CN114107079B - 一种耐油酿酒酵母基因工程菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

一种耐油酿酒酵母基因工程菌及其构建方法，属于生物工程技术领域。本发明公开了一株过表达Are2和Yft2基因的同时替换SEI1及Tgl1基因的酿酒酵母基因工程菌，所述酿酒酵母由原始酿酒酵母利用同源重组技术替换基因后改造而成。由于原始菌株BY4741自身存储甾醇类物质的量有限，并且过量积累的脂质中间体会产生产物抑制作用，不仅直接影响目标产物的合成，而且会引发细胞毒性，降低细胞活力。改造后的耐油酿酒酵母基因工程菌较原始出发菌株显著提升了细胞油脂存储单元脂滴结构的体积占比，有效地降低了脂质累积引起的细胞毒性和产物抑制，显著提升了酯类化合物的胞内累积量，为突破酯类类化合物酿酒酵母从头合成极限提供了新的策略以及良好的耐受细胞模型。

Description

一种耐油酿酒酵母基因工程菌及其构建方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种耐油酿酒酵母基因工程菌及其构建方法。

背景技术

脂类化合物是一种多样且普遍存在的化合物，如脂肪酸、磷脂、甾醇、鞘脂、萜烯等，具有许多关键的生物学功能，参与细胞膜的结构组成、能量的储存和信号转导等过程，是医药、食品及大宗化学品的代表性产品。

酿酒酵母具有较为完备的遗传操作优势、分子信息的高获得性、传代时间短、易于培养和对有机溶剂的高耐受性，经常被用作通过代谢工程生产高价值药物的重要底盘。通过强化脂肪酸合成途径，实现在酿酒酵母细胞底盘的脂肪醇、脂肪酸及其衍生物的高效合成，从而搭建油脂平台化合物的从头合成的新途径。此外，酿酒酵母具有内源性的甲羟戊酸途径，能够稳定提供前体异戊烯焦磷酸、二磷酸二甲基烯丙酯和2,3-环氧角鲨烯，其完整内膜系统和翻译后修饰有利于环化酶和P450酶的活性表达，借助其完善的遗传操作平台，已成为萜类化合物、黄酮类化合物等多种输水性酯类化合物从头合成的重要底盘，以构建了包括紫杉二烯、青蒿酸，法呢烯、α-檀香烯、人参皂甙、香叶醇等多种天然产物的从头合成路径。由此可见，酿酒酵母作为酯类化合物从头的合成底盘，具有重要的开发及应用潜力。

在酿酒酵母发酵生产酯类化合物的反应体系中，廉价的油酸作为油脂合成前体，是替代葡萄糖等简单碳源促进酯类化合物细胞合成的重要碳源替代物。此外，在输水性油脂化合物发酵合成路线中，油-水两相反应体系的应用不但能够及时富集产物在油相的累积，减轻水相细胞中的产物抑制效应，也同时能够简化后续产品的分离提取，是一种理想的微生物发酵体系。但大部分野生型酿酒酵母在油酸培养基生长条件下呈现生物量明显降低，细胞耐受差等表型，不利于油酸碳源的有效利用及脂质化合物的高效转化。因此，利用基因工程改造技术获得油脂耐受性较高的酿酒酵母菌对提升脂质化合物的从头合成及廉价碳源利用具有重要意义。

脂质的合成、运输、储存和其他过程都受到酿酒酵母内膜系统的动态和精确调节，是最终影响产量的关键因素。由于细胞内空间有限，单纯提高关键限速酶的活性无法彻底突破细胞脂质合成和储存的限制。近年来，细胞器的理性改造技术已成为除了强化目标产物代谢通量之外的另一种合理强化策略。其中，脂滴作为酵母细胞脂质储存最重要的细胞器，以中性脂质为核心，由单层磷脂包裹，允许细胞将非极性分子储存在特定的隔间中，实现非极性分子与细胞的水环境的隔离。脂滴结构的修饰和储存的加强有效地降低了脂质积累引起的细胞毒性和产物抑制，使细胞突破了脂质合成的极限。因此，如何通过定向的基因工程改造提升细胞脂滴存储单元，减轻细胞内脂质积累和提高单细胞的脂质存储量效率对强化输水性酯类化合物在酿酒酵母细胞的高效合成尤为重要。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种耐油酿酒酵母基因工程菌及其构建方法的技术方案。

本发明第一方面提供了一种耐油酿酒酵母基因工程菌。

为了实现上述技术问题，本发明选取Are2(NC_001146.8)、Yft2(NC_001136.10)、SEI1(NC_001144.5)及Tgl1(NC_001143.9)基因作为改造对象，构建酿酒酵母基因工程菌，以增加脂滴大小及含量，降低脂质积累引起的细胞毒性和产物抑制，使细胞突破脂质合成极限，具体是通过原始酿酒酵母过表达Are2和Yft2基因，同时靶向敲除SEI1及Tgl1基因后获得了耐油酿酒酵母基因工程菌株，所述Are2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Yft2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述原始酿酒酵母为BY4741，购自欧洲酿酒酵母功能分析中心(http://www.euroscarf.de/search.php？name＝Order)。

进一步地，上述四个目标基因是结合油酸诱导的应激模型及适应性驯化菌株的转录组差异基因及其功能注释筛选获得。在酵母细胞中，甾醇通常以游离甾醇或甾酯形式存在，其中甾酯为甾醇的储存形式，甾醇的酯化与水解可以缓冲游离甾醇的过量与缺乏，使其达到稳态。其中，乙酰辅酶A甾醇酰基转移酶Are2可使游离甾醇酯化转变为储存形式；乙酰辅酶A二磷酸酶Yft2能维持内质网膜稳定并影响细胞能量稳态；而酿酒酵母中的Tgl1和SEI1蛋白对甾醇的储存可能具有逆向影响，因此选择上述基因进行定向改造。

