CN117701513A - Atp合酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种ATP合酶突变体及其应用。将ATP合酶第547位赖氨酸突变为精氨酸或组氨酸，获得的特定突变体能显著提高L‑谷氨酸生产菌株中相应目标氨基酸的产量及转化率，且该突变体对菌株生长无影响。本发明为谷氨酸发酵生产提供有效手段。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体地说，涉及一种ATP合酶突变体及其应用。
背景技术
谷氨酸棒杆菌是一种需氧、生长快速、不产孢子、短杆棒状、非致病性的革兰氏阳性微生物。谷氨酸棒杆菌从被分离以来，被广泛应用于氨基酸的生产。由于其易于遗传操作以及生长速度快，发酵周期短，还被应用于除氨基酸生产以外的有机酸、醇、类胡萝卜素等的生产，是科研和工业生产中重要的模式生物。
生物代谢途径呈网络体系，细胞中的大多数基因型与表型并不是线性相关，细胞的特定表型往往由多个基因控制，近几十年谷氨酸合成途径上的基因的强化在一定程度上能够提高谷氨酸的产量，但继续提高谷氨酸的合成还需要其他基因的参与使细胞达到动态平衡来进一步提高谷氨酸的产量及转化率。
发明内容
本发明的目的是提供一种ATP合酶突变体及其应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种ATP合酶突变体，所述突变体包含ATP合酶第547位氨基酸由K到R或H的突变，优选K547R。
本发明中，ATP合酶在NCBI上的参考序列编号为BBD29_06475。
第二方面，本发明提供编码所述ATP合酶突变体的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料。
所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
第三方面，本发明提供所述核酸分子或所述生物材料在提高微生物的谷氨酸产量、生产强度或转化率中的应用。
第四方面，本发明提供一种重组微生物，所述微生物表达所述的ATP合酶突变体。
优选地，所述重组微生物是将编码ATP合酶的基因突变为编码所述ATP合酶突变体的基因构建得到的。
所述重组微生物为棒杆菌属(Corynebacterium)菌种，优选谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
进一步地，所述重组微生物的出发菌株为能够积累谷氨酸的谷氨酸棒杆菌。
优选地，所述出发菌株为MHZ-0112-8(谷氨酸棒杆菌MHZ-0112-8保藏编号CGMCCNo.11941，参见CN105695383A)。
第五方面，本发明提供所述重组微生物的构建方法，其是将所述ATP合酶突变体的基因通过质粒导入微生物中或通过基因工程手段整合到微生物染色体上，或者，将出发菌株中编码ATP合酶的基因突变为编码所述ATP合酶突变体的基因。
第六方面，本发明提供所述重组微生物在谷氨酸发酵生产中的应用。
第七方面，本发明提供一种生产谷氨酸的方法，包括将所述重组微生物进行发酵培养的步骤。
优选地，发酵所用培养基为：葡萄糖50-60g/L，硫酸铵10-20g/L，KH2PO4 0.5-1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2-0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.05-0.15mg/L，MnSO4·5H2O 0.05-0.15mg/L，VB1 150-250μg/L，生物素250-350μg/L，豆粕水解液0.3-0.6g/L，pH 7.2-7.5。
本发明ATP合酶突变体能够提高ATP合酶的催化活性，提高了细胞内能量的供应，平衡了细胞的代谢网络，通过与谷氨酸合成网络的相互作用，提高了谷氨酸的合成。
具体地，ATP合酶第547位赖氨酸被精氨酸或组氨酸取代，获得特定突变体，显著提高了L-谷氨酸生产菌株中相应目标氨基酸的产量及转化率，且该突变体对菌株生长几乎没有影响。
具体实施方式
本发明旨在提供蛋白突变体(ATP合酶突变体)、表达该蛋白突变体的重组微生物及其制备方法和应用。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种酶活提高的ATP合酶突变体及其用于L-谷氨酸生产的方法，其使L-谷氨酸生产菌株表达ATP合酶突变体，所述ATP合酶突变体以L-谷氨酸生产菌株野生型ATP合酶的氨基酸序列为参考序列，含有第547位赖氨酸被其他氨基酸取代的突变。
优选地，所述ATP合酶突变体含有第547赖氨酸被精氨酸或组氨酸取代的突变，优选被精氨酸取代。
术语“突变”是指编码蛋白的基因上的碱基进行添加、缺失或者替换一个或者多个碱基引起的编码蛋白的氨基酸的序列发生改变，进而使该蛋白的功能活性发生改变。所述突变的方法可以选自诱变、PCR定点突变法和/或同源重组等方法中的一种。本发明中，优选通过同源重组的突变方法，将ATP合酶基因编码蛋白的第547位赖氨酸突变为精氨酸。
本发明ATP合酶突变体具有提高ATP合酶的催化活性，提高了细胞内能量的供应，平衡了细胞的代谢网络，通过与谷氨酸合成网络的相互作用，提高了谷氨酸的合成。
本发明中，所述ATP合酶突变体具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
编码所述ATP合酶突变体的核酸具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
