CN104593407B - 树干毕赤酵母基因表达系统及其构建与应用 - Google Patents
树干毕赤酵母基因表达系统及其构建与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104593407B CN104593407B CN201510005584.6A CN201510005584A CN104593407B CN 104593407 B CN104593407 B CN 104593407B CN 201510005584 A CN201510005584 A CN 201510005584A CN 104593407 B CN104593407 B CN 104593407B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- expression
- promoter
- pichia stipitis
- terminator
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及树干毕赤酵母基因表达系统及其构建与应用，包括一种新型表达载体，其为环状，从5’‑3’依次可操作性地连接有以下元件：pMD19‑Tsimple质粒骨架、rDNA同源重组序列、外源基因表达盒和筛选标记基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、外源基因插入酶切位点以及转录终止子；所述筛选标记基因表达盒包括启动子、抗生素抗性基因、转录终止子。所述能够利用木糖的酵母为树干毕赤酵母。本发明的表达载体可实现在树干毕赤酵母中的整合型稳定表达，对树干毕赤酵母的基础理论研究及产品开发具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种树干毕赤酵母(Scheffersomycesstipitis)的表达系统及其构建方法及应用。
背景技术
随着分子生物学理论研究的不断深入和分子生物学手段的不断创新，基因工程技术得以迅速发展，取得了令人瞩目的成绩。作为基因工程技术的重要内容，基因表达技术渗透到了工业、农业以及生命科学的各个领域，受到人们的广泛重视。根据外源基因表达宿主的不同，目前，已发展的基因表达系统有大肠杆菌表达系统、哺乳动物表达系统、酵母表达系统等。其中酵母表达系统具有操作简单、易于培养、生长速度快、成本低等优点，还具有大肠杆菌表达系统所不具备的对外源蛋白的翻译后修饰等特点，因此得到越来越广泛的应用。
酿酒酵母是研究最多的酵母表达系统，然而酿酒酵母在表达外源基因方面还存在一些缺点，如缺少易于调控外源蛋白表达的强启动子，缺少恰当的外源蛋白转录后修饰系统，外源蛋白分泌效率不理想等。因此需要寻找可替代的酵母表达系统来克服现有表达系统的缺陷，从而进一步扩大酵母表达系统在基因工程中的应用范围，更有效的促进蛋白的工业化生产。
树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis)因具有降解木聚糖，生成并发酵木糖生产酒精、乳酸等工业产品的能力而成为研究的热点，被认为是极具有工业应用前景的半子囊菌类酵母。木聚糖是一种多聚五碳糖，是植物半纤维素重要组成部分，而秸秆半纤维素中木聚糖含量更是占到90％以上。随着全球资源的不断消耗，开发利用木聚糖等丰富的可再生资源并生产人类期望的产品成为人们共同关注的焦点。
图4为实施例5的为菌绿色荧光蛋白重组质粒转化子菌落PCR验证图(M为Maker，泳道1-9为阳性转化子扩增结果，泳道10为野生菌扩增结果)；
，人们逐渐认识到树干毕赤酵母代谢木糖生产工业产品的潜在优势，开始对其木糖发酵的传统发酵工艺进行优化。同时，随着基因改良手段的兴起，尤其在树干毕赤酵母全基因组测序工作(JEFFRIES T W,GRIGORIEV I V,GRIMWOOD J,et al.Genome sequence ofthe lignocellulose- bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis[J].Nature biotechnology,2007,25(3):319-326)完成后，人们逐渐将研究方向转向分子领域。
树干毕赤酵母自身的一些特点使其作为基因工程表达宿主具有很大的应用潜力，如：(1)不具有酵解抑制有氧氧化效应(Crabtree-negative)(PRIOR B,KILIAN S,PREEZ JC.Fermentation of D-xylose by the yeasts Candida shehatae and Pichia stipitis[J].Process biochemistry,1989,24(1):21-32)，在严格好气条件下能够有效转化碳源用于细胞生长，并且不会产生乙醇(G RGENS J F,PASSOTH V,ZYL W H,et al.Amino acidsupplementation,controlled oxygen limitation and sequential double inductionimproves heterologous xylanase production by Pichia stipitis[J].FEMS YeastRes,2005,5(6-7):677-683)，有利于后期外源蛋白的高效生产；(2)酵母为单倍体，较易分离特定突变株(HO N W Y,PETROS D,DENG X.Genetic transformation of xylose-fermenting yeast Pichia stipitis[J].Appl Biochem Biotechnol,1991,28(1):369-375)，在筛选营养缺陷型宿主菌株并构建有效转化系统方面具有较好优势；(3)具有降解廉价木聚糖并利用生成的木糖进行发酵生产的能力。然而，研究发现，树干毕赤酵母在基因表达过程中使用特殊的基因编码系统，密码子CUG编码的亮氨酸被替换为丝氨酸(LAPLAZA JM,TORRES B R,JIN Y S,et al.Sh ble and Cre adapted for functional genomics andmetabolic engineering of Pichia stipitis[J].Enzyme and microbial technology,2006,38(6):741-747)。同时由于对其研究与应用开展的较晚，树干毕赤酵母作为外源基因表达系统的发展比较缓慢，远不及酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母。
目前，对构建树干毕赤酵母表达系统的研究仅停留在探索阶段。现在发展的可利用载体元件，如启动子、筛选标记等还很少，无法满足高效表达载体的构建与应用。因此，有必要寻找高效的新型载体元件来构建适用于树干毕赤酵母自身的基因表达系统，在此基础上，可采用该基因表达系统对树干毕赤酵母进行基因工程改造，为构建新型酵母基因工程菌奠定基础，同时基因表达技术的应用以及有效基因表达系统的构建使树干毕赤酵母利用木糖转化生产人类有用产品，建立可再生资源循环利用的生物加工工艺成为可能。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种树干毕赤酵母基因表达系统及其构建与应用。本发明的表达载体可实现在树干毕赤酵母中的整合型或 游离型表达，对树干毕赤酵母的基础理论研究及产品开发具有重要的意义。
本发明的技术方案如下：
本发明一方面涉及一种新型整合型表达载体，其为环状，且可操作性地连接有以下元件：
pMD19-Tsimple质粒骨架、rDNA同源整合序列、外源基因表达盒和筛选标记基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次包括启动子，外源基因插入酶切位点以及转录终止子；所述筛选标记基因包括启动子、抗生素抗性基因、转录终止子。
优选的，所述的rDNA同源重组序列为18s rDNA，序列如SEQ ID NO:1所示。另一个选择是，所述的rDNA序列与SEQ ID NO:1的相似性不低于90％，优选为95％，更优为98％。
本发明还提供一种新型游离型表达载体，其为环状，且可操作性地连接有以下元件：
pMD19-Tsimple质粒骨架、树干毕赤酵母来源的自主复制序列(PsARS2)、外源基因表达盒和筛选标记基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次包括启动子，外源基因插入酶切位点以及转录终止子；所述筛选标记基因包括启动子、抗生素抗性基因、转录终止子。
所述的表达载体中的外源基因表达盒启动子包括SpADHP、SpXYLP；转录终止子包括SpCYC1T、SpXYLT。
所述的表达载体中的外源基因表达盒启动子和转录终止子的DNA序列来自一株能够利用木糖的酵母Spathaspora passalidarum，该酵母全基因组序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的编号为NZ_AEIK00000000，其中所述酵母可为来自美国农业研究菌种保藏中心的细胞株NRRL Y-27907。
所述外源基因的DNA片段可包括所述外源基因和筛选标记基因，所述外源基因插入所述外源基因表达盒中启动子和转录终止子之间。在本发明的一个实施例中，所述外源基因为gfp基因，该基因的DNA序列如SEQ ID NO:12所示。
所述的SpADHP启动子为Spathaspora passalidarum来源的乙醇脱氢酶基因ADH1启动子，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:2所示。
所述的SpXYLP启动子为Spathaspora passalidarum来源的木糖还原酶基因XYL启动子，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:3所示；
所述的SpTEF1P启动子为Spathaspora passalidarum来源的转录起始因子基因TEF1启动子，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:4所示；
所述的SpCYC1T终止子为Spathaspora passalidarum来源的细胞色素C基因CYC1终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID NO:5所示；