本发明第二方面提供了一种耐油酿酒酵母基因工程菌的构建方法。

为了实现上述技术问题，本发明通过以下步骤实现：

(1)提取原始酿酒酵母的基因组DNA；

(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，在SEI1基因的上下游各设置同源臂且同源臂不包含此靶向序列；以上游同源臂、G418抗性基因序列、Are2基因序列和下游同源臂为模板，通过融合PCR扩增得到SEI1::Are2基因替换组件；

(3)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，在Tgl1基因的上下游各设置同源臂且同源臂不包含此靶向序列；以上游同源臂、hph抗性基因序列、Yft2基因序列和下游同源臂为模板，通过融合PCR扩增得到Tgl1::Yft2基因替换组件；

(4)将步骤(2)和(3)得到的SEI1::Are2及Tgl1::Yft2基因替换片段转化至原始酿酒酵母感受态中，即得SEI1::Are2及Tgl1::Yft2基因替换的酿酒酵母基因工程菌。

进一步，步骤(2)中Are2基因启动子替换成GAP强启动子，所述GAP强启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步，步骤(2)中SEI1::Are2基因替换组件的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步，步骤(3)中Yft2基因启动子替换成GAP强启动子，所述GAP强启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步，步骤(3)中Tgl1::Yft2基因替换组件的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

进一步，步骤(4)中利用含有500ug/mLG418和500ug/mLhph的YPD培养基筛选获得阳性转化子，得到SEI1::Are2和Tgl1::Yft2双基因替换的酿酒酵母基因工程菌。

本发明第三方面提供了一种耐油酿酒酵母基因工程菌在提升酿酒酵母耐油性中的应用。

本发明第四方面提供了耐油酿酒酵母基因工程菌表型鉴定及高通量筛选的方法。

为了实现上述技术问题，本发明通过以下方法实现：

其中，耐油酿酒酵母基因工程菌株于YPD培养基中进行48h培养，期间每隔6h在超净台中吸取适量培养细胞悬浮液并稀释至适当浓度，通过分光光度计测量OD₆₀₀值；

其中，所述高通量筛选方法为尼罗红染色法。在二甲基亚砜中溶解尼罗红，然后将其添加到培养后的细菌溶液中，保持其最终浓度为2μg/ml，并在30℃下培养20min。吸取5μl孵育后的混合溶液滴在载玻片上，放置于荧光电子显微镜下，使用光学通道及RFP荧光立方体通道(Ex＝531/40；Em＝593/40)进行观察。

本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一株过表达Are2和Yft2基因的同时替换SEI1及Tgl1基因的酿酒酵母基因工程菌，细胞结构中油脂存储单元结构脂滴含量较原始菌株BY4741显著提升，在油酸等含油培养基条件下细胞耐受显著提高，并且胞内脂质组分也成明显的提升，突破了酿酒酵母细胞脂质合成的限制，为有效提高酯类化合物在酿酒酵母的从头合成提供了良好的底盘和改造策略。

附图说明

图1油脂耐受菌株BY4741-SEI1::Are2/Tgl1::Yft2基因整合片段的序列结构；

图2显微镜观察耐油酿酒酵母菌株及原始菌株的脂滴结构差异。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：耐油酿酒酵母菌株的构建

1.1 SEI1::Are2基因替换组件的构建

(1)以原始酿酒酵母BY4741的基因组DNA及pUG6质粒为模板﹐利用普通PCR扩增得到SEI1基因上游、G418抗性基因、GAP启动子、Are2基因、CYC1终止子和SEI1基因下游同源臂扩增片段；PCR反应体系见表1，PCR反应条件如下：1)98℃预变性5min；2)98℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，三个步骤进行30次循环，72℃再延伸10min。其中，退火温度取决于引物的Tm值，72℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb·min^-1)。通过琼脂糖凝胶电泳，切胶回收PCR扩增得到上述基因片段。表1PCR反应体系：

(2)以步骤(1)得到的6段基因为模板，以up-F1为上游引物，以down-R1为下游引物(up-F1核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，down-R1核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)，利用融合PCR技术扩增SEI1::Are2基因替换组件。反应体系见表2，PCR反应条件如下：1)98℃预变性5min；2)98℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸5min，三个步骤进行35次循环，72℃再延伸10min。其中，退火温度取决于引物的Tm值，72℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb·min^-1)。反应完成后利用琼脂糖凝胶电泳切胶回收，得到酿酒酵母SEI1::Are2基因替换组件。基因替换组件的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。表2PCR反应体系：

1.2 Tgl1::Yft2基因替换组件的构建

(1)以原始酿酒酵母BY4741的基因组DNA及pSH69质粒为模板﹐利用普通PCR扩增得到Tgl1基因上游、hph抗性基因、GAP启动子、Yft2基因、CYC1终止子和Tgl1基因下游同源臂扩增片段；PCR反应体系见表1，PCR反应条件如下：1)98℃预变性5min；2)98℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，三个步骤进行30次循环，72℃再延伸10min。其中，退火温度取决于引物的Tm值，72℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb·min^-1)。通过琼脂糖凝胶电泳，切胶回收PCR扩增得到上述基因片段。

(2)以步骤(1)得到的6段基因为模板，以up-F2为上游引物，以down-R2为下游引物(up-F2核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，down-R2核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)，利用融合PCR技术扩增Tgl1::Yft2基因替换组件。反应体系见表2，PCR反应条件如下：1)98℃预变性5min；2)98℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸5min，三个步骤进行35次循环，72℃再延伸10min。其中，退火温度取决于引物的Tm值，72℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb·min^-1)。反应完成后利用琼脂糖凝胶电泳切胶回收，得到酿酒酵母Tgl1::Yft2基因替换组件。基因替换组件的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

