可能带来的是负面影响。因此，如何合理调控合成途径以外的基因促进类胡萝卜素的生物合成，是本领域技术人员需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够高效合成类胡萝卜素的基因工程菌，利用微生物异源合成方式制备类胡萝卜素，通过调控类胡萝卜素合成途径之外的基因靶点促进类胡萝卜素的生物合成。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种合成类胡萝卜素的基因工程菌，所述基因工程菌以产类胡萝卜素的酵母工程菌株为出发菌，敲除了编码血红素依赖性低氧基因阻遏因子的基因ROX1，同时上调表达编码参与NADPH再生转录因子的基因STB5、编码液泡蛋白分选途径E类蛋白的基因DID2和编码在V-ATP酶V0区组装中发挥作用的内质网蛋白的基因VOA1；其中，ROX1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，STB5的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，DID2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，VOA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明通过基因敲除技术手段沉默ROX1基因的表达；利用基因编辑技术将基因组中STB5、DID2、VOA1基因上游的启动子替换成强启动子或者在基因组中额外整合STB5、DID2、VOA1基因拷贝，或者往宿主菌中导入包含了STB5、DID2、VOA1的重组表达质粒等方式使得STB5、DID2、VOA1基因上调表达。本发明通过对上述类胡萝卜素合成途径以外的基因的表达进行组合调控，促进类胡萝卜素的合成，实现以安全、高效的酿酒酵母为细胞工厂大量生产类胡萝卜素。
优选的，所述基因工程菌还包括：以产类胡萝卜素的酵母工程菌株为出发菌，下调表达编码参与控制减数分裂核分裂的蛋白质的基因SSP1，SSP1的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。本发明可通过将基因组中SSP1上游的启动子替换成弱启动子以下调基因表达。
优选的，所述基因工程菌染色体上STB5、DID2、VOA1基因上游的启动子为TEF1启动子，SSP1基因上游的启动子为BTS1启动子。更为优选，TEF1启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；BTS1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
所述出发菌产类胡萝卜素的酵母工程菌株采用本领域公知的具有产类胡萝卜素功能的酵母菌株。所述类胡萝卜素可以为但不限于β-胡萝卜素、斑蝥黄和虾青素。
进一步的，所述产类胡萝卜素的酵母工程菌株为产β-胡萝卜素的工程菌株、产斑蝥黄的工程菌株或产虾青素的工程菌株。
优选的，所述产β-胡萝卜素的工程菌株采用工程菌株Ycarot-02，为公众可获得材料。
优选的，所述产斑蝥黄的工程菌株为以产β-胡萝卜素的工程菌株为出发菌，在基因组中插入或者利用重组表达质粒导入编码β-胡萝卜素酮化酶的基因构建得到。
优选的，所述产虾青素的工程菌株为以产β-胡萝卜素的工程菌株为出发菌，在基因组中插入或者利用重组表达质粒导入编码β-胡萝卜素酮化酶的基因和编码β-胡萝卜素羟化酶的基因构建得到。
更为优选，所述编码β-胡萝卜素酮化酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述编码β-胡萝卜素羟化酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明还提供了一种构建所述的合成类胡萝卜素的基因工程菌的方法，所述构建方法包括：以产类胡萝卜素的酵母工程菌株为出发菌，利用基因编辑技术敲除ROX1、将染色体上STB5、DID2、VOA1基因上游的启动子均替换为强启动子或者在染色体上额外整合STB5、DID2、VOA1基因拷贝，获得所述的合成类胡萝卜素的基因工程菌；
或者，以产类胡萝卜素的酵母工程菌株为出发菌，利用基因编辑技术敲除ROX1，再导入包含了STB5、DID2、VOA1的重组表达质粒，获得所述的合成类胡萝卜素的基因工程菌。