所述的SpXYLT终止子为Spathaspora passalidarum来源的木糖还原酶基因XYL终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID NO:6所示；
所述的筛选标记基因表达盒中的启动子为SpTEF1P；抗生素抗性基因可以是表达载体中常用的；转录终止子为ScCYC1T。
所述的ScCYC1T终止子为Saccharomyces cerevisiae来源的细胞色素C基因CYC1终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID NO:7所示。
所述的筛选标记基因表达盒中可包括一个以上的标记基因，所述标记基因可为潮霉素B抗性基因、博来霉素抗性基因和/或G418；在本发明的一个实施方案中，所述标记基因是潮霉素B抗性基因。
所述的潮霉素B抗性基因的DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
所述的博来霉素抗性基因的DNA序列如SEQ ID NO:9所示。
所述的G418的DNA序列如SEQ ID NO:10所示。
所述的自主复制序列(PsARS2)的DNA序列如SEQ ID NO:11所示。
本发明所使用的酵母为树干毕赤酵母。具体的，该酵母购自美国农业研究菌种保藏中心，保藏编号为NRRL Y-7124。
本发明提供了含有树干毕赤酵母的整合型基因表达系统；且其中还含有基因表达载体，所述基因表达载体从5’-3’依次包括以下可操作性连接的元件：pMD19-Tsimple质粒骨架、rDNA同源重组序列、外源基因表达盒和抗生素筛选标记基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次包括启动子，外源基因插入酶切位点以及转录终止子；所述抗生素筛选标记基因包括启动子、抗生素抗性基因、转录终止子。所述含有树干毕赤酵母的整合型表达系统与上述环状的新型整合型表达载体的各元件的序列相同。
本发明还提供了含有树干毕赤酵母的游离型基因表达系统；且其中还含有基因表达载体，所述基因表达载体从5’-3’依次包括以下可操作性连接的元件：pMD19-Tsimple质粒骨架、自主复制序列PsARS2、外源基因表达盒和抗生素筛选标记基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次包括启动子，外源 基因插入酶切位点以及转录终止子；所述抗生素筛选标记基因包括启动子、抗生素抗性基因、转录终止子。所述含有树干毕赤酵母的游离型表达系统与上述环状的新型游离型表达载体的各元件的序列相同。
具体而言，发明人按照下述技术方案制备得到了新型整合型表达载体：
以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P1和P2进行PCR扩增获得18s rDNA同源重组序列；以引物P23和P24进行PCR扩增获得SpTEF1P启动子；以引物P25和P26进行PCR扩增获得SpADH1P启动子；以引物P27和P28进行PCR扩增获得SpXYLP启动子；以引物P29和P30进行PCR扩增获得SpCYC1T终止子；以引物P31和P32进行PCR扩增获得SpXYLT终止子。以PMD-hphm质粒DNA为模板，以引物P21和P22进行PCR扩增获得片段hphm-ScCYC1T。所述引物P1-P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14-15所示，所述P21-P32的核苷酸序列如SEQ IDNO.34-45所示。
以pMD19-Tsimple为骨架，将上述各片段连接，所述连接是在适当的限制酶酶切位点上进行的。具体连接方式为：在pMD19-Tsimple的EcoR V酶切位点连接18s rDNA后，沿着18s rDNA的方向依次连接外源基因表达盒启动子、外源基因表达盒转录终止子、SpTEF1P启动子、hphm-ScCYC1T。
另外，发明人按照下述技术方案制备得到了新型游离型表达载体：
以树干毕赤酵母基因组DNA为模板，以引物P33和P34进行PCR扩增获得自主复制序列；以引物P23和P24进行PCR扩增获得SpTEF1P启动子；以引物P25和P26进行PCR扩增获得SpADH1P启动子；以引物P27和P28进行PCR扩增获得SpXYLP启动子；以引物P29和P30进行PCR扩增获得SpCYC1T终止子；以引物P31和P32进行PCR扩增获得SpXYLT终止子。以PMD-hphm质粒DNA为模板，以引物P21和P22进行PCR扩增获得片段hphm-ScCYC1T。
以pMD19-Tsimple为骨架，将上述各片段连接，所述连接是在适当的限制酶酶切位点上进行的。具体连接方式为：在pMD19-Tsimple的EcoR V酶切位点连接自主复制序列后，在自主复制序列的3’端依次连接外源基因表达盒启动子、外源基因表达盒转录终止子、SpTEF1P启动子、hphm-ScCYC1T。
酵母基因表达调控是一个非常复杂的过程，选择合适的启动子和转录终止子对外源蛋白的表达至关重要。本发明提供了可供外源蛋白表达的启动子和转录终止子组合，包括SpADHP-SpCYC1T、SpXYLP-SpCYC1T、SpADHP-SpXYLT、 SpXYLP-SpXYLT、SpTEF1P-SpCYC1T、、SpXYLP-SpXYLT。
所述启动子根据以下方法预测获得：
(1)根据Spathaspora passalidarum基因组序列，选择酵母表达系统中常用的启动子所属基因与上一个基因的开放阅读框之间的所有核苷酸片段；
(2)采用启动子在线测评软件，对可能的启动子序列进行在线预测；
(3)根据高评分值的潜在启动子序列，设计引物扩增获得待测启动子序列。
所述终止子根据以下方法获得：
(1)根据Spathaspora passalidarum基因组序列，选择酵母表达系统中常用的终止子所属基因的开放阅读框后约300bp作为待测终止子序列。
(2)设计引物扩增获得所述待测终止子。
所述外源蛋白表达的启动子和转录终止子组合用于外源基因的功能表达。在实施例中，gfp基因插入所述外源蛋白表达的启动子和转录终止子之间。
所述的基因表达载体整合于所述树干毕赤酵母宿主菌的基因组中。
所述树干毕赤酵母宿主菌是(但不限于)来自美国农业研究菌种保藏中心的细胞株NRRL Y-7124。
在本发明的一个实施例中，所述树干毕赤酵母宿主菌为来自美国农业研究菌种保藏中心的Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124。
本发明的另一个方面，提供了树干毕赤酵母基因表达系统的构建方法，包括以下步骤：
所述树干毕赤酵母基因表达系统整合型表达载体的构建：
根据Spathaspora passalidarum全基因组序列，调取Spathasporapassalidarum18s rDNA部分序列作为同源重组位点。以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P1和P2进行PCR扩增获得18s rDNA同源重组序列，同时在片段上游引入酶切位点EcoR I，下游引入酶切位点Bgl II、BamH I和Kpn I。将PCR产物纯化后克隆至质粒pMD19-Tsimple，获得重组质粒pMD-18s rDNA。
以PMD-hphm质粒DNA为模板，以引物P21和P22进行PCR扩增获得片段hphm-ScCYC1T，同时在片段上游引入BamH I、Pst I，下游引入Kpn I。将纯化的PCR产物和重组质粒pMD-18srDNA分别用BamH I和Kpn I双酶切，酶切产物连接获得重组质粒PR-hphm。
以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P23和P24进行PCR 扩增获得SpTEF1P启动子，同时在片段两端引入酶切位点BamH I和Pst I。将纯化的PCR产物和重组质粒PR-hphm分别用BamH I和Pst I双酶切，酶切产物连接获得重组质粒PRTH。
以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P25和P26进行PCR扩增获得SpADHP启动子；以引物P27和P28进行PCR扩增获得SpXYLP启动子；同时在片段的上游引入酶切位点Bgl II，下游引入酶切位点Sal I和BamH I。将纯化的PCR产物和重组质粒PRTH分别用Bgl II和Sal I双酶切，将酶切的重组质粒和PCR产物连接获得重组质粒PRATH和PRXTH。
以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P29和P30进行PCR扩增获得SpCYC1T终止子；以引物P31和P32进行PCR扩增获得SpXYLT终止子。在片段上游引入酶切位点Sal I和Not I，在片段下游引入酶切位点BamH I。将纯化的PCR产物和重组质粒PRATH与PRXTH分别用Sal I和BamH I双酶切，酶切产物连接获得PR系列重组质粒PRACTH、PRAXTH、PRXCTH和PRXXTH。
所述引物P1-P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14-15所示；
所述P21-P32的核苷酸序列如SEQ ID NO.34-45所示。
所述树干毕赤酵母基因表达系统游离型表达载体的构建：
以树干毕赤酵母基因组DNA为模板，以引物P33和P34进行PCR扩增获得自主复制序列，同时在片段上游引入酶切位点EcoR I，下游引入酶切位点Bgl II、BamH I和Kpn I。将PCR产物纯化后克隆至质粒pMD19-Tsimple，获得重组质粒pMD-PsARS2。
以PMD-hphm质粒DNA为模板，以引物P21和P22进行PCR扩增获得片段hph-ScCYC1T，同时在片段上游引入BamH I、Pst I，下游引入Kpn I。将纯化的PCR产物和重组质粒pMD-18srDNA分别用BamH I和Kpn I双酶切，酶切产物连接获得重组质粒PA-hph。
以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P23和P24进行PCR扩增获得SpTEF1P启动子，同时在片段两端引入酶切位点BamH I和Pst I。将纯化的PCR产物和重组质粒PA-hphm分别用BamH I和Pst I双酶切，酶切产物连接获得重组质粒PATH。