1.3酿酒酵母菌株感受态制备

(1)挑取酿酒酵母菌株BY4741接种于YPD液体培养基，于30℃、180r/min过夜培养，得到活化种子液；

(2)按照体积比1％的接种比例，将种子液转接至100mL新鲜的YPD液体培养基，于30℃、180r/min继续培养至菌液OD₆₀₀在0.6-0.8之间；

(3)将步骤(2)得到的菌液冰水浴预冷30min，低温高速离心机4℃、5300r/min离心5min收集菌体；

(4)用25mL预冷无菌水重悬菌体，低温高速离心机4℃、5300r/min离心5min收集菌体，重复两次；用10mL预冷的1M醋酸锂水溶液重悬菌体，低温高速离心机4℃、5300r/min离心5min收集菌体；

(5)用1mL预冷的1M醋酸锂水溶液重悬菌体，13500r/min高速离心10s收集菌体；

(6)用1mL 1M醋酸锂水溶液重悬菌体，分装每管100μL。

1.4酿酒酵母菌株感受态转化及转化子的鉴定

(1)1.3所得分装后的菌液取1管，按照顺序将化转所需试剂及1.1、1.2得到的基因敲入组件各加入5μL。反应体系见表3，置于30℃摇床培养30min后立即放入42℃水浴加热30min；取出后13500r/min高速离心30s，弃上清，加入800μL液体YPD培养基30℃摇床震荡培养2h。

(2)涂布于含有500ug/mL G418和500μg/mL hph的YPD培养基平板上，于30℃培养至菌落长出；

(3)挑取步骤(3)得到的转化子作为模板，使用验证引物(核苷酸序列如SEQIDN0.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDN0.12和SEQ ID NO.13所示)进行菌落PCR扩增以鉴定SEI1::Are2和Tgl1::Yft2基因被替换成功的阳性转化子。PCR反应体系见表3，PCR反应条件如下：1)98℃预变性5min；2)98℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，三个步骤进行30次循环，72℃再延伸10min。其中，退火温度取决于引物的Tm值，72℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb·min^-1)。

表3 PCR反应体系：

(4)挑选阳性转化子接入5mL含有500μg/mL G418和500μg/mL hph的YPD液体培养基中活化24h，与灭菌的30％甘油1:1混合，-80℃保藏。

实施例2：油酸诱导应激下酿酒酵母细胞活力比较

挑取野生型BY4741及改造菌的单菌落，接种于YPO种子液培养24h，收集细胞，用YPO培养基将细浓度稀释至OD₆₀₀＝0.1后，将出发菌及改造菌株分别接种于96孔板中(200μL/孔)培养72h，每组实验做3个复孔，期间每隔24h进行四唑盐(MTT)细胞活力检测。

上述YPO培养基配方如下：0.3％酵母粉、0.5蛋白胨、0.6％葡萄糖、0.5％KH₂PO₂、0.2％油酸，并添加0.2％tween-80溶解油酸。

MTT细胞活力的定量分析。30℃培养24，48，72h后分别利用MTT检测法比较出发菌株BY4741和改造菌的细胞活力，在每孔中加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h。2000rpm离心20min后，用枪小心吸取上清，弃掉后在每孔加入100μL二甲基亚砜，室温下置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。将96孔板送样至酶联免疫检测仪，于OD₅₇₀nm处测量各孔的吸光值，若吸光值大于0.7，用二甲基亚砜稀释后事吸光值在(0-0.7范围)。此外，以YPO培养基作为对照，每组设定三个复孔。

MTT细胞活力检测实验结果表明，在油酸应激模型下，油脂耐受菌株BY4741-SEI1::Are2/Tgl1::Yft2在培养48h后，MTT的吸光值为出发菌株的1.35±0.15倍。培养72h后，改造菌株的吸光值为出发菌株的1.78±0.23倍，统计分析表明具有显著性。以上结果提示，在油酸应激模型下，油脂耐受菌株具有更高的细胞活力。

实施例3：尼罗红染色细胞脂滴结构及脂质含量比较

本发明采用尼罗红染色法对细胞的脂滴结构进行染色。收集30℃，YPD培养基培养24h的BY4741及BY4741-SEI1::Are2/Tgl1::Yft2油脂耐受细胞，取1mL菌液进行染色实验。在二甲基亚砜中溶解尼罗红，然后将其添加到培养后溶液中，保持其最终浓度为2μg/ml，并在30℃下培养20min。吸取5μL孵育后的混合溶液滴在载玻片上，放置于荧光电子显微镜下，使用光学通道及RFP荧光立方体通道(Ex＝531/40；Em＝593/40)进行观察。在100×视野中观察到宽2.5-5μm、长度4.5-10μm的卵圆形或球形的酿酒酵母细胞，以及细胞内直径约1μm、呈现黄色荧光的脂滴；

结果表明：从图2中可见，油脂耐受细胞内部有较为明显的荧光信号，提示其细胞内部的脂滴结构显著大于出发菌株BY4741。此外，通过酶标仪分别检测540nm尼罗红特异吸收峰和细胞浓度OD₆₀₀的吸光值，并通过两者的比值(RFP₅₄₀/OD₆₀₀)显示单位细胞脂质体的含量，结果显示油脂耐受菌RFP₅₄₀/OD₆₀₀是出发菌株BY4741的1.53±0.14倍。以上结果表明，通过实施例1的细胞构建策略，能够显著提升酿酒酵母细胞中的脂滴比重，从而进一步提升了改造细胞对油脂的耐受性。

