CN100562577C

CN100562577C - 离子束介导麻黄总dna在酵母菌中的转化及获得转基因酵母工程菌

Info

Publication number: CN100562577C
Application number: CNB2006100114027A
Authority: CN
Inventors: 毛培宏; 娄恺; 金湘�; 王志方; 魏东; 张军
Original assignee: INSTITUTE OF MICROBIOLOGY XINJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES; Xinjiang University
Current assignee: INSTITUTE OF MICROBIOLOGY XINJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES; Xinjiang University
Priority date: 2006-03-01
Filing date: 2006-03-01
Publication date: 2009-11-25
Anticipated expiration: 2026-03-01
Also published as: CN101029315A

Abstract

本发明提供一种将麻黄总DNA转化入酵母菌的方法，由该方法所获得的转基因酵母菌。同时，本发明还提供了一种分离上述转基因酵母菌的培养基和培养上述转基因酵母菌的液体培养基。

Description

离子束介导麻黄总DNA在酵母菌中的转化及获得转基因酵母工程菌

技术领域

本发明涉及借助离子束介导活性裸露DNA大分子的遗传转化的技术领域。具体的说，本发明涉及离子注入介导麻黄总DNA在酵母菌中的遗传转化方法，及通过遗传转化获得产麻黄碱和伪麻黄碱的转基因酵母工程菌株。

背景技术

药用植物含有的有效成分大多为其次生代谢产物，一般由多基因控制，在目前还不完全了解其遗传背景的情况下，尚无法构建目的基因的质粒载体。因此进行药用植物总DNA的遗传转化研究具有重要的理论和实践意义。近年来，植物总DNA转化技术有了很大进展，特别是借助离子束介导活性裸露DNA大分子的遗传转化已成为引人注目的一个新的研究方向。

中国科学院离子束生物技术重点实验室用离子束介导法将碳4循环紫玉米的总DNA导入水稻品种早籼213，获得了一批稳定遗传的变异株系，不仅根系发达，而且在茎干等部位表现出供体玉米的紫色性状[见参考文献1]。

河南省离子束生物技术重点实验室用离子束介导法将两个大豆品种的总DNA分别导入两个小麦栽培品种皖9210和扬麦5号，获得了两个高蛋白小麦株系[见参考文献2]。

安徽省农业科学院用离子束介导法将抗枯萎病的比克氏棉DNA导入泗棉2号，获得了抗病棉花新品系[见参考文献3]；离子束介导红麻总DNA转入棉花获得11个优良株系，具有高抗枯萎病性能[见参考文献3]。

在天然药物研究方面，中国科学院离子束生物技术重点实验室用离子束介导法将银杏总DNA导入西瓜品种3-16和SR2-14-2中，银杏内酯在西瓜品种3-16和SR2-14-2的转化当代叶片中的表达量分别为17.0756μg/g和45.9998μg/g；有银杏内酯表达的两个月龄西瓜叶片超氧化物岐化酶活性，表明了供体植物银杏的多个基因在受体植物西瓜中的得到了表达[见参考文献4]。

在维生素C的微生物发酵生产中，氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)必须依赖巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)提供代谢产物来维持其正常生产和产酸，而产酸所必需的两种脱氢酶以及相应的糖酸转运系统只存在于G.oxydans中。中国科学院离子束生物技术重点实验室用离子束介导法将B.megaterium总DNA导入G.oxydans，获得了能单独生长和产酸的G.oxydans基因工程菌[见参考文献5]。

而酵母菌与人类的关系源远流长，早在八千年前，人们就会利用酵母菌来制作面包、酿造葡萄酒、啤酒和清酒等。到20世纪末，酵母菌已作为一种模式生物在生物化学、遗传学和分子生物学研究等方面担任了重要的角色。酵母菌作为单细胞低等真核生物，具有易培养、繁殖快、便于基因操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒物质等特性，已成为外源基因表达的合适宿主。

荒漠药用植物麻黄(Ephedra sp.)含有特殊的生物碱-麻黄碱(l-ephedrine)和伪麻黄碱(d-pseudoephedrine)，具有很高的药用价值，不仅是驰名中外的传统药材，还是重要的蓄水保土、防风固沙的荒漠旱生灌木植物，对维持干旱半干旱荒漠地区的生态平衡具有显著作用。麻黄种群所处生境十分恶劣，在自然条件下荒漠地区的麻黄种子很难萌发，在麻黄生长区，很少见到麻黄的实生苗。所以，野生的麻黄挖一棵就少一棵，很难恢复。长期的人为的掠夺式采挖，已严重破坏了干旱半干旱地区本来就很脆弱的生态平衡，不少草地和荒漠已遭到了严重破坏，加剧了生态环境恶化，致使风沙满天、水土流失、沙进人退。据有关专家预测，未来几年国内外医药市场对麻黄碱和伪麻黄碱的需求量每年可达1800～2000吨，而提取1吨麻黄碱就需消耗掉200吨野生麻黄。因此，创建麻黄总DNA大分子在酵母菌中的遗传转化方法，获得产麻黄碱和伪麻黄碱的酵母工程菌株，将为实现微生物发酵生产麻黄碱和伪麻黄碱奠定基础，将对中国干旱半干旱荒漠地区生态环境的保护和民族制药业的发展产生深远的影响。

