CN109526988A - 球孢白僵菌no6的分离、鉴定与除草活性研究 - Google Patents

球孢白僵菌no6的分离、鉴定与除草活性研究 Download PDF

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Abstract

本发明提供了球孢白僵菌NO6的分离、鉴定与除草活性的研究，涉及微生物应用技术领域，能够实现对土壤中野燕麦的生长产生明显的抑制作用，起到防除的作用，从而保证种植的农作物的生长质量和产出量；相对于农药除草能够避免农作物农药残留，减少土壤和环境污染；该研究提供一种化合物，所述化合物含有球孢白僵菌NO6制成物，所述化合物用于除草，所述制成物包括发酵滤液和/或粗提物。本发明提供的技术方案适用于野燕麦的防除过程中。

Description

球孢白僵菌NO6的分离、鉴定与除草活性研究
【技术领域】
本发明涉及微生物应用技术领域，尤其涉及球孢白僵菌NO6的分离、鉴定与除草活性的研究。
【背景技术】
野燕麦(Avena fatua L.)是禾本科燕麦属一年生或二年生草本植物，属田间恶性杂草，在欧洲、北美洲、非洲、澳洲以及亚洲温寒带地区均有分布。其分蘖能力强、繁殖率高、适应广泛，是田间农作物的主要威胁。目前，我国16个省区约160万hm2农田遭受野燕麦危害，其中冬麦区危害率达15.6％，春麦区危害率达25.3％，每年导致粮食减产月17.5亿kg。目前，如何对野燕麦进行有效防除面临很多困难，小麦播种前选种、人工拔除、大田轮作以及使用化学除草剂是可以选择的几种常规方法。但小麦播种前选种与人工拔除不仅成本高昂，而且防除效果并不显著，大田轮作又会受到地理位置与农民耕作习惯等诸多因素限制，虽然大田喷施化学除草剂就成为防治野燕麦的主要措施，但诸如污染环境、产生抗药性等等问题的存在。因此，开展新型除草剂的研究，尤其是微生物源除草剂的研究，对发展生态农业、防除作物田杂草具有重要的现实意义。
利用自然界生物中具有生物活性的代谢产物开发新的生物源除草剂是防除杂草的一个重要途径和未来发展方向。自然界中微生物(真菌、细菌、病毒)是开发生物除草剂的重要来源，其中利用最多的是真菌。目前，有超过40个属的真菌已经或者正在被考虑开发成生物源除草剂。近年来，随着生防真菌的发掘和研究，寻找新的具有除草活性的真菌难度越来越大，因此从盐碱地等极端环境中分离具有优良除草活性的特殊菌株逐渐成为研究的热点。由于盐碱地具有高的盐碱、高渗透压的特殊环境，其中蕴含着丰富的微生物资源，目前所利用的特殊环境微生物资源仅仅只是自然界存在微生物资源的一小部分。因此，从盐碱土样中筛选得到具有除草活性的菌株，并对其次级代谢产物进行了深入研究，对今后农田杂草的防除和开发盐碱地生态环境土壤微生物资源具有重要的意义。
【发明内容】
有鉴于此，本发明提供了球孢白僵菌的分离、鉴定与除草活性的研究，该研究能够找出对野燕麦具有显著抑制活性的球孢白僵菌，并制作在农业领域对野燕麦具有有效防除作用的除草剂。
一方面，本发明提供一种化合物，其特征在于，所述化合物含有球孢白僵菌NO6制成物，且所述化合物用于除草。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述球孢白僵菌NO6制成物包括发酵滤液和/或粗提物。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述粗提物为石油醚粗提物、乙酸乙酯粗提物和正丁醇粗提物中的任意一种或多种。
另一方面，本发明提供一种用于除草的球孢白僵菌NO6制成物的制备方法，其特征在于，制备方法包括：
S1、对盐碱土进行培养和分离纯化，得到球孢白僵菌NO6的分生孢子和菌丝；
S2、对所述分生孢子和菌丝进行发酵和过滤，得到发酵滤液；
S3、对所述发酵滤液进行粗提操作，得到粗提物。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述S1的具体操作内容包括：
S11、将所述盐碱土放入盛有灭菌水的容器中充分振荡使土粒单粒分散开，得到土壤悬浮液；