实施例4；气相质谱定量比较油脂应激模型下细胞麦角固醇含量差异

30℃,180rpm条件下，YPO培养基摇瓶培养酿酒酵母出发菌株BY4741及油脂耐受菌株BY4741-SEI1::Are2/Tgl1::Yft2，48h后，8000rpm、4℃下离心10min收集细胞(5g湿细胞)，采用皂化提取结合氯仿—甲醇萃取法提取细胞的麦角固醇，比较两种细胞的单位细胞内麦角固醇累积量的差异。具体操作流程如下：

1)配制皂化液，甲醇与4M NaOH(1：1)混合液中加入0.5％焦性没食子酸。

2)加入30mL皂化液，将离心管于80℃水浴摇床中反应3h，在反应过程中尽量避免菌体碎片沉底。

3)将皂化液倒入干净的分液漏斗，取30ml正己烷，利用分液漏斗反复萃取3次，离心去除絮状不溶物。

4)在旋蒸仪中将正己烷旋转蒸干，再加入少许二氯甲烷或乙酸乙酯将产物复溶(体积比1:1)，旋转蒸发至2mL以下，转移至EP管，进行气相质谱(GC-MS)定量检测，并根据麦角固醇标准曲线换算单位细胞的麦角固醇含量，用mg/DCWg表示。

5)GC-MS检测条件：毛细管柱：DB-17MS(30m*0.25mm*0.25μm)；进样口温度：300℃；程序升温：150℃(1min)20℃/min 300℃(10min)；进样量：0.5μL，分流比20:1；载气：He，流速1.0mL/min；传输杆温度：250℃；质量采集范围：28-650Da；源温：230℃；灯丝电流：35μA；电子轰击能量：70eV；四级杆温度：150℃、150℃。

结果表明：在YPO培养基中，油脂耐受菌BY4741-SEI1::Are2/Tgl1::Yft2的麦角固醇含量为3.17mg/gDCW，较原始菌株BY4741的2.37gm/gDCW，提升了33.76％。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种耐油酿酒酵母基因工程菌及其构建方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2185

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggacaaga agaaggatct actggagaac gaacaatttc tccgcatcca aaagctcaac 60

gctgccgatg cgggcaaaag acaatctata acagtggacg acgagggcga actatatggg 120

ttagacacct ccggcaactc accagccaat gaacacacag ctaccacaat tacacagaat 180

cacagcgtgg tggcctcaaa cggagacgtc gcattcatcc caggaactgc taccgaaggc 240

aatacagaga ttgtaactga agaagtgatt gagaccgatg ataacatgtt caagacccat 300

gtgaagactt taagctccaa agagaaggca cggtataggc aagggtcctc taactttata 360

tcgtatttcg atgatatgtc atttgaacac aggcccagta tattagatgg gtcagttaac 420

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cataatggta gcttcaagga ttcggagatc ttgaaattta tgactacgaa tttgttcact 780

gtggcatccg tagatctttt gatgtatttg agcacttatt ttgtcgttgg aatacaatac 840

ttatgcaagt ggggggtctt gaaatggggc actaccggct ggatcttcac ctcaatttac 900

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aacatcccag tgcataagtt tttgttaaga catgtttacc atagttcaat gagttcattc 1680

aaattgaaca agagtcaagc aactttgatg acctttttct taagttccgt cgttcatgaa 1740

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<212> DNA

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attctaccca aaattgggat actacacaat tacttatatc tatgatcatg taattagtta 840

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tatttatatt tcaaattttt cttttttttc tgtacagacg cgtgtacgca tgtaacatta 1020

tactgaaaac cttgcttgag aaggttttgg gacgctcgaa ggctttaatt tgc 1073

<210> 3

<211> 667

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcattatcaa tactgccatt tcaaagaata cgtaaataat taatagtagt gattttccta 60

actttattta gtcaaaaaat tagcctttta attctgctgt aacccgtaca tgcccaaaat 120

agggggcggg ttacacagaa tatataacat cgtaggtgtc tgggtgaaca gtttattcct 180

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attttcttac accttctatt accttctgct ctctctgatt tggaaaaagc tgaaaaaaaa 480

ggttgaaacc agttccctga aattattccc ctacttgact aataagtata taaagacggt 540

aggtattgat tgtaattctg taaatctatt tcttaaactt cttaaattct acttttatag 600

ttagtctttt ttttagtttt aaaacaccaa gaacttagtt tcgaataaac acacataaac 660

aaacaaa 667

<210> 4

<211> 7269

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtaatctag tcgatgccgt ttcaacgaat gatgtgtttt taagaacgag caattctcca 60