麻黄碱和伪麻黄碱是荒漠药用植物麻黄的主要次生代谢产物，它们的分子式、分子量均相同，只是空间结构不同，具体的是位于C原子上的羟基的位置不同，因此，麻黄碱和伪麻黄碱互为同分异构体，麻黄碱又称“左旋麻黄碱”，伪麻黄碱又称“右旋麻黄碱”。麻黄碱在某种消旋酶的作用下，可转变为伪麻黄碱。但它们的生物合成途径不清，遗传背景不详。因此，就无法按照常规的基因工程方法构建产麻黄碱和伪麻黄碱的工程菌。加之，麻黄的基因组很大，更无人尝试其在微生物中的遗传转化方法，即使借助离子束介导，也只是植物与植物、微生物与微生物之间的总DNA遗传转化的探索。很难想象，比微生物基因组大许多倍的药用植物基因组如何能在微生物中遗传转化。

本发明首次实现了药用植物-麻黄总DNA在酵母菌中的转化。成功转化麻黄基因组DNA的酵母菌可产生麻黄碱和/或伪麻黄碱。若转基因酵母菌株只产生麻黄碱，而不产生伪麻黄碱，说明控制这种消旋酶的基因未转入受体，或者转入了受体而失去了功能；若转基因酵母菌株只产生伪麻黄碱，而不产生麻黄碱，说明控制这种消旋酶的基因已转入受体，并且活性很强；若转基因酵母菌株既产生麻黄碱，又产生伪麻黄碱，说明控制这种消旋酶的基因已转入受体，但其活性不强，否则，所有的麻黄碱均转变为伪麻黄碱。因此，只要是转基因菌株产麻黄碱，不论其是否产伪麻黄碱，均证明转化植物总DNA基因组的成功。

发明内容

针对国内外药用植物总DNA在微生物中遗传转化存在的上述技术难题，本发明的目的是提供一种荒漠药用植物麻黄的总DNA在酵母菌中的转化方法，从而获得产麻黄碱和伪麻黄碱的转基因酵母工程菌株。

本发明提供了一种荒漠药用植物麻黄的总DNA在酵母菌中的转化方法。

同时，本发明还提供了产麻黄碱和伪麻黄碱的转基因酵母工程菌株，这些菌株都是通过利用本发明的遗传转化方法而获得。

具体地，本发明提供了一种荒漠药用植物麻黄的总DNA在酵母菌中的遗传转化方法，具体步骤如下：

1、采集药用植物麻黄，提取纯度A₂₆₀/A₂₈₀为1.8±0.1总DNA，并在琼脂糖电泳中呈单一区带；

2、将酵母菌的菌种斜面接入麦芽汁培养液中，置旋转式摇床培养8小时-12小时，以可溶性淀粉和葡萄糖溶液(淀粉及葡萄糖的浓度分别为0.1-1.0重量％)作为保护稀释液，将菌液稀释至1.0×10⁷CFU/mL-1.0×10⁸CFU/mL。取稀释液0.1mL，均匀涂布于无菌平皿中央，无菌风吹干制成菌膜。备选地，也可取培养8小时-12小时的酵母菌斜面菌种1～2环悬浮于浓度为200μg/mL-800μg/mL麻黄总DNA的TE缓冲液中，使菌体浓度达到1.0×10⁷CFU/mL-1.0×10⁸CFU/mL，使菌体分散，取0.1mL均匀涂布于无菌平皿中央，无菌风吹干制成菌膜；

3、将菌膜置于离子注入机靶台上，采用剂量为10.0×10¹⁵ions/cm²-20.0×10¹⁵ions/cm²的Ar+、N+、C+、O+或H+，优选Ar+或N+在真空状态下，以5s-10s脉冲方式分别注入不同的酵母菌菌体，本领域的普通技术人员可以根据需要无需创造性的劳动确定注入所采用的能量，优选为10KeV-20KeV；

4、离子注入结束后，立即用浓度为200μg/mL-800μg/mL麻黄总DNA的TE缓冲液浸泡离子注入后的菌膜，温育2小时后，洗脱(其中所谓的菌膜，是紧贴于平皿表面的一层含有微生物细胞的薄膜，无菌分吹干后，此菌膜就被固定在平皿表面。离子注入后，加入含DNA的TE缓冲液，是让DNA进入被离子注入过的细胞，但TE缓冲液并不能完全将菌膜从平皿上洗脱下来，因此，用无菌玻璃刮铲反复涂抹平皿，使菌膜脱离平皿，并充分与TE缓冲液混合，所得液体在离子束生物技术领域称为洗脱液)2min，获得洗脱液，并将洗脱液均匀涂布于分离平板，每一个分离平板可涂布0.1mL洗脱液，倒置，培养72小时，获得产麻黄碱和/或伪麻黄碱的转基因酵母工程菌株。

本发明同时提供了转基因酵母工程菌菌株，通过利用荒漠药用植物麻黄的总DNA在酵母菌中的遗传转化方法，实现荒漠药用植物麻黄的总DNA在酵母菌中的遗传转化，从而获得产麻黄碱和伪麻黄碱的转基因酵母工程菌株。

