CN105463007B - 基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶i的方法 - Google Patents
基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶i的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105463007B CN105463007B CN201610009811.7A CN201610009811A CN105463007B CN 105463007 B CN105463007 B CN 105463007B CN 201610009811 A CN201610009811 A CN 201610009811A CN 105463007 B CN105463007 B CN 105463007B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ion beam
- coenzyme
- bacillus coli
- recombination bacillus
- mediated
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 title claims abstract description 42
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 36
- 238000010884 ion-beam technique Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 238000005215 recombination Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 230000006798 recombination Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 title claims abstract description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 18
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 26
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 26
- 108010021066 nicotinamide riboside kinase Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 12
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical class O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 9
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000006152 selective media Substances 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 7
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 7
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 claims description 7
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 claims description 7
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 6
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 5
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 5
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 5
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 5
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000012358 sourcing Methods 0.000 claims description 4
- -1 Nitrogen ion Chemical class 0.000 claims description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 3
- ZIGVUIYVPLQEAL-UHFFFAOYSA-M sodium;2-tetradecylbenzenesulfonate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCC1=CC=CC=C1S([O-])(=O)=O ZIGVUIYVPLQEAL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- JYTNGEWJAZCVAN-UHFFFAOYSA-N 2-hexadecylbenzenesulfonic acid;sodium Chemical compound [Na].CCCCCCCCCCCCCCCCC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O JYTNGEWJAZCVAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 2
- 241000922174 Metarhizium robertsii Species 0.000 claims description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 2
- MZSDGDXXBZSFTG-UHFFFAOYSA-M sodium;benzenesulfonate Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 MZSDGDXXBZSFTG-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims 1
- SNRUBQQJIBEYMU-NJFSPNSNSA-N dodecane Chemical group CCCCCCCCCCC[14CH3] SNRUBQQJIBEYMU-NJFSPNSNSA-N 0.000 claims 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000015424 sodium Nutrition 0.000 claims 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 abstract 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 230000022558 protein metabolic process Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O NAD(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000003754 machining Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000005482 strain hardening Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/36—Dinucleotides, e.g. nicotineamide-adenine dinucleotide phosphate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
- C12Y207/01023—NAD+ kinase (2.7.1.23)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法。将烟酰胺核苷激酶基因与pet28a载体连接，构建表达载体，经低能离子束介导作用将表达载体导入大肠杆菌，从而获得产辅酶I重组大肠杆菌，本发明采用离子束介导作用技术将辅酶I合成途径中烟酰胺核苷激酶基因在大肠杆菌中进行重组表达，使重组菌能够多产烟酰胺核苷激酶，从而大幅提高发酵产物辅酶I的含量。在5L发酵罐中其辅酶I产量最高可以达到10.28g/l，具有很高的经济应用价值和产业化前景。
Description
技术领域
本发明属于离子束生物技术和分子生物学领域，具体涉及离子束介导基因生产辅酶I方法。
背景技术
在酶的六大类型中，有百分之三十左右是氧化还原酶，氧化还原酶在在制药、食品、精细化工、农药等领域具有重要的用途，它的应用也越来越受到人们的重视，而大部分氧化还原酶催化作用的发挥需要烟酰型辅酶的参与，辅酶I在生物氧化过程中起递氢作用，活化各种酶系统，促进核酸、蛋白质、多糖的合成及代谢，增加物质转运和调节控制，改善代谢功能。NAD+和NADH的价格昂贵，通常比酶促反应所得产物要贵得多，每克辅酶I大约要700元左右，由于氧化还原酶应用广泛而辅酶价格昂贵，使得辅酶工业化生产逐渐成为研究热点。
1986年，受离子注入材料表面改性研究的启发，中国科学院等离子体物理研究所与安徽省农科院水稻所合作将低能离子注入应用于水稻的品种改良，获得极大的成功。随后离子注入被用于微生物和农作物的基因组改良，大量研究表明低能离子与生物体之间具有动量传递、能量沉积、粒子注入和电荷交换的过程。离子束介导是通过一定剂量和能量的离子束对细胞壁的溅射作用在破坏细胞壁或细胞膜上产生微孔通道，促进外源遗传物质进入细胞；其次，用于注入的带正离子降低了细胞表面的负电性，从而减弱了对带负电的外源DNA的排斥力,从而促进了外源DNA的吸附和进入。再者，离子束可以直接和间接的打断细胞内的双链DNA，以便外源DNA的整合和重组。
众所周知，很多疾病的起因大多是因为体内糖、脂肪和蛋白质代谢不良而引起，而辅酶I是参与体内乙酰化反应、氧化还原反应和能量代谢的关键辅酶，对体内糖、脂肪和蛋白质代谢起重要作用。如何强化上述糖、脂肪和蛋白质代谢已成为药物研发主攻方向之一。