tcaagacacg ttccgcacaa taaacaaatt aacagtaaca ataatagtgg tatcaatatc 120

aataataata cctcacacaa ttctaatatt aacatgggta gtaaaaacgc catggtgaat 180

cgtccacata cttttaataa ctattccttg aacaaaacgt ccaggaatcc tattcaacat 240

caatcaagaa aaattgatcc tcatcaaacc gatttatcac ctctggtact tgtccaagat 300

atagatttaa gttttatgga tgatgatatt ttgggcccta gtaaccacaa ttccatgaac 360

tctgtcgtaa atccaactac aggttctcac aactacaata cttttcattc ttccgtacac 420

gcaaaatctt ctcaaaacat ggtcgaggat caagacattg atgacattga tgatgacgat 480

gatgttgatg atgacgatga cgatgacgat gacgatgaca cagaaaatgg ctccagttcc 540

aatggaaaat cagttcataa caacaattac aagatgcctc agcaagctta tatagacgat 600

cctgcgagaa ggctctatgt aatggatcat gaggaacaaa aaccctttaa gtgtccagtt 660

attggttgtg aaaagactta taaaaaccaa aacggtttga agtaccatag gttgcacgga 720

catcagaatc aaaaattaca tgaaaaccct gacggtacat ttagcgtaat agatccagat 780

tcgacagatt cttttggtga tggaatgggc tctgcaaagg ataaaccata ccgttgtgaa 840

gtttgtggta agagatataa gaacttgaac ggtttaaaat atcacagggg ccactccact 900

cactaagata taattgtttc tttactgaat tgatttagta tgctatttag atactaattc 960

taccgttacc gactcatgca tcgagcggcc gctctttctc ttgttgttgg gcgcaattta 1020

tgtgatcatc tttgaacgaa aatgcatgat aaagctgtgc tcttcgactg ttaccattaa 1080

tttcaaaaaa taaaaagcat atctattatt gaaaaatgaa cttataatag aataacattt 1140

tcttgttttg tcatcatttc ctctaaatac tccgtcatga aaacgatttg cgctctgtct 1200

ggtctctcct tttagtatta ttgttgtgtg ttttttacta ttcatttttt actactgtgt 1260

ttttactata tatattttgg ctttacttac ttccttctgt tctgatgtat taaaaactat 1320

ttttattcta agaaaagaaa ctttaattct tcttattcat gctctaaatc ttaaataaaa 1380

ggttccgttt tttatctgca attctgtgta tttgtaagtg aattaccatg cacgttgtcg 1440

gatcgttttt ctaggcagaa actatcttat tgaaccatta aaagattact taaatattac 1500

aattaatctt acgaagcata ttaattagac tggaattaca gcgcaactat cacaggttaa 1560

taattggttg agaaaatatt atagttttgt tagtaatgtt gaacttttat tttatacact 1620

tatgaaagta aattaattca atatcaataa taatatacta taagtaactt aaaaagcaac 1680

cttcctccca aacctacaat ccaatcacgc tgataagtat tatctagaaa gttgacaaca 1740

ccaagccata tggtcaagaa acatttattg agagttattt tgtaaataag acttttcgtc 1800

atccatataa agcaacctaa ttgttcatct aatactagag tcgctctttt gaaagttaag 1860

tataactacc tcatcattag ttgctactat gtgtataatt tgaaaatctc aacgtaaggt 1920

tattaaaaat ataaatgcgc gtaagacaga aaaatagaga cagcttacgg caaattatca 1980

aaatgtgaat ccaaggtttc aagaaaataa gataaagtga ataggaaggg acatggaggc 2040

ccagaatacc ctccttgaca gtcttgacgt gcgcagctca ggggcatgat gtgactgtcg 2100

cccgtacatt tagcccatac atccccatgt ataatcattt gcatccatac attttgatgg 2160

ccgcacggcg cgaagcaaaa attacggctc ctcgctgcag acctgcgagc agggaaacgc 2220

tcccctcaca gacgcgttga attgtcccca cgccgcgccc ctgtagagaa atataaaagg 2280

ttaggatttg ccactgaggt tcttctttca tatacttcct tttaaaatct tgctaggata 2340

cagttctcac atcacatccg aacataaaca accatgggta aggaaaagac tcacgtttcg 2400

aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg ggtataaatg ggctcgcgat 2460

aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat cgattgtatg ggaagcccga tgcgccagag 2520

ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg ttacagatga gatggtcaga 2580

ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca agcattttat ccgtactcct 2640

gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc cccggcaaaa cagcattcca ggtattagaa 2700

gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg cagtgttcct gcgccggttg 2760

cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc gcgtatttcg tctcgctcag 2820

gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga cgagcgtaat 2880

ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataagc ttttgccatt ctcaccggat 2940