本领域技术人员应理解，在上述蛋白突变体序列的N端或C端添加标签蛋白或将其与其他蛋白进行融合形成融合蛋白，在不改变上述突变蛋白本身的活性的情况下，上述添加标签的蛋白或融合蛋白也在本发明的保护范围内。
根据上述提供的ATP合酶突变体的氨基酸序列，本领域技术人员能够获得其编码核酸的序列。基于密码子的简并性，编码上述氨基酸序列的核酸序列并不唯一，所有能够编码上述蛋白突变体的核酸均在本发明的保护范围内。
本发明中，所述氨基酸生产菌株为棒杆菌属微生物，优选为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
基于ATP合酶突变体的功能，本发明提供所述ATP合酶突变体或其编码核酸的如下任一种应用：
(1)提高L-谷氨酸生产菌株中L-谷氨酸的含量；
本发明还提供一种重组微生物，其表达ATP合酶突变体，所述ATP合酶突变体如上所述；所述重组微生物的出发菌株为谷氨酸棒杆菌MHZ-0112-8，其保藏编号为CGMCCNo.11941，或者所述重组微生物的出发菌株为谷氨酸棒杆菌MHZ-0912-6，其保藏编号为CGMCC No.11942。
优选地，将出发菌株染色体上原始ATP合酶编码基因突变为所述ATP合酶突变体的编码基因。
本发明提供的表达该ATP合酶突变体的重组微生物显著提高了L-谷氨酸工业生产菌株中L-谷氨酸的产量及转化率。
本发明还提供一种上述重组微生物的构建方法，其包括：将出发菌株中编码ATP合酶的基因突变为编码ATP合酶突变体的基因，所述ATP合酶突变体如上所述。
在本发明的一个具体实施方式中，所述方法包括：将携带编码所述ATP合酶突变体的基因的重组质粒导入出发菌株中的步骤。
优选地，所述重组质粒为可在菌体中发生同源重组的质粒，将质粒上的ATP合酶突变体的编码基因与染色体上的同源基因进行交换。
进一步地，所述构建方法包括：
(1)构建含有编码所述ATP合酶突变体的基因的重组质粒；
(2)将重组质粒转化出发菌株，用含抗生素的选择培养基筛选转化子；
(3)在阳性转化子中筛选发生目标突变的重组微生物。
本发明还提供一种生产谷氨酸的方法，其包括以上述的重组微生物进行发酵培养的步骤，所述重组微生物的出发菌株为谷氨酸棒杆菌MHZ-0112-8。
本发明中，发酵培养时的发酵培养基包括如下组分：葡萄糖50-60g/L，硫酸铵10-20g/L，KH2PO4 0.5-1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2-0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.5-1.5mg/L，MnSO4·5H2O 0.8-1.2mg/L，VB1 150-250μg/L，生物素250-350μg/L，豆粕水解液0.3-0.6g/L，碳酸钙40-80g/L，pH 7.2-7.5。
具体地，本发明的一种酶活提高的ATP合酶突变体及其用于L-谷氨酸生产的方法包括：将所述重组微生物接种至斜面培养基进行斜面培养，挑取斜面培养基上的菌苔接种至种子培养基进行种子培养，然后将种子培养物转入发酵培养基进行发酵。
当进行谷氨酸生产时，优选地，所用斜面培养基为：酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉2.5g/L，pH 7.0-7.2。
所用种子培养基为：葡萄糖25g/L，尿素3.0g/L，K2HPO4·3H2O 2.2g/L，MgSO4·7H2O0.9g/L，玉米浆33mL/L，豆粕水解液22mL/L，pH 7.0-7.2。
所用发酵培养基为：葡萄糖60g/L，硫酸铵15g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，FeSO4·7H2O 1.0mg/L，MnSO4·5H2O 1.0mg/L，VB1 200μg/L，生物素300μg/L，豆粕水解液0.48g/L，碳酸钙50g/L，pH 7.2-7.5。
种子培养为31.5℃，220rpm下振荡培养至对数生长中后期，培养时间为10-14h。
发酵为31.5℃，220rpm振荡培养12-20h。
本发明中使用的豆粕水解液，其制备方法可参见文献“响应面法优化豆粕水解的工艺研究，中国食品添加剂，2018年第2期”。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中涉及的引物名称及序列信息如表1所示。
表1引物序列
| 引物 | 序列(5′-3′) |
| P19 | GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGCTCAGACCAAGGGTATGAAG |
| P20 | GCTGCCTTACCTCTTGCTGACCTTG |
| P21 | TCAGCAAGAGGTAAGGCAGCGAGCC |
| P22 | ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTCAGTCTGGATCCTGTGAGAATC |
| P23 | TCAGCAAGCATTAAGGCAGCGAGCC |
| P24 | GCTGCCTTAATGCTTGCTGACCTTG |
| P25 | GTGATTTCCATCACCGACGG |
| P26 | TCGAAGCCCTGGATATCCTG |
| P27 | CCCGCAAGGTCAGCAAGAGT |