S12、取三份所述土壤悬浮液分别稀释不同的倍数；将不同稀释倍数的稀释液分别涂布于培养基平板上，再在所述培养基平板表面贴玻璃纸；
S13、将涂布稀释液并贴好玻璃纸的所述培养基平板倒置于25℃～28℃条件下培养12～16天，待菌丝长满玻璃纸，揭开，得到分离纯化的球孢白僵菌的分生孢子和菌丝。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，振荡时所述容器中加入有直径为1-2mm的灭菌的玻璃珠。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述培养基平板的成分包括燕麦片、结晶紫、多果定可湿性粉剂、青霉素、硫酸链霉素、琼脂和蒸馏水。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述S2的具体内容包括：将所述分生孢子和菌丝接入PDA液体培养基中，在摇床震荡条件下培养3～4天得到发酵液，将所述发酵液进行离心处理，弃沉淀，取上清并将所述上清经0.18-0.28μm的滤膜过滤去除菌体，得到所述发酵滤液。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述S3的具体内容包括：用等体积的粗提萃取液对所述发酵滤液萃取2～3次，至萃取液变为无色，经减压浓缩后得到所述提取物。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述粗提萃取液包括石油醚、乙酸乙酯和/或正丁醇。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：本发明的研究成果能够实现对土壤中野燕麦的生长产生明显的抑制作用，起到防除的作用，从而保证种植的农作物的生长质量和产出量；相较于传统的农药除草，本发明利用微生物进行除草，一方面能够避免对农作物造成农药残留，另一方面能够减少土壤和环境污染。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
【附图说明】
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明一个实施例提供的菌株NO6发酵液正相硅胶柱分离的不同馏分除草活性检测图；
图2是本发明一个实施例提供的菌株NO6发酵液正相硅胶柱分离的除草活性馏分的TLC检测图；
图3是本发明一个实施例提供的具有较强除草活性的馏分4的HPLC峰谱图；
图4是本发明一个实施例提供的具有较强除草活性的馏分4反相HPLC分离的不同组分除草活性检测图；
图5是本发明一个实施例提供的NO6菌株的形态特征观测图；
图6是本发明一个实施例提供的NO6菌株的PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳图；
图7是本发明一个实施例提供的基于18S rDNA基因序列构建菌株NO6系统发育树。
【具体实施方式】
为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明实施例进行详细描述。
应当明确，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
本发明对菌株的研究从青海省尖扎县坎布拉镇盐碱土样中筛选得到了除草活性较高的NO6菌株，对该菌株进行了种属鉴定，并对其次级代谢产物进行了深入研究，为今后农田杂草的防除和开发盐碱地生态环境土壤微生物资源具有重要的意义。
一、具体研究内容：
1.1、研究材料
菌株是从青海省尖扎县坎布拉镇海拔2 800m盐碱土壤中筛选得到的真菌菌株。杂草野燕麦(Avena fatua)种子采自青海省农林科学院植保所试验田。
1.2、研究过程中使用的主要仪器和试剂