tcagtcgtca ctcatggtga tttctcactt gataacctta tttttgacga ggggaaatta 3000

ataggttgta ttgatgttgg acgagtcgga atcgcagacc gataccagga tcttgccatc 3060

ctatggaact gcctcggtga gttttctcct tcattacaga aacggctttt tcaaaaatat 3120

ggtattgata atcctgatat gaataaattg cagtttcatt tgatgctcga tgagtttttc 3180

taatcagtac tgacaataaa aagattcttg ttttcaagaa cttgtcattt gtatagtttt 3240

tttatattgt agttgttcta ttttaatcaa atgttagcgt gatttatatt ttttttcgcc 3300

tcgacatcat ctgcccagat gcgaagttaa gtgcgcagaa agtaatatca tgcgtcaatc 3360

gtatgtgaat gctggtcgct atactgtcat tatcaatact gccatttcaa agaatacgta 3420

aataattaat agtagtgatt ttcctaactt tatttagtca aaaaattagc cttttaattc 3480

tgctgtaacc cgtacatgcc caaaataggg ggcgggttac acagaatata taacatcgta 3540

ggtgtctggg tgaacagttt attcctggca tccactaaat ataatggagc ccgcttttta 3600

agctggcatc cagaaaaaaa aagaatccca gcaccaaaat attgttttct tcaccaacca 3660

tcagttcata ggtccattct cttagcgcaa ctacagagaa caggggcaca aacaggcaaa 3720

aaacgggcac aacctcaatg gagtgatgca acctgcctgg agtaaatgat gacacaaggc 3780

aattgaccca cgcatgtatc tatctcattt tcttacacct tctattacct tctgctctct 3840

ctgatttgga aaaagctgaa aaaaaaggtt gaaaccagtt ccctgaaatt attcccctac 3900

ttgactaata agtatataaa gacggtaggt attgattgta attctgtaaa tctatttctt 3960

aaacttctta aattctactt ttatagttag tctttttttt agttttaaaa caccaagaac 4020

ttagtttcga ataaacacac ataaacaaac aaaatggaca agaagaagga tctactggag 4080

aacgaacaat ttctccgcat ccaaaagctc aacgctgccg atgcgggcaa aagacaatct 4140

ataacagtgg acgacgaggg cgaactatat gggttagaca cctccggcaa ctcaccagcc 4200

aatgaacaca cagctaccac aattacacag aatcacagcg tggtggcctc aaacggagac 4260

gtcgcattca tcccaggaac tgctaccgaa ggcaatacag agattgtaac tgaagaagtg 4320

attgagaccg atgataacat gttcaagacc catgtgaaga ctttaagctc caaagagaag 4380

gcacggtata ggcaagggtc ctctaacttt atatcgtatt tcgatgatat gtcatttgaa 4440

cacaggccca gtatattaga tgggtcagtt aacgagccct tcaagaccaa attcgtggga 4500

cctactttag aaaaggagat cagaagaagg gagaaagagc taatggccat gcgcaaaaat 4560

ttacaccacc gcaagtcctc cccagatgct gtcgactcag tagggaaaaa tgatggcgcc 4620

gccccaacta ctgttccaac tgccgccacc tcagaaacgg tggtcaccgt tgaaaccacc 4680

ataatttcat ccaatttctc cgggttgtac gtggcgtttt ggatggctat tgcatttggt 4740

gctgtcaagg ctttaataga ctattattac cagcataatg gtagcttcaa ggattcggag 4800

atcttgaaat ttatgactac gaatttgttc actgtggcat ccgtagatct tttgatgtat 4860

ttgagcactt attttgtcgt tggaatacaa tacttatgca agtggggggt cttgaaatgg 4920

ggcactaccg gctggatctt cacctcaatt tacgagtttt tgtttgttat cttctacatg 4980

tatttaacag aaaacatcct aaaactacac tggctgtcca agatcttcct ttttttgcat 5040

tctttagttt tattgatgaa aatgcattct ttcgccttct acaatggcta tctatggggt 5100

ataaaggaag aactacaatt ttccaaaagc gctcttgcca aatacaagga ttctataaat 5160

gatccaaaag ttattggtgc tcttgagaaa agctgtgagt tttgtagttt tgaattgagc 5220

tctcagtctt taagcgacca aactcaaaaa ttccccaaca atatcagtgc aaaaagcttt 5280

ttttggttca ccatgtttcc aaccctaatt taccaaattg aatatccaag aactaaggaa 5340

atcagatgga gctacgtatt agaaaagatc tgcgccatct tcggtaccat tttcttaatg 5400

atgatagatg ctcaaatctt gatgtatcct gtagcaatga gagcattggc tgtgcgcaat 5460

tctgaatgga ctggtatatt ggatagatta ttgaaatggg ttggattgct cgttgatatc 5520

gtcccagggt ttatcgtgat gtacatcttg gacttctatt tgatttggga tgccattttg 5580

aactgtgtgg ctgaattgac aagatttggc gacagatatt tctacggtga ctggtggaat 5640

tgtgttagtt gggcagactt cagtagaatt tggaacatcc cagtgcataa gtttttgtta 5700

agacatgttt accatagttc aatgagttca ttcaaattga acaagagtca agcaactttg 5760

atgacctttt tcttaagttc cgtcgttcat gaattagcaa tgtacgttat cttcaagaaa 5820

ttgaggtttt acttgttctt cttccaaatg ctgcaaatgc cattagtagc tttaacaaat 5880

actaaattca tgaggaacag aaccataatc ggaaatgtta ttttctggct cggtatctgc 5940

atgggaccaa gtgtcatgtg tacgttgtac ttgacattct aagggccgca tcatgtaatt 6000

agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg aaaaggaagg 6060

agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt tagtattaag 6120

aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt acgcatgtaa 6180

cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt taatttgcgc 6240

tgatagaatt gtacttctcg ctatataatt ttaaaaccta gctgttattt tctaagtaag 6300

taggctcttc cagcattctg cttcttcgcc ctgaataaaa aaaagatgat cagcgaaaaa 6360

actcaaaatg aaaataagag atggattctt caaagttata attcatatgc agaataaaga 6420

ttctaaagaa aatgcacaca atgcatattc catccggtga tgttctgata ccgaagccga 6480

agcttattac tgaagaaaca gatccactgc atataataaa gacgaggcaa aagacacatg 6540

gtcggcccgt gaccattgca ggcccaatgg ttcggtattc caagttacca ttccgtcagt 6600

tgtgccgaga atataacgtt gatatagttt actcccccat gattttggca agagaatatg 6660

tccgtaatga gcatgcaaga atctcagacc tttctacaaa taatgaggac accccgctaa 6720

tcgtccaagt aggtgtaaat aacgtggctg atttactaaa atttgtggaa atggttgccc 6780

catactgtga tggtattggt attaactgtg gttgtcctat aaaggaacaa atccgagagg 6840

gcataggttg cgctctgata tacaattcag atttgttatg cagtatggtc catgctgtga 6900

aagataagta tggcgacaaa ctaagaattg aaacgaaaat aagaatacat gaggcattgg 6960

acgagacggt ggagttatgt agaaagctat gtgatgctgg ggtagattgg attacgattc 7020

atggccgaac acgtagaact aggtcatcgc agccggctaa cctggatgcg ataaaatata 7080

tcatcgagaa catcagcgac aaaaatgtgc ctgtaatagc gaatggggat tgttttaagt 7140

tatccgattt ggaaagaatc accaaataca ctggtgcaca tggtgtcatg gctgtgcgtg 7200

ggttgttaag caatccagcg ttatttgctg gatatactac ctgcccttgg ggctgcattg 7260

agaagtttt 7269

<210> 5

<211> 5380

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttttcaagag cagctgcctt gagctcctcg aggaggctgc tttttaatac agctagaaca 60

