CN114990043A - 代谢赖氨酸的工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

代谢赖氨酸的工程菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供代谢赖氨酸的工程菌及其构建方法与应用。所述工程菌是以大肠杆菌为出发菌株，通过敲除ldcC1和ldcC2基因，并在大肠杆菌中表达来自酿酒酵母菌BY4741的LKR和SDR基因构建得到的；或者，所述工程菌是以大肠杆菌为出发菌株，通过敲除ldcC1和ldcC2基因，并在大肠杆菌中表达来自酿酒酵母菌BY4741的lys5和lys2基因构建得到的。本发明通过改造源自酵母菌科的酵母氨酸合成酶和酵母氨酸脱氢酶，并将这两个基因转入大肠杆菌中。使其能够将赖氨酸转化为酵母氨酸再进一步转化为氨基己酸，从而在大肠杆菌中实现赖氨酸的快速代谢。本发明为利用微生物调节体内赖氨酸代谢奠定基础。

Description

代谢赖氨酸的工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体地说，涉及代谢赖氨酸的工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
大肠杆菌Nissle 1917(EcN)，是一种肠道益生菌，该益生菌具有多方面的优良性能，如改善肠道微生物群落，抑制病原菌生长，不含肠毒素等对人体致病的有害因子，对肿瘤具有高靶向性。研究发现EcN对常见胃肠道疾病有良好疗效，被广泛用于预防传染性腹泻、溃疡性结肠炎等炎性肠疾病，防止新生儿消化道内病原菌定殖等被认为是一种安全菌株。近年来，EcN表达外源基因作为疾病诊治载体的研究越来越多，其作为微观生活的“机器人工厂”，能特异性定植于人体，长期使用具有安全性和遗传可追踪性，可用于实体诊断的临床研究中，具有作为运送载体对疾病进行治疗的潜在应用价值。
赖氨酸是机体合成蛋白质的重要组成成分，参与人体生命活动和能量代谢过程。哺乳动物与微生物具有不同的赖氨酸代谢途径。在哺乳动物细胞中，赖氨酸的主要代谢途径为酵母氨酸途径，双功能酶α-氨基己二酸半醛合酶(AASS)是该途径主要的催化酶，赖氨酸首先在酮戊二酸还原酶(LKR)的作用下生成酵母氨酸，进而在酵母氨酸脱氢酶(SDH)的作用下生成氨基己二酸半醛，氨基己二酸半醛与谷氨酸联合在氨基己二酸半醛脱氢酶(LYS5/LYS2)的作用下生成氨基己二酸，最后经过一系列生化反应变成乙酰辅酶A进入三羧酸循环。其中赖氨酸代谢紊乱疾病，如高赖氨酸血症，正是由赖氨酸降解途径的关键酶AASS发生突变引起。而微生物将赖氨酸代谢为戊二胺，进一步转化为尸胺，而这两种代谢物对细胞均具有毒性。如何调节微生物体内赖氨酸代谢速度，以降低体内赖氨酸浓度成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种代谢赖氨酸的工程菌及其构建方法与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种代谢赖氨酸的工程菌EcNT(pTLS)，所述工程菌是以大肠杆菌为出发菌株，通过敲除ldcC1和ldcC2基因，并在大肠杆菌中表达来自酿酒酵母菌BY4741的LKR和SDR基因构建得到的。
优选地，所述大肠杆菌为Nissle 1917。
第二方面，本发明提供所述工程菌EcNT(pTLS)的构建方法，分别构建靶向ldcC1和ldcC2基因的CRISPR-Cas9系统，共同导入大肠杆菌得到重组菌，然后将来自酿酒酵母菌BY4741的LKR和SDR基因通过质粒导入所述重组菌中，即得代谢赖氨酸的工程菌EcNT(pTLS)。
优选地，所述CRISPR-Cas9系统中靶向ldcC1基因的gRNA的核苷酸序列为：5′-CTGTTTAAATATGTTCGTGA-3′，靶向ldcC2基因的gRNA的核苷酸序列为：5′-CAATATGCGTATTCAGGATC-3′。
第三方面，本发明提供所述工程菌EcNT(pTLS)在代谢赖氨酸中的应用。
第四方面，本发明提供一种提高赖氨酸代谢速率的方法，所述方法包括如下步骤：
1)培养所述工程菌EcNT(pTLS)，以获得微生物的培养物；
2)从步骤1)中获得的所述培养物中收集所产生的酵母氨酸。
第五方面，本发明提供一种代谢赖氨酸的工程菌EcNT(pK25)，所述工程菌是以大肠杆菌为出发菌株，通过敲除ldcC1和ldcC2基因，并在大肠杆菌中表达来自酿酒酵母菌BY4741的lys5和lys2基因构建得到的。
优选地，所述大肠杆菌为Nissle 1917。
本发明中，ldcC1基因为：
a1)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
b1)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
c1)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
d1)与a1)、b1)或c1)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
ldcC2基因为：
a2)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
