CN106434509B - 一种提高大肠杆菌合成血红素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高大肠杆菌合成血红素的方法，属于代谢工程技术领域。本发明通过将来源大肠杆菌的血红素合成途径基因分成两个模块，利用拷贝数不同的质粒，将两个模块随机组合，在过量表达谷氨酰‑tRNA还原酶(hemA编码)、谷氨醛氨基转移酶(hemL编码)的基础上，强化了血红素合成途径。本发明构建的重组大肠杆菌工程菌E.coli DH5α：pUC19‑hemA‑hemL+pACYCDuet‑2‑hemB‑hemC‑hemD‑hemE+pRSFDuet‑2‑hemF‑hemG‑hemH摇瓶发酵培养48h，生产血红素0.56μM/OD细胞。本发明采用代谢工程策略，改造微生物菌株来合成目的产物血红素，为微生物法高效生产血红素奠定了一定基础。

Description

一种提高大肠杆菌合成血红素的方法
技术领域
本发明涉及一种提高大肠杆菌合成血红素的方法，属于代谢工程技术领域。
背景技术
血红素是含铁卟啉衍生物，由原卟啉与1个二价铁原子构成。其核心是亚铁离子，具有携氧能力，是有氧呼吸及厌氧呼吸电子传递链蛋白的重要组分。除此之外，它还是许多感应调节蛋白和酶的辅基，参与生物细胞中的许多重要的生理生化反应过程，比如电子传递、气体转运、细胞中的信号转导、过氧化物还原等，并且是许多生物体的优质铁源。目前，血红素不仅在食品行业常被用于着色剂，如肠类制品，而且在医学临床上也广泛的使用，如血红素可作为半合成胆红素原料，也可生产抗肝功能亢进、抗炎症作用和抗肿瘤作用的重要药物。血红素也是人类良好的补血剂，亚铁血红素可直接被人体吸收，吸收率高达10％～20％。
包括血红素在内的卟啉类化合物的合成可以通过化学合成，但是由于它们结构复杂，合成过程中反应步骤繁琐，得率比较低，使得卟啉类化合物价格昂贵。为此，微生物成为生产结构复杂的卟啉类化合物的最佳选择。随着基因工程技术的成熟，选择大肠杆菌作为宿主大量合成血红素具有广阔的前景。Kwon等人在大肠杆菌中表达来源于类球红细菌的hemA基因合成血红素，并且将其作为老鼠饲料的铁源。此外，Lee等人分别表达了参与泛酸途径的coaA基因和卟啉合成途径的每个基因hemB、hemC、hemD、hemE，获得较高产量的血红素，即使通过优化培养基，但是这个产量对于工业生产来讲，还是非常低。因此，进一步对血红素合成途径进行改造，提高血红素产量是十分必要的。
在生物体内，血红素的合成途径是从5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)开始的(图1)。ALA是血红素合成途径的关键前体物质。ALA在ALA脱水酶(HemB,由基因hemB编码)的催化下生成胆色素原，然后胆色素原在羟甲基胆素合成酶(HemC,由基因hemC编码)的作用下生成羟甲基胆素，又被尿卟啉原Ⅲ合成酶(HemD,由基因hemD编码)催化生成含有四吡咯环的尿卟啉原Ⅲ，再经过尿卟啉原Ⅲ脱羧酶(HemE,由基因hemE编码)和粪卟啉原Ⅲ氧化酶(HemF,由基因hemF编码；无氧条件下为HemN,由基因hemN编码)的脱羧氧化作用生成原卟啉原Ⅸ，又在偶联呼吸链辅酶Q的原卟啉原氧化酶(HemG,由基因hemG编码)催化下生成原卟啉Ⅸ。原卟啉Ⅸ在亚铁螯合酶(HemH,由基因hemH编码)作用下将铁离子螯合进原卟啉环生成血红素。
由于血红素合成途径调控机理复杂，受多方面因素影响。目前有关血红素合成途径的研究，主要集中于分析某单个基因或某几个基因对血红素生产的影响，并未考虑血红素合成途径基因的表达强度与合成血红素之间的关系。
ALA是血红素合成途径的关键前体物质，为了进一步促进血红素的积累，本发明在在表达5-氨基乙酰丙酸C5合成途径关键酶基因hemL和hemA的基础上，将来源于大肠杆菌血红素生物合成途径的基因分为两个模块，利用拷贝数不同的质粒对两个模块的基因组合表达，实现血红素产量的提高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种提高大肠杆菌工程菌株产血红素的方法，是利用不同拷贝数的表达载体，将血红素合成途径的基因分模块组合表达，实现血红素产量的提高。
本发明的第一个目的是提供一种高产血红素的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并串联表达hemF、hemG和hemH基因。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌包括(a),(b)，(c)，其中：
(a)是以pRSFDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pACYCDuet-2为载体串联表达hemF、hemG和hemH基因；
(b)是以pCDFDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pRSFDuet-2或pACYCDuet-2为载体，串联表达hemF、hemG和hemH基因；
(c)是以pACYCDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pRSFDuet-2或pCDFDuet-2为载体，串联表达hemF、hemG和hemH基因；
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还以pUC19为载体过量表达hemA和hemL基因。
在本发明的一种实施方式中，所述hemA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述hemL的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述hemB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述hemC的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述hemD的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述hemE的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在本发明的一种实施方式中，所述hemF的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在本发明的一种实施方式中，所述hemG的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在本发明的一种实施方式中，所述hemH的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
在本发明的一种实施方式中，所述载体pRSFDuet-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。
在本发明的一种实施方式中，所述载体pCDFDuet-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
在本发明的一种实施方式中，所述载体pACYCDuet-2的核苷酸序列如SEQ IDNO.26所示。