| P28 | CCCGCAAGGTCAGCAAGCAT |
| odhA-UP-1F | GGTACCCGGGGATCCTCTAGAACGAGATGTTCCAGCAGTTC |
| odhA-UP-1R | GTAGGAGTTGTTCATGTCCGG |
| odhA-DN-2F | CGGACATGAACAACTCCTACCCTGCTCACCGATGATTCC |
| odhA-UP-2R | ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGGTCTGCAGGAAGTTCTCG |
| odhA-ID-F | GTGAGCAGCGCTAGTACTTT |
| odhA-ID-R | GAACAGCACGTTGAGGCGA |
| P81 | TATGCTTCCGGCTCGTATGTTG |
| P86 | TTCCGCTTCCTTTAGCAGCC |
以下实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均可通过正规渠道商购获得。
以下实施例中涉及的菌株如下：
出发菌株MHZ-0112-8为谷氨酸棒杆菌，谷氨酸棒杆菌MHZ-0112-8的纯培养物已经于2015年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.11941。谷氨酸棒杆菌MHZ-0112-8已在CN105695383A中公开。
实施例1重组质粒pK18-△odhA的构建
根据NCBI数据库中odhA(GenBank NO:BBD29_06050)的基因序列设计引物，引物序列如表1所示。利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，odhA-UP-1F/odhA-UP-1R，odhA-DN-2F/odhA-DN-2R作为引物对，以谷氨酸棒杆菌ATCC13869的基因组为模板，分别制备重组片段UP，DN，PCR程序为：98℃变性10s，55℃复性20s，72℃延伸30s，循环30次，72℃彻底延伸10min，所得片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化回收，-20℃冻存备用。将pK18mobsacB用XbaI/HindIII限制性内切酶进行消化，利用ClonExpress MultiS One StepCloning Kit试剂盒(诺唯赞生物科技股份有限公司)将上述扩增的UP/DN片段与双酶切后的载体按照一定的比例混合，吹打混匀后置于金属浴(金银杏生物科技有限公司)37℃连接30min，反应结束后转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取卡那抗性克隆，XbaI/NheI酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，进一步通过测序(GENEWIZ公司)鉴定插入的片段正确，将得到的质粒命名为pK18-△odhA。
实施例2重组质粒pK18-BBD29_06475(K547R)以及pK18-BBD29_06475(K547H)的构建
根据NCBI数据库中BBD29_06475(GenBank NO:BBD29_06475)基因的序列设计引物，引物序列如表1所示。利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，P19/P20，P21/P22，P19/P24，P23/P22作为引物对，以谷氨酸棒杆菌MHZ-0112-08的基因组为模板，分别制备重组片段UP1，DN2，UP3和DN4，PCR程序为：98℃变性10s，55℃复性20s，72℃延伸20s，循环30次，72℃彻底延伸10min，所得片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化回收，-20℃冻存备用。将pK18mobsacB用XbaI/HindIII限制性内切酶进行消化，利用ClonExpressMultiS One Step Cloning Kit试剂盒(诺唯赞生物科技股份有限公司)将上述扩增的UP1/DN2片段与双酶切后的载体按照一定的比例混合，同时将UP3/DN4片段与双酶切后的载体按照一定的比例混合，吹打混匀后置于金属浴(金银杏生物科技有限公司)37℃连接30min，反应结束后转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取卡那抗性克隆，XbaI/NheI酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，进一步通过测序(Invitrogen公司)鉴定插入的片段正确，将得到的质粒命名为pK18-BBD29_06475(K547R)(含重组片段UP1和DN2)和pK18-BBD29_06475(K547H)(含重组片段UP3和DN4)。
实施例3缺失野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869中odhA基因