进一步的，所述构建方法还包括利用基因编辑技术将染色体上SSP1基因上游的启动子替换为弱启动子。
优选的，基因STB5、DID2和VOA1的上游均具有TEF1启动子，基因SSP1的上游具有BTS1启动子。目标基因在强启动子PTEF1的作用下表达量提高，目标基因在弱启动子PBTS1的作用下表达量降低。
本发明通过组合调控ROX1、STB5、DID2、VOA1、SSP1等类胡萝卜素合成途径以外的基因的表达，构建了能够高效生产类胡萝卜素的基因工程菌。具体的，所述的构建方法包括以下步骤：
(1)以产类胡萝卜素的工程菌株为出发菌，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除基因组中编码血红素依赖性低氧基因阻遏因子的基因ROX1；
(2)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将基因组中编码参与NADPH再生的转录因子基因STB5、编码液泡蛋白分选途径的E类蛋白基因DID2和编码在V-ATP酶V0区组装中发挥作用的内质网蛋白基因VOA1上游的天然启动子均替换为TEF1启动子；
(3)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将基因组中编码参与控制减数分裂核分裂的蛋白质的基因SSP1上游的天然启动子替换为BTS1启动子，获得所述的合成类胡萝卜素的基因工程菌。
进一步的，所述产类胡萝卜素的工程菌株为产β-胡萝卜素的工程菌株、产斑蝥黄的工程菌株或产虾青素的工程菌株，对应的发酵产物分别为β-胡萝卜素、斑蝥黄、虾青素。
本发明还提供了所述的合成类胡萝卜素的基因工程菌在制备类胡萝卜素中的应用。各类胡萝卜素从本发明构建的基因工程菌株的发酵培养物中制备得到。
进一步的，所述类胡萝卜素为β-胡萝卜素、斑蝥黄或虾青素。
具体的，所述应用包括：将所述的合成类胡萝卜素的基因工程菌扩大培养后，接种于YPD液体培养基中，振荡培养，得到发酵液；收集发酵液中的菌体，细胞破碎后萃取相应的类胡萝卜素。
利用有机相萃取剂提取细胞破碎液中的类胡萝卜素，优选萃取剂为丙酮。
优选的，发酵的条件为：200～250rpm，28～30℃恒温摇床中培养72～84小时。
与现有技术相比，本发明具备的有益效果：
本发明提供了一种高产类胡萝卜素的重组基因工程菌，以产类胡萝卜素的酵母工程菌株为底盘细胞，通过组合调控类胡萝卜素合成目标途径之外的基因表达，具体包括敲除ROX1，上调STB5、DID2和VOA1基因的表达，以促进类胡萝卜素合成，显著提高类胡萝卜素的产量，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为途径外基因文库的筛选结果，其中A为用于初筛的酵母转化平板；B为A中框起来区域的局部放大，箭头所示的单个菌落颜色更红，可能具有更高的β-胡萝卜素产量；C为第二轮筛选，将初筛中挑选的阳性菌落点样接种在新的平板上；D为第二轮筛选菌株产β-胡萝卜素的高效液相色谱分析。
图2为实施例3中途径外基因靶点敲除对于β-胡萝卜素产量的影响。
图3为实施例3中途径外基因靶点上调对于β-胡萝卜素产量的影响。
图4为实施例3中途径外基因靶点下调对于β-胡萝卜素产量的影响。
图5为实施例3中途径外基因组合调控对于β-胡萝卜素产量的影响。
图6为途径外基因组合调控对于斑蝥黄产量的影响。
图7为途径外基因组合调控对于虾青素产量的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
本发明用于构建类胡萝卜素生产菌的出发菌株为本课题组前期构建的Ycarot-02，该菌使得Gal4p蛋白不再受半乳糖调控而受葡萄糖调控可以摆脱传统诱导型启动子需外源添加诱导剂的问题，从而可以通过葡萄糖浓度的变化将酿酒酵母生长和产物合成分开以减少外源蛋白表达对于菌体产生的代谢负担，其构建方法参考文献(Alleviation ofmetabolic bottleneck by combinatorial engineering enhanced astaxanthinsynthesis in Saccharomyces cerevisiae.Enzyme and Microbial Technology,2017,100:28-36.)。
质粒pSpSgH、pSaSgH、pSpH和pAID6参见文献(Combinatorial metabolicengineering using an orthogonal tri-functional CRISPR system.NatureCommunications,2017,8:1688)。
质粒pUMRI-11-PGAL1-PMSeV-C-OBKTM29-TADH1参见文献(Construction ofcanthaxanthin-producing yeast by combining spatiotemporal regulation andpleiotropic drug resistance engineering.ACS Synthetic Biology,2022,11(1):325-333)。
质粒p426-SpSgH、p426-ccdB、p423-LbSgH、pUMRI-11-PGAL1-OCrtZM1-PGAL10-OBKTM29、p416-TEF1-Cas9-CYC1-G418、pSg121和p426-DLY参见文献(Spatiotemporalregulation of astaxanthin synthesis in S.cerevisiae.ACS Synthetic Biology,2022,11(8):2636-2649)。
虾青素产量对照菌株YM4的构建方法参见文献(Spatiotemporal regulation ofastaxanthin synthesis in S.cerevisiae.ACS Synthetic Biology,2022,11(8):2636-2649)。
本发明中核苷酸序列从5’至3’的方向从左向右书写。
实施例1：构建与类胡萝卜素合成相关的类胡萝卜素合成途径之外的靶点的gRNA质粒文库
1、途径外靶点库的检索与整理
通过文献检索共收集了28个与类胡萝卜素生物合成相关的途径外基因靶标，如表1所示。
表1.与类胡萝卜素生物合成相关的途径外基因靶标
| 基因名称 | 功能 | 拟进行操作 |
| YKR035W-A(DID2) | 液泡蛋白分选途径的E类蛋白 | 上调 |
| YGR106C(VOA1) | 在V-ATP酶V0区组装中发挥作用的内质网蛋白 | 上调 |
| YGL166W(ACE1) | 铜结合转录因子 | 上调 |
| YJR104C(SOD1) | 超氧化物歧化酶 | 上调 |
| YGL055W(OLE1) | 脂肪酸去饱和酶 | 上调 |
| YHR178W(STB5) | 转录因子 | 上调 |
| YPL188W(POS5) | 线粒体NADH激酶 | 上调 |
| YMR070W(MOT3) | 转录因子 | 敲除 |
| YGR240C(PFK1) | 异八聚体磷酸果糖激酶的α亚基 | 敲除 |
| YDR068W(DOS2) | 功能未知 | 敲除 |
| YER134C | 镁依赖性酸性磷酸酶 | 敲除 |
| YNR063W(PUL4) | 推测为锌簇转录因子 | 敲除 |
| YGR259C | 功能未知 | 敲除 |
| YPR065W(ROX1) | 转录因子 | 敲除 |
| YPL062W | 功能未知 | 敲除 |
| YJL064W | 功能未知 | 敲除 |
| YLR085C(ARP6) | 结合核小体的肌动蛋白相关蛋白 | 敲除 |
| YIL074C(SER33) | 3-磷酸甘油脱氢酶/α-酮戊二酸还原酶 | 敲除 |
| YNL280C(ERG24) | 脱氢胆固醇还原酶14 | 敲除 |
| YDR215C | 功能未知 | 敲除 |
| YHR184W(SSP1) | 参与控制减数分裂核分裂的蛋白质 | 下调 |
| YOR291W(YPK9) | 液泡蛋白，可能在贮存重金属方面发挥作用 | 下调 |
| YER060W-A(FCY22) | 可能为嘌呤-胞嘧啶渗透酶 | 下调 |
| YOR389W | 功能未知 | 下调 |
| YJR151C(DAN4) | 细胞壁甘露糖蛋白 | 下调 |
| YIL169C(CSS1) | 功能未知 | 下调 |
| YBR012W-B | 逆转录转座子 | 下调 |
| YGR243W(MPC3) | 线粒体丙酮酸载体的保守亚基 | 下调 |
2、gRNA质粒文库的构建(所用引物见表2，所构建的质粒见表3)
为了构建gRNA质粒文库，首先构建针对表1中每个单个靶点的gRNA质粒。使用Benchling平台为每个基因靶标设计合适的gRNA序列(https://www.benchling.com)。然后将gRNA经退火形成带粘性末端的双链后通过T4 DNA连接酶分别连接到用BsaI-HFv2线性化的pSpSgH、pSaSgH或p423-LbSgH质粒上。
为了构建gRNA质粒文库，使用表2中三对引物扩增单个gRNA表达盒，在BsaI-HFv2消化后形成不同的粘性末端，并通过Golden-Gate组装连接到pSpH质粒上。
表2.用于构建途径外基因gRNA质粒文库的引物
表3.gRNA质粒文库
/>
实施例2：高通量筛选有利于类胡萝卜素合成的靶点
1、敲除donor文库的构建(所用引物见表4)
用于敲除的donor，以引物自身为模板，通过HSDNA聚合酶进行扩增，形成100bp的DNA片段，并使用乙醇沉淀进行浓缩。
表4.用于构建敲除donor的引物
/>
2、高通量筛选
使用LiAc/SS载体DNA/PEG方法(High-efficiency yeast transformation usingthe LiAc/SS carrier DNA/PEG method.Nature Protocols,2007,2(1):31-34)先将表达三个Cas蛋白的pAID6质粒用PmeⅠ线性化之后转化到Ycarot-02中，整合到酵母基因组上，再将实例1中构建的gRNA质粒文库和实例2步骤1中构建的敲除donor文库转化到酵母中，涂布于SD-HIS-平板上。根据转化平板上单菌落的颜色进行第一轮初步筛选，挑选颜色比较红的菌落通过点样的方式接种到新的平板上进行第二轮筛选，单菌落的颜色越红，产量可能越高。从第二轮平板上筛选得到的菌株经活化接种到摇瓶中进行摇瓶发酵培养。通过HPLC分析，确定产量提高的菌株。
基因工程菌的发酵培养及产物的提取与分析：
(1)从划线的平板中挑取工程菌的单菌落接种于5mL YPD培养基中培养大约46小时，将菌株接种于50mL YPD液体培养基中，使初始OD600nm为0.05。进行发酵，220rpm，30℃恒温摇床中培养84小时。
(2)收集0.2mL酵母发酵液至2mL离心管中，12000rpm离心2min，弃上清，然后用1mL蒸馏水清洗两次，离心弃上清，向离心管中加入约0.5mL体积的研磨珠(0.1mm和0.5mm的氧化锆珠子各半)，向离心管中加入200μL的丙酮，重悬菌体。
(3)将装有珠子和菌体的离心管，置于全自动样品快速研磨仪中，65HZ，研磨5min。
(4)研磨完后，向离心管中加入800μL丙酮，充分混匀，并置于超声5min。
(5)超声后，将该离心管置于4℃离心机中12000rpm，2min，收集上清到新的2mL离心管中。
(6)将萃取液用0.22μm有机系滤头过滤，待进HPLC检测。
使用下列条件，通过HPLC检测酿酒酵母工程菌株中各类胡萝卜素及其含量。液相分析仪器为岛津LC-20AT，色谱柱为Amethyst C18-H column(4.6×150mm,5μm)检测波长470nm。采用梯度洗脱，流动相A泵为乙腈和纯水(9:1)，B泵为甲醇和异丙醇(3:2)，流速为1mL/min，梯度洗脱条件如下：0-15min，B泵流动相从0升到90％；15-27min，B泵流动相保持不变为90％；27-28min，B泵流动相从90％降到0；27-35min，B泵流动相保持不变为0。
结果如图1所示，通过上述方式，经过两轮颜色初筛，63个单菌落被确定可能具有较高的β-胡萝卜素产量，并接种到摇瓶中进行第三轮筛选。通过HPLC分析，57个菌株被确认为阳性突变体，其中β-胡萝卜素产量的最高增幅达到185.36％。菌株编号为11、36、45、60和63的五个菌株的产量反而比原始菌株低。
3、阳性靶点的确定
使用酵母质粒提取试剂盒从阳性突变体中提取gRNA质粒，在大肠杆菌Top 10中扩增，并通过DNA测序确定gRNA质粒对应的基因靶点，其中出现频率较高的几个靶点如表5所示。
表5.阳性靶点出现的频率
实施例3：通过途径外基因组合调控高产β-胡萝卜素
1、敲除靶点的反向工程菌株的构建
利用表6中的引物，根据实施例1和2构建针对YJL064W和ROX1靶点的单一和组合gRNA质粒(单一gRNA的质粒骨架是p426-SpSgH，组合gRNA的质粒骨架是p426-ccdB)以及敲除的donor。将p416-TEF1-Cas9-CYC1-G418、gRNA质粒(单一和组合)和敲除donor按照实施例2的转化方法转化到Ycarot-02中，分别构建了Ycar-1(ΔYJL064W)、Ycar-2(ΔROX1)、Ycar-3(ΔYJL064W+ΔROX1)。
表6.构建敲除靶点的donor所需要的引物
| YJL064W-donor-59F | agccgtatcgttcaccacataggcggagtaaacttcattagggggcatgatgatcacat |
| YJL064W-donor-59R | cagaagaaacaagagagaatagcgtcaggatagctcgctcgatgtgatcatcatgcccc |
| ROX1-donor-59F3 | gaaaatactaatacttcttcacacaaaagaacgcagttagacaatcaacagcaacactg |
| ROX1-donor-59R3 | aaatcatttcggagaaactaggctagttttagcggtgacctcagtgttgctgttgattg |
按照实施例2的方法进行菌株培养及产物的提取与分析，结果如图2所示，相比于对照菌株Ycarot-02，单独敲除ROX1位点的菌株Ycar-2的β-胡萝卜素产量提高了24.2％，但是单独敲除YJL064W反而会极大地降低β-胡萝卜素的产量，并且同时敲除ROX1和YJL064W也会降低β-胡萝卜素的产量。
2、上调靶点的反向工程菌株的构建
利用表7中的引物，根据实施例1构建针对DID2、STB5、VOA1和POS5靶点的启动子区域的单一和组合gRNA质粒(单一gRNA的质粒骨架是p426-SpSgH，组合gRNA的质粒骨架是p426-ccdB)。以酿酒酵母BY4741为模板，用HSDNA聚合酶进行扩增出带同源臂的TEF1启动子，作为整合donor。将p416-TEF1-Cas9-CYC1-G418、gRNA质粒(单一和组合)和donor按照实施例2的转化方法转化到Ycar-2中，分别构建了Ycar-4(↑POS5)、Ycar-5(↑STB5)、Ycar-6(↑DID2)、Ycar-7(↑VOA1)、Ycar-8(↑POS5+↑DID2+↑VOA1)、Ycar-9(↑STB5+↑DID2+↑VOA1)、Ycar-10(↑POS5+↑STB5)。
表7.上调靶点反向工程所需的引物
按照实施例2的方法进行菌株培养及产物的提取与分析，结果如图3所示，相较于Ycar-2，同时上调STB5、DID2和VOA1的菌株Ycar-9的β-胡萝卜素产量提高了58.8％；分别单独上调POS5、STB5、DID2和VOA1也能提高β-胡萝卜素的产量，但是作用效果没有同时上调STB5、DID2和VOA1这三个基因时明显；同时上调POS5、DID2和VOA1这三个基因或者同时上调POS5和STB5两个基因时不利于β-胡萝卜素积累。
3、下调靶点的反向工程菌株的构建
利用表8中的引物，根据实施例1构建针对MPC3、SSP1和DAN4靶点的启动子区域的单一和组合gRNA质粒(单一gRNA的质粒骨架是p426-SpSgH，组合gRNA的质粒骨架是p426-ccdB)。以酿酒酵母BY4741为模板，用HSDNA聚合酶进行扩增出带同源臂的BTS1启动子，作为整合donor。将p416-TEF1-Cas9-CYC1-G418、gRNA质粒(单一和组合)和donor按照实施例2的转化方法转化到Ycar-9中，分别构建了Ycar-11(↓MPC3)、Ycar-12(↓SSP1)、Ycar-13(↓DAN4)、Ycar-14(↓MPC3+↓SSP1)、Ycar-15(↓MPC3+↓DAN4)、Ycar-16(↓SSP1+↓DAN4)、Ycar-17(↓MPC3+↓SSP1+↓DAN4)。/>
表8.下调靶点反向工程所需的引物
按照实施例2的方法进行菌株培养及产物的提取与分析，结果如图4所示，相较于Ycar-9，单独下调SSP1的菌株Ycar-12的β-胡萝卜素产量提高了4.1％，下调SSP1的作用效果不显著，其它单独下调和组合下调的策略都会降低β-胡萝卜素的产量。
如图5所示，Ycar-12中的β-胡萝卜素产量为153.0mg/L，相比出发菌株Ycarot-02提高了51.0％。
实施例4:高产斑蝥黄酵母工程菌株的构建
1、构建整合donor
β-胡萝卜素酮化酶编码基因(β-carotene ketolase variant,OBKTM29)为本课题组前期优化获得，核苷酸序列如SEQ ID NO.8示。
用HSDNA聚合酶以表9中的引物扩增出带同源臂的PGAL1-PMSeV-C-OBKTM29-TADH1表达盒，作为整合donor。模板所用质粒pUMRI-11-PGAL1-PMSeV-C-OBKTM29-TADH1。
表9.克隆β-胡萝卜素酮化酶编码基因OBKTM29所需用到的引物
| 引物名称 | 引物序列(5’to 3’) |
| DPP1-TADH1-59F | tgaatcaccgttgatgcctttatggagaaaaatggtggcctgaattggagcgacctcat |
| DPP1-TCYC1-59R | atcgacgaaatgatgtctgtaatcttgagttctggatagcttcgagcgtcccaaaacct |
2、产斑蝥黄酿酒酵母的构建
将p416-TEF1-Cas9-CYC1-G418、gRNA质粒(pSg121)和整合donor分别转化到Ycarot-02和实施例3构建的Ycar-12中，使得PGAL1-PMSeV-C-OBKTM29-TADH1分别整合到Ycarot-02、Ycar-12基因组的DPP1位点上，得到Ycan-1和Ycan-2。
3、基因工程菌的发酵培养及产物的提取与分析
按照实施例2的方法进行菌株培养及产物的提取与分析，结果如图6所示，Ycan-2中的斑蝥黄产量为148.6mg/L，相比对照菌株Ycan-1提高了34.0％。
实施例5:高产虾青素酿酒酵母的构建
1.构建整合donor
β-胡萝卜素羟化酶编码基因(β-carotene hydroxylase variant,OCrtZM1)为本课题组前期优化获得，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
用HSDNA聚合酶以表10中的引物分别扩增出带同源臂的TADH1-OBKTM29-PGAL10-PGAL1-OCrtZM1-TCYC1表达盒和PGAL1-OCrtZM1-TCYC1表达盒，作为整合donor。模板所用质粒pUMRI-11-PGAL1-OCrtZM1-PGAL10-OBKTM29。
用表10中的引物按照实例2的步骤1构建YPL062W位点的100bp敲除donor。
表10.构建产虾青素酿酒酵母用到的引物
| 引物 | 序列(5’→3’) |
| DPP1-TADH1-59F | tgaatcaccgttgatgcctttatggagaaaaatggtggcctgaattggagcgacctcat |
| DPP1-TCYC1-59R | atcgacgaaatgatgtctgtaatcttgagttctggatagcttcgagcgtcccaaaacct |
| LPP1-PGAL1-59F | agctatactactttcagtacatgataattggtctatgtacggattagaagccgccgagc |
| LPP1-TCYC1-59R | ataacgttttgatatactggggtcatcaagactaaattccttcgagcgtcccaaaacct |
| YPL062W-donor-59F | aaactaaaaaccgtactcacaactttccgcggacgctaacagacaaatagccttgttag |
| YPL062W-donor-59R | tttgatgtgttactcaaccgttaaatcgctgtttgagctgactaacaaggctatttgtc |
2、产虾青酿酒酵母的构建
将p416-TEF1-Cas9-CYC1-G418、gRNA质粒(p426-DLY)和整合/敲除donor转化到实施例3构建的Ycar-12中，使得TADH1-OBKTM29-PGAL10-PGAL1-OCrtZM1-TCYC1表达盒和PGAL1-OCrtZM1-TCYC1表达盒分别整合到Ycar-12基因组的DPP1和LPP1位点上，同时敲除YPL062W位点，得到Yast-3。
3、基因工程菌的发酵培养及产物的提取与分析
按照实施例2的方法进行菌株培养及产物的提取与分析，如图7所示，Yast-3中的虾青素产量为21.5mg/L，相比对照菌株YM4(由Ycarot-02转入OBKTM29和OCrtZM1而得)提高了63.9％。
Claims (10)
1.一种合成类胡萝卜素的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以产类胡萝卜素的酵母工程菌株为出发菌，敲除了编码血红素依赖性低氧基因阻遏因子的基因ROX1，同时上调表达编码参与NADPH再生转录因子的基因STB5、编码液泡蛋白分选途径E类蛋白的基因DID2和编码在V-ATP酶V0区组装中发挥作用的内质网蛋白的基因VOA1；其中，ROX1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，STB5的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，DID2的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，VOA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.如权利要求1所述的合成类胡萝卜素的基因工程菌，其特征在于，所述产类胡萝卜素的酵母工程菌株为产β-胡萝卜素的工程菌株、产斑蝥黄的工程菌株或产虾青素的工程菌株。
3.如权利要求1或2所述的合成类胡萝卜素的基因工程菌，其特征在于，还包括下调表达编码参与控制减数分裂核分裂蛋白质的基因SSP1，SSP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.如权利要求3所述的合成类胡萝卜素的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌染色体上STB5、DID2、VOA1基因上游的启动子为TEF1启动子；SSP1基因上游的启动子为BTS1启动子。
5.如权利要求1-4任一项所述的合成类胡萝卜素的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括：以产类胡萝卜素的酵母工程菌株为出发菌，利用基因编辑技术敲除ROX1、将染色体上STB5、DID2、VOA1基因上游的启动子均替换为强启动子或者在染色体上额外整合STB5、DID2、VOA1基因拷贝，获得所述的合成类胡萝卜素的基因工程菌；
或者，以产类胡萝卜素的酵母工程菌株为出发菌，利用基因编辑技术敲除ROX1，再导入包含了STB5、DID2、VOA1的重组表达质粒，获得所述的合成类胡萝卜素的基因工程菌。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，还包括利用基因编辑技术将染色体上SSP1基因上游的启动子替换为弱启动子。
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以产类胡萝卜素的工程菌株为出发菌，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除基因组中编码血红素依赖性低氧基因阻遏因子的基因ROX1；
(2)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将基因组中编码参与NADPH再生转录因子的基因STB5、编码液泡蛋白分选途径E类蛋白的基因DID2和编码在V-ATP酶V0区组装中发挥作用的内质网蛋白的基因VOA1上游的天然启动子均替换为TEF1启动子；
(3)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将基因组中编码参与控制减数分裂核分裂的蛋白质的基因SSP1上游的天然启动子替换为BTS1启动子，获得所述的合成类胡萝卜素的基因工程菌。
8.如权利要求1-4任一项所述的合成类胡萝卜素的基因工程菌在制备类胡萝卜素中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述类胡萝卜素为β-胡萝卜素、斑蝥黄或虾青素。
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于，包括：将所述的合成类胡萝卜素的基因工程菌扩大培养后，接种于YPD液体培养基中，振荡培养，得到发酵液；收集发酵液中的菌体，细胞破碎后萃取相应的类胡萝卜素。
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- 2023-09-06 CN CN202311145116.XA patent/CN117229934A/zh active Pending
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| CN116286899A (zh) * | 2023-05-12 | 2023-06-23 | 昆明理工大学 | 一种NADH激酶基因RkNADHK1及其应用 |
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