台式冷冻离心机(Sigma公司)、旋转蒸发仪(上海市爱朗仪器有限公司)、生化培养箱(宁波江南仪器厂)、PCR仪(Bio-Rad公司)、显微镜(Olympus公司)、高效液相色谱仪(江苏汉邦科技有限公司)。石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、葡萄糖、氯化钠(分析纯，天津大茂化学试剂厂)、琼脂粉(美国Sigma公司)、析硅胶(200～300目，青岛海洋化工有限公司)、薄层层析硅胶板(青岛海洋化工有限公司)。HPLC甲醇(德国默克公司)。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。选择性培养基。
1.3、菌株的分离和提纯
称取土壤10g盐碱土放入盛有0.05％吐温-80灭菌水(加入适量直径为1-2mm的灭菌的玻璃珠)的100毫升的锥形瓶中振荡约20min，使其充分振荡土粒单粒分散开，使土壤与水充分混合。用无菌水对混合液进行梯度稀释至在10-1、10-2、10-3等不同浓度稀释液。取1毫升的土壤悬浮液逐一稀释10-2、10-3、10-4倍，用灭菌的三角涂棒分别涂布不同稀释倍数的稀释液于选择性培养基平板表面(燕麦片35g、结晶紫5mg、多果定可湿性粉剂0.9g、青霉素0.4g、硫酸链霉素1g、琼脂5g、蒸馏水1000mL)，每个浓度3次重复，25℃～28℃恒温箱中倒置培养14天左右，待菌丝长满玻璃纸，揭开，即可得分离纯化的球孢白僵菌的分生孢子和菌丝。从菌落边缘挑取少量菌丝，进行再次纯化后保存于PDA试管斜面中备用。
1.4、菌株发酵滤液及粗提物的制备
分离获得的菌株接入PDA液体培养基中，30℃、200r/min摇床震荡培养3～4d，将发酵液8000r/min离心5min，弃沉淀，取上清过0.22μm滤膜去除菌体，得到发酵滤液。NO6菌株发酵滤液用等体积石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取2～3次，至萃取液变为无色，经减压浓缩后分别得到石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物。
1.5、除草活性测定
除草活性测定采用培养皿分析法，分别测定菌株发酵滤液和各提取物对野燕麦除草活性。
选择饱满完整的杂草种子，用10g/L次氯酸钠溶液进行表明消毒，无菌水冲洗3次，在12孔板的孔中铺上圆滤纸片，加入待测发酵滤液1mL，每孔置10粒种子进行除草活性测定。每步处理重复3次，另设清水作为空白对照，28℃智能光照培养箱培养，处理3～5d后测定根长和芽长，计算抑制率。
按如下公式计算抑制率：抑制率(％)＝[(空白对照组的根(芽)长－处理组的根(芽)长)/对照组的根(芽)长]×100。
将粗提物(石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物)用丙酮溶解，配制成100μg/mL的药液。在12孔板的孔中铺上滤纸铺上圆滤纸片，加入待测药液1.0mL，待溶剂挥发干后，加入1.0mL蒸馏水，选择10粒成熟度一致的露白的杂草种子孔中，保鲜膜封好，于28℃智能光照培养箱培养，每处理步骤重复3次，测定根长和芽长，计算抑制率。
1.6、除草活性物质分离纯化
经大批发酵，获得菌株NO6发酵液共36L，发酵液经5000r/min冷冻离心30min，收集上清液部分。加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相40℃减压浓缩，再用甲醇浸提2遍，过滤除去不溶物，60℃减压浓缩除去甲醇得浸膏31g。粗提浸膏首先经过正相硅胶柱层析，二氯甲烷/甲醇(V/V，25:1、20:1、15:1、10:1和1:1)梯度洗脱，每50mL洗脱液收集为一瓶，TLC检测洗脱进程，同时进行除草活性检测，最终合并活性馏分。利用制备型高效液相色谱仪(20mm×250mm，10μm)在流动相为48％甲醇、检测波长为220nm、流速为3mL/min、进样量为100μL的色谱条件下，对上述经过硅胶柱层析所得的活性馏分进行分析，并检测其除草活性。
1.7、菌株的鉴定
包括形态学鉴定和分子鉴定。形态学鉴定参考《真菌鉴定手册》，采用载玻片法在显微镜下观察，根据菌落的成长特性、颜色、菌丝的形态特征、孢子的形态进行鉴定。