以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P25和P26进行PCR扩增获得SpADHP启动子；以引物P27和P28进行PCR扩增获得SpXYLP启动 子。同时在片段的上游引入酶切位点Bgl II，下游引入酶切位点Sal I和BamH I。将纯化的PCR产物和重组质粒PRTH分别用Bgl II和Sal I双酶切，将酶切的重组质粒和PCR产物连接获得重组质粒PAATH和PAXTH。
以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P29和P30进行PCR扩增获得SpCYC1T终止子；以引物P31和P32进行PCR扩增获得SpXYLT终止子。在片段上游引入酶切位点Sal I和Not I，在片段下游引入酶切位点BamH I。将纯化的PCR产物和重组质粒PRATH与PRXTH分别用Sal I和BamH I双酶切，酶切产物连接获得PA系列重组质粒PAACTH、PAAXTH、PAXCTH和PAXXTH。
所述P21-P34的核苷酸序列如SEQ ID NO.34-47所示。
宿主菌树干毕赤酵母的活化与培养。
PR系列重组质粒在宿主菌树干毕赤酵母中的遗传转化。
PA系列重组质粒在宿主菌树干毕赤酵母中的遗传转化。
宿主菌树干毕赤酵母阳性转化子筛选。
所述树干毕赤酵母基因表达系统的构建方法，其中，所述表达载体是整合型重组质粒PRACTH，其中外源基因表达盒的启动子和终止子分别为SpADHP和SpCYC1T。
所述树干毕赤酵母基因表达系统的构建方法，其中，所述表达载体是整合型重组质粒PRAXTH，其中外源基因表达盒的启动子和终止子分别为SpADHP和SpXYLT。
所述树干毕赤酵母基因表达系统的构建方法，其中，所述表达载体是整合型重组质粒PRXCTH，其中外源基因表达盒的启动子和终止子分别为SpXYLP和SpCYC1T。
所述树干毕赤酵母基因表达系统的构建方法，其中，所述表达载体是整合型重组质粒PRXXTH，其中外源基因表达盒的启动子和终止子分别为SpXYLP和SpXYLT。
所述树干毕赤酵母基因表达系统的构建方法，其中，所述表达载体是游离型重组质粒PAACTH，其中外源基因表达盒的启动子和终止子分别为SpADHP和SpCYC1T。
所述树干毕赤酵母基因表达系统的构建方法，其中，所述表达载体是游离型重组质粒PAAXTH，其中外源基因表达盒的启动子和终止子分别为SpADHP和 SpXYLT。
所述树干毕赤酵母基因表达系统的构建方法，其中，所述表达载体是游离型重组质粒PAXCTH，其中外源基因表达盒的启动子和终止子分别为SpXYLP和SpCYC1T。
所述树干毕赤酵母基因表达系统的构建方法，其中，所述表达载体是游离型重组质粒PAXXTH，其中外源基因表达盒的启动子和终止子分别为SpXYLP和SpXYLT。
所述树干毕赤酵母基因表达系统的构建方法，其中所述的遗传转化方法包括PEG-LiAC转化法、电转化法和原生质体转化法，优选的转化方法是PEG-LiAC转化法。
所述树干毕赤酵母基因表达系统的构建方法，其中，所述宿主菌树干毕赤酵母转化子筛选方法为抗性平板筛选，对经过初步筛选的转化子进行菌落PCR或基因组PCR检测，并最终通过检测外源蛋白活性或代谢产物的方法确定转化子。
本发明提供了一种表达外源基因的方法，包括如下步骤：
(1)提供所述的整合型树干毕赤酵母基因表达系统；
(2)将外源基因插入所述表达载体的外源基因插入酶切位点，获得重组表达载体；
(3)将所述重组表达载体转化宿主菌树干毕赤酵母并在宿主菌中表达所述外源基因。
本发明还提供了一种代谢工程改造宿主菌树干毕赤酵母的方法，包括如下步骤：
(1)提供权利要求1所述的整合型树干毕赤酵母表达系统；
(2)将目标基因插入所述表达载体的外源基因插入酶切位点，获得重组表达载体；
(3)将所述重组表达载体转化宿主菌树干毕赤酵母并在宿主菌中表达所述目标基因；
(4)培养所述重组菌，检测所述重组菌代谢产物。
发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
本发明有益的技术效果在于：
1、本发明所使用的酵母是一株能够利用木糖的酵母，具有高效的木糖利用能力和较高的乙醇产率，是目前研究较多，极具工业应用前景的木糖利用酵母之一。然而该酵母使用特殊的基因编码系统，密码子CUG编码丝氨酸而非亮氨酸，因此市面上应用于酿酒酵母、毕赤酵母等表达系统的表达载体无法适用于该木糖利用酵母。鉴于此，本发明人测试并找到了多个适用于该酵母的启动子、终止子元件，并以此构建了一系列新型表达载体，采用该系列表达载体，可方便地对该酵母进行外源蛋白的表达和代谢工程改造。
2、本发明提供了用其他DNA分子转化树干毕赤酵母的方法，所述的DNA分子可来自在上述载体启动子和终止子之间连接树干毕赤酵母基因组片段所构成的文库中或合成的DNA分子。本发明从而可提供，能够用于表达基因多样性文库，产生能够从中筛选新的生物活性物质的产品的技术。
3、本发明所述的整合型表达载体中，尝试采用多个rDNA序列作为整合位点，但仅有其中一个序列表现出整合效应，该序列为Spathaspora passalidarum来源的18s rDNA的部分序列，且该位点表现出拷贝数高，稳定性好的特点，使得该系列整合型表达载体成为能够适用于树干毕赤酵母表达外源蛋白及代谢工程改造的酵母多拷贝整合型表达载体。
4、本发明所构建的新型表达载体中，对所使用的潮霉素B抗性基因、博来霉素抗性基因等筛选标记基因开放阅读框中多个CUG密码子进行定点突变，突变为UUG，对报告基因gfp开放阅读框中的CUG密码子进行了定点突变，突变为UUG，从而实现了该系列新型表达载体在树干毕赤酵母中的有效转化和功能性表达。
附图说明
图1为实施例1的定点突变后hph基因CDS序列(表示定点突变位点)；
图2为实施例5的定点突变后gfp基因CDS序列(表示定点突变位点)；
图3为实施例5的绿色荧光蛋白重组质粒PRACTH-gfpm的质粒图谱；
图4为实施例5的为菌绿色荧光蛋白重组质粒转化子菌落PCR验证图；
图5为实施例5的绿色荧光蛋白重组质粒PRACTH-gfpm转化树干毕赤酵母及GFP荧光显微镜检测(左图为暗场，右图为明场)；
图6为实施例6的绿色荧光蛋白重组质粒PAACTH-gfpm的质粒图谱；
图7为实施例6的绿色荧光蛋白重组质粒PAACTH-gfpm转化树干毕赤酵母 及GFP荧光显微镜检测；
图8为实施例7的植物乳杆菌L-乳酸脱氢酶基因序列；
图9为实施例7的乳酸脱氢酶重组质粒PRACTH-ldh的质粒图谱；
图10为实施例7的树干毕赤酵母基因工程菌生长及葡萄糖代谢情况。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行详细阐述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均视为落入本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本都按照常用克隆手册或制造商所建议的条件进行实验操作；所用试剂或仪器未注明生产商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
除非在本文中另作限定，本文所用的全部术语具有本发明所属领域的普通人员通常所理解的相同含义。
在本发明中，术语“可操作地连接”是指两个或多个核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子序列被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得该目的基因的转录受到该启动子的引导，使表达变得可行，从而，启动子序列被“可操作地连接”到该核酸序列上。通常，术语“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是相邻的，所述序列的连接是通过在适当的限制酶切位点上进行连接来实施的。如果所述位点不存在，可以使用根据常规方法合成的寡聚核苷酸衔接子或接头。
实施例1：PR系列整合型表达载体的构建
一、重组质粒pMD-18s rDNA的构建
(1)根据Spathaspora passalidarum全基因组序列(GenBank accession NZ_AEIK00000000)，设计两条引物截取Spathaspora passalidarum 18s rDNA部分序列作为同源重组位点。引物序列如下：引物P1下划线部分为EcoR I的识别位点，引物P2下划线部分由5’到3’端分别为Bgl II、BamH I和Kpn I的识别位点。
P1：5’GCCGGAATTCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTC3’
P2：5’ATATTAGGGGTACCCGGGATCCGAAGATCTGTTGAAGAGCAATAAT3’
(2)过夜培养Spathaspora passalidarum，收集细胞，分离、提取基因组DNA。
(3)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P1和P2进行PCR扩增。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃延伸5min。纯化回收PCR扩增产物后克隆至pMD19-Tsimple载体，获得重组质粒pMD-18srDNA。
二、重组质粒PMD-hphm的构建
(1)根据质粒pRS303H(Taxis C,Knop M.System of centromeric,episomal,andintegrative vectors based on drug resistance markers for Saccharomycescerevisiae.BioTechniques,2006,40(1):73-78.)中潮霉素抗性基因表达盒序列设计引物P3和P4。
P3：5’ACATTTTGATGGCCGCACGG3’
P4：5’AACTCCTTCCTTTTCGGTTAGAGCG 3’
(2)以pRS303H质粒DNA为模板，以引物P3和P4扩增hph表达盒片段，扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃延伸5min。纯化回收上述片段后，克隆至pMD19-Tsimple载体，获得重组质粒PMD-hph。
(3)根据潮霉素抗性基因CDS中CUG密码子情况设计突变引物。