现在国内外主要通过提取法、发酵法、生物合成法、强化法、和有机合成法等方法制备辅酶I。国内一直利用离子交换树脂从酵母中生产辅酶I，但是产品得率和纯度较低，虽然工艺成熟，但是耗费大量能源和材料，以及原料的昂贵，使得辅酶I的生产和后续产品研发收到了极大限制，大肠杆菌因培养条件简单、遗传背景清楚、生长快、发酵周期短、等诸多优点，在基因工程领域成为使用最广泛的宿主菌，基因工程菌株大量表达合成原本在野生菌株中不能或微量表达的蛋白和不能合成的有机化学品。而实现产品的工业化生产与成熟的重组菌发酵工艺是紧密相关，不可逾越的，因此实现基因工程技术和工程菌的发酵工艺的有机结合，无疑会为重组产品实现大规模生产奠定基础。
尽管许多微生物在自然状态下都能产辅酶I，但绝大多数的辅酶产量极低，而通过常规育种技术耗时费力，难以筛选到产辅酶I的高产菌株，这就造成了生产成本居高不下，限制了其工业化生产。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法，以克服现有技术的不足，提供一种新的辅酶I生产技术，可大幅提高发酵液中辅酶I的含量，其含量可以稳定在10g/L。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法，包括如下步骤：
1）将烟酰胺核苷激酶基因，连接到载体上，构建表达载体；
a)将步骤1）的表达载体通过低能离子束介导技术导入大肠杆菌；
b)利用选择性培养基进行重复筛选，获得可以高效表达烟酰胺核苷激酶的重组大肠杆菌；
c)将重组大肠杆菌接种到发酵培养基中发酵生产辅酶I。
步骤1）所述烟酰胺核苷激酶基因为罗伯茨绿僵菌（Metarhizium robertsii）ARSEF 23的NRK基因片段MAA_05394，所述载体为pet28a。
步骤2）中离子束介导的能量为14~18KeV，剂量（80~200）×1014ions/cm2，靶室真空度为（1.0~2.0）×10-3Pa。优选为离子束介导的能量为18KeV，剂量170×1014ions/cm2，靶室真空度为1.6×10-3Pa。
步骤3）选择性培养基是在LB培养基中加入50ug/ml的卡那霉素。
步骤4）中发酵培养基包含按质量百分比的如下组分：碳源2-6%、氮源 0.5-1%，无机盐0.01-0.1%，生长因子0.1-0.4%，余量为水，pH=7.0-7.2，其中碳源为葡萄糖、蔗糖和甘油中的至少一种；氮源为酵母膏、玉米浆、蛋白胨和氯化铵中的至少一种；无机盐为氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠中的至少一种；生长因子为腺嘌呤或烟酰胺中的至少一种。
步骤4）中发酵采用高密度发酵，接种量为1-5%(V/V)，发酵培养的温度为28-34℃，摇床转速为200-250r/min。接种后检测OD在0.6-0.8时加入终浓度为0.5mM IPTG诱导培养12-16h后加入终浓度为0.2-0.5%表面活性剂，继续培养4-8h。其中表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠、十四烷基苯磺酸钠和十六烷基苯磺酸钠中的一种。
有益效果：
本发明将烟酰胺核苷激酶基因基因片段，经分子生物学手段构建表达载体，通过离子束介导方法将表达载体导入大肠杆菌，得到遗传稳定性良好的高产辅酶I的重组大肠杆菌，可以大幅提高发酵过程中辅酶I的含量；相对于传统技术，由于离子束射程的可控性和可聚束的特点，可精确控制被刻蚀受体表面形成转基因通道的直径和深度，有利于外源基因转移、整合和表达而且离子束的溅射属于冷加工范畴，与传统转到技术相比，加工精度高，可以不伤及邻近组织和细胞器。
本发明所导入的烟酰胺核苷激酶可以高效的将底物腺嘌呤和烟酰胺转化成产物辅酶I，在发酵后期添加阴离子表面活性剂，可以将胞内的辅酶I泄露到细胞外，这样可以省去传统方法中需要使用昂贵破壁设备，大大节约了生产成本，易于后期的分离提取。
具体实施方式
下面结合具体实施实例对本发明做进一步描述，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1 本实施例说明基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌的方法
1、设计合成带有EcoR I酶切位点的上游引物和带有BamH I 酶切位点的下游引物（下划线部分为相应的酶切位点），
Primer1上游引物：5’- CGGAATTCATGCCCAAATCCCTCATAATAGG-3’；
Primer2下游引物：5’- CGGGATTC CTATGGGTGCTTCCTCAGTT-3’。
2、以Metarhizium robertsii ARSEF 23基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因片段MAA_05394 (Gene ID:19259680)，反应条件为：95℃，5 min；(95℃ 30 s，60℃60s，72℃1.5min，30个循环)；72℃，10 min。纯化扩增出的MAA_05394基因（参照Takara DNA片段纯化试剂盒说明书）和克隆质粒pet28a（购自Takara公司）分别用EcoR I和bamHI双酶切、连接转化至DH5α感受态细胞（购自Takara公司），使用EcoR I和bamHI双酶切鉴定重组质粒pet28a-phzM，得到大小为1000 bp左右的条带，酶切结果表明，重组质粒pet28a-phzM构建成功，获得重组质粒pet28a-phzM。