aacttccttt ctacctcacc attgaagaat gtggccagtg aaatgaacac caaagcggca 120

attgctgaag aacaaatatt aaacaagcaa agagcaaaga gacctatttc tccacatctg 180

accatttacc agccacaatt aacttggtac ctgtcttctc ttcaccgtat ttcgttggtg 240

cttatgggac taggtttcta cttgtttact atactcttcg gagtctctgg tttattaggt 300

cttggattga ctaccgaaaa ggtttctaat tggtaccatc agaagttttc caagattacc 360

gaatggtcca tcaagggttc ctttgcttac ttatttgcaa ttcactatgg tggcgccatt 420

agacacttga tctgggatac cgctaaggaa ttgacattga aaggcgttta cagaactggt 480

tacgctctca ttggtttcac cgccgttctc ggtacttatt tattaacttt atgattcttt 540

aaggcgacgc acctgtttct acacacaaat atatatatag ccaattttat atatacgttc 600

ctatatatga cccaataccg cacttattta ttctttaaga tctttataac ccaaaatgcc 660

gattaacaca aacctatatt tactaggggc acatttttta tttttttgcc tttctgtaaa 720

atacaataga gaaaataaag gaacaaacaa gaggaaaaac aggaaaagat agcgcaagag 780

taatcatatt caacaaaata tcagtgattt tttacagata tcaagataat ttctttccgg 840

atacttattg aagctattat ttgttactgg caagaaaaag caaacatagg cggtcatttt 900

tcttttgtat aaagtaaata caagaagaat tattttcgag gaataactag gtgtgcagag 960

atattaagga acaaggaaag aagaaagaaa acaattcgaa caaaacttta ttattctagc 1020

actattttaa aaaactgtct tttggcaaag acatggaggc ccagaatacc ctccttgaca 1080

gtcttgacgt gcgcagctca ggggcatgat gtgactgtcg cccgtacatt tagcccatac 1140

atccccatgt ataatcattt gcatccatac attttgatgg ccgcacggcg cgaagcaaaa 1200

attacggctc ctcgctgcag acctgcgagc agggaaacgc tcccctcaca gacgcgttga 1260

attgtcccca cgccgcgccc ctgtagagaa atataaaagg ttaggatttg ccactgaggt 1320

tcttctttca tatacttcct tttaaaatct tgctaggata cagttctcac atcacatccg 1380

aacataaaca accatgggta aaaagcctga actcaccgcg acgtctgtcg agaagtttct 1440

gatcgaaaag ttcgacagcg tctccgacct gatgcagctc tcggagggcg aagaatctcg 1500

tgctttcagc ttcgatgtag gagggcgtgg atatgtcctg cgggtaaata gctgcgccga 1560

tggtttctac aaagatcgtt atgtttatcg gcactttgca tcggccgcgc tcccgattcc 1620

ggaagtgctt gacattgggg aattcagcga gagcctgacc tattgcatct cccgccgtgc 1680

acagggtgtc acgttgcaag acctgcctga aaccgaactg cccgctgttc tgcagccggt 1740

cgcggaggca atggatgcga tcgctgcggc cgatcttagc cagacgagcg ggttcggccc 1800

attcggaccg caaggaatcg gtcaatacac tacatggcgt gatttcatat gcgcgattgc 1860

tgatccccat gtgtatcact ggcaaactgt gatggacgac accgtcagtg cgtccgtcgc 1920

gcaggctctc gatgagctga tgctttgggc cgaggactgc cccgaagtcc ggcacctcgt 1980

gcacgcggat ttcggctcca acaatgtcct gacggacaat ggccgcataa cagcggtcat 2040

tgactggagc gaggcgatgt tcggggattc ccaatacgag gtcgccaaca tcttcttctg 2100

gaggccgtgg ttggcttgta tggagcagca gacgcgctac ttcgagcgga ggcatccgga 2160

gcttgcagga tcgccgcggc tccgggcgta tatgctccgc attggtcttg accaactcta 2220

tcagagcttg gttgacggca atttcgatga tgcagcttgg gcgcagggtc gatgcgacgc 2280

aatcgtccga tccggagccg ggactgtcgg gcgtacacaa atcgcccgca gaagcgcggc 2340

cgtctggacc gatggctgtg tagaagtact cgccgatagt ggaaaccgac gccccagcac 2400

tcgtccgagg gcaaaggaat aatcagtact gacaataaaa agattcttgt tttcaagaac 2460

ttgtcatttg tatagttttt ttatattgta gttgttctat tttaatcaaa tgttagcgtg 2520

atttatattt tttttcgcct cgacatcatc tgcccagatg cgaagttaag tgcgcagaaa 2580

gtaatatcat gcgtcaatcg tatgtgaatg ctggtcgcta tactgtcatt atcaatactg 2640

ccatttcaaa gaatacgtaa ataattaata gtagtgattt tcctaacttt atttagtcaa 2700

aaaattagcc ttttaattct gctgtaaccc gtacatgccc aaaatagggg gcgggttaca 2760

cagaatatat aacatcgtag gtgtctgggt gaacagttta ttcctggcat ccactaaata 2820

taatggagcc cgctttttaa gctggcatcc agaaaaaaaa agaatcccag caccaaaata 2880

ttgttttctt caccaaccat cagttcatag gtccattctc ttagcgcaac tacagagaac 2940

aggggcacaa acaggcaaaa aacgggcaca acctcaatgg agtgatgcaa cctgcctgga 3000

gtaaatgatg acacaaggca attgacccac gcatgtatct atctcatttt cttacacctt 3060

ctattacctt ctgctctctc tgatttggaa aaagctgaaa aaaaaggttg aaaccagttc 3120

cctgaaatta ttcccctact tgactaataa gtatataaag acggtaggta ttgattgtaa 3180

ttctgtaaat ctatttctta aacttcttaa attctacttt tatagttagt ctttttttta 3240

gttttaaaac accaagaact tagtttcgaa taaacacaca taaacaaaca aaatgatacg 3300

tcagctcaat tattggtcaa ggaaggcgta tctcatttac ccctttcaag tttttgtagg 3360

cgcattatta tcaatagtag tatcttcaga aacattaaac catcaaaaag agacatgcgc 3420