P5：5’GAGAAGTTTTTGATCGAAAAGTTCGACAGC 3’
P6：5’GCTGTCGAACTTTTCGATCAAAAACTTCTC 3’
P7：5’GACAGCGTCTCCGACTTGATGCAGCTCTCG 3’
P8：5’CGAGAGCTGCATCAAGTCGGAGACGCTGTC 3’
P9：5’GGGCGTGGATATGTCTTGCGGGTAAATAG 3’
P10：5’CTATTTACCCGCAAGACATATCCACGCCC 3’
P11：5’AATTCAGCGAGAGCTTGACCTATTGCATCT 3’
P12：5’AGATGCAATAGGTCAAGCTCTCGCTGAATT 3’
P13：5’TTGCAAGACTTGCCTGAAACCGAATTGCCCGCTGTT 3’
P14：5’AACAGCGGGCAATTCGGTTTCAGGCAAGTCTTGCAA 3’
P15：5’AATTGCCCGCTGTTTTGCAGCCGGT 3’
P16：5’ACCGGCTGCAAAACAGCGGGCAATT 3’
P17：5’AGGCTCTCGATGAGTTGATGCTTTGGGCCGAG 3’
P18：5’CTCGGCCCAAAGCATCAACTCATCGAGAGCCT 3’
P19：5’GCTCCAACAATGTCTTGACGGACAATGG 3’
P20：5’CCATTGTCCGTCAAGACATTGTTGGAGC 3’
以质粒PMD-hph为模板，采用Stratagene定点突变试剂盒(购自安捷伦科技有限公司)，以上述引物进行PCR扩增，获得环状PCR产物。扩增条件为：95℃预变性2min，95℃变性30s，55℃退火2min，68℃延伸3.5min，30个循环，68℃充分延伸5min。
(4)将上述PCR产物纯化后用内切酶Dpn I于37℃消化30min，于65℃反应15min以失活内切酶Dpn I。将酶切产物纯化后，转化E.coli JM109感受态细胞(购自北京全式金公司)，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，挑选突变位点正确的质粒。经过上述突变操作后，突变质粒命名为PMD-hphm，其中突变后hph的CDS序列如图1所示。
三、重组质粒PR-hphm的构建
(1)根据PMD-hphm质粒中潮霉素抗性基因表达盒序列，设计两条引物：引物P21下划线部分由5’到3’端分别为BamH I和Pst I的识别位点，引物P22下划线部分为Kpn I的识别位点。
P21：5’CGGGATCCAAACTGCAGATGGGTAAAAAGCCTGAACTCAC3’
P22：5’GGGGTACCAACTCCTTCCTTTTCGGTTAGAGCG3’
(2)以PMD-hphm质粒DNA为模板，以引物P21和P22进行PCR扩增，获得PCR产物。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃延伸5min。
(3)将纯化的PCR产物和重组质粒pMD-18s rDNA分别用BamH I和Kpn I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后BamH I和Kpn I双酶切验证，获得重组质粒PR-hphm。
四、重组质粒PRTH的构建
(1)根据Spathaspora passalidarum全基因组序列(GenBank accession NZ_AEIK00000000)和在线数据库EMBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk/)提供的序列信息，获得Spathaspora passalidarum转录起始因子和上一个基因开放阅读框之间的所有DNA序列。根据启动子软件(http：//www.softberrv.com和http://www.cbs.dtu.dk/services/)对上述序列进行在线预测，之后根据所选序列酶切位点情况设计两条引物，调取Spathasporapassalidarum转录起始因子上游700bp左右作为启动子SpTEF1P：引物P23下划线部分为BamH I的识别位点，引物P24下划线部分为Pst I的识别位点。
P23：5’CGGGATCCACCACTTACATAATAGAAAGAC 3’
P24：5’ACGAGCCTGCAGTTTTGATTGATTGATTG 3’
(2)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P23和P24进行PCR扩增，获得PCR产物。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环，72℃延伸5min。
(3)将纯化的PCR产物和重组质粒PR-hphm分别用BamH I和Pst I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后BamH I和Pst I双酶切验证，获得重组质粒PRTH。
五、重组质粒PRATH和PRXTH的构建
(1)根据Spathaspora passalidarum全基因组序列(GenBank accession NZ_AEIK00000000)和在线数据库EMBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk/)提供的序列信息，获得Spathaspora passalidarum乙醇脱氢酶与木糖还原酶分别和上一个基因开放阅读框之间的所有DNA序列。根据启动子软件(http：//www.softberrv.com和http://www.cbs.dtu.dk/services/)对上述序列进行在线预测，之后根据所选序列酶切位点情况设计引物，调取Spathaspora passalidarum乙醇脱氢酶和木糖还原酶开放阅读框上游1000bp左右作为启动子，即SpADHP和SpXYLP：引物P25和P27下划线部分为Bgl II的识别位点，引物P26和P28下划线部分由5’到3’端分别为BamH I和Sal I的识别位点。
P25：5’GCCGGAAGATCTGTAAATTAATGCTACATCAGTTGAGG 3’
P26：5’CGGGATCCACGCGTCGACTATATTTTATTTAGGAATT 3’
P27：5’GCCGGAAGATCTGTGACATAGTTAACTATGGC 3’
P28：5’CGGGATCCACGCGTCGACTTTATTGTATTGTG 3’
(2)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P25和P26进行PCR扩增，获得片段SpADHP。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸5min。
(3)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P27和P28进行PCR扩增，获得片段SpXYLP。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸5min。
(4)将纯化的片段SpADHP和重组质粒PRTH分别用Bgl II和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Bgl II和BamH I双酶切验证，凝胶电泳后显示1000bp左右条带的即正向连接，获得重组质粒PRATH。
(5)将纯化的片段SpXYLP和重组质粒PRTH分别用Bgl II和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Bgl II和BamH I双酶切验证，凝胶电泳后显示1000bp左右条带的即正向连接，获得重组质粒PRXTH。
六、PR系列整合型表达载体的构建
(1)根据Spathaspora passalidarum全基因组序列(GenBank accession NZ_AEIK00000000)和在线数据库EMBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk/)提供的序列信息，获得Spathaspora passalidarum细胞色素C1和木糖还原酶开放阅读框下游序列。设计引物调取Spathaspora passalidarum细胞色素C1和木糖还原酶开放阅读框下游300bp左右作为转录终止子，即SpCYC1T和SpXYLT：引物P29和P31下划线部分由5’到3’端分别为Sal I和Not I的识别位点，引物P30和P32下划线部分为BamH I的识别位点。
P29：5’ACGCGTCGACATAAGAATGCGGCCGCGCTAACTTCAATTAGAA T3’
P30：5’CGGGATCCCATCACTATAAGCGAAATCGGGTTTC 3’
P31：5’ACGCGTCGACATAAGAATGCGGCCGCGTTTGATTCTAGTTTATA T3’
P32：5’GCGCGGATCCATAGTTAACTATGTCACTTGAACTC 3’
(2)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P29和P30进行PCR扩增，获得片段SpCYC1T。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min。
(3)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P31和P32进行PCR扩增，获得片段SpXYLT。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min。
(4)将纯化的片段SpCYC1T和重组质粒PRATH分别用Sal I和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和BamH I双酶切验证，获得重组质粒PRACTH。
(5)将纯化的片段SpCYC1T和重组质粒PRXTH分别用Sal I和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和BamH I双酶切验证，获得重组质粒PRXCTH。
(6)将纯化的片段SpXYLT和重组质粒PRATH分别用Sal I和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和BamH I双酶切验证，获得重组质粒PRAXTH。