分子鉴定具体为：提取真菌基因组DNA进行鉴定。提取DNA的方法具体为：刮取培养基上培养的白僵菌菌丝体150mg，置于2mL的灭菌离心管中，加少量石英砂和1mL提取液(真菌DNA提取试剂盒内的一种组份，市售)，放在冰上用玻棒进行研磨8-10min，然后在冰冻离心机上以8000rpm离心10min，取上清液移入另一支2mL的离心管中，加500μL缓冲液静置10min，再以8000rpm离心10min，上清液即为白僵菌样品的DNA溶液，移入1.5mL的离心管内备用。
真菌基因组DNA的提取使用Ezup柱式SK8259试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]。采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行ITS序列扩增。电泳回收产物由生工生物工程(上海)股份有限公司纯化并测序。利用Blastn(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)与GenBank数据库中的序列进行比对，获得相近菌株ITS序列，利用Clustal x 1.8按最高同源性的原则进行排序，采用MEGA(ver.5.05)的Neighbor-joining法构建系统发育进化树，各分支的置信度自举检测(bootstrap)1000次。
扩增方法具体为：PCR反应体系为20μL，其中DNA提取液1.0μL(含50ng DNA)；ITS1(10mmol·L-1)和ITS4(10mmol·L-1)各0.5μL；2×Taq DNA聚合酶0.5μL；10×Taq反应缓冲液2.0μL；dNTP(每种成分均为2.5mmol·L-1)0.5μL；灭菌双蒸水15.0μL。PCR循环参数：95℃预变性3min，94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸2min，35个循环，最后72℃终延伸10min。
白僵菌样品DNA-ITS区域PCR扩增产物电泳条带检测：制备2.0％TAE琼脂糖凝胶电板；将凝胶板移至含有TAE电泳缓冲液水平电泳槽中，补足电泳液；加入样品、标准Marker，电泳后用凝胶成像仪观察、照相。
白僵菌样品ITS PCR扩增产物测序分析与比对：经过电泳检测后确认白僵菌样品DNA-ITS区域PCR产物符合测序要求后，将白僵菌菌株ITS PCR扩增产物样品冰冻寄给上海生工公司进行序列测定。将测序结果与NCBI基因数据库的白僵菌菌株序列进行比对。
二、结果与分析：
2.1、菌株发酵液及粗提物的除草活性测定
1)菌株发酵液对燕麦种子萌发的抑制效果：
采用浓度梯度稀释法，从青海尖扎县坎布拉镇土壤中共分离得到9株真菌菌株，详见表1。采用不同菌株发酵滤液对野燕麦种子萌发的抑制作用进行了测定。实验结果表明：菌株NO6发酵滤液对野燕麦的胚根和胚芽萌发均有很强的抑制作用，抑制率分别达到93.10％和91.20％，菌株NO8-5和NO2-4发酵滤液对野燕麦种子的萌发抑制作用次之；菌株F8、1和NO9-1发酵滤液对野燕麦的胚芽和胚根抑制率低于60％；F10和G14发酵滤液对燕麦种子萌发抑制率均较低，对燕麦胚芽抑制率分别为-22.98％、-22.01％，胚根抑制率均低于30％，表明其对燕麦的胚芽生长有一定促生作用。
表1不同菌株发酵液抑制野燕麦萌发种子效果
表中数值为平均值±标准误，同列数据后不同小写字母表示在0.05水平差异显著，下同。
2)粗提物对燕麦种子萌发的抑制效果
综合考虑，选用对野燕麦胚根和胚芽抑制作用显著的真菌菌株NO6，制备提取该菌株的粗提物，通过培养皿分析法测其不同粗提物处理对野燕麦胚根和胚芽的抑制作用。由表2可知，在100μg/mL的浓度条件下，菌株NO6各粗提物对野燕麦胚根和胚芽的抑制作用存在显著差异。其中乙酸乙酯粗提物对野燕麦胚芽抑制率达到97.09％，对胚根的抑制率为96.08％，要显著高于正丁醇和石油醚粗提物的抑制作用，正丁醇和石油醚粗提物的除草抑制活性相当，达到90％以上，但这两者处理之间没有显著差异。
表2培养皿分析法测定菌株NO6对野燕麦的防除效果
2.2、除草活性物质分离纯化
乙酸乙酯萃取得到的粗提物，按极性由弱到强的溶剂系统进行梯度洗脱后，共收集了500个馏分，经过TLC检测合并得到16个馏分(编号为Fr1-Fr16，极性大小顺序为Fr1＜Fr2＜……＜Fr15＜Fr16)，各馏分旋转蒸发至干后的甲醇溶解液，经培养皿分析法进行除草活性检测，结果显示16个合并馏分具有不同程度的除草活性，如图1所示，表现为胚芽和胚根受到不同程度的抑制，其中以馏分Fr4除草活性最强，馏分Fr3和Fr5的对野燕麦有弱的抑制生长作用，初步确定除草活性成分主要分布在Fr3-Fr5号馏分中，同时对具有除草活性的馏分Fr3-Fr5进行TLC检测，如图2所示，确定合适展开剂的比例，为下一次硅胶柱层析提供合适的洗脱剂比例。
图1中每个培养皿的第一行从左到右的编号为A1-A4，第二行从左到右编号为B1-B4，第三行从左到右编号为C1-C4。左边A1-A4分别代表Fr1-Fr4，B1-B4代表Fr5-Fr8，C1-C4代表Fr9-Fr12；右边A1-A4分别代表Fr13-Fr16，B1-B4为空白对照。
将硅胶柱层析中得到的具有较强除草活性组分Fr4转溶于甲醇进行HPLC分析。图3为馏分Fr4的HPLC分析图，由图3所示内容可知该馏分包括3个组分，其保留时间分别为13.852min、29.718min、66.868min，分别标记为组分1、组分2和组分3，分别将这3个组分收集制备。培养皿分析结果如图4所示，图中第一行从左到右为A1、A2、A3、A4，A1、A2、A3分别代表峰1、2和3馏分，A4代表甲醇洗脱组分；图中第二行从左到右为B1-B4，代表空白对照。组分3有明显的除草活性，其对野燕麦胚芽、胚根的抑制率分别达到87.74％、93.17％。组分1和甲醇洗脱组分除草活性较低。需要指出的是，组分2对野燕麦胚芽、胚根的抑制率分别为-36.13％、-99.08％，这表明其对野燕麦种子萌发有较强的促生作用(表3)。
表3各组分抑制野燕麦种子萌发效果
2.3、菌株的鉴定
菌株的鉴定包括形态学鉴定和分子鉴定。
形态学鉴定：如图5所示，其中A图代表菌落，B图为分生孢子梗，C图为分生孢子，均为放大1000倍的观测图。菌株NO6的菌落呈圆形，呈绒状、丛卷毛至粉状，培养初期多呈白色，后来变成淡黄色，偶成淡红色，背面无色或淡黄色至粉红色。菌丝生长缓慢，但产孢速度较快。分生孢子梗多不分枝，垂直着生在菌丝分枝或短的小分支上。分生孢子球形至近球形，或呈卵型，无色透明，壁薄，直径2.0～4.0μm。
分子鉴定：菌株NO6经rDNA-ITS序列通用真菌引物PCR进行扩增，菌株NO6经rDNA-ITS序列通用真菌引物PCR扩增后，获得552bp大小的序列片段，如图6所示，将序列测定结果上传至GeneBank，其序列登录号为MH091336。利用GeneBank数据库中BLASTn软件对该序列和GenBank中已登陆的rDNA-ITS序列进行同源性比较，该菌与球孢白僵菌同源性均在99％以上，调取其中与之同源性较高的菌株rDNA-ITS序列，利用软件Clustal W进行多重匹配排列分析，采用邻近法构建菌株系统发育树，结合菌株形态，确立该菌株的种属关系。由图7所示的系统发育树可以看出，菌株NO6与Beauveria属内各种的一致性均在99.0％以上，系统发育分析归于同一分支，并结合其形态学特征，确定NO6菌株均为球孢白僵菌(Beauveriabassiana)成员。
本试验从青海省尖扎县坎布拉镇盐碱土壤分离出具有除草活性的NO6真菌菌株，经过菌落、菌丝和孢子形态特征以及rDNA-ITS序列鉴定，初步确定该菌株属于球孢白僵菌Beauveria bassiana中的一员。球孢白僵菌(Beauveria bassiana)隶属于白僵菌属的一种真菌，该属真菌分布广泛，是世界最常见的土壤虫生真菌，也是植物内生真菌，对多种植物害虫、病原菌有很好的抑制作用，可以提高寄主植物的抗病虫能力和促进植物生长，具有双重生防活性和促生作用。本试验分离得到的具有除草活性的菌株NO6，是盐碱土壤微生物资源真菌除草性的首次发现。
本研究从青海尖扎县坎布拉盐碱土中共分离得到9株生防菌株，通过培养皿分析初筛，以真菌菌株NO6发酵液表现出相对较高抑制效果。通过对发酵液进行溶媒萃取，获得以菌株NO6乙酸乙酯粗提物表现出相对较高的除草活性。采用多种色谱分离技术，对NO6菌株代谢产物进行分离获得1个除草活性组分。上述研究结果提示盐碱土壤真菌代谢产物具有很好的除草生物活性，可能具有以往农用药剂不同的作用靶点，是开发新颖生物除草剂的重要资源之一。
以上对本申请实施例所提供的一种球孢白僵菌NO6的分离、鉴定与除草活性研究，进行了详细介绍。以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。
如在说明书及权利要求书当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求书并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求书当中所提及的“包含”、“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含/包括但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求书所界定者为准。
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
应当理解，本文中使用的术语“和/或”仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求书的保护范围内。

Claims (10)

1.一种化合物，其特征在于，所述化合物含有球孢白僵菌NO6制成物，且所述化合物用于除草。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述球孢白僵菌NO6制成物包括发酵滤液和/或粗提物。
3.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述粗提物为石油醚粗提物、乙酸乙酯粗提物和正丁醇粗提物中的任意一种或多种。
4.一种用于除草的球孢白僵菌NO6制成物的制备方法，其特征在于，制备方法包括：
S1、对盐碱土进行培养和分离纯化，得到球孢白僵菌NO6的分生孢子和菌丝；
S2、对所述分生孢子和菌丝进行发酵和过滤，得到发酵滤液；
S3、对所述发酵滤液进行粗提操作，得到粗提物。
5.根据权利要求4所述的用于除草的球孢白僵菌NO6制成物的制备方法，其特征在于，所述S1的具体操作内容包括：
S11、将所述盐碱土放入盛有灭菌水的容器中充分振荡使土粒单粒分散开，得到土壤悬浮液；
S12、取三份所述土壤悬浮液分别稀释不同的倍数；将不同稀释倍数的稀释液分别涂布于培养基平板上，再在所述培养基平板表面贴玻璃纸；
S13、将涂布稀释液并贴好玻璃纸的所述培养基平板倒置于25℃～28℃条件下培养12～16天，待菌丝长满玻璃纸，揭开，得到分离纯化的球孢白僵菌的分生孢子和菌丝。
6.根据权利要求5所述的用于除草的球孢白僵菌NO6制成物的制备方法，其特征在于，振荡时所述容器中加入有直径为1-2mm的灭菌的玻璃珠。
7.根据权利要求5所述的用于除草的球孢白僵菌NO6制成物的制备方法，其特征在于，所述培养基平板的成分包括燕麦片、结晶紫、多果定可湿性粉剂、青霉素、硫酸链霉素、琼脂和蒸馏水。
8.根据权利要求4所述的用于除草的球孢白僵菌NO6制成物的制备方法，其特征在于，所述S2的具体内容包括：将所述分生孢子和菌丝接入PDA液体培养基中，在摇床震荡条件下培养3～4天得到发酵液，将所述发酵液进行离心处理，弃沉淀，取上清并将所述上清经0.18-0.28μm的滤膜过滤去除菌体，得到所述发酵滤液。
9.根据权利要求4所述的用于除草的球孢白僵菌NO6制成物的制备方法，其特征在于，所述S3的具体内容包括：用等体积的粗提萃取液对所述发酵滤液萃取2～3次，至萃取液变为无色，经减压浓缩后得到所述提取物。
10.根据权利要求9所述的用于除草的球孢白僵菌NO6制成物的制备方法，其特征在于，所述粗提萃取液包括石油醚、乙酸乙酯和/或正丁醇。
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