b2)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
c2)在严格条件下与SEQ ID NO:2所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
d2)与a2)、b2)或c2)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
LKR基因为：
a3)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
b3)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
c3)在严格条件下与SEQ ID NO:3所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
d3)与a3)、b3)或c3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
SDR基因为：
a4)SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
b4)SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
c4)在严格条件下与SEQ ID NO:4所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
d4)与a4)、b4)或c4)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
lys5基因为：
a5)SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
b5)SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
c5)在严格条件下与SEQ ID NO:5所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
d5)与a5)、b5)或c5)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
lys2基因为：
a6)SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
b6)SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
c6)在严格条件下与SEQ ID NO:6所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
d6)与a6)、b6)或c6)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
第六方面，本发明提供所述工程菌EcNT(pK25)的构建方法，分别构建靶向ldcC1和ldcC2基因的CRISPR-Cas9系统，共同导入大肠杆菌得到重组菌，然后将来自酿酒酵母菌BY4741的lys5和lys2基因通过质粒导入所述重组菌中，即得代谢赖氨酸的工程菌EcNT(pK25)。
优选地，所述CRISPR-Cas9系统中靶向ldcC1基因的gRNA的核苷酸序列为：5′-CTGTTTAAATATGTTCGTGA-3′，靶向ldcC2基因的gRNA的核苷酸序列为：5′-CAATATGCGTATTCAGGATC-3′。
第七方面，本发明提供所述工程菌EcNT(pK25)在发酵代谢赖氨酸中的应用。
第八方面，本发明提供一种提高赖氨酸发酵代谢速率的方法，所述方法包括如下步骤：
1)培养所述工程菌EcNT(pK25)，以获得微生物的培养物；
2)从步骤1)中获得的所述培养物中收集所产生的酵母氨酸和酵母氨酸半醛。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明通过改造源自酵母菌科的酵母氨酸合成酶和酵母氨酸脱氢酶，并将这两个基因转入大肠杆菌中。使其能够将赖氨酸转化为酵母氨酸再进一步转化为氨基己酸，从而在大肠杆菌中实现赖氨酸的快速代谢。
本发明以EcN作为出发菌株，利用基因工程技术，在益生菌中构建了一个新的代谢赖氨酸途径，为用微生物调节体内赖氨酸代谢奠定基础。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中pTrc99a质粒、LKR、SDR基因电泳图；M:DL5000Maker；1:pTrc99a质粒；2:LKR基因；3:SDR基因。
图2为本发明较佳实施例中pTLS质粒图谱。
图3为本发明较佳实施例中lys5基因电泳图。
图4为本发明较佳实施例中lys2-1、lys2基因电泳图。
图5为本发明较佳实施例中pK18mobSacB质粒及酶切电泳图。
图6为本发明较佳实施例中pK25质粒图谱。
图7为本发明较佳实施例中pTLS、pK25质粒生长及代谢发酵验证图。*表示不同处理组之间的差异具有统计学意义，P<0.05。
具体实施方式
本发明利用合成生物学提供一种构建益生菌或合成益生菌群的方法。本发明所构建的菌株能够以加强赖氨酸的代谢速度从而降低体内赖氨酸浓度，从而弥补现有技术的不足，为用微生物调节体内赖氨酸代谢提供新策略。