本发明的第二个目的是提供所述重组大肠杆菌的构建方法，步骤为：(1)以pUC19为表达载体，在大肠杆菌中过量表达hemA和hemL基因；(2)再以pRSFDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pACYCDuet-2为载体串联表达hemF、hemG和hemH基因；或以pCDFDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pRSFDuet-2或pACYCDuet-2为载体串联表达hemF、hemG和hemH基因；或以pACYCDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pRSFDuet-2或pCDFDuet-2为载体串联表达hemF、hemG和hemH基因；
在本发明的一种实施方式中，所述方法步骤如下：
(1)分别以pRSFDuet-2、pCDFDuet-2和pACYCDuet-2为载体，构建pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE、pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE、pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE、pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH、pCDFDuet-2-hemF-hemG-hemH、pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH六种重组载体；
(2)将pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE和pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH组合，或将pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE、pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE和pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH、pCDFDuet-2-hemF-hemG-hemH、pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH两两组合，转入以pUC19为载体过量表达hemA和hemL基因的大肠杆菌中。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：
(1)基因片段的扩增：以E.coli DH5α基因组为模板分别扩增hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG、hemH基因。
(2)相关表达载体的构建：利用酶切位点PstⅠ和HindⅢ将片段hemC-hemD分别与表达载体pRSFDuet-2、pCDFDuet-2、pACYCDuet-2连接，获得重组载体pRSFDuet-2-hemC-hemD、pCDFDuet-2-hemC-hemD、pACYCDuet-2-hemC-hemD。通过BamHⅠ和SacⅠ将片段hemB分别与载体pRSFDuet-2-hemC-hemD、pCDFDuet-2-hemC-hemD、pACYCDuet-2-hemC-hemD连接，得到重组载体pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD、pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD、pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD。将扩增得到的hemE片段通过酶切位点NdeⅠ和XhoⅠ分别连接到pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD、pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD、pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD中，得到重组质粒pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE、pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE、pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE。
(3)利用酶切位点BamHⅠ和HindⅢ将从大肠杆菌基因组扩增得到的片段hemF分别与表达载体pRSFDuet-2、pCDFDuet-2、pACYCDuet-2连接，获得重组载体pRSFDuet-2-hemF、pCDFDuet-2-hemF、pACYCDuet-2-hemF。通过NdeⅠ和XhoⅠ将片段hemG-hemH分别与载体pRSFDuet-2-hemF、pCDFDuet-2-hemF、pACYCDuet-2-hemF连接，得到重组载体pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH、pCDFDuet-2-hemF-hemG-hemH、pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH。
(4)构建相关重组菌株：将质粒pUC19-hemA-hemL转化菌株E.coli DH5α，得到重组菌株E.coli DH5α-pUC19-hemA-hemL。将大肠杆菌血红素合成途径两个模块的相关重组质粒两两组合，转化菌株E.coli DH5α：pUC19-hemA-hemL，得到如下重组工程菌株(b)、(c)、(d)、(e)、(f)：
(b)E.coli DH5α：pUC19-hemA-hemL+pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH；
(c)E.coli DH5α：pUC19-hemA-hemL+pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH；
(d)E.coli DH5α：pUC19-hemA-hemL+pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH；
(e)E.coli DH5α：pUC19-hemA-hemL+pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH；
(f)E.coli DH5α：pUC19-hemA-hemL+pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pCDFDuet-2-hemF-hemG-hemH。
本发明的第三个目的是提供所述的重组大肠杆菌在食品、医药领域中的应用。
本发明的第四个目的是提供应用所述重组大肠杆菌发酵生产血红素的方法，是以1～5mL菌液/100mL培养基的接种量将所述重组大肠杆菌接种至发酵培养基，37℃，220r/min培养6～48h.