(7)将纯化的片段SpXYLT和重组质粒PRXTH分别用Sal I和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和BamH I双酶切验证，获得重组质粒PRXXTH。
实施例2：PA系列整合型表达载体的构建
一、重组质粒pMD-PsARS2的构建
(1)根据树干毕赤酵母自主复制序列的DNA序列(GenBank accession U08628.1)，设计两条引物P19和P20,。引物序列如下：引物P33下划线部分为EcoR I的识别位点，引物P34下划线部分由5’到3’端分别为Bgl II、BamH I和Kpn I的识别位点。
P33：5’GCGCCGGAATTCAGTATAGGATATGGTGTTTAG 3’
P34：5’ATTGGGGTACCCGGGATCCGAAGATCTTCTGCGGTGTC3’
(2)过夜培养树干毕赤酵母，收集细胞，分离、提取基因组DNA。
(3)以树干毕赤酵母宿主菌基因组DNA为模板，以引物P33和P34进行PCR扩增。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃延伸5min。纯化回收PCR扩增产物后克隆至pMD19-Tsimple载体，获得重组质粒pMD-PsARS2。
二、重组质粒PA-hphm的构建
(1)根据PMD-hphm质粒中潮霉素抗性基因表达盒序列，设计两条引物：引物P21下划线部分由5’到3’端分别为BamH I和Pst I的识别位点，引物P22下划线部分为Kpn I的识别位点。
P21：5’CGGGATCCAAACTGCAGATGGGTAAAAAGCCTGAACTCAC3’
P22：5’GGGGTACCAACTCCTTCCTTTTCGGTTAGAGCG3’
(2)以PMD-hphm质粒DNA为模板，以引物P21和P22进行PCR扩增，获得PCR产物。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃延伸5min。
(3)将纯化的PCR产物和重组质粒pMD-PsARS2分别用BamH I和Kpn I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后BamH I和Kpn I双酶切验证，获得重组质粒PA-hphm。
三、重组质粒PATH的构建
(1)根据Spathaspora passalidarum全基因组序列(GenBank accession NZ_AEIK00000000)和在线数据库EMBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk/)提供的序列信息，获得Spathaspora passalidarum转录起始因子和上一个基因开放阅读框之间的所有DNA序列。根据启动子软件(http：//www.softberrv.com和http://www.cbs.dtu.dk/services/)对上述序列进行在线预测，之后根据所选序列酶切位点情况设计两条引物，调取Spathasporapassalidarum转录起始因子上游700bp左右作为启动子SpTEF1P：引物P23下划线部分为BamH I的识别位点，引物P24下划线部分为Pst I的识别位点。
P23：5’CGGGATCCACCACTTACATAATAGAAAGAC 3’
P24：5’ACGAGCCTGCAGTTTTGATTGATTGATTG 3’
(2)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P23和P24进行PCR扩增，获得PCR产物。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环，72℃延伸5min。
(3)将纯化的PCR产物和重组质粒PA-hphm分别用BamH I和Pst I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后BamH I和Pst I双酶切验证，获得重组质粒PATH。
四、重组质粒PAATH和PAXTH的构建
(1)根据Spathaspora passalidarum全基因组序列(GenBank accession NZ_AEIK00000000)和在线数据库EMBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk/)提供的序列信息，获得Spathaspora passalidarum乙醇脱氢酶与木糖还原酶分别和上一个基因开放阅读框之间的所有DNA序列。根据启动子软件(http：//www.softberrv.com和http://www.cbs.dtu.dk/services/)对上述序列进行在线预测，之后根据所选序列酶切位点情况设计引物，调取Spathaspora passalidarum乙醇脱氢酶和木糖还原酶开放阅读框上游1000bp左右作为启动子，即SpADHP和SpXYLP：引物P25和P27下划线部分为Bgl II的识别位点，引物P26和P28下划线部分由5’到3’端分别为BamH I和Sal I的识别位点。
P25：5’GCCGGAAGATCTGTAAATTAATGCTACATCAGTTGAGG 3’
P26：5’CGGGATCCACGCGTCGACTATATTTTATTTAGGAATT 3’
P27：5’GCCGGAAGATCTGTGACATAGTTAACTATGGC 3’
P28：5’CGGGATCCACGCGTCGACTTTATTGTATTGTG 3’
(2)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P25和P26进行PCR扩增，获得片段SpADHP。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸5min。
(3)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P27和P28进行PCR扩增，获得片段SpXYLP。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸5min。
(4)将纯化的片段SpADHP和重组质粒PRTH分别用Bgl II和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Bgl II和BamH I双酶切验证，凝胶电泳后显示1000bp左右条带的即正向连接，获得重组质粒PAATH。
(5)将纯化的片段SpXYLP和重组质粒PRTH分别用Bgl II和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Bgl II和BamH I双酶切验证，凝胶电泳后显示1000bp左右条带的即正向连接，获得重组质粒PAXTH。
五、PA系列整合型表达载体的构建
(1)根据Spathaspora passalidarum全基因组序列(GenBank accession NZ_AEIK00000000)和在线数据库EMBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk/)提供的序列信息，获得Spathaspora passalidarum细胞色素C1和木糖还原酶开放阅读框下游序列。设计引物调取Spathaspora passalidarum细胞色素C1和木糖还原酶开放阅读框下游300bp左右作为转录终止子，即SpCYC1T和SpXYLT：引物P29和P31下划线部分由5’到3’端分别为Sal I和Not I的识别位点，引物P30和P32下划线部分为BamH I的识别位点。
P29：5’ACGCGTCGACATAAGAATGCGGCCGCGCTAACTTCAATTAGAA T3’
P30：5’CGGGATCCCATCACTATAAGCGAAATCGGGTTTC 3’
P31：5’ACGCGTCGACATAAGAATGCGGCCGCGTTTGATTCTAGTTTATA T3’
P32：5’GCGCGGATCCATAGTTAACTATGTCACTTGAACTC 3’
(2)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P29和P30进行PCR扩增，获得片段SpCYC1T。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min。
(3)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P31和P32进行PCR扩增，获得片段SpXYLT。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min。
(4)将纯化的片段SpCYC1T和重组质粒PRATH分别用Sal I和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和BamH I 双酶切验证，获得重组质粒PAACTH。
(5)将纯化的片段SpCYC1T和重组质粒PRXTH分别用Sal I和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和BamH I双酶切验证，获得重组质粒PAXCTH。
(6)将纯化的片段SpXYLT和重组质粒PRATH分别用Sal I和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和BamH I双酶切验证，获得重组质粒PAAXTH。
(7)将纯化的片段SpXYLT和重组质粒PRXTH分别用Sal I和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和BamH I双酶切验证，获得重组质粒PAXXTH。
实施例3：PEG/LiAc介导的树干毕赤酵母转化方法的建立。
以Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124作为宿主菌，采用PEG/LiAc介导转化酵母的方法实施如下：
一、Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124感受态的制备