本发明通过敲除大肠杆菌自身代谢赖氨酸生成戊二胺的关键酶(由cadA和ldcC基因编码)，以避免由赖氨酸生成毒性产物戊二胺。
本发明构建的大肠杆菌通过基因改造降低代谢终产物毒性。通过表达醛脱氢酶7族A1(由aldH基因编码)，用于将α-氨基己二酸半醛进一步转化为α-氨基己二酸，以及二羧酸载体蛋白(由dcu基因编码)用于将α-氨基己二酸排出大肠杆菌体外。
本发明的合成型益生菌，所述的改造是赖氨酸在酵母氨酸合成酶的催化下转化为酵母氨酸，并继续在己二酸半醛合成酶的催化下转化为己二酸半醛，并阻断赖氨酸生成戊二胺的途径，促进赖氨酸向己二酸的转化。
本发明的合成型益生菌，催化赖氨酸转化为酵母氨酸的酵母氨酸合成酶可能是任一具有该功能的酶；催化酵母氨酸转化为己二酸半醛的己二酸半醛合成酶可能是任一具有该功能的酶。
本发明提供的益生菌可以是任一株具体菌株，包括但不限于大肠杆菌。
本发明涉及的方法用于在提高赖氨酸利用酵母氨酸代谢及促进赖氨酸下游产品产量提高。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中涉及的菌株信息见表1，质粒信息见表2，引物信息见表3。
表1
菌株 描述 来源
E.coli DH5α / TaKaRa大连宝生物公司
E.coli Nissle 1917(EcN) 编号DM6601 购自德国微生物菌种中心
E.coli Nissle 1917ΔldcC1(EcNO) 缺失ldcC1基因 本发明构建
E.coli Nissle 1917ΔldcC1 ΔldcC2(EcNT) 缺失ldcC1,ldcC2基因 本发明构建
表2
Figure BDA0003719182840000051
Figure BDA0003719182840000061
实施例1代谢赖氨酸的工程菌的构建方法
1、LKR、SDR酶基因的获得
以pTrc99a质粒为模板，pTrc99a-XhoI-F和pTrc99a-EcorI-R为上下游引物，获得带有XhoI、EcoRI双酶切位点的pTrc99a载体片段，以酿酒酵母菌BY4741(购自中国普通微生物菌种保藏中心，编号bio-82064)为模板，分别以LKR-EcoRI-F和LKR-XhoI-R，SDR-XhoI-R和SDR-NdeI-F为上下游引物PCR扩增LKR、SDR基因，获得带有带有XhoI、EcoRI双酶切位点的LKR基因片段和带有XhoI、NdeI双酶切位点的SDR基因片段。LKR、SDR基因和pTrc99a载体片段大小为：LKR 1119bp，SDR 1399bp，pTrc99a4176bp。琼脂糖凝胶电泳见图1。
2、宿主菌株EcN中ldcC1和ldcC2基因的敲除
采用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌Nissle 1917中的ldcC1和ldcC2基因。双质粒系统由pREDCas和pGRB质粒组成(表2)，用于基因组编辑。pREDCas9质粒主要用于构建Cas9的结构表达和CRISPR介导的大肠杆菌基因组编辑质粒凝固系统的诱导表达。利用pGRB质粒在大肠杆菌中表达gRNA。
为了构建gRNA质粒，利用一套引物对表达gRNA的pGRB质粒进行PCR扩增，引导Cas9靶向到目的基因。运用SnapGene 4.3.6对待敲除的基因进行设计，在敲除基因的PAM位点后选20bp的gRNA序列加入引物中(靶向ldcC1基因的gRNA的核苷酸序列为：5′-CTGTTTAAATATGTTCGTGA-3′，靶向ldcC2基因的gRNA的核苷酸序列为：5′-CAATATGCGTATTCAGGATC-3′)。pGRB质粒模板，高速高保真PCR酶PrimeSTAR MaxDNAPolymerase为限制酶，相应上下游引物进行PCR扩增反应，PCR反应体系见表4。
表4 PCR扩增反应体系
试剂 体积(μL)
pGRB 1
PrimeSTAR Max Premix(2×) 25
gRNA-up(10mM) 2
gRNA-down(10mM) 2
灭菌水 20
总体系 50
将上述试剂在PCR管中充分混匀，置于PCR仪中进行反应，PCR反应条件为：98℃，10min热变性；98℃，10s，55℃，15s，72℃，1min，循环32次；72℃，10min；4℃保存。
将回收的gRNA片段与T4 PNK进行非放射性磷酸化，在冰上的微离心管中进行以下反应：反应体系为DNA7μL，T4 PNK反应缓冲液(10×)1μL，ATP(10mM)1μL，T4 PNK 0.2μL。37℃孵育30分钟，然后加入T4连接酶0.5μL，4℃过夜进行连接反应。将获得的gRNA质粒转化到DH5α中进行复制，并使用引物check-sgRNA-R/check-sgRNA-F进行测序验证。通过测序证实了gRNA质粒构建成功，得到ldcC1-gRNA和ldcC2-gRNA。
为了生成供体DNA(donor DNA)，可以通过三步PCR获得donor基因。以ldcC1基因为例：以大肠杆菌Nissle 1917基因组为模板，在ldcC1基因的上游和下游扩增引物ldcC1-up-R/ldcC1-up-F和ldcC1-down-R/ldcC1-down-F。利用引物ldcC1-up-R/ldcC1-down-R对两个片段进行重叠扩增，获得ldcC1 donor DNA。以同样的方法获得ldcC2 donor DNA。将获得的供体DNA进一步连接到载体上，用于保存和测序。Blunting Kination反应：在微量离心管中配制以下反应液：donor DNA2μL，10×Blunting Kination Buffer 1μL，BluntingKination Enzyme Mix 0.5μL，ddH2O 6.5μL。37℃反应10分钟。0℃热处理5分钟。连接反应：上述体系2.5μL，对照质粒(pUC118/Hind III/BAP)0.5μL，Ligation Solution I 3μL。16℃反应1小时。全量反应液转化50μL的DH5α细胞，在含有Amp、IPTG、X-Gal的平板培养基上进行蓝白斑筛选获得相应的转化子。
3、pTrc99a-LKR-SDR(pTLS)重组质粒的构建
采用双酶切连接的方式将基因片段与载体质粒进行连接。首先使用XhoI、EcoRI双酶切LKR和pTrc99a质粒，T4连接酶进行连接，得到pTrc99a-LKR重组质粒。为了后期能够表征重组质粒表达蛋白情况，将该重组质粒引入红色荧光蛋白(RFP)基因，以pK18mobSacB为模板，pBb-XbaI-F和pBb-EcoRI-R为上下游引物进行PCR扩增，获得引入XbaI、EcoRI酶切位点的RFP基因，以LKR-EcoRI-F和LKR-XbaI-R为上下游引物，PCR扩增pTrc99a-LKR片段，得到引入XbaI、EcoRI酶切位点pTrc99a-LKR片段，将RFP基因和pTrc99a-LKR片段进行XbaI，EcoRI双酶切，T4连接酶进行连接，得到pTrc99a-LKR-RFP重组质粒。
以pBb-SDR-NdeI-R和pTrc99a-XhoI-F为上下游引物扩增pTrc99a-LKR-RFP重组片段，得到引入XhoI、NdeI双酶切的载体片段，将SDR基因和pTrc99a-LKR-RFP片段进行XhoI、NdeI双酶切，T4连接酶进行连接，得到pTrc99a-LKR-RFP-SDR重组质粒。将该重组进行菌落PCR阳性筛选后送测序。经测序结果证明：得到重组质粒pTrc99a-LKR-RFP-SDR，将该重组质粒命名为pTLS(图2)。
4、pK18-LYS5-LYS2(pK25)重组质粒的构建
为了从酿酒酵母菌BY4741上获得lys5，lys2基因，首先利用TaKaRa提基因组试剂盒对酿酒酵母菌BY4741进行基因组提取。以BY4741基因组为模板，为将lys5基因加入EcoRⅠ与XbaⅠ酶切位点为后续酶切连接反应做准备，设计引物lys5-EcoRI-F和lys5-XbaI-R为上下游引物进行PCR扩增反应，琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示，得到引入EcoRⅠ与XbaⅠ酶切位点的lys5基因片段，其大小约为863bp。
lys2基因的获得，因其引物特异性较差，因此采用巢氏PCR的方法进行扩增。首先以BY4741基因组为模板，以lys2-up和lys2-down为上下游引物，进行第一轮PCR，PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收得到基因片段为lys2-1，其大小约为4179bp。为引入双酶切位点，以lys2-XbaI-F和lys2-HindIII-R为上下游引物，lys2-1为模板，进行第二轮PCR扩增反应。琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示，得到引入XbaI与HindIII酶切位点的lys2基因片段，其大小约为4203bp。
为了构建重组质粒，选择pK18mobSacB质粒为载体，其质粒大小为5721bp。EcoRI和XbaI双酶切质粒得到片段大小为5694bp和27bp，pK18mobSacB质粒的提取以及酶切验证琼脂糖凝胶电泳图如图5所示。
lys5基因与pK18mobSacB载体的连接，采用双酶切连接的方法，将lys5基因片段与pK18mobSacB载体分别进行EcoRI和XbaI双酶切反应，T4连接酶进行连接反应，将连接反应产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中，将转化成功的菌落进行阳性克隆筛选后送测序。经测序结果证明：得到重组质粒pK18-LYS5。将lys2基因与pK18-LYS5重组质粒使用XbaI和HindIII双酶切，lys2酶切片段长度为4203bp，pK18-LYS5载体片段的长度为6515bp和24bp，其中24bp远离凝胶。酶切产物经T4连接酶连接反应后转化至E.coli DH5α感受态细胞中，得到的转化子经过菌落PCR反应阳性筛选后送测序，进一步验证重组质粒是否构建成功。经测序结果表明，得到重组质粒pK18-LYS5-LYS2，将该重组质粒命名为pK25(图6)。
为了构建重组菌株，制备了EcN感受态细胞，将pREDCas9转化到该细胞中，得到EcN(pREDCas9)。然后制备含有pREDCas9的大肠杆菌Nissle 1917感受态细胞。在50μL该细胞中加入100ng供体DNA和100ng gRNA质粒。使用电穿孔仪在1.80kV的0.1cm试管中进行电穿孔，然后立即在2mL LB中悬浮，30℃复苏3h，涂布于含大观霉素(50μg/mL)和氨苄西林(100μg/mL)的LB平板上，30℃孵育过夜。利用菌落聚合酶链反应和DNA测序技术对其进行鉴定。将正确的克隆接种到含有大观霉素和10％L-阿拉伯糖的LB上，培养过夜以丢失gRNA。通过对大观霉素(50mg/L)的敏感性，证实了已敲除ldcC1基因获得E.coli Nissle 1917ΔldcC1(EcNO)。采用上述相同的方法，进行ldcC2基因编辑，获得E.coli Nissle 1917ΔldcC1ΔldcC2(EcNT)。
将重组质粒pTLS、pK25转化改造菌株EcNT中，分别获得工程菌株EcNT(pTLS)和EcNT(pK25)。
实施例2pTLS、pK25质粒代谢赖氨酸能力的验证
将实施例1获得的两种工程菌株在LB液体培养基中培养过夜，得到种子菌株。发酵培养基(10g/L葡萄糖、1g/L酵母膏、5g/L KH2PO4、5g/L(NH4)2SO4、0.7g/L KCl、0.003g/LFeSO4·7H2O、0.003g/L MnSO4、1g/L MgSO4、25g/L赖氨酸)在1％接种量，37℃，200rpm进行发酵培养。为了诱导质粒基因的表达，将0.2mol/L IPTG诱导剂加入100mL发酵培养基中。初始OD600为0.1，在不同的时间间隔收集样品，离心发酵菌液，收集上清，以测量菌株的生长并代谢物绘制出具有代表性的发酵谱图。
生物菌体量的测定，利用紫外分光光度计(GE Health-care)在600nm处测量吸光度，测定菌体吸光度。
发酵液中的葡萄糖浓度通过葡萄糖测定试剂盒(葡萄糖氧化酶法)检测。试剂条件：温度37℃，波长505nm，反应时间10min，样本用量10μL，试剂用量1000μL，测量光径1.0cm。测定方法：终点法。用空白管调“零”点测定各管的吸光度。取样本10μL加入到1000μL试剂中，于37℃金属浴上加热反应10min后立即使用1.0cm光径比色杯检测OD505nm处的吸光度。试验结果的计算方法：葡萄糖(mmol/L)＝样品管吸光度(A)/标准管吸光度(A)×标准液浓度
发酵液中的赖氨酸的含量通过高效液相色谱仪检测。样品前处理混匀后过HPLC专用膜待检测。色谱柱分析条件，采用Diamonsil AAA 5μm(4.6mm×250mm)色谱柱和紫外检测器(360nm)的高效液相色谱(HPLC)分析赖氨酸。流动相A为0.02mol/LNa2HPO4和0.02mol/LNaH2PO4水溶液，流动相B为甲醇:乙腈＝10:90(V:V)。柱温保持在45℃，流速为1mL/min。采用二元梯度洗脱的方法进行分析。
对pTLS和pK25两种菌株进行发酵培养并监测其生长和葡萄糖及赖氨酸的代谢水平，其中初试葡萄糖浓度为10g/L，初始赖氨酸浓度为25g/L。结果如图7所示，在24h发酵培养时间内，pTLS菌株的葡萄糖转化率为24.9％，pK25菌株的葡萄糖转化率为29.2％；pTLS菌株的赖氨酸转化率为12.9％，pK25菌株的赖氨酸转化率为15.0％，两株菌株均能有效代谢葡萄糖与赖氨酸。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 滨州医学院
<120> 代谢赖氨酸的工程菌及其构建方法与应用
<130> PI202210005
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2148
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 1
atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60
gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120
gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180
aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240
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tccatttcag tatctgaatt gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600
gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660
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<210> 2
<211> 2142
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 2
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<211> 1122
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
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<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 6
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acactaaatt ccgacaagtc ccgttctttc acttatcgcg acatcaaccg cacttctaac 840
atagttgccc attatttgat taaaacaggt atcaaaagag gtgatgtagt gatgatctat 900
tcttctaggg gtgtggattt gatggtatgt gtgatgggtg tcttgaaagc cggcgcaacc 960
ttttcagtta tcgaccctgc atatccccca gccagacaaa ccatttactt aggtgttgct 1020
aaaccacgtg ggttgattgt tattagagct gctggacaat tggatcaact agtagaagat 1080
tacatcaatg atgaattgga gattgtttca agaatcaatt ccatcgctat tcaagaaaat 1140
ggtaccattg aaggtggcaa attggacaat ggcgaggatg ttttggctcc atatgatcac 1200
tacaaagaca ccagaacagg tgttgtagtt ggaccagatt ccaacccaac cctatctttc 1260
acatctggtt ccgaaggtat tcctaagggt gttcttggta gacatttttc cttggcttat 1320
tatttcaatt ggatgtccaa aaggttcaac ttaacagaaa atgataaatt cacaatgctg 1380
agcggtattg cacatgatcc aattcaaaga gatatgttta caccattatt tttaggtgcc 1440
caattgtatg tccctactca agatgatatt ggtacaccgg gccgtttagc ggaatggatg 1500
agtaagtatg gttgcacagt tacccattta acacctgcca tgggtcaatt acttactgcc 1560
caagctacta caccattccc taagttacat catgcgttct ttgtgggtga cattttaaca 1620
aaacgtgatt gtctgaggtt acaaaccttg gcagaaaatt gccgtattgt taatatgtac 1680
ggtaccactg aaacacagcg tgcagtttct tatttcgaag ttaaatcaaa aaatgacgat 1740
ccaaactttt tgaaaaaatt gaaagatgtc atgcctgctg gtaaaggtat gttgaacgtt 1800
cagctactag ttgttaacag gaacgatcgt actcaaatat gtggtattgg cgaaataggt 1860
gagatttatg ttcgtgcagg tggtttggcc gaaggttata gaggattacc agaattgaat 1920
aaagaaaaat ttgtgaacaa ctggtttgtt gaaaaagatc actggaatta tttggataag 1980
gataatggtg aaccttggag acaattctgg ttaggtccaa gagatagatt gtacagaacg 2040
ggtgatttag gtcgttatct accaaacggt gactgtgaat gttgcggtag ggctgatgat 2100
caagttaaaa ttcgtgggtt cagaatcgaa ttaggagaaa tagatacgca catttcccaa 2160
catccattgg taagagaaaa cattacttta gttcgcaaaa atgccgacaa tgagccaaca 2220
ttgatcacat ttatggtccc aagatttgac aagccagatg acttgtctaa gttccaaagt 2280
gatgttccaa aggaggttga aactgaccct atagttaagg gcttaatcgg ttaccatctt 2340
ttatccaagg acatcaggac tttcttaaag aaaagattgg ctagctatgc tatgccttcc 2400
ttgattgtgg ttatggataa actaccattg aatccaaatg gtaaagttga taagcctaaa 2460
cttcaattcc caactcccaa gcaattaaat ttggtagctg aaaatacagt ttctgaaact 2520
gacgactctc agtttaccaa tgttgagcgc gaggttagag acttatggtt aagtatatta 2580
cctaccaagc cagcatctgt atcaccagat gattcgtttt tcgatttagg tggtcattct 2640
atcttggcta ccaaaatgat ttttacctta aagaaaaagc tgcaagttga tttaccattg 2700