本发明所用酵母菌选自，但不限于汉逊酵母属(Hansenula)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)和红酵母属(Rhodotorula)。具体地，选自异常汉逊酵母(Hansenula anomala)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)，树状假丝酵母(Candida arborea)，热带假丝酵母(Candida tropicalis)，深红酵母(Rhodotorula rubra)，粘红酵母(Rhodotorula glutinis)。

具体地，一方面，本发明提供了一种转基因酵母工程菌株的菌株，命名为0451，其主要次生代谢产物为麻黄碱。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，邮编：100080。保藏日期是2005年10月20日，保藏号是CGMCC.No.1499。根据受体菌的来源，0451菌为异常汉逊酵母(Hansenula anomala)。可采用如下方法对其进行保存：采用常规的斜面传代保存法，此方法是将本发明菌种接种于只要适合于酵母菌生长的斜面培养基表面，常规培养和保存即可。或是利用真空冷冻干燥法将本发明菌种制成干粉菌种，低温或常温保藏即可。

另一方面，本发明提供了一种转基因酵母工程菌菌株，命名为1179，其主要次生代谢产物为麻黄碱和伪麻黄碱。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，邮编：100080。保藏日期是2005年10月20日，保藏号是CGMCC.No.1500。根据受体菌的来源，1179菌为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。可采用上述保存0451菌的方法对其进行保存。

再一方面，本发明提供了一种转基因酵母工程菌菌株，命名为3161，其主要次生代谢产物为麻黄碱和伪麻黄碱。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，邮编：100080。保藏日期是2005年10月20日，保藏号是CGMCC.No.1501。根据受体菌的来源，3161菌为发酵毕赤酵母(Pichiafermentans)。可采用上述保存0451菌的方法对其进行保存。

从如上转基因酵母工程菌的培养液中采集产物，可如下进行转基因酵母菌产麻黄碱和伪麻黄碱的定性和定量检测。即转基因酵母工程菌液体培养结束后，离心，收集培养液，测定转基因酵母胞外麻黄碱和伪麻黄碱含量；收集菌体，冰融破壁，离心，弃细胞碎片，收集上清液，测定转基因酵母胞内麻黄碱和伪麻黄碱含量。其中定性检测通过铜铬盐反应进行，定量检测通过高压液相色谱(HPLC)进行。

培养液或上清液中麻黄碱的铜铬盐定性检测：分别取上述培养液或上清液1mL，加入硫酸铜试剂1滴，再加氢氧化钠试液1滴，含麻黄碱的培养液或上清液显蓝紫色；再加入1mL乙醚，振摇后放置分层，醚层显紫红色，水层变为红色。通过对转基因酵母菌株培养液进行铜铬盐反应，其反应为阳性，表明转基因酵母菌发酵液中含有麻黄碱。伪麻黄碱的定性检测同样进行。同时具备上述两种颜色反应，即表示为阳性，表示培养液或上清液中含有麻黄碱或(和)伪麻黄碱。见[参考文献6]。

培养液或上清液中麻黄碱和伪麻黄碱的高压液相色谱(HPLC)定量检测方法：应用美国产Waters 1525pump高压液相色谱仪，UV2487双通道紫外检测器，检测波长(λ)210nm，Kromasil 100-5C18色谱柱(4.6mm×150mm)，Breeze 3.30色谱工作站。流动相：0.02M KH₂PO₄∶乙晴＝95∶5；流量：1.2mL/min。

酵母菌胞内的麻黄碱和伪麻黄碱的定性及定量检测同上。

本发明还提供一种分离转化麻黄总DNA的酵母的培养基，其由下述成分组成：葡萄糖5.0％～15.0％，酵母膏粉0.5％～1.5％，硝酸钠0.5％～1.5％，硫酸镁0.05％～0.1％，磷酸氢二钾0.05％～0.1％，用氢氧化钠调pH至7.0后，再加入溴百里香酚兰0.02％，琼脂1.5％～2.0％，余量为水。上述百分比为重量百分比。通过该分离培养基，可以分离出成功转化麻黄总DNA的酵母菌。

本发明还提供一种培养转化麻黄总DNA的酵母的培养基，其由下述成分组成：葡萄糖5.0％～15.0％，酵母膏粉0.5％～1.5％，硝酸钠0.5％～1.5％，硫酸镁0.05％～0.1％，磷酸氢二钾0.05％～0.1％，用氢氧化钠调pH至7.0，余量为水。利用该培养基，可以获得高产率的成功转化麻黄总DNA的酵母菌，其中酵母菌培养液中麻黄碱的产率高达2.93mg/L。上述百分比为重量百分比。从而可以实现利用酵母菌高产量获得麻黄碱或伪麻黄碱。

通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果：利用本发明的方法，有效克服了由于植物基因组DNA很大使得难以实现其在微生物中遗传转化的技术难题。本发明充分利用酵母菌具有易培养、繁殖快、便于基因操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒物质等特性，获得产麻黄碱和伪麻黄碱的酵母工程菌株，可实现微生物发酵生产麻黄碱和伪麻黄碱的目的。

附图说明

图1：所示为转基因酵母菌在分离平板上的生长情况。

图2：所示为转基因酵母菌株0451的HPLC色谱图。

图3：所示为转基因酵母菌株1179的HPLC色谱图。

图4：所示为转基因酵母菌株3161的HPLC色谱图。

图5：所示为麻黄总DNA琼脂糖电泳图。

申请人于2005年10月20日将转基因酵母菌株保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，邮编：100080。保藏号分别是CGMCC.No.1499(菌株0451)、CGMCC.No.1500(菌株1179)和CGMCC.No.1501(菌株3161)。

具体实施方式

下面，通过参考实施例详细描述本发明，但是，本领域的普通技术人员可以理解的是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，则％皆指重量百分比。

其中，分离平板培养基配方如下：

葡萄糖5.0％～15.0％，酵母膏粉0.5％～1.5％，硝酸钠0.5％～1.5％，硫酸镁0.05％～0.1％，磷酸氢二钾0.05％～0.1％，用氢氧化钠调pH至7.0后，再加入溴百里香酚兰0.02％，琼脂1.5％～2.0％，余量为水。分装，121℃灭菌15min。

斜面培养基配方如下：

葡萄糖5.0％～15.0％，酵母膏粉0.5％～1.5％，硝酸钠0.5％～1.5％，硫酸镁0.05％～0.1％，磷酸氢二钾0.05％～0.1％，琼脂1.5％～2.0％，用氢氧化钠调pH至7.0，余量为水。分装试管，121℃灭菌15min。

液体培养基配方如下：

葡萄糖5.0％～15.0％，酵母膏粉0.5％～1.5％，硝酸钠0.5％～1.5％，硫酸镁0.05％～0.1％，磷酸氢二钾0.05％～0.1％，用氢氧化钠调pH至7.0，余量为水。分装三角瓶，四层纱布和两层牛皮纸封口，121℃灭菌15min。

本实施例中的斜面培养基，最重要的功能是转接菌种，其次是保证菌种在传代时保持稳定遗传，因此，在各实施例中均保持其成分不变。

而分离平板培养基对于获得转基因酵母是关键的，而液体培养基对获得高产率的麻黄碱或伪麻黄碱是关键的。从液体培养基的组成可以看出，转基因酵母是以葡萄糖为碳源、NaNO₃为氮源合成麻黄碱和/或伪麻黄碱的。

实施例1：麻黄总DNA的导入和转化获得异常汉逊酵母工程菌0451

(1)、药用植物麻黄的采集、总DNA的制备

使用蓝麻黄(Ephedra glauca)样品10倍量的变色硅胶(产地：上海)与带鳞片状三角形叶片的蓝麻黄嫩枝(采自新疆雅玛里克山荒漠区)共同放入密封袋中，室温下保证12小时内干燥，如果发现硅胶已从深蓝色变为粉红色，就及时更换，回到实验室后立即将干燥好的蓝麻黄材料密封放在干燥器中保存。

蓝麻黄材料经液氮速冻后，加石英砂共研，采用CTAB法(见参考文献7)提取总DNA。紫外分光光度计检测DNA的纯度A₂₆₀/A₂₈₀为1.8，并在琼脂糖电泳中呈单一区带(附图5a)。

(2)、酵母菌细胞的处理

将异常汉逊酵母(Hansenula anomala)的菌种(购于北京：中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为2.340)斜面接入麦芽汁培养液(见参考文献8)中，置旋转式摇床230r/min、30℃培养12小时。以0.5％可溶性淀粉(国产，分析纯)和0.5％葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O，国产，分析纯)作为保护稀释液(保护稀释液的配制方法：在100mL蒸馏水中加入0.5g可溶性淀粉和0.5g葡萄糖，装入300mL三角瓶中，塞棉塞，121℃灭菌15min)，对酵母菌培养液进行稀释。取浓度为1.0×10⁷CFU/mL的菌体稀释液0.1mL，用无菌玻璃刮铲均匀涂布于直径为90mm的无菌平皿中央，无菌风吹干制成菌膜，置于IBB-Device1型(产地：合肥，中国科学院等离子体物理研究所制造)或LZD1000型离子注入机(产地：成都，原核工业部西南物理研究院制造)小真空靶室的无菌靶台上进行氩离子(Ar⁺)或氮离子(N⁺)注入。(注入条件见(3)、离子注入)

另外，取30℃培养12小时的酵母菌的斜面菌种2环悬浮于浓度为300μg/mL的蓝麻黄总DNA的TE缓冲液中，使菌体浓度达到1.0×10⁸CFU/mL，轻摇使菌体分散，取0.1mL用无菌玻璃刮铲均匀涂布于直径为90mm的无菌平皿中央，无菌风吹干制成菌膜，置于IBB-Device1型或LCD1000型离子注入机小真空靶室的无菌靶台上进行氩离子(Ar⁺)或氮离子(N⁺)注入。(注入条件见(3)、离子注入)

(3)、离子注入

采用能量15KeV、剂量15.0×10¹⁵ions/cm²的Ar⁺或N⁺在10^-3Pa真空状态下，以8s脉冲方式注入酵母菌菌体。

(4)、麻黄总DNA的导入和转化

上述两种菌体离子注入结束后，分别立即用2mL浓度为400μg/mL的蓝麻黄总DNA的TE缓冲液浸泡离子注入后的菌膜，30℃培育2小时后，用无菌玻璃刮铲反复洗脱2min，获得洗脱液。洗脱液用无菌玻璃刮铲均匀涂布于分离平板，每一个分离平板可涂布0.1mL洗脱液，倒置，于30℃培养72小时。转基因酵母在分离平板上的生长情况如图1(a)所示。其中分离平板培养基的组成如下：葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O，国产，分析纯)10.0％，酵母膏粉(Sigma产，生化试剂)0.5％，硝酸钠(NaNO₃，国产，分析纯)1.0％，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O，国产，分析纯)0.05％，磷酸氢二钾(K₂HPO₃·3H₂O，国产，分析纯)0.1％，用氢氧化钠(国产，分析纯)调pH至7.0后，再加入溴百里香酚兰(BTB，国产，指示剂)0.02％，琼脂(国产，生化试剂)1.8％，分装，121℃灭菌15min，倾倒平板。每个直径为90mm的无菌平皿倾倒分离平板培养基20mL。

(5)、转基因酵母菌的培养

将转化后在分离平板上生长的酵母菌菌落分别接入斜面培养基，30℃培养72小时。再分别接入液体培养基，置旋转式摇床230r/min、30℃培养72小时。其中液体培养基的组成如下：葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O，国产，分析纯)10.0％，酵母膏粉(Sigma产，生化试剂)0.5％，硝酸钠(NaNO₃，国产，分析纯)1.0％，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O，国产，分析纯)0.05％，磷酸氢二钾(K₂HPO₃·3H₂O，国产，分析纯)0.1％，用氢氧化钠调pH至7.0，分装三角瓶，四层纱布和两层牛皮纸封口，121℃灭菌15min。

(6)、转基因酵母菌产麻黄碱和伪麻黄碱的定性和定量检测

液体培养结束后，3500r/min离心10min，收集培养液，测定转基因酵母胞外麻黄碱含量；收集菌体，冰融破壁，3500r/min离心15min，弃细胞碎片，收集上清液，测定转基因酵母胞内麻黄碱含量。

将获得的两种转基因酵母菌株培养液分别进行铜铬盐反应：取上述培养液1mL，加入硫酸铜试剂1滴，再加氢氧化钠试液1滴，含麻黄碱和(或)伪麻黄碱的培养液显蓝紫色；再加入1mL乙醚，振摇后放置分层，醚层显紫红色，水层变为红色。通过对转基因酵母菌株培养液进行铜铬盐反应，其反应为阳性，表明转基因酵母菌发酵液中含有麻黄碱和(或)伪麻黄碱。两种转基因酵母菌株培养液经HPLC检测后，色谱图如图2所示。按美国产WATERS 1525pump高压液相色谱仪的操作规程进行仪器的操作。每次进样量10μL。标样来源于新疆国际实业股份有限公司麻黄素事业部，标样符合美国FDA药典标准。培养液与标样的对应关系如图2所示，经检测，两种培养液中麻黄碱含量为1.32mg/L，不含伪麻黄碱。

针对两种转基因酵母菌的胞内检测同样如上所述进行。经铜铬盐检测呈阳性。

将获得的转基因酵母菌株编号为0451，并于2005年10月20日保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号是CGMCC.No.1499。

实施例2：麻黄总DNA的导入和转化获得酿酒酵母工程菌1179

(1)、药用植物麻黄的采集、总DNA的制备

除使用带鳞片状三角形叶片的草麻黄(Ephedra sinica)嫩枝(采自新疆塔里木盆地北部荒漠区)以外，以与实施例1的第(1)部分所述相同的方法制得总DNA。紫外分光光度计检测DNA的纯度A₂₆₀/A₂₈₀为1.9，并在琼脂糖电泳中呈单一区带(附图5b)。

(2)、酵母菌细胞的处理

将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌种(购于北京：中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为2.1882)斜面接入麦芽汁培养液(见参考文献8)中，置旋转式摇床230r/min、30℃培养12小时。以0.1％可溶性淀粉(国产，分析纯)和0.1％葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O，国产，分析纯)作为保护稀释液(保护稀释液的配制方法：在100mL蒸馏水中加入0.1g可溶性淀粉和0.1g葡萄糖，装入300mL三角瓶中，塞棉塞，121℃灭菌15min)，对酵母菌培养液进行稀释以外，其它操作过程同实施例1的部分(2)。

(3)、离子注入

采用能量20KeV、剂量10.0×10¹⁵ions/cm²的Ar⁺或N⁺在10^-3Pa真空状态下，以5s脉冲方式注入酵母菌菌体。

(4)、麻黄总DNA的导入和转化

两种菌体离子注入结束后，分别立即用2mL浓度为400μg/mL的草麻黄总DNA的TE缓冲液浸泡离子注入后的菌膜，30℃温育2小时后，用无菌玻璃刮铲反复洗脱2min，获得洗脱液。洗脱液用无菌玻璃刮铲均匀涂布于分离平板，每一个分离平板可涂布0.1mL洗脱液，倒置，于30℃培养72小时。转基因酵母在分离平板上的生产情况如图1(b)所示。其中分离平板培养基的组成如下：葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O，国产，分析纯)5.0％，酵母膏粉(Sigma产，生化试剂)1.5％，硝酸钠(NaNO₃，国产，分析纯)0.5％，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O，国产，分析纯)0.1％，磷酸氢二钾(K₂HPO₃·3H₂O，国产，分析纯)0.05％，用氢氧化钠(国产，分析纯)调pH至7.0后，再加入溴百里香酚兰(BTB，国产，指示剂)0.02％，琼脂(国产，生化试剂)1.8％，分装，121℃灭菌15min，倾倒平板。每个直径为90mm的无菌平皿倾倒分离平板培养基20mL。

(5)、转基因酵母菌的培养

将转化后在分离平板上生长的酵母菌菌落分别接入斜面培养基，30℃培养72小时。再分别接入液体培养基，置旋转式摇床230r/min、30℃培养72小时。其中液体培养基的组成如下：葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O，国产，分析纯)5.0％，酵母膏粉(Sigma产，生化试剂)1.5％，硝酸钠(NaNO₃，国产，分析纯)0.5％，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O，国产，分析纯)0.1％，磷酸氢二钾(K₂HPO₃·3H₂O，国产，分析纯)0.05％，用氢氧化钠调pH至7.0，分装三角瓶，四层纱布和两层牛皮纸封口，121℃灭菌15min。

(6)、转基因酵母菌产麻黄碱和伪麻黄碱的定性和定量检测

液体培养结束后，重复实施例1的部分(6)，对获得的转基因酵母胞外麻黄碱和伪麻黄碱及胞内麻黄碱和伪麻黄碱进行定性及定量测定。其中铜铬盐反应为阳性，表明转基因酵母菌发酵液中含有麻黄碱。转基因酵母菌株培养液经HPLC检测后，色谱图如图3所示。按美国产WATERS 1525pump高压液相色谱仪的操作规程进行仪器的操作。每次进样量10μL。标样来源于新疆国际实业股份有限公司麻黄素事业部，标样符合美国FDA药典标准。培养液与标样的对应关系如图3所示，两种菌体培养液中麻黄碱含量为1.91mg/L，伪麻黄碱含量为1.18mg/L。

将获得的转基因酵母菌株编号为1179，并于2005年10月20日保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号是CGMCC.No.1500。

实施例3：麻黄总DNA的导入和转化获得发酵毕赤酵母工程菌3161

(1)、药用植物麻黄的采集、总DNA的制备

除使用带鳞片状三角形叶片的中麻黄(Ephedra intermadia)嫩枝(采自新疆准葛尔盆地西部荒漠区)以外，重复实施例1的部分(1)，提取总DNA。紫外分光光度计检测DNA的纯度A₂₆₀/A₂₈₀为1.7，并在琼脂糖电泳中呈单一区带(附图5c)。

(2)、酵母菌细胞的处理

将发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)的菌种(购于北京：中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为2.1706)斜面接入麦芽汁培养液(见参考文献8)中，置旋转式摇床230r/min、30℃培养12小时。以1.0％可溶性淀粉(国产，分析纯)和1.0％葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O，国产，分析纯)作为保护稀释液(保护稀释液的配制方法：在100mL蒸馏水中加入1.0g可溶性淀粉和1.0g葡萄糖，装入300mL三角瓶中，塞棉塞，121℃灭菌15min)，对酵母菌培养液进行稀释以外，其它操作过程同实施例1的部分(2)。

(3)、离子注入

采用能量10KeV、剂量20.0×10¹⁵ions/cm²的Ar⁺或N⁺在10^-3Pa真空状态下，以10s脉冲方式注入酵母菌菌体。

(4)、麻黄总DNA的导入和转化

两种菌体离子注入结束后，分别立即用2mL浓度为400μg/mL的中麻黄总DNA的TE缓冲液浸泡离子注入后的菌膜，30℃温育2小时后，用无菌玻璃刮铲反复洗脱2min，获得洗脱液。洗脱液用无菌玻璃刮铲均匀涂布于分离平板，每一个分离平板可涂布0.1mL洗脱液，倒置，于30℃培养72小时。转基因酵母在分离平板上的生产情况如图1(c)所示。其中分离平板培养基配方如下：葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O，国产，分析纯)15.0％，酵母膏粉(Sigma产，生化试剂)1.0％，硝酸钠(NaNO₃，国产，分析纯)1.5％，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O，国产，分析纯)0.08％，磷酸氢二钾(K₂HPO₃·3H₂O，国产，分析纯)0.08％，用氢氧化钠(国产，分析纯)调pH至7.0后，再加入溴百里香酚兰(BTB，国产，指示剂)0.02％，琼脂(国产，生化试剂)1.8％，分装，121℃灭菌15min，倾倒平板。每个直径为90mm的无菌平皿倾倒分离平板培养基20mL。

(5)、转基因酵母菌的培养

将转化后在分离平板上生长的酵母菌菌落分别接入斜面培养基，30℃培养72小时。再分别接入液体培养基，置旋转式摇床230r/min、30℃培养72小时。其中液体培养基的组成如下：葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O，国产，分析纯)15.0％，酵母膏粉(Sigma产，生化试剂)1.0％，硝酸钠(NaNO₃，国产，分析纯)1.5％，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O，国产，分析纯)0.08％，磷酸氢二钾(K₂HPO₃·3H₂O，国产，分析纯)0.08％，用氢氧化钠调pH至7.0，分装三角瓶，四层纱布和两层牛皮纸封口，121℃灭菌15min。

(6)、转基因酵母菌产麻黄碱和伪麻黄碱的定性和定量检测

两种菌体液体培养结束后，重复实施例1的部分(6)，测定转基因酵母胞外麻黄碱和伪麻黄碱含量；测定转基因酵母胞内麻黄碱和伪麻黄碱含量。

其中，对获得的转基因酵母菌株培养液进行铜铬盐反应为阳性，表明转基因酵母菌发酵液中含有麻黄碱。转基因酵母菌株培养液经上述HPLC检测后，色谱图如图4所示。经检测，两种菌体培养液中麻黄碱含量为2.19mg/L，伪麻黄碱含量为1.78mg/L。

针对转基因酵母菌的胞内检测同样如上所述进行。经铜铬盐检测呈阳性。

将获得的转基因酵母菌株编号为3161，并于2005年10月20日保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号是CGMCC.No.1501。

实施例4：麻黄总DNA的导入和转化获得树状假丝酵母工程菌

(1)、药用植物麻黄的采集、总DNA的制备

重复实施例1的部分(1)，提取总DNA。紫外分光光度计检测DNA的纯度A₂₆₀/A₂₈₀为1.8，并在琼脂糖电泳中呈单一区带(参见实施例1的电泳图)。

(2)、酵母菌细胞的处理

将树状假丝酵母(Candida arborea)的菌种(购于北京：中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为2.566)斜面接入麦芽汁培养液中，其它操作过程同实施例1。

(3)、离子注入

(4)、麻黄总DNA的导入和转化

操作过程同实施例1

(5)、转基因酵母菌的培养

操作过程同实施例1

6、转基因酵母菌产麻黄碱和伪麻黄碱的定性和定量检测

操作过程同实施例1

通过对获得的两种转基因酵母菌株培养液进行铜铬盐反应，其反应为阳性，表明转基因酵母菌发酵液中含有麻黄碱和伪麻黄碱。转基因酵母菌株经HPLC检测后，培养液中麻黄碱含量为4.11mg/L，伪麻黄碱含量为1.32mg/L。两种转基因酵母胞内检测铜铬盐反应为阳性。

将成功获得的转基因酵母菌编号为0806。

实施例5：麻黄总DNA的导入和转化获得深红酵母工程菌

1、药用植物麻黄的采集、总DNA的制备

重复实施例2的部分(1)，提取总DNA。紫外分光光度计检测DNA的纯度A₂₆₀/A₂₈₀为1.9，并在琼脂糖电泳中呈单一区带(参见实施例2的电泳图)。

2、酵母菌细胞的处理

将深红酵母(Rhodotorula rubra)(购于北京：中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为2.279)的菌种斜面接入麦芽汁培养液中，其它操作过程同实施例1。

3、离子注入

4、麻黄总DNA的导入和转化

操作过程同实施例2

5、转基因酵母菌的培养

操作过程同实施例2

6、转基因酵母菌产麻黄碱的定性和定量检测

操作过程同实施例2

通过对获得的两种转基因酵母菌株培养液进行铜铬盐反应，其反应为阳性，表明转基因酵母菌发酵液中含有麻黄碱和伪麻黄碱。转基因酵母菌株经HPLC检测后，培养液中麻黄碱含量为1.39mg/L，伪麻黄碱含量为0.13mg/L。两种转基因酵母胞内检测铜铬盐反应为阳性。

将成功获得的转基因酵母菌编号为1016。

实施例6：麻黄总DNA的导入和转化获得粘红酵母工程菌

1、药用植物麻黄的采集、总DNA的制备

重复实施例3的部分(1)，提取总DNA。紫外分光光度计检测DNA的纯度A₂₆₀/A₂₈₀为1.7，并在琼脂糖电泳中呈单一区带(参见实施例3的电泳图)。

2、酵母菌细胞的处理

将粘红酵母(Rhodotorula glutinis)(购于北京：中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为2.102)的菌种斜面接入麦芽汁培养液中，其它操作过程同实施例3。

3、离子注入

4、麻黄总DNA的导入和转化

操作过程同实施例3

5、转基因酵母菌的培养

操作过程同实施例3

6、转基因酵母菌产麻黄碱的定性和定量检测

操作过程同实施例3

通过对获得的两种转基因酵母菌株培养液进行铜铬盐反应，其反应为阳性，表明转基因酵母菌发酵液中含有麻黄碱和伪麻黄碱。转基因酵母菌株经HPLC检测后，培养液中麻黄碱含量为2.16mg/L，不含伪麻黄碱。两种转基因酵母胞内检测铜铬盐反应为阳性。

将成功获得的转基因酵母菌编号为编号为3140。

实施例7：麻黄总DNA的导入和转化获得热带假丝酵母工程菌

1、药用植物麻黄的采集、总DNA的制备

2、酵母菌细胞的处理

将热带假丝酵母(Candida tropicalis)(购于北京：中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为2.587)的菌种斜面接入麦芽汁培养液中，其它操作过程同实施例3。