(1)将冻存管保藏的Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124接种于YPD培养基，摇瓶活化培养48h。
(2)将活化好的菌液在YPD平板上划线培养，并4℃保存。
(3)于YPD平板中挑取Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124单菌落，接种于20ml YPD培养基中，于100ml摇瓶中30℃过夜培养。
(4)将过夜培养的新鲜菌液接种于50ml YPD培养基中，于250ml摇瓶中30℃，200rpm培养，至菌液OD600到1.2左右。
(5)5000rpm室温离心5min，收集菌体细胞。
(6)将细胞重新悬浮于500μl 0.1mol/L的LiAc中，离心，弃上清，获得感受态细胞。
二、线性化重组质粒的制备
(1)将含有重组表达质粒的E.coli接种于LB培养基，过夜培养。
(2)收集E.coli菌体细胞，采用碱裂法提取重组质粒，具体方法参照博大泰克质粒提取试剂盒。
(3)采用限制性内切酶Stu I单酶切重组质粒，酶切反应体系(50μL)：40μL DNA，5μL buffer，1.5μL限制性内切酶Stu I，用双蒸水补足50μL，混匀后置于37℃恒温箱中酶切2h。
(4)纯化酶切产物，获得线性化重组质粒。
三、PEG/LiAc法转化Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124
(1)在感受态细胞中顺序加入下列转化混合液：240μL PEG3350，36μL1.0mol/LLiAc，25μL鲑鱼精DNA，50μL待转化线性DNA，其中鲑鱼精DNA沸水浴10min后立即冰浴；
(2)剧烈振荡每个反应管直至细胞完全混匀；
(3)置于30℃温育1h；
(4)置于42℃金属浴热击22min；
(5)待降至室温后，5000rpm离心5min，弃上清；
(6)加入1ml YPD培养基，于30℃后培养2h；
(7)5000rpm离心5min，弃掉800μl上清，混匀菌体并涂布潮霉素B(250mg/mL)抗性平板，30℃培养3-4d，获得转化子。
实施例4：电穿孔法介导的酵母树干毕赤酵母转化方法的建立
以Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124作为宿主菌，采用电穿孔法介导转化酵母的实施如下：
一、Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124电转感受态细胞的制备
(1)将冻存管保藏的Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124接种于YPD培养基，摇瓶活化培养48h；
(2)将活化好的菌液在YPD平板上划线培养，并4℃保存；
(3)于YPD平板中挑取Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124单菌落，接种于20ml YPD培养基中，于100ml摇瓶中30℃过夜培养；
(4)将过夜培养的新鲜菌液接种于50ml YPD培养基中，于250ml摇瓶中30℃，200rpm培养，至菌液OD600到1.2左右；
(5)将菌液置于冰上30min，5000rpm，4℃离心5min，收集菌体细胞；
(6)加入预冷的20ml双蒸水洗涤菌体2次，5000rpm，4℃离心5min，收集菌体细胞；
(7)加入20ml预冷的1.0mol/L山梨醇洗涤菌体2次，5000rpm，4℃离心5min，收集菌体细胞；
(8)加入200μl预冷的1.0mol/L山梨醇混匀菌体细胞，获得感受态细胞。
二、线性化重组质粒的制备
(1)将含有重组表达质粒的E.coli接种于LB培养基，过夜培养。
(2)收集E.coli菌体细胞，采用碱裂法提取重组质粒，具体方法参照博大泰克质粒提取试剂盒。
(3)采用限制性内切酶Stu I单酶切重组质粒，酶切反应体系(50μL)：40μL DNA，5μL buffer，1.5μL限制性内切酶Stu I，用双蒸水补足50μL，混匀后置于37℃恒温箱中酶切2h。
(4)纯化酶切产物，获得线性化重组质粒。
三、Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124的电转化
(1)取100μl电转化感受态细胞和10μl DNA混合，加入到0.2cm电转杯中；
(2)电转杯冰浴5min，设定条件1500v，电击5s，进行电转化；
(3)立即向电转杯中加入1ml预冷的1.0mol/L山梨醇，转移至培养箱30℃温育1h；
(4)5000rpm离心5min，弃上清；
(5)加入1ml YPD培养基，混匀菌体细胞，于培养箱30℃后培养2h；
(6)5000rpm离心5min，弃掉800μl上清，混匀菌体并涂布潮霉素B(250mg/mL)抗性平板，30℃培养3-4d，获得转化子。
实施例5：PR系列整合型表达载体的应用。
一、构建绿色荧光蛋白重组表达载体
(1)根据绿色荧光蛋白的基因序列，设计引物：引物P35下划线部分为Sal I的识别位点，引物P36下划线部分为Not I的识别位点。
P35：5’ACGCGTCGACATGGGTAAGGGAGAAGAACTTTTCAC 3’
P36：5’ATAAGAATGCGGCCGCTTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATG 3’
(2)以绿色荧光蛋白基因的DNA为模板，以引物P35和P36进行PCR扩增，获得基因gfp。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸5min。
(3)将纯化对gfp片段克隆至pMD19-Tsimple载体，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和Not I双酶切验证，获得重组质粒pMD-gfp。
(4)由于gfp基因序列开放阅读框中存在密码子CUG，而树干毕赤酵母使用特殊的编码系统，即密码子CUG编码丝氨酸而非亮氨酸。因此有必要对gfp基因进行定点突变，将密码子CUG突变为密码子UUG。
(5)以gfp基因序列开放阅读框中601位的碱基C作为突变位点，设计单点突变引物：引物P37和P38下划线部分为突变位点。
P37：5’GGCAGATTGTGTGGACAAGTAATGGTTGTCTGGTA3’
p38：5’TACCAGACAACCATTACTTGTCCACACAATCTGCC3’
(6)以重组质粒pMD-gfp为模板，采用高保真聚合酶Primerstar，以引物P37和P38进行PCR扩增，获得环状PCR产物。扩增条件为：98℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸90s，30个循环，72℃延伸5min。
(7)将上述PCR产物纯化后用内切酶Dpn I于37℃消化30min，于65℃反应15min以失活内切酶Dpn I。将酶切产物纯化后，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，挑选突变位点正确的质粒，命名为pMD-gfpm。gfp基因定点突变后序列如图2所示。
(8)将重组质粒pMD-gfpm和PRACTH分别用Sal I和Not I双酶切。gfp片段酶切纯化后与质粒PRACTH的酶切产物过夜连接，转化E.coli JM109菌株，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和Not I双酶切验证，获得绿色荧光蛋白重组表达载体PRACTH-gfpm，质粒图谱如图3所示。
二、构建树干毕赤酵母重组菌
将经Stu I线性化的质粒PRACTH-gfpm按实施例2或实施例3中所述方法，转化到Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124中，获得转化子。
三、转化子筛选与验证
(1)通过高浓度潮霉素B抗性平板筛选转化子。将绿色荧光蛋白重组表达载体转化Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124后获得的转化子转接于更高浓度潮霉素B(350μg/mL)抗性平板上，30℃培养2-3d，采用相同的方法连续转接3次，获得纯培养转化子菌株。
(2)阳性转化子的菌落PCR验证。以引物P21和P22配制PCR扩增体系，并在体系中加入微量微波处理的转化子菌体。PCR扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳显示1100bp左右条带，如图4所示，与DNA片段hphm-ScCYC1T条带大小相符合。
(3)阳性转化子的荧光检测。将步骤(1)中获得的纯培养转化子菌株接种于YPD培养基中，摇瓶30℃培养18h后，收集菌体，双蒸水洗涤菌体细胞2次并重悬于双蒸水中。吸取少量悬液置于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下用油镜观察并拍照。如图5所示，可以观察到细胞发出绿色荧光。
实施例6：PA系列游离型表达载体的应用。
一、构建绿色荧光蛋白重组表达载体
(1)将实施例4中重组的质粒pMD-gfpm和PAACTH分别用Sal I和Not I双酶切。gfp片段酶切纯化后与质粒PRACTH的酶切产物过夜连接，转化E.coli JM109菌株，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和Not I双酶切验证，获得绿色荧光蛋白重组表达载体PAACTH-gfpm，质粒图谱如图6所示。
二、构建树干毕赤酵母重组菌
将绿色荧光蛋白重组表达质粒PAACTH-gfpm按实施例2或实施例3中所述方法，转化到Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124中，获得转化子。
三、转化子筛选与验证
(1)通过高浓度潮霉素B抗性平板筛选转化子。将绿色荧光蛋白重组表达载体转化Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124后获得的转化子转接于更高浓度潮霉素B(350μg/mL)抗性平板上，30℃培养2-3d，采用相同的方法连续转接3次，获得纯培养转化子菌株。