ggcacaattt tcaagtatcc aacgataaag gcctttgccg cggaaattga cagaattaaa 2760
tcatcgggtg gatcatctca aggtgaggtc gtcgaaaatg tcactgcaaa ttatgcggaa 2820
gacgccaaga aattggttga gacgctacca agttcgtacc cctctcgaga atattttgtt 2880
gaacctaata gtgccgaagg aaaaacaaca attaatgtgt ttgttaccgg tgtcacagga 2940
tttctgggct cctacatcct tgcagatttg ttaggacgtt ctccaaagaa ctacagtttc 3000
aaagtgtttg cccacgtcag ggccaaggat gaagaagctg catttgcaag attacaaaag 3060
gcaggtatca cctatggtac ttggaacgaa aaatttgcct caaatattaa agttgtatta 3120
ggcgatttat ctaaaagcca atttggtctt tcagatgaga agtggatgga tttggcaaac 3180
acagttgata taattatcca taatggtgcg ttagttcact gggtttatcc atatgccaaa 3240
ttgagggatc caaatgttat ttcaactatc aatgttatga gcttagccgc cgtcggcaag 3300
ccaaagttct ttgactttgt ttcctccact tctactcttg acactgaata ctactttaat 3360
ttgtcagata aacttgttag cgaagggaag ccaggcattt tagaatcaga cgatttaatg 3420
aactctgcaa gcgggctcac tggtggatat ggtcagtcca aatgggctgc tgagtacatc 3480
attagacgtg caggtgaaag gggcctacgt gggtgtattg tcagaccagg ttacgtaaca 3540
ggtgcctctg ccaatggttc ttcaaacaca gatgatttct tattgagatt tttgaaaggt 3600
tcagtccaat taggtaagat tccagatatc gaaaattccg tgaatatggt tccagtagat 3660
catgttgctc gtgttgttgt tgctacgtct ttgaatcctc ccaaagaaaa tgaattggcc 3720
gttgctcaag taacgggtca cccaagaata ttattcaaag actacttgta tactttacac 3780
gattatggtt acgatgtcga aatcgaaagc tattctaaat ggaagaaatc attggaggcg 3840
tctgttattg acaggaatga agaaaatgcg ttgtatcctt tgctacacat ggtcttagac 3900
aacttacctg aaagtaccaa agctccggaa ctagacgata ggaacgccgt ggcatcttta 3960
aagaaagaca ccgcatggac aggtgttgat tggtctaatg gaataggtgt tactccagaa 4020
gaggttggta tatatattgc atttttaaac aaggttggat ttttacctcc accaactcat 4080
aatgacaaac ttccactgcc aagtatagaa ctaactcaag cgcaaataag tctagttgct 4140
tcaggtgctg gtgctcgtgg aagctccgca gcagcttaa 4179

Claims (10)

1.代谢赖氨酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌是以大肠杆菌为出发菌株，通过敲除ldcC1和ldcC2基因，并在大肠杆菌中表达来自酿酒酵母菌BY4741的LKR和SDR基因构建得到的；
优选地，所述大肠杆菌为Nissle 1917；
其中，ldcC1基因为：
a1)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
b1)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
c1)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
d1)与a1)、b1)或c1)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
ldcC2基因为：
a2)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
b2)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
c2)在严格条件下与SEQ ID NO:2所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
d2)与a2)、b2)或c2)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
LKR基因为：
a3)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
b3)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
c3)在严格条件下与SEQ ID NO:3所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
d3)与a3)、b3)或c3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
SDR基因为：
a4)SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
b4)SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
c4)在严格条件下与SEQ ID NO:4所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
d4)与a4)、b4)或c4)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
2.权利要求1所述工程菌的构建方法，其特征在于，分别构建靶向ldcC1和ldcC2基因的CRISPR-Cas9系统，共同导入大肠杆菌得到重组菌，然后将来自酿酒酵母菌BY4741的LKR和SDR基因通过质粒导入所述重组菌中，即得代谢赖氨酸的工程菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas9系统中靶向ldcC1基因的gRNA的核苷酸序列为：5′-CTGTTTAAATATGTTCGTGA-3′，靶向ldcC2基因的gRNA的核苷酸序列为：5′-CAATATGCGTATTCAGGATC-3′。
4.权利要求1所述工程菌在代谢赖氨酸中的应用。
5.一种提高赖氨酸代谢速率的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)培养权利要求1所述工程菌，以获得微生物的培养物；
2)从步骤1)中获得的所述培养物中收集所产生的酵母氨酸。
6.代谢赖氨酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌是以大肠杆菌为出发菌株，通过敲除ldcC1和ldcC2基因，并在大肠杆菌中表达来自酿酒酵母菌BY4741的lys5和lys2基因构建得到的；
优选地，所述大肠杆菌为Nissle 1917；
其中，ldcC1、ldcC2基因同权利要求1中所述；
lys5基因为：
a5)SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
b5)SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
c5)在严格条件下与SEQ ID NO:5所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
d5)与a5)、b5)或c5)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
lys2基因为：
a6)SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
b6)SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
c6)在严格条件下与SEQ ID NO:6所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
d6)与a6)、b6)或c6)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
7.权利要求6所述工程菌的构建方法，其特征在于，分别构建靶向ldcC1和ldcC2基因的CRISPR-Cas9系统，共同导入大肠杆菌得到重组菌，然后将来自酿酒酵母菌BY4741的lys5和lys2基因通过质粒导入所述重组菌中，即得代谢赖氨酸的工程菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas9系统中靶向ldcC1基因的gRNA的核苷酸序列为：5′-CTGTTTAAATATGTTCGTGA-3′，靶向ldcC2基因的gRNA的核苷酸序列为：5′-CAATATGCGTATTCAGGATC-3′。
9.权利要求6所述工程菌在代谢赖氨酸中的应用。
10.一种提高赖氨酸代谢赖氨酸速率的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)培养权利要求6所述工程菌，以获得微生物的培养物；
2)从步骤1)中获得的所述培养物中收集所产生的酵母氨酸及酵母氨酸半醛。。
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