3、离子注入

采用能量10KeV、剂量20.0×10¹⁵ions/cm²的Ar⁺或N⁺在10^-3Pa真空状态下，以10s脉冲方式分别注入不同的酵母菌菌体。

4、麻黄总DNA的导入和转化

操作过程同实施例3

5、转基因酵母菌的培养

操作过程同实施例3

6、转基因酵母菌产麻黄碱的定性和定量检测

操作过程同实施例3

通过对获得的两种转基因酵母菌株培养液进行铜铬盐反应，其反应为阳性，表明转基因酵母菌发酵液中含有麻黄碱和伪麻黄碱。转基因酵母菌株经HPLC检测后，培养液中麻黄碱含量为2.93mg/L，伪麻黄碱含量为0.30mg/L。两种转基因酵母胞内检测铜铬盐反应为阳性。

将成功获得的转基因酵母菌编号为编号为0406。

[参考文献]

[1]杨剑波，吴李君，吴家道等.应用低能离子束介导法获得水稻转基因植株[J].科学通报，1994，36(16)：1530-1534

[2]吴丽芳，尹若春，谷运红等.离子注入法将外源DNA直接导入小麦的研究[J].生物物理学报，2001，17(4)：724-730

[3]程备久，田秋元，姚佐文等.离子注入法导入棉花外源基因的研究[J].安徽农业大学学报，1993(增刊)：19-22

[4]宋道军，陈若雷，尹若春等.离子束介导植物分子超远缘杂交研究[J].自然科学进展，2001，11(3)：327-330

[5]虞龙，余增亮.低能离子注入介导Vc前体(2-KLG)产生菌DNA的转导[J].核技术.2004，27(4)：264～268

[6]吴立军.天然药物化学[M].北京：人民卫生出版社，2003

[7]闫新甫.转基因植物[M].北京：科学出版社，2003

[8]赵斌，何绍江.微生物学实验[M].北京，科学出版社，2002

Claims

1.一种在酵母菌中转化麻黄总DNA的方法，其包含下述步骤：

(1)采集麻黄，提取总DNA，使其纯度为A₂₆₀/A₂₈₀＝1.8±0.1；

(2)培养酵母菌，并稀释至1.0×10⁷CFU/mL-1.0×10⁸CFU/mL，所述稀释使用含淀粉和葡萄糖的溶液或浓度为200μg/mL-800μg/mL麻黄总DNA的TE缓冲液进行，其中所述淀粉和葡萄糖的浓度分别为0.1-1.0重量％；

(3)将稀释后的酵母菌制成菌膜；

(4)采用剂量为10.0×10¹⁵离子/平方厘米-20.0×10¹⁵离子/平方厘米的离子，在真空状态下，以5s～10s脉冲方式注入菌膜中的酵母菌菌体，所述离子选自Ar⁺、N⁺、C⁺、O⁺或H⁺；

(5)用浓度为200μg/mL-800μg/mL的麻黄总DNA的TE缓冲液浸泡离子注入后的菌膜，温育2小时后，洗脱，将获得的洗脱液均匀涂布于分离培养基平板上培养，其中所述分离培养基由下述物质组成：葡萄糖5.0重量％-15.0重量％，酵母膏粉0.5重量％-1.5重量％，硝酸钠0.5重量％-1.5重量％，硫酸镁0.05重量％-0.1重量％，磷酸氢二钾0.05重量％-0.1重量％，用氢氧化钠调pH至7.0后，再加入溴百里香酚兰0.02重量％，琼脂1.5重量％-2.0重量％，余量为水。

2.权利要求1的方法，其中在步骤(2)中所述淀粉和葡萄糖的浓度分别为0.5重量％。

3.权利要求1的方法，其中在步骤(4)中离子注入的能量为10KeV-20KeV。

4.权利要求1的方法，其中所述酵母菌选自汉逊酵母属(Hansenula)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)或红酵母属(Rhodotorula)。

5.权利要求4的方法，其中所述酵母选自异常汉逊酵母(Hansenulaanomala)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，发酵毕赤酵母(Pichiafermentans)，树状假丝酵母(Candida arborea)，热带假丝酵母(Candidatropicalis)，深红酵母(Rhodotorula rubra)或粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中步骤(4)中所述离子为Ar⁺或N⁺。

7.权利要求1的方法，其中在步骤(5)中在分离培养基平板上培养后得到的转基因酵母是保藏号为CGMCC.No.1499的异常汉逊酵母，保藏号为CGMCC.No.1500的酿酒酵母或保藏号为CGMCC.No.1501的发酵毕赤酵母。

8.一种用于分离转化了麻黄总DNA的转基因酵母菌的培养基，其由下述成分组成：葡萄糖5.0重量％-15.0重量％，酵母膏粉0.5重量％-1.5重量％，硝酸钠0.5重量％-1.5重量％，硫酸镁0.05重量％-0.1重量％，磷酸氢二钾0.05重量％-0.1重量％，用氢氧化钠调pH至7.0后，再加入溴百里香酚兰0.02重量％，琼脂1.5重量％-2.0重量％，余量为水。