(2)阳性转化子的菌落PCR验证。以引物P21和P22配制PCR扩增体系， 并在体系中加入微量微波处理的转化子菌体。PCR扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳显示1100bp左右条带，与DNA片段hph-ScCYC1T条带大小相符合。
(3)阳性转化子的荧光检测。将步骤(1)中获得的纯培养转化子菌株接种于含有潮霉素B(250μg/ml)的YPD培养基中，摇瓶30℃培养18h后，收集菌体，双蒸水洗涤菌体细胞2次并重悬于双蒸水中。吸取少量悬液置于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下用油镜观察并拍照。如图7所示，可以观察到细胞发出绿色荧光。
实施例7：树干毕赤酵母表达系统在树干毕赤酵母代谢工程改造方面的应用。
一、构建L-乳酸脱氢酶重组表达载体
(1)根据植物乳杆菌的L-乳酸脱氢酶基因序列，设计引物：引物P37下划线部分为Sal I和Xba I的识别位点，引物P38下划线部分为Not I的识别位点。
P39：5’ACGCGTCGACTGCTCTAGAATGCCAAATCATCAAAAAGTT 3’
P40：5’GGCGATAAGAATGCGGCCGCTTATTTATTTTCTAATTCAGC 3’
(2)以植物乳杆菌(购自江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心，http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn/)菌体细胞为模板，采用高保真性聚合酶Primerstar，以引物P39和P40进行菌落PCR扩增，获得L-乳酸脱氢酶基因L-ldh。扩增条件为98℃预变性2min，98℃变性10s，62℃退火20s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min。
(3)将纯化的L-ldh片段克隆至pMD19-Tsimple载体，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和Not I双酶切验证，将验证正确的质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，挑选L-ldh的DNA序列正确的质粒，命名为pMD-ldh。L-ldh的DNA序列为SEQ ID NO:13，如图8所示。
(4)将重组质粒pMD-ldh和PRACTH分别用Sal I和Not I双酶切。将经酶切的L-ldh片段纯化后与质粒PRACTH的酶切产物过夜连接，转化E.coli JM109菌株，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和Not I双酶切验证，获得L-乳酸脱氢酶重组表达载体PRACTH-ldh，质粒 图谱如图9所示。
二、构建Pichia stipitis基因工程菌
将经Stu I线性化的质粒PRACTH-gfpm按实施例2或实施例3中所述方法，转化到Pichia stipitis NRRL Y-7124中，获得转化子。
三、转化子筛选与验证
(1)通过高浓度潮霉素B抗性平板筛选转化子。将L-乳酸脱氢酶重组表达载体转化Pichia stipitis NRRL Y-7124后获得的转化子转接于更高浓度潮霉素B(350μg/mL)抗性平板上，30℃培养2-3d，采用相同的方法连续转接3次，获得纯培养转化子菌株。
(2)阳性转化子的菌落PCR验证。以引物P21和P22配制PCR扩增体系，并在体系中加入微量微波处理的转化子菌体。PCR扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳显示1100bp左右条带，与DNA片段hphm-ScCYC1T条带大小相符合。
四、阳性转化子摇瓶发酵及代谢产物分析。
(1)将上述步骤中获得的纯培养转化子菌株接种于20ml YPD培养基中，于100ml摇瓶中，30℃，200rpm条件下培养18h后，收集菌体，双蒸水洗涤菌体细胞2次并重悬于双蒸水中，获得种子细胞。
(2)将种子细胞接种于50ml YPD培养基中，使初始OD600在0.5左右。于250ml摇瓶，30℃，150rpm条件下进行发酵培养。定时取样测定菌液OD600及相关物质含量，其中OD600采用可见分光光度计在600nm下测定。葡萄糖、L-乳酸和乙醇用高效液相色谱法(HPLC)测定，色谱仪为DIONEX P680；泵为Agilent 1100；检测器为示差折光检测器(RID)；色谱柱为SUGARSH1011，条件：0.01mol/L H2SO4，流速0.8ml/min，进样量20ul，柱温50℃。取发酵上清液加入等体积10％的三氯乙酸，沉淀蛋白3小时以上，12000r/min离心20min，经0.45μm水膜过滤处理后，取20μl进样，采用示差检测器检测相关物质。树干毕赤酵母生长及葡萄糖代谢情况如图10所示。
Claims (5)
1.一种整合型树干毕赤酵母的表达系统，其特征在于包括一种整合型表达载体，所述表达载体从5’-3’依次包括以下可操作性元件：
pMD19-Tsimple质粒骨架、rDNA同源重组序列、外源基因表达盒和筛选标记基因表达盒；
所述外源基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、外源基因插入酶切位点以及转录终止子；
所述筛选标记基因表达盒包括启动子、抗生素抗性基因、转录终止子；
所述整合型表达载体的宿主细胞为树干毕赤酵母；
所述rDNA同源重组序列为18s rDNA序列；所述的18s rDNA序列如SEQ ID NO:1所示；
所述外源基因表达盒中的启动子包括SpADHP、SpXYLP；转录终止子包括SpCYC1T、SpXYLT；
所述筛选标记基因表达盒中的启动子包括SpTEF1P；抗生素抗性基因包括潮霉素抗性基因、博来霉素抗性基因、G418；转录终止子包括SpCYC1T、ScCYC1T；
所述的SpADHP启动子为Spathaspora passalidarum来源的乙醇脱氢酶基因ADH1启动子，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:2所示；
所述的SpXYLP启动子为Spathaspora passalidarum来源的木糖还原酶基因XYL启动子，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:3所示；
所述的SpTEF1P启动子为Spathaspora passalidarum来源的转录起始因子基因TEF1启动子，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:4所示；
所述的SpCYC1T终止子为Spathaspora passalidarum来源的细胞色素C基因CYC1终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID NO:5所示；
所述的SpXYLT终止子为Spathaspora passalidarum来源的木糖还原酶基因XYL终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID NO:6所示；
所述的ScCYC1T终止子为Saccharomyces cerevisiae来源的细胞色素C基因CYC1终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID NO:7所示；
所述的潮霉素抗性基因的DNA序列如SEQ ID NO:8所示；
所述的博来霉素抗性基因的DNA序列如SEQ ID NO:9所示；
所述的G418的DNA序列如SEQ ID NO:10所示。
2.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于，宿主菌树干毕赤酵母保藏于美国农业研究菌种保藏中心，保藏编号为NRRL Y-7124。
3.权利要求1所述的树干毕赤酵母的表达系统的用途，其特征在于用于表达外源蛋白和宿主菌自身代谢工程改造。
4.一种表达外源基因的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）制备如权利要求1所述的表达系统；
（2）将外源基因插入所述表达载体的外源基因插入酶切位点，获得重组表达载体；
（3）将所述重组表达载体转化宿主菌树干毕赤酵母并在宿主菌中表达所述外源基因。
5.一种代谢工程改造宿主菌树干毕赤酵母的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）制备如权利要求1所述的表达系统；
（2）将目标基因插入所述表达载体的外源基因插入酶切位点，获得重组表达载体；
（3）将所述重组表达载体转化宿主菌树干毕赤酵母并在宿主菌中表达所述目标基因；
（4）培养步骤（3）得到的重组菌，检测所述重组菌代谢产物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510005584.6A CN104593407B (zh) | 2015-01-06 | 2015-01-06 | 树干毕赤酵母基因表达系统及其构建与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510005584.6A CN104593407B (zh) | 2015-01-06 | 2015-01-06 | 树干毕赤酵母基因表达系统及其构建与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104593407A CN104593407A (zh) | 2015-05-06 |
| CN104593407B true CN104593407B (zh) | 2017-11-21 |
Family
ID=53119460
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510005584.6A Active CN104593407B (zh) | 2015-01-06 | 2015-01-06 | 树干毕赤酵母基因表达系统及其构建与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104593407B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108866050B (zh) * | 2017-05-11 | 2022-12-27 | 杭州菁因康生物科技有限公司 | 一种高效的基因工程载体 |