3、将步骤2）的表达载体通过低能离子束介导技术导入大肠杆菌：取已培养好的大肠杆菌BL21用无菌水制成浓度大约为1×106个/mL 孢子悬浮液；取100μL孢子悬浮液加入50μL步骤2）构建的重组质粒pet28a-phzM，均匀涂布到无菌空平板上，以无菌风吹干，在能量为18 Kev，注入剂量为170×1014ions/cm2，靶室真空度为1.6×10-3Pa进行氮离子注入介导，注入完毕后，在无菌环境下用1ml 无菌水进行洗脱；取洗脱液50μL在无菌条件下均匀涂布到加入50ug/ml的卡那霉素平板培养基上，在37℃下培养12-24小时，即可获得重组大肠杆菌。
实施例2
从实施例1选择性培养基上挑取三个单菌落，分别记为S1~S3，其形态学及生理化学特性：
菌落形态：光滑、圆润、有光泽、乳白色、圆形或椭圆形；需氧方式：异养兼性厌氧型；菌落大小：0.5～3μm；生长温度：28-37℃；最适pH 为7.0-7.2；菌落形态：短杆；革兰氏染色为阴性。
传代发酵试验结果见表1
表1 重组大肠杆菌的遗传稳定性
从遗传稳定性实验结果分析可知，经过6次传代试验，重组大肠杆菌发酵产辅酶I基本稳定，具有很好的遗传稳定性，可以作为进一步研究和开发产业化菌株。
实施例3
本实例说明通过加入特异性底物和表面活性剂发酵辅酶I的生产工艺
从实施例1选择性培养基上挑取十个单菌落，分别记为A1~10，将该十个菌株分别接种到4mL含50ug/ml的卡那霉素LB培养基中，37℃，200rpm，培养4小时后按1%（v/v）接种量接入发酵培养基中，发酵培养基为葡萄糖50g/l，酵母膏5 g/l，氯化钠2 g/l，硫酸镁1 g/l，磷酸二氢钾1 g/l，磷酸氢二钠1 g/l，烟酰胺1 g/l、腺嘌呤2 g/l，pH=7.0-7.2，摇瓶装液量20%，摇床转速为200r/min，发酵温度32℃，当OD600在0.6-0.8时加入终浓度为0.5mM IPTG诱导培养12-16h，后加入终浓度为4 g/l十二烷基苯磺酸钠，继续培养8h，测定发酵液中辅酶I的含量达到，结果见表2。
表2
| 菌株 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 | A9 | A10 |
| 产量（g/L） | 10.33 | 10.58 | 10.39 | 10.98 | 10.83 | 10.47 | 10.21 | 10.27 | 10.23 | 10.95 |
实施例4 本实施例说明基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌的方法
本实施例步骤1）~2）同实施例1，区别仅在于步骤3），具体为：
将步骤2）的表达载体通过低能离子束介导技术导入大肠杆菌：取已培养好的感受态大肠杆菌BL21用无菌水制成浓度大约为1×106个/mL 孢子悬浮液；取100μL孢子悬浮液加入50μL步骤2）构建的重组质粒pet28a-phzM，均匀涂布到无菌空平板上，以无菌风吹干，在能量为16 Kev，注入剂量为120×1014ions/cm2，靶室真空度为1.2×10-3Pa进行氮离子注入介导，注入完毕后，在无菌环境下用1ml 无菌水进行洗脱；取洗脱液50μL在无菌条件下均匀涂布到加入50ug/ml的卡那霉素平板培养基上，在37℃下培养12-24小时，即可获得重组大肠杆菌。
实施例5
本实例说明通过加入特异性底物和表面活性剂发酵辅酶I的生产工艺
从实施例4选择性培养基上挑取十个单菌落，分别记为B1~10，将该十个菌株分别接种到4mL含50ug/ml的卡那霉素LB培养基中，37℃，200rpm，培养4小时后按1%（v/v）接种量接入发酵培养基中，发酵培养基为葡萄糖50g/l，酵母膏5 g/l，氯化钠2 g/l，硫酸镁1 g/l，磷酸二氢钾1 g/l，磷酸氢二钠1 g/l，烟酰胺1 g/l、腺嘌呤2 g/l，pH=7.0-7.2摇瓶装液量20%，摇床转速为200r/min，当当OD600在0.6-0.8时将温度转为32℃，并加入终浓度为0.5mMIPTG诱导培养12-16h后加入终浓度为4 g/l十四烷基苯磺酸钠，继续培养6h，测定发酵液中辅酶I的含量达到，结果见表3。
表3：
| 菌株 | B1 | B2 | B3 | B4 | B5 | B6 | B7 | B8 | B9 | B10 |
| 产量（g/L） | 10.58 | 9.97 | 8.58 | 9.88 | 9.59 | 10.52 | 9.63 | 9.91 | 9.41 | 10.42 |
实施例6
本实例说明重组菌在5L发酵罐中发酵产辅酶I
从实施例4选择性培养基上挑取十个单菌落，分别记为C1~10，将该十个菌株分别接种到4mL含50ug/ml的卡那霉素LB培养基中，37℃，200rpm，培养4小时后按1%（v/v）接种量接入5L发酵罐中，发酵培养基为葡萄糖50g/l，玉米浆8g/l，氯化铵4g/l，氯化钠0.8 g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，磷酸氢二钠1 g/l，烟酰胺3 g/l、腺嘌呤2 g/l，pH=7.0-7.2，发酵罐转速300rpm，37℃培养，当OD600在0.6-0.8时将温度转为32℃，并加入终浓度为0.5mM IPTG诱导培养12-16h后加入终浓度为5 g/l十二烷基苯磺酸钠，继续培养6h，测定发酵液中辅酶I的含量达到，结果见表4。
表4
| 菌株 | C1 | C2 | C3 | C4 | C5 | C6 | C7 | C8 | C9 | C10 |
| 产量（g/L） | 9.89 | 8.93 | 8，92 | 9.24 | 10.28 | 10.01 | 8.77 | 9.82 | 9.21 | 8.93 |
实施例7
本实例说明CaCl2法转化质粒构建的重组大肠杆菌及其发酵产辅酶I