tctattgaaa tcgtccaata ttttcaatgt tatttttgca tacaaagcga accaactgtg 3480

gccattttta ttctttagtt tggcttttct gcaaatatac ttccactatc tagcaagaat 3540

ggatatattg cctttaccaa tatcaagtac cgaaactagc tcttcctatt taacatatac 3600

taaccattgg cctctgctca aaaatagaat aatcagtatt atgatcactc aatatgcttg 3660

caagttcgtt ctaaaatatc tattattgtt tttgaatttc caatttatcg atcatgtttt 3720

catttggaca gggggagaat gcagttctgg tagtaaaacg acatcagctg aaaagtgccg 3780

tctagaaaat gggaaatggg atggtgggtt tgacattagt ggacacttct gctttcttgt 3840

gagtataagc atgattcttt ggatggaact tcacttattc agtagatttg ttcaagctga 3900

agatatgttt tgggttgtga ataagtgggt acgagcttgc cttgccattg tttgcgctgt 3960

cctagtaatt tggatatgta ttctctgggt taccgctatt tattatcata ctatcttgga 4020

aaaagtgtta ggttgcctta tgggtttcat atgccctgtt ttcatatacc acattctacc 4080

caaaattggg atactacaca attacttata tctatgatca tgtaattagt tatgtcacgc 4140

ttacattcac gccctccccc cacatccgct ctaaccgaaa aggaaggagt tagacaacct 4200

gaagtctagg tccctattta tttttttata gttatgttag tattaagaac gttatttata 4260

tttcaaattt ttcttttttt tctgtacaga cgcgtgtacg catgtaacat tatactgaaa 4320

accttgcttg agaaggtttt gggacgctcg aaggctttaa tttgcaaaga atgcgagaga 4380

aaccctatta aactattttt tgtctaggat aataatatta gcgctaatct aaaaatcgat 4440

gaactaaaga aagaatatac gtacgtttta tacacaataa atggatttca taagaagtcc 4500

ttaatatcct catgcttgtg gatactggaa attagtaaag taattaactt ccttttagca 4560

ttattcttat ttggcttaaa aaggtcacgt gaagctctat ttttttcgtt tttttttttc 4620

actgatggaa gagaaaaacc tctacataat aaggtaactt tacatattga ttgccaatga 4680

gatgttaaaa aatggacggt tcagacagta aaatacattt agaaaaaaag agaaggtctt 4740

atcagtgtat ttattcactg tgcatattag ctttttttgg actttttttg ttccattagt 4800

acttttaaaa aacctatttg taaataaaac taattctagc actattcttt gcactagaat 4860

aacacaggga ccatacagca taaattattt ggtaacaatg tcctacaata atggcaatac 4920

ttattcaaag agttatagca gaaataataa gagacccttg ttcggaaaga ggtcgccaaa 4980

tcctcagtcc ctagcgagac caccgccacc aaagagaata cggactgata gtggttacca 5040

gtcgaatatg gacaatatat cttctcatag ggtaaattca aatgaccaac caggccacac 5100

gaaaagtcgt ggtaacaata atttatctcg ctataacgat acatcctttc aaacaagttc 5160

cagatatcaa ggttcaagat acaacaataa taatacgtcg tatgaaaata ggcctaaaag 5220

cataaaaagg gatgaaacaa aggctgaatt cctgtctcat ttgccaaagg ggcccaaatc 5280

tgttgagaaa tcaagatata ataattcatc caatactagt aatgatataa aaaatggcta 5340

tcatgcttca aaatactata accacaaagg ccaggaaggg 5380

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttgttgggcg caatttatgt gat 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaaacttctc aatgcagccc c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttttcaagag cagctgcctt g 21

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cccttcctgg cctttgtggt tatag 25

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccgttgtgaa gtttgtggta ag 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttgtcgcacc tgattgcccg ac 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cattctgatt ggctgcggta gc 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atatccacgc cctcctacat cg 22

Claims (3)

1.一种耐油酿酒酵母基因工程菌，其特征在于该基因工程菌通过原始酿酒酵母过表达Are2和Yft2基因，同时靶向敲除SEI1及Tgl1基因后获得，具体通过以下步骤得到：

（1）提取原始酿酒酵母的基因组DNA，所述原始酿酒酵母为BY4741；

（2）以步骤（1）得到的基因组DNA为模板，在SEI1基因的上下游各设置同源臂且同源臂不包含此靶向序列；以上游同源臂、G418抗性基因序列、Are2基因序列和下游同源臂为模板，通过融合PCR扩增得到SEI1::Are2基因替换组件，所述Are2基因启动子替换成GAP强启动子，所述GAP强启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述SEI1::Are2基因替换组件的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

（3）以步骤（1）得到的基因组DNA为模板，在Tgl1基因的上下游各设置同源臂且同源臂不包含此靶向序列；以上游同源臂、hph抗性基因序列、Yft2基因序列和下游同源臂为模板，通过融合PCR扩增得到Tgl1::Yft2基因替换组件，所述Yft2基因启动子替换成GAP强启动子，所述GAP强启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Tgl1::Yft2基因替换组件的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

（4）将步骤（2）和（3）得到的SEI1::Are2及Tgl1::Yft2基因替换片段转化至原始酿酒酵母感受态中，利用含有500ug/mLG418和500ug/mLhph的YPD培养基筛选获得阳性转化子，即得SEI1::Are2及Tgl1::Yft2基因替换的酿酒酵母基因工程菌。

2.如权利要求1所述的一种耐油酿酒酵母基因工程菌，其特征在于所述Are2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Yft2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1-2任一所述的一种耐油酿酒酵母基因工程菌在提升酿酒酵母耐油性中的应用。