| CN107338263B (zh) * | 2017-06-20 | 2020-12-29 | 天津大学 | 一种基于树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产衣康酸的构建方法 |
| CN107630029B (zh) * | 2017-06-28 | 2020-08-25 | 广东利世康低碳科技有限公司 | 一种产朊假丝酵母游离型表达载体及其构建方法与应用 |
| CN111500479B (zh) * | 2020-04-29 | 2022-12-27 | 江南大学 | 一种非甲醇诱导双启动子毕赤酵母工程菌的构建及其应用 |
| CN112342149A (zh) * | 2020-11-12 | 2021-02-09 | 新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心） | 一种禽流感病毒样颗粒组装表达系统及其应用 |
-
2015
- 2015-01-06 CN CN201510005584.6A patent/CN104593407B/zh active Active
Non-Patent Citations (15)
| Title |
|---|
| Cloning vector pCloneHyg1, complete sequence;Gregan,J. 等;《GenBank Database》;20061209;Accession No.EF101286 * |
| Cloning vector pH1TO-shRNA_FF4-hEF1a-TetR-2A-iRFP-2A-Bla, complete sequence;Li,Y. 等;《GenBank Database》;20141223;Accession No.KM519788 * |
| Cre /LoxP重组系统的改造及在树干毕赤酵母中的应用;傅静 等;《生物加工过程》;20140915(第5期);第39－45页 * |
| Cre/Loxp重组系统的修饰及其在树干毕赤酵母中的应用;傅静;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）基础科学辑》;20140215(第02期);第一章"绪论"1.1"树干毕赤酵母"第1段第1，5－6，11－12行 * |
| Expression vector pUDE188, complete sequence;Koopman,F. 等;《GenBank Database》;20121220;Accession No.JX268038 * |
| Pichia stipitis CBS 6054 ATCC 58785 autonomous replication sequence;Yang,V.W. 等;《GenBank Database》;19950510;Accession No.U08628 * |
| S p ath asp o ra p assalid aru m N R R L Y -27907 h yp o th eticalp ro tein (SPAPADRAFT_60097),m R N A;Wohlbach,D.J. 等;《GenBank Database》;20140326;Accession No.XM _007374197 * |
| ScINO1基因克隆及酵母多基因多拷贝整合表达载体的构建;黄贞杰 等;《福建师范大学学报（自然科学版）》;20121115;第28卷(第6期);摘要，第101页第3段，图3，1.2"方法"，第104页3"讨论"第4段第1－2行，第105页第2－3行 * |
| Spathaspora passalidarum 18S ribosomal RNA gene, partial sequence;Nguyen,N.H. 等;《GenBank Database》;20061117;Accession No.DQ232894 * |
| Spathaspora passalidarum NRRL Y-27907 hypothetical protein (SPAPADRAFT_62827), mRNA;Wohlbach,D.J. 等;《GenBank Database》;20140326;Accession No.XM_007376891 * |
| Spathaspora passalidarum NRRL Y-27907 xylose reductase (SPAPADRAFT_61339), mRNA;Wohlbach,D.J. 等;《GenBank Database》;20140326;Accession No.XM_007375472 * |
| Spathaspora passalidarum NRRL Y-27907 xylose reductase (SPAPADRAFT_61341), partial;Wohlbach,D.J. 等;《GenBank Database》;20140326;Accession No.XM_007375474 * |
| Uncultured bacterium DCM006Kan09 genomic sequence;Wichmann,F. 等;《GenBank Database》;20140428;Accession No.KJ512980 * |
| 巴斯德毕赤酵母表达系统;唐元家 等;《国外医药抗生素分册》;20021125;第23卷(第6期);第246－271页 * |
| 毕赤酵母表达系统研究进展;马银鹏 等;《黑龙江科学》;20130915;第4卷(第9期);第27－31页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104593407A (zh) | 2015-05-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104593407B (zh) | 树干毕赤酵母基因表达系统及其构建与应用 | |
| CN104630258B (zh) | 一种酿酒酵母基因表达系统及其构建与应用 | |
| CN110272858B (zh) | 一种高产l-乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用 | |
| CN104561082B (zh) | 一株能够利用木糖的酵母Candida jeffriesii的表达系统 | |
| CN111154705B (zh) | 热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌及其构建方法及应用 | |
| CN101613707B (zh) | 一种用代谢工程菌生产谷胱甘肽的方法 | |
| CN107937296A (zh) | 一种具有乙酸糠醛香草醛耐受性重组酿酒酵母及制备方法、应用 | |
| CN117229934A (zh) | 一种合成类胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN101993850B (zh) | 一种生产d-乳酸基因工程菌及构建方法和应用 | |
| CN104561081B (zh) | 一株能够利用木糖的酵母Candida amazonensis的表达系统 | |
| CN114525215B (zh) | 产萜类化合物的重组菌株及其构建方法和发酵产萜类化合物的方法及应用 | |
| CN104630257B (zh) | 一株能够利用木糖的酵母Spathaspora passalidarum的表达系统 | |
| CN114736918B (zh) | 一种整合表达生产红景天苷的重组大肠杆菌及其应用 | |
| CN115725484A (zh) | 合成d-阿洛酮糖的酶突变表达工程菌及应用 | |
| CN101892250A (zh) | 一种高产油酸的浅白隐球酵母工程菌株的构建方法 | |
| CN101892228B (zh) | 一种高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性产腈水合酶工程菌及应用 | |
| CN106434700B (zh) | 一种提高乙醇产率的酿酒酵母spt15定点饱和基因突变方法 | |
| CN109370972A (zh) | 一种醋酸杆菌工程菌及其应用 | |
| CN115960920B (zh) | 协氧蛋白FHb及其重组菌X33-pPICZαA-102C300C-FHb2和应用 | |
| CN115948427B (zh) | 协氧蛋白FHb及其重组菌X33-pPICZαA-102C300C-FHb1和应用 | |
| CN116478893B (zh) | 一种产丙酸的工程益生菌的构建与应用 | |
| CN107815461A (zh) | 瘤胃真菌木糖异构酶基因及其应用 | |
| CN115011537B (zh) | 一株双厌氧启动子诱导产高光学纯l-乳酸的工程菌及其制备方法与应用 | |
| CN117701515A (zh) | Nadh脱氢酶突变体及其应用 | |
| CN117701513A (zh) | Atp合酶突变体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP02 | Change in the address of a patent holder | ||
| CP02 | Change in the address of a patent holder |
Address after: 214001 Liangxi District Food Science and Technology Park, 7th floor, South Building, No. 898, Tongsha Road, Liangxi District, Wuxi City, Jiangsu Province Patentee after: Jiangnan University Address before: No. 1800 road 214122 Jiangsu Lihu Binhu District City of Wuxi Province Patentee before: Jiangnan University |