挑取E.coli BL21单菌落接种至有50ml LB液体培养基的三角瓶中，37℃震荡培养2小时（摇床转速250r/min）。吸取1.4ml菌液至Eppendorf管于7000g离心2min，弃上清，并倒置于吸水纸上，重复三次。将细菌悬浮于1ml预冷的0.1MCaCl2溶液中，置冰浴10min。7000g离心2min，弃上清，收集菌体。将菌体重悬于200μl预冷的0.1M CaCl2 溶液，冰浴30min。每管加入质粒DNA 50ng/10μl，轻轻混匀，冰浴放置20min，设一不加质粒DNA的对照。将管置于42℃水浴中2min，迅速转移至冰浴2min。加入800μl LB液体培养基，37℃培养45min后接种到含100μg/ml卡那霉素的LB冷平板上。将平板倒置入37℃恒温培养箱培养过夜，即可获得重组大肠杆菌。
随机挑取CaCl2法转化质粒构建的重组大肠杆菌的一个单菌落，接种到4mL含50ug/ml的卡那霉素LB培养基中，37℃，200rpm，培养4小时后按1%（v/v）接种量接入发酵培养基中，发酵培养基为葡萄糖50g/l，酵母膏5 g/l，氯化钠2 g/l，硫酸镁1 g/l，磷酸二氢钾1 g/l，磷酸氢二钠1 g/l，烟酰胺1 g/l、腺嘌呤2 g/l和十二烷基苯磺酸钠4 g/l，pH=7.0-7.2摇瓶装液量20%，摇床转速为200r/min，当OD600在0.6-0.8时加入终浓度为0.5mM IPTG诱导培养，培养温度37℃，发酵12-18h，加入终浓度为4 g/l十二烷基苯磺酸钠，继续培养8h，测定发酵液中辅酶I的含量达到4.57g/L。与离子束介导技术构建重组大肠杆菌的方法相比，辅酶I产量大大降低。
<110> 南京工业大学
<120> 基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cggaattcat gcccaaatcc ctcataatag g 31
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgggattcct atgggtgctt cctcagtt 28
Claims (7)
1.一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将烟酰胺核苷激酶基因，连接到载体上，构建表达载体；
2）将步骤1）的表达载体通过低能离子束介导技术导入大肠杆菌；所述低能离子束介导的能量为14~18KeV，剂量为（80~200）×1014ions/cm2，靶室真空度为（1.0~2.0）×10-3Pa；所述离子为氮离子；
3）利用选择性培养基进行重复筛选，获得可以表达烟酰胺核苷激酶的重组大肠杆菌；
4）将重组大肠杆菌接种到发酵培养基中发酵生产辅酶I。
2.根据权利要求1所述的一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法，其特征在于，步骤1）所述烟酰胺核苷激酶基因为罗伯茨绿僵菌（Metarhizium robertsii） ARSEF 23的NRK基因片段MAA_05394，所述载体为pet28a。
3.根据权利要求1所述的一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法，其特征在于，步骤3）选择性培养基是在LB培养基中加入50ug/ml的卡那霉素。
4.根据权利要求1所述的一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法，其特征在于，步骤4）中发酵培养基包含按质量百分比的如下组分：碳源2-6%、氮源 0.5-1%，无机盐0.01-0.1%，生长因子0.1-0.4%，余量为水，pH=7.0-7.2，其中碳源为葡萄糖、蔗糖和甘油中的至少一种；氮源为酵母膏、玉米浆、蛋白胨和氯化铵中的至少一种；无机盐为氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠中的至少一种；生长因子为腺嘌呤或烟酰胺中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法，其特征在于，步骤4）接种量为1-5%(V/V)，发酵培养的温度为28-34℃，摇床转速为200-250r/min。
6.根据权利要求5所述的一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法，其特征在于，步骤4）中接种后检测OD在0.6-0.8时加入终浓度为0.5mM IPTG诱导培养12-16h，然后加入终浓度为0.2-0.5%表面活性剂，继续培养4-8h，其中表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠、十四烷基苯磺酸钠和十六烷基苯磺酸钠中的一种。
7.根据权利要求1所述的一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法，其特征在于，步骤2）中离子束介导的能量为18KeV，剂量170×1014ions/cm2，靶室真空度为1.6×10-3Pa。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610009811.7A CN105463007B (zh) | 2016-01-08 | 2016-01-08 | 基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶i的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610009811.7A CN105463007B (zh) | 2016-01-08 | 2016-01-08 | 基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶i的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105463007A CN105463007A (zh) | 2016-04-06 |