在本发明的一种实施方式中，所述方法是在接种后0h添加终浓度0.1mmol/L IPTG进行诱导，接种后4h时添加终浓度100μmol/L的FeSO4。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是挑取在斜面培养基中培养的重组菌株(b)、(c)、(d)、(e)、(f)接种于LB培养基，37℃过夜培养约12h后，以1％接种量转接发酵培养基中发酵，0h时添加0.1mM IPTG诱导基因表达以及对应的抗生素，氨苄青霉素(100μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)、链霉素(50μg/mL)、氯霉素(34μg/mL)，37℃，220r/min培养，4h时添加100μM的FeSO4，周期48h。
本发明还提供所述方法在生产血红素中的应用。
有益效果：本发明首次采用分模块组合的思路，将血红素合成途径分成两个模块，用拷贝数不同的质粒将两个模块的基因组合表达，控制不同基因的表达强度，使重组菌血红素产量最高达到0.56μM/OD细胞。
附图说明
图1大肠杆菌血红素合成途径示意图；
图2大肠杆菌各重组工程菌株的血红素产量。
具体实施方式
培养基：
斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5.0，琼脂20，pH 7.0；
种子培养基(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5.0，pH 7.0，装液量20mL/250mL；
发酵培养基(g/L)：(NH4)2SO415，KH2PO45.0，Na2HPO4·12H2O 15，MgSO4·7H2O 1.0，yeast extract 1.0，Glucose 20，pH 7.0，装液量30mL/250mL。
培养条件：
菌种培养：甘油管划线，然后挑取单菌落划线平板37℃培养，作为种子来源；
种子培养：平板挑取菌体，37℃，220r/min，根据要求添加氨苄青霉素100μg/mL，卡那霉素50μg/mL，链霉素50μg/mL，氯霉素34μg/mL，培养约12h，转接发酵培养基；
发酵培养：以1％接种量转接，0h时添加0.1mM IPTG诱导基因表达，根据需要添加氨苄青霉素(100μg/mL)，卡那霉素(50μg/mL)，链霉素(50μg/mL)，氯霉素(34μg/mL)，37℃，220r/min培养，4h时添加100μM的FeSO4，周期48h。
血红素检测方法：
采用荧光法测定血红素的浓度：细胞发酵液4℃，12000rpm离心5min，收集菌体，加入去离子水，重悬菌体，测定其OD600。取含有0.1-0.5OD(根据菌体产血红素浓度决定)的细胞重悬液，分别加入两个1.5mL离心管中，其中一个用于对照试验。向两个1.5mL离心管中加入200mM的草酸，使其总体积为500μL，再加入500μL的2M的草酸，放入100℃的金属浴中加热30min，对照组放置在室温条件下。待样品自然冷却后12000rpm离心5min，取200μL上清加入黑色96孔板中，将96孔板放入酶标仪，设置荧光测定的激发波长为400nm，发射波长为620nm，测定样品和对照的荧光值。
hemA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，hemL的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，hemB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，hemC的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，hemD的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，hemE的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，hemF的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，hemG的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，hemH的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示，pRSFDuet-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，pCDFDuet-2的核苷酸序列如SEQID NO.25所示，pACYCDuet-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。
实施例1血红素合成途径相关基因片段的扩增
以E.coli DH5α基因组为模板分别扩增hemB(989bp)、hemC(956bp)、hemD(755bp)、hemE(1079bp)、hemF(914bp)、hemG(560bp)、hemH(977bp)基因，然后以融合PCR将hemC和hemD片段融合为hemC-hemD，将hemG和hemH片段融合为hemG-hemH。引物表1所示。
表1引物
实施例2大肠杆菌合成血红素相关重组工程菌株的构建
利用酶切位点PstⅠ和HindⅢ将片段hemC-hemD分别与表达载体pRSFDuet-2、pCDFDuet-2、pACYCDuet-2连接，获得重组载体pRSFDuet-2-hemC-hemD、pCDFDuet-2-hemC-hemD、pACYCDuet-2-hemC-hemD。通过BamHⅠ和SacⅠ将片段hemB分别与载体pRSFDuet-2-hemC-hemD、pCDFDuet-2-hemC-hemD、pACYCDuet-2-hemC-hemD连接，得到重组载体pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD、pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD、pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD。将扩增得到的hemE片段通过酶切位点NdeⅠ和XhoⅠ分别连接到pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD、pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD、pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD中，得到重组质粒pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE、pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE、pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE。
利用酶切位点BamHⅠ和HindⅢ将从大肠杆菌基因组扩增得到的片段hemF分别与表达载体pRSFDuet-2、pCDFDuet-2、pACYCDuet-2连接，获得重组载体pRSFDuet-2-hemF、pCDFDuet-2-hemF、pACYCDuet-2-hemF。通过NdeⅠ和XhoⅠ将片段hemG-hemH分别与载体pRSFDuet-2-hemF、pCDFDuet-2-hemF、pACYCDuet-2-hemF连接，得到重组载体pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH、pCDFDuet-2-hemF-hemG-hemH、pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH。
将质粒pUC19-hemA-hemL转化菌株E.coli DH5α，得到重组菌株E.coli DH5α：pUC19-hemA-hemL。将大肠杆菌血红素合成途径两个模块的相关重组质粒两两组合，转化菌株E.coli DH5α：：pUC19-hemA-hemL，得到重组工程菌株(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)：(a)E.coli DH5α：pUC19-hemA-hemL+pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pCDFDuet-2-hemF-hemG-hemH；
(b)E.coli DH5α：pUC19-hemA-hemL+pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH；
(c)E.coli DH5α：pUC19-hemA-hemL+pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH；
(d)E.coli DH5α：pUC19-hemA-hemL+pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH；
(e)E.coli DH5α：pUC19-hemA-hemL+pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH；
(f)E.coli DH5α：pUC19-hemA-hemL+pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pCDFDuet-2-hemF-hemG-hemH。
实施例3重组菌摇瓶发酵验证
以E.coli DH5α：pUC19-hemA-hemL作为对照，
重组菌株：
(a)E.coli DH5α：pUC19-hemA-hemL+pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pCDFDuet-2-hemF-hemG-hemH；
(b)E.coli DH5α：pUC19-hemA-hemL+pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH；
(c)E.coli DH5α：pUC19-hemA-hemL+pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH；
(d)E.coli DH5α：pUC19-hemA-hemL+pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH；
(e)E.coli DH5α：pUC19-hemA-hemL+pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH；
(f)E.coli DH5α：pUC19-hemA-hemL+pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pCDFDuet-2-hemF-hemG-hemH。
将重组大肠杆菌(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)与对照菌株分别在250mL三角瓶中发酵，接种量1％，初始葡萄糖浓度为20g/L，0h添加0.1mM IPTG诱导以及相应的抗生素，4h时添加100μM的FeSO4，发酵48h检测各重组工程菌每OD菌体细胞生产血红素的产量，结果显示，重组工程菌(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)的血红素产量分别为0.09μM/OD、0.25μM/OD、0.35μM/OD、0.44μM/OD、0.56μM/OD、0.46μM/OD(图2)，最高比出发菌株血红素产量提高8倍。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种高产血红素的重组大肠杆菌，其特征在于，包括(a),(b)，(c)，其中
(a)是以pRSFDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pACYCDuet-2为载体串联表达hemF、hemG和hemH基因；
(b)是以pCDFDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pRSFDuet-2或pACYCDuet-2为载体，串联表达hemF、hemG和hemH基因；
(c)是以pACYCDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pRSFDuet-2或pCDFDuet-2为载体，串联表达hemF、hemG和hemH基因；
所述载体pRSFDuet-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；所述载体pCDFDuet-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示；所述载体pACYCDuet-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示；
所述重组大肠杆菌还以pUC19为载体过量表达hemA和hemL基因。
2.权利要求1所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，步骤为：(1)以pUC19为表达载体，在大肠杆菌中过量表达hemA和hemL基因；(2)再以pRSFDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pACYCDuet-2为载体串联表达hemF、hemG和hemH基因；或以pCDFDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pRSFDuet-2或pACYCDuet-2为载体串联表达hemF、hemG和hemH基因；或以pACYCDuet-2为载体串联表达hemB、hemC、hemD和hemE基因，并以pRSFDuet-2或pCDFDuet-2为载体串联表达hemF、hemG和hemH基因；所述载体pRSFDuet-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；所述载体pCDFDuet-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示；所述载体pACYCDuet-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)分别以pRSFDuet-2、pCDFDuet-2和pACYCDuet-2为载体，构建pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE、pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE、pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE、pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH、pCDFDuet-2-hemF-hemG-hemH、pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH六种重组载体；
(2)将pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE和pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH组合，或将pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE、pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE和pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH、pCDFDuet-2-hemF-hemG-hemH、pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH两两组合，转入以pUC19为载体过量表达hemA和hemL基因的大肠杆菌中。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为Escherichia coliDH5α。
5.权利要求1所述的重组大肠杆菌在食品领域中的应用。
6.应用权利要求1所述重组大肠杆菌发酵生产血红素的方法，其特征在于，以1～5mL菌液/100mL培养基的接种量将所述重组大肠杆菌接种至发酵培养基，37℃，220r/min培养6～48h。
7.权利要求6所述方法在生产血红素中的应用。
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