CN104830748A - 一种弱化hemB基因表达提高大肠杆菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种弱化hemB基因表达提高大肠杆菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，属于代谢工程和微生物发酵领域。本发明在使用载体pRSFDuet-1过量表达谷氨酰-tRNA还原酶，谷氨醛氨基转移酶和粪卟啉原III氧化酶以及使用载体pETDuet-1过量表达尿卟啉原III合酶的基础上，通过在基因组水平改造hemB基因的启动子进而调控其表达，考察其对ALA积累的影响。通过摇瓶发酵验证，目的产物ALA产量有明显提高，30h时ALA产量为2680mg/L。

Description

一种弱化hemB基因表达提高大肠杆菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法

技术领域

本发明涉及一种弱化hemB基因表达提高大肠杆菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，属于代谢工程和微生物发酵领域。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)，分子式为C₅O₃NH₉，分子量为131.13，熔点为149-151℃，它是生物体合成叶绿素、血红素、维生素B₁₂等关键前体物质。ALA已广泛应用于医学和农业领域，作为一种安全、选择、渗透性好的光动力学药物已成功应用于皮肤癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌等的诊断和光动力治疗中。另外，由于ALA在自然界中可降解，作为一种无公害的新型光活化农药、除草剂以及植物生长调节剂等在农药领域应用也非常广泛。

目前，ALA主要通过化学法合成，最早出现在上世纪50年代，到20世纪90年代，相关研究开始大量开展并取得一定的成绩。但化学合成存在许多缺点，如反应步骤繁琐，副产物多，分离提纯困难，ALA得率也较低，并且环境污染严重。近年来，微生物发酵生产ALA已成为研究的热点。自然界中，ALA的生物合成存在两条途径，一条是C4途径，琥珀酰-CoA和甘氨酸在5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS，hemA编码)作用下生成ALA的一步酶促反应，主要存在于一些光合细菌、真菌以及动物体内。另外一条是广泛存在于植物、藻类以及细菌(如大肠杆菌)中的C5途径，首先谷氨酸在谷氨酰-tRNA合成酶(GluRS，gltX编码)催化下，生成谷氨酰-tRNA，然后，谷氨酰-tRNA在谷氨酰-tRNA还原酶(GluTR，hemA编码)作用下生成谷氨酸-1-半醛(GSA)，最后GSA由谷氨酸-1-半醛-2,1-氨基转移酶(GSA-AT，hemL编码)催化生成ALA。

早期，人们筛选到产ALA的光合细菌类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，通过诱变育种筛选ALA的高产菌株，并通过发酵优化等方法使得ALA的产量达到7.2g/L。但由于光合细菌的特殊性，其成本较高，不适合大规模的工业化生产。随着基因工程技术的成熟，Mariet和Zeikus选用大肠杆菌作为宿主细胞，采用基因工程的技术表达来源于R.sphaeroides的ALA合酶基因(hemA)，ALA产量为3.79g/L。Xie et al.等利用过量表达R.sphaeroides来源的hemA基因，经发酵优化，ALA产量最高达到5.2g/L。但目前以C4途径为基础的生物转化由于添加前体琥珀酸和甘氨酸生产ALA成本相对较高，Kang et al.等通过分析大肠杆菌中C5途径的调控机制，发现ALA合成C5途径的关键基因hemA和hemL，同时实现了以葡萄糖为唯一碳源发酵生产ALA。

由于ALA是血红素合成途径的关键前体物质(图1)，而血红素是细胞生长所必需的，为了进一步促进ALA的积累，本发明在表达5-氨基乙酰丙酸C5合成途径关键酶基因hemL和hemA和表达来源于大肠杆菌血红素生物合成途径基因hemD及hemF的基础上，通过在基因组水平改造ALA下游5-氨基乙酰丙酸脱水酶编码基因hemB的启动子，弱化hemB基因的表达水平，实现ALA产量的进一步提高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种提高大肠杆菌工程菌株产5-氨基乙酰丙酸的方法，是在基因组水平削弱大肠杆菌工程菌株hemB基因的表达，实现ALA产量的进一步提高。

所述在基因组水平削弱hemB基因的表达，是在基因组水平将hemB基因的启动子替换为在大肠杆菌生长稳定期强度减弱的启动子，例如基因fliC、flgC、tnaA、tap或fliA的启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述在大肠杆菌生长稳定期强度减弱的启动子是fliC基因的启动子，来源于大肠杆菌，序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌株，是以大肠杆菌为宿主，使用不同拷贝数的表达载体组合过量表达谷氨酰-tRNA还原酶(hemA编码)、谷氨醛氨基转移酶(hemL编码)、尿卟啉原III合酶(hemD编码)和粪卟啉原III氧化酶(hemF编码)。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌是Escherichia coli BL21(DE3)；所述不同拷贝数表达载体分别为pRSFDuet-1和pETDuet-1。

在本发明的一种实施方式中，所述hemL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述hemA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述hemD的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述hemF的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌株以pRSFDuet-1串联表达hemA、hemL、hemF，并以pETDuet-1表达hemD。

本发明还提供了一种5-氨基乙酰丙酸产量提高的重组大肠杆菌，是将大肠杆菌基因组中hemB基因的启动子替换为fliC基因的启动子，并转入质粒pRSFDuet-1-hemA-hemL-hemF和pETDuet-1-hemD。

所述重组大肠杆菌的构建方法，是通过基因重组将大肠杆菌基因组上的hemB基因的启动子替换为fliC基因的启动子，然后将质粒pRSFDuet-1-hemA-hemL-hemF和pETDuet-1-hemD转化改造的菌株E.coli BL21(DE3)PfliC中，构建重组工程菌株PfliC-LADF-6：E.coli BL21(DE3)PfliC/pRSFDuet-1-hemA-hemL-hemFpETDuet-1-hemD。

应用所述重组大肠杆菌生产5-氨基乙酰丙酸时，可将菌株活化后，以2％接种量转接发酵培养基中发酵，0h时添加0.1-0.5mM IPTG诱导基因表达以及氨苄青霉素(100μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)，30-37℃，200r/min培养，周期28-36h。

本发明以表达C5途径关键基因hemL和hemA以及ALA代谢途径的下游基因hemD和hemF的工程菌为出发菌株，通过在基因组水平改造hemB基因的启动子，所得大肠杆菌工程菌株在3L发酵罐中积累5-氨基乙酰丙酸4.08g/L，有效地利用C5途径促进5-氨基乙酰丙酸的合成，实现了ALA产量的进一步提高。

附图说明

图1：大肠杆菌中血红素合成途径。

图2：基因组改造hemB启动子菌落PCR电泳图。M：DL 5000Maker；A：对照；B：改造hemB启动子菌株；C：改造hemB启动子菌株。

图3：改造hemB启动子对重组大肠杆菌合成ALA的影响。(a)250mL摇瓶发酵结果；A：LADF-6；B：PfliC-LADF-6。(b)重组大肠杆菌在3L发酵罐发酵结果。

具体实施方式

ALA分析方法：

采用Mauzerall和Granick的分光光度法：将样品稀释至2mL，加入1mL的乙酸钠缓冲液，0.5mL的乙酰丙酮，然后煮沸15min。冷却至室温，取2mL的反应液至新管中，然后加入2mL的Modified Ehrlich’s试剂，反应20min，利用分光光度计554nm下检测。

培养基：

斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5.0，琼脂20，pH 7.0；

种子培养基(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5.0，pH 7.0，装液量20mL/250mL；

发酵培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄15，KH₂PO₄5.0，Na₂HPO₄·12H₂O 15，MgSO₄·7H₂O 1.0，酵母提取物1.0，葡萄糖20，pH 7.0。

培养条件：

菌种培养：甘油管划线，然后挑取单菌落划线平板37℃培养，作为种子来源；

种子培养：平板挑取菌体，37℃，200r/min，根据要求添加氨苄青霉素100μg/mL，卡那霉素50μg/mL，培养约12h，转接发酵培养基；

发酵培养：以2％接种量转接，0h时添加0.1-0.5mM IPTG诱导基因表达，根据需要添加苄青霉素(100μg/mL)以及卡那霉素(50μg/mL)，30-37℃，200r/min培养，周期28-36h。

大肠杆菌工程菌LADF-6:E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-hemLA-hemF pETDuet-1-hemD的构建方法，参见发明名称为“一种利用组合调控策略提高5-氨基乙酰丙酸产量的方法”，申请号为201410274656.2的专利申请。

实施例1同源重组片段P1-Kan-PfliC-P2的组装

以大肠杆菌基因组为模板分别扩增hemB基因的启动子上游同源臂P1(934bp)、下游同源臂P2(726bp)和fliC启动子PfliC(130bp)，以质粒pKD13为模板扩增筛选标记抗性基因Kan(1330bp)。然后以融合PCR的方法将4个片段组装，即P1-Kan-PfliC-P2(3120bp)。

引物如下：

上游同源臂P1

F1：CACTTGTATCAAATGTCTCATTTGTGTG

R1：CGAAGCAGCTCCAGCCTACACTTATTTATAGCTGTTGGTTATTATTTTTTGG

抗性基因Kan

F2：TAACCAACAGCTATAAATAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

R2：TTTCAAAAACAGCCATTTTTTGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTAATT

启动子PfliC

F3：TCATGTTTGACAGCTTATCAAAAAATGGCTGTTTTTGAAAAAAATT

R3：CGTTGGATTAAGTCTGTCATGATTCGTTATCCTATATTGCAAGTC

下游同源臂P2

F4：GCAATATAGGATAACGAATCATGACAGACTTAATCCAACGCCC

R4：AGTCTGCGCCCTGGGCTT

实施例2 hemB基因启动子改造

启动子改造方法采用Red重组一步法敲除：

(1)将质粒pKD46转化E.coli BL21(DE3)，该质粒为温度敏感型，菌体培养温度为30℃。挑取在斜面培养基中培养的单菌落接种于添加100mg/L氨苄青霉素的SOB培养基中，30℃过夜培养约12h后，以2％接种量转接于添加100mg/L氨苄青霉素的SOB培养基中继续培养至OD600nm约0.1-0.2时，添加终浓度10mM的L-阿拉伯糖诱导重组酶的表达，继续培养至OD600nm约0.6时，冰浴菌液约10min。4℃，4000r/min离心10min收集菌体，然后用无菌10％的甘油水溶液洗涤菌体三次，浓缩100倍，制备感受态细胞。

(2)利用电穿孔仪，2500v，电击重组片段P1-Kan-PfliC-P2，迅速加入600μL冰浴的SOC培养基，然后转入无菌的EP管中，30℃下后培养2h，然后涂布Kan抗性平板，30℃培养。挑取单克隆，利用菌落PCR验证(图2)，与对照(扩增片段大小为1830bp)相比，改造启动子后扩增片段大小约为3000bp，说明启动子改造正确，进一步测序验证。

(3)辅助质粒pKD46的消除，将改造正确的菌株在37℃下过夜培养，划线于LB平板上，待单菌落长出，分别在无氨苄抗性和含氨苄抗性的平板上点板，在无氨苄抗性的平板上生长而在含氨苄抗性的平板上不生长的菌，说明质粒已消除成功。

(4)抗性基因的去除采用辅助质粒pCP20，将已成功消除质粒pKD46的菌株转化温度敏感型的质粒pCP20，挑取单菌落过夜培养后，按照1％(v/v)的接种量转入装有20mL LB培养基的250mL的三角瓶中，30℃培养至OD600nm为0.1时，转入42℃条件下培养12h以上，然后将菌液划线无抗性的LB平板，挑取单克隆，分别在无抗性、含氨苄抗性和含卡纳抗性的LB平板上点板，以验证抗性基因和pCP20质粒是否成功去除。

实施例3重组菌发酵验证

菌株：

LADF-6:E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-hemLA-hemFpETDuet-1-hemD。

PfliC-LADF-6:E.coli BL21(DE3)PfliC/pRSFDuet-1-hemLA-hemF pETDuet-1-hemD。

重组大肠杆菌PfliC-LADF-6与对照菌LADF-6分别在250mL三角瓶中发酵，接种量1％，初始葡萄糖浓度为20g/L，0h添加0.1-0.5mM IPTG诱导以及氨苄青霉素(100mg/L)和卡那霉素(50mg/L)，10h后ALA开始大量积累，在30h左右产量最高，为2680mg/L，相比对照产量提高25％以上(图3a)。

将重组大肠杆菌PfliC-LADF-6在3L发酵罐中放大培养，接种量2％，初始葡萄糖浓度约为35g/L，0h添加0.1-0.5mM IPTG诱导以及氨苄青霉素(100mg/L)和卡那霉素(50mg/L)，在30h左右产量最高，为4.08g/L(图3b)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种提高大肠杆菌工程菌株产5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，是在基因组水平削弱大肠杆菌工程菌株hemB基因的表达。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述在基因组水平削弱hemB基因的表达，是在基因组水平将hemB基因的启动子替换为在大肠杆菌生长稳定期强度减弱的启动子。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述在大肠杆菌生长稳定期强度减弱的启动子是fliC基因的启动子，来源于大肠杆菌，序列如SEQ ID NO.5所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌株，是以大肠杆菌为宿主，过量表达hemA编码的谷氨酰-tRNA还原酶、hemL编码的谷氨醛氨基转移酶、hemD编码编码的尿卟啉原III合酶和hemF编码的粪卟啉原III氧化酶。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌株以pRSFDuet-1串联表达hemA、hemL、hemF，并以pETDuet-1表达hemD。

6.一种5-氨基乙酰丙酸产量提高的重组大肠杆菌，其特征在于，是将大肠杆菌基因组中hemB基因的启动子替换为fliC基因的启动子，并以pRSFDuet-1串联表达hemA、hemL、hemF，并以pETDuet-1表达hemD。

7.一种构建权利要求6所述重组大肠杆菌的方法，其特征在于，是通过基因重组将大肠杆菌基因组上的hemB基因的启动子替换为fliC基因的启动子，然后以pRSFDuet-1串联表达hemA、hemL、hemF，并以pETDuet-1表达hemD。

8.权利要求6所述重组大肠杆菌在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用。