| CN105463007B true CN105463007B (zh) | 2018-07-31 |
Family
ID=55601163
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610009811.7A Active CN105463007B (zh) | 2016-01-08 | 2016-01-08 | 基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶i的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105463007B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021220209A1 (en) | 2020-04-30 | 2021-11-04 | Dyadic International (Usa), Inc. | Nicotinamide riboside production in filamentous fungi |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101029315A (zh) * | 2006-03-01 | 2007-09-05 | 新疆大学 | 离子束介导麻黄总dna在酵母菌中的转化及获得转基因酵母工程菌 |
| CN104277989A (zh) * | 2014-09-25 | 2015-01-14 | 虞龙 | 一株面包酵母及其在发酵生产辅酶i中的应用 |
| CN104480170A (zh) * | 2014-12-20 | 2015-04-01 | 郁庆明 | 氧化型辅酶i制备方法 |
-
2016
- 2016-01-08 CN CN201610009811.7A patent/CN105463007B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101029315A (zh) * | 2006-03-01 | 2007-09-05 | 新疆大学 | 离子束介导麻黄总dna在酵母菌中的转化及获得转基因酵母工程菌 |
| CN100562577C (zh) * | 2006-03-01 | 2009-11-25 | 新疆大学 | 离子束介导麻黄总dna在酵母菌中的转化及获得转基因酵母工程菌 |
| CN104277989A (zh) * | 2014-09-25 | 2015-01-14 | 虞龙 | 一株面包酵母及其在发酵生产辅酶i中的应用 |
| CN104480170A (zh) * | 2014-12-20 | 2015-04-01 | 郁庆明 | 氧化型辅酶i制备方法 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| Characteristics of heavy ion beam-bombarded bacteria E. coli and induced direct DNA transfer;B Phanchaisri 等;《Surface and Coatings Technology》;20020930;第624-629页 * |
| Metarhizium robertsii ARSEF 23 MAA_Scf_2, whole genome shotgun sequence;Hu, X. 等;《GenBank Database》;20150226;Accession No. NW 011942160 * |
| 低能离子注入介导Vc前体(2-KLG)产生菌DNA的转导;虞龙 等;《核技术》;20040430;第27卷(第4期);第264-268页 * |
| 低能离子注入介导外源DNA转化的原理与应用;黄国伟 等;《基因组学与应用生物学》;20090831;第28卷(第4期);第815-820页 * |
| 离子束介导DNA大分子遗传转化的研究;樊永红 等;《生物技术》;20040620;第14卷(第3期);第65-67页 * |
| 离子注入介导外源基因转导研究综述;周剑 等;《化学与生物工程》;20050331;第22卷(第3期);第1-3页 * |
| 重组大肠杆菌产NAD激酶发酵条件的优化研究;侯堃 等;《工业微生物》;20150630;第45卷(第3期);第41-47页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105463007A (zh) | 2016-04-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10968424B2 (en) | Bacillus subtilis strain, culture method and use thereof | |
| CN102453691B (zh) | 高产l-色氨酸的大肠杆菌工程菌 | |