按照谷氨酸棒杆菌经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备ATCC13869感受态细胞，将重组质粒pK18-△odhA以电转化方法转入谷氨酸棒杆菌ATCC13869感受态细胞中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。利用Fast Taq DNA聚合酶(TransGen Biotech)，以odhA-UP-1F/P86，P81/odhA-DN-2R引物对进行菌落PCR鉴定KanR克隆，PCR参数为：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 40s，共30个循环，72℃彻底延伸10min。两对引物扩增出一长一短(1258bp、640bp)片段的克隆为阳性克隆。将挑选出的阳性克隆接种到无抗BHI培养基中培养12-14h，将菌液稀释100-1000倍后涂布在含有10％蔗糖的固体BHI培养基上培养36h，将所筛选出的菌株进一步进行卡那抗性表型验证，挑选KanS的重组子利用鉴定引物对odhA-ID-F/odhA-ID-R验证odhA基因缺失重组子，PCR扩增得到的缺失455bp片段的重组子，即为正确的重组子，正确重组子长1198bp。将得到的阳性重组子用odhA-ID-F/odhA-ID-R扩增测序，测序正确的菌株命名为13869-△odhA。
实施例4重组菌株13869-△odhA引入BBD29_06475基因点突变
按照谷氨酸棒杆菌经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备13869-△odhA感受态细胞，将重组质粒pK18-BBD29_06475(K547R)以及pK18-BBD29_06475(K547H)分别以电转化方法转入谷氨酸棒杆菌13869-△odhA感受态细胞中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。利用Fast Taq DNA聚合酶(TransGen Biotech)，以P19/P86，P81/P22引物对进行菌落PCR鉴定KanR克隆，PCR参数为：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃30s，共30个循环，72℃彻底延伸10min。两对引物分别扩增出1129bp、1247bp的片段的克隆为阳性克隆。将挑选出的阳性克隆接种到无抗BHI培养基中培养12-14h，将菌液稀释100-1000倍后涂布在含有10％蔗糖的固体BHI培养基上培养36h，将所筛选出的菌株进一步进行卡那抗性表型验证，挑选KanS的重组子利用鉴定引物对P27/P26验证K547R点突变重组子，以及P28/P26验证K547H点突变重组子。通过摸索退火温度，获得含点突变的重组子，将得到的阳性重组子用P25/P26扩增测序，正确重组子长1225bp，测序正确的菌株命名为13869-△odhA-K547R和13869-△odhA-K547H。
实施例5谷氨酸生产菌株MHZ-0112-8引入BBD29_06475基因点突变
按照谷氨酸棒杆菌经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备MHZ-0112-8(CGMCC No.11941)感受态细胞，将重组质粒pK18-BBD29_06475(K547R)以及pK18-BBD29_06475(K547H)分别以电转化方法转入谷氨酸棒杆菌MHZ-0112-8感受态细胞中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。利用Fast Taq DNA聚合酶(TransGen Biotech)，以P19/P86，P81/P22引物对进行菌落PCR鉴定KanR克隆，PCR参数为：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共30个循环，72℃彻底延伸10min。两对引物分别扩增出1129bp、1247bp的片段的克隆为阳性克隆。将挑选出的阳性克隆接种到无抗BHI培养基中培养12-14h，将菌液稀释100-1000倍后涂布在含有10％蔗糖的固体BHI培养基上培养36h，将所筛选出的菌株进一步进行卡那抗性表型验证，挑选KanS的重组子利用鉴定引物对P27/P26验证K547R点突变重组子，以及P28/P26验证K547H点突变重组子。通过摸索退火温度，获得含点突变的重组子，将得到的阳性重组子用P25/P26扩增测序，正确重组子长1225bp，测序正确的菌株命名为MHZ-0112-42和MHZ-0112-43。
实施例6工程菌株13869-△odhA-K547R、13869-△odhA-K547H、MHZ-0112-42、MHZ-0112-43、生产谷氨酸的性能验证
对实施例4及实施例5构建的重组谷氨酸棒杆菌进行发酵，验证其谷氨酸的生产性能，具体如下：
将冻存于-80℃甘油管中的菌株接种于斜面培养基中进行活化，于31.5℃下培养24h后长出菌苔，从新鲜活化的斜面上挑取菌苔，接种于种子培养基中，于31.5℃，220rpm下振荡培养至对数生长中后期，培养时间为12h，制得种子液，以10％的接种量将上述种子液接种至装有20ml发酵培养基的500ml摇瓶中，在31.5℃，220rpm振荡培养16h。通过HPLC方法测定培养基中积累的L-谷氨酸的浓度。结果见表2。
具体培养基配方如下：
斜面培养基：酵母粉5.0g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉2.5g/L，pH 7.0-7.2，121℃0.1MPa灭菌30min。
种子培养基：葡萄糖25g/L，尿素3.0g/L，K2HPO4·3H2O 2.2g/L，MgSO4·7H2O 0.9g/L，玉米浆33mL/L，豆粕水解液22mL/L，pH 7.0-7.2，121℃0.1MPa灭菌15min。
发酵培养基：葡萄糖60g/L，硫酸铵15g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，FeSO4·7H2O 1.0mg/L，MnSO4·5H2O 1.0mg/L，VB1 200μg/L，生物素300μg/L，豆粕水解液0.48g/L，碳酸钙50g/L，用NaOH调节至pH 7.2-7.5，121℃0.1MPa灭菌15min。
表2突变菌株谷氨酸含量检测
| 菌株 | OD600(×100) | Glu(g/L) | 转化率％ |
| 13869-△odhA | 0.625±0.31 | 2.1±0.14 | 3.5±0.21 |
| 13869-△odhA-K547R | 0.633±0.15 | 4.4±0.06 | 7.3±0.16 |
| 13869-△odhA-K547H | 0.606±0.22 | 3.9±0.04 | 6.5±0.13 |
| MHZ-0112-8 | 0.414±0.12 | 34.6±0.02 | 57.6±0.03 |
| MHZ-0112-42 | 0.405±0.03 | 37.4±0.02 | 62.3±0.05 |
| MHZ-0112-43 | 0.422±0.02 | 36.3±0.09 | 60.5±0.15 |
注：OD600是稀释100倍的培养液在600nm的浊度并表示细胞量，Glu(g/L)表示积累的L-谷氨酸的量。
如表2所示，在13869-△odhA-K547R中BBD29_06475基因所编码蛋白的547位氨基酸由赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)，即AAG突变为AGG后，谷氨酸从2.1g/L提高到4.4g/L，谷氨酸转化率提高3.8％。而13869-△odhA-K547H中BBD29_06475基因所编码蛋白的547位氨基酸由赖氨酸(K)突变为组氨酸(H)，即AAG突变为CAT后，谷氨酸从2.1g/L提高到3.9g/L，谷氨酸转化率提高3.0％。
在MHZ-0112-42中BBD29_06475基因所编码蛋白的547位氨基酸由赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)，即AAG突变为AGG后，谷氨酸从34.6g/L提高到37.4g/L，谷氨酸转化率提高4.7％。而MHZ-0112-43中BBD29_06475基因所编码蛋白的547位氨基酸由赖氨酸(K)突变为组氨酸(H)，即AAG突变为CAT后，谷氨酸从34.6g/L提高到36.3g/L，谷氨酸转化率提高2.9％。表明BBD29_06475基因编码的蛋白序列中第547位碱性氨基酸突变为同性质氨基酸不会影响ATP合酶的活性，且对谷氨酸的合成具有促进作用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.ATP合酶突变体，其特征在于，所述突变体包含ATP合酶第547位氨基酸由K到R或H的突变；
其中，ATP合酶在NCBI上的参考序列编号为BBD29_06475。
2.编码权利要求1所述ATP合酶突变体的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料；
所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
3.权利要求2所述核酸分子或所述生物材料在提高微生物的谷氨酸产量、生产强度或转化率中的应用。
4.一种重组微生物，其特征在于，所述微生物表达权利要求1所述的ATP合酶突变体；
优选地，所述重组微生物是将编码ATP合酶的基因突变为编码权利要求1所述ATP合酶突变体的基因构建得到的。
5.根据权利要求4所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物为棒杆菌属(Corynebacterium)菌种，优选谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物的出发菌株为能够积累谷氨酸的谷氨酸棒杆菌；
优选地，所述出发菌株为MHZ-0112-8。
7.权利要求4-7任一项所述重组微生物的构建方法，其特征在于，将编码权利要求1所述ATP合酶突变体的基因通过质粒导入微生物中或通过基因工程手段整合到微生物染色体上，或者，将出发菌株中编码ATP合酶的基因突变为编码权利要求1所述ATP合酶突变体的基因。
8.权利要求4-7任一项所述重组微生物在谷氨酸发酵生产中的应用。
9.一种生产谷氨酸的方法，其特征在于，包括将权利要求4-6任一项所述重组微生物进行发酵培养的步骤；
优选地，发酵所用培养基为：葡萄糖50-60g/L，硫酸铵10-20g/L，KH2PO4 0.5-1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2-0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.05-0.15mg/L，MnSO4·5H2O 0.05-0.15mg/L，VB1150-250μg/L，生物素250-350μg/L，豆粕水解液0.3-0.6g/L，pH 7.2-7.5。
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