| CN105886431A (zh) | 一株谷氨酸棒状杆菌及其高产异亮氨酸的方法 | |
| CN105755062B (zh) | 一种利用氧化还原电位调控发酵过程生产长链二元酸的方法 | |
| CN103249832B (zh) | 同时利用蔗糖和甘油的新的产琥珀酸突变微生物和利用其生产琥珀酸的方法 | |
| CN105420154A (zh) | 双基因敲除重组红球菌、构建方法及其应用 | |
| CN103881954A (zh) | 一株产γ-聚谷氨酸基因工程菌及其高产γ-聚谷氨酸方法 | |
| CN104593308A (zh) | 一种基因工程菌及其构建方法和在生产木糖醇中的应用 | |
| CN104845896B (zh) | 生产威兰胶的菌株及方法 | |
| CN110499345A (zh) | 一种维生素k2(MK-7型)的发酵方法 | |
| CN104046586B (zh) | 一株基因工程菌及其在生产(2r,3r)-2,3-丁二醇中的应用 | |
| CN102533626A (zh) | 利用葡萄糖产丁二酸的基因工程菌株及其发酵产酸方法 | |
| CN104988172A (zh) | 一种高产间苯三酚基因工程菌的构建方法及应用 | |
| CN104726381A (zh) | 一株产l-赖氨酸的菌株及其生产l-赖氨酸的方法 | |
| CN107227283A (zh) | 一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用 | |
| CN110093298A (zh) | 酯香微杆菌mcda02及其产几丁质脱乙酰酶的方法 | |
| CN105463007B (zh) | 基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶i的方法 | |
| CN104152483A (zh) | argJ基因在发酵生产L-瓜氨酸中的应用 | |
| CN111621454B (zh) | 基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及ε-聚赖氨酸的生产方法和应用 | |
| CN102776245A (zh) | 一种1,3-丙二醇的制备方法 | |
| CN104531798A (zh) | 一种提高四烯大环内酯类抗生素产量的方法 | |
| CN106636238A (zh) | 一种微生物利用酒糟发酵生产γ‑氨基丁酸的方法 | |
| CN101864389A (zh) | 一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其筛选方法和应用 | |
| CN104611284A (zh) | 一种环糊精葡萄糖基转移酶生产菌株及其应用 | |
| CN104109651A (zh) | 利用l-乳酸合成s-1,2-丙二醇的重组大肠杆菌及其构建方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20160720 Address after: 211816 Jiangsu, Nanjing, Pu Pu Road, Pukou District No. 30 Applicant after: Yu Long Applicant after: Du Yuying Address before: 211816 Jiangsu, Nanjing, Pu Pu Road, Pukou District No. 30 Applicant before: Nanjing Tech University |
|
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20180619 Address after: 215000 Bamboo Garden Road, Suzhou high tech Zone, Jiangsu Province, No. 209 Applicant after: SUZHOU ZHIHUI BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Address before: 211816 Puzhu South Road, Pukou District, Nanjing, Jiangsu Province, No. 30 Applicant before: Yu Long Applicant before: Du Yuying |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20211103 Address after: 215107 No. 1269, Xinzhou highway, Lili Town, Wujiang District, Suzhou City, Jiangsu Province Patentee after: Changzhou Biotechnology (Jiangsu) Co.,Ltd. Address before: 215000 Bamboo Garden Road, Suzhou high tech Zone, Jiangsu Province, No. 209 Patentee before: SUZHOU ZHIHUI BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |