CN108486184A - 玫瑰黄链霉菌nkz-259次级代谢物iaa的鉴定及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种鉴定玫瑰黄链霉菌NKZ‑259的次级代谢产物中存在IAA的方法，包括步骤如下：第一步，根据基因iaaM(Genbank accession No.：NP‑625735)设计引物；第二步，以玫瑰黄链霉菌NKZ‑259的DNA为模板进行基因扩增，将扩增得到的基因与iaaM基因进行比对；第三步，当第二步中扩增基因与iaaM基因相似性大于80％时，利用TLC法或HPLC法检测NKZ‑259菌株次级代谢物中是否存在IAA。本发明的有益效果是：使用分析型色谱仪探索得到合适的液相条件，用制备型色谱仪进行分离收集，快速分离得到IAA纯品。通过发酵罐大量发酵得到发酵液，直接用制备型色谱收集，方便快捷。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其属于微生物次级代谢产物领域，具体涉及一株玫瑰黄链霉菌NKZ-259(Streptomyces roseoflavus strain NKZ-259)次级代谢产物IAA的鉴定及应用。
背景技术
玫瑰黄链霉菌属于好氧型、革兰氏阳性放线菌，是一种优良的生防菌株。它具有强大的次级代谢能力，在其生长过程中能够产生大量的次级代谢物质。主要包括核苷类、聚酮类、吲哚类、萜烯类、内酯类、酚类等。在这些代谢产物中，不仅有具有抑菌活性的物质如抗生素等，还有一些能够促进植物生长的物质。目前，关于其他玫瑰黄链霉菌己报道可产生氨基糖苷类、大环内酯类及多烯类等多种抗生素，却鲜有报道可产生具有促进植物生长的物质。
IAA(Indole-3-acetic acid)是一种植物体内普遍存在的内源生长素，属于吲哚类化合物。其参与植物生长发育的许多过程，如根和茎的发育和生长、维管束组织的形成和分化、顶端优势以及植物的向性生长等。IAA一般在植物生长旺盛的组织中合成，通过极性运输至其他植物组织中发挥作用。在较低浓度时就能够促进植株侧芽萌发，诱导单性结实，提高坐果率等来。IAA最早是由英国科学家Darwin父子在金丝雀草胚芽鞘向光性试验中首先发现的生长素，现已证实其存在于高等植物和细菌、真菌、藻类中，但我们却很少应用这些植物和菌株来生产IAA，现今用于农业生产上的IAA大多为化学合成，成本高，又易造成环境污染，且危害人类健康。因此，开发一种新的IAA产生菌并将其应用于农业生产上具有一定的创新性和新颖性。
由于IAA是一种植物体内普遍存在的内源生长素，但是其在植物中合成的量十分微少，自由态吲哚乙酸的含量更低，约每千克鲜植物有1-100微克。因此，从在植物组织中提取开始，到一步步的萃取、分离过程中，很大情况下仅有的一点IAA已经在分离过程中损失掉。
并且，并不是所有的菌在次级代谢过程中都能产生IAA，目前报道的能产生IAA的菌株大多是从植物的根际土壤中分离得到的细菌及某些病原真菌。由于IAA的生物合成途径在色氨酸依赖型中有四条途经，不同的菌产生IAA的途径可能不同，因此产生能力也不同。如王西祥报道的路德维希肠杆菌代谢产生IAA的含量达148.80μg/mL，Mohamed HemidaAbd-Alla报道的链霉菌ASU14代谢产生的IAA仅为22μg/mL。所以筛选一株产IAA的菌株也十分不易，需要大量筛选和鉴定工作。
况且，在这些能产IAA的菌株中，每种菌的代谢过程中都会伴随产生许多其他的次级代谢物，如各种抗生素等，他们是完全混合在一起，想要单独分离出来，就需要根据IAA的理化性质来过各种分离柱，如硅胶柱、凝胶柱、大孔树脂柱等，这样虽然可以分离得到一些IAA，但此过程耗时耗材，不符合大量生产的要求。因此，要想从菌株生产IAA，必须要有更好的分离提取技术。
发明内容
本发明克服了现有技术中的不足，本专利目的之一是提供了一种玫瑰黄链霉菌NKZ-259次级代谢物IAA的鉴定方法，能够根据化合物的极性进行物质分离，快速分离和定性分析少量物质，确定IAA的纯度；本专利另一个目的提供一种将玫瑰黄链霉菌NKZ-259在在产植物激素IAA和/或促进植物生长中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
玫瑰黄链霉菌NKZ-259在产植物激素IAA和/或促进植物生长中的应用。
进一步，将玫瑰黄链霉菌NKZ-259的次代谢产物进行分离获得IAA，将获得的IAA制备调节液、生物肥料。
一种鉴定玫瑰黄链霉菌NKZ-259的次级代谢产物中存在IAA的方法，包括步骤如下：
第一步，根据基因iaaM(Gebank accession No.：NP-625735)设计引物；
第二步，以玫瑰黄链霉菌NKZ-259的DNA为模板进行基因扩增，将扩增得到的基因与iaaM基因比对；
第三步，当所述第二步中扩增基因与所述iaaM基因相似性大于80％时，利用TLC法或HPLC法检测NKZ-259菌株次级代谢物中是否存在IAA。
进一步，所述第一步中的引物为：
iaaM-3F(5'-3')：GCCGATCACCATGTTCGGGC；
iaaM-3R(5'-3')：CTAGTCCTCGGGGAGTTCCA。
进一步，所述基因iaaM为模式菌天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor A3(2))IAA生物合成关键基因。
进一步，所述第三步中用TLC法检测的步骤如下：
(1)将玫瑰黄链霉菌NKZ-259用无菌牙签涂布接种到MS培养基上，置于28℃、黑暗培养7天；
(2)将菌块接种到发酵培养基中，在温度为28℃，转速为200rpm的条件下震荡发酵6d，得到发酵液；
(3)将得到的所述发酵液用滤纸过滤后，调节PH值至2后萃取2次，合并乙酸乙酯相，在旋蒸仪中40℃蒸干，用甲醇溶解；
(4)将所述甲醇溶解的样品上硅胶柱进行分离，将收集得到的各组分洗脱液浓缩至10mL，用于TLC检测；
(5)用硅胶板依次对每个组分进行TLC试验。
进一步，所述第三步中用HPLC法检测的步骤如下：
(1)将玫瑰黄链霉菌NKZ-259用无菌牙签涂布接种到MS培养基上，置于28℃、黑暗培养7天；
(2)将菌块接种到发酵培养基中，在温度为28℃，转速为200rpm的条件下震荡发酵6d，得到发酵液；
(3)将得到的所述发酵液用滤纸过滤后，调节PH值至2后萃取2次，合并乙酸乙酯相，在旋蒸仪中40℃蒸干，用甲醇溶解；
(4)将所述甲醇溶解的样品上硅胶柱进行分离，将收集得到的各组分洗脱液浓缩至10mL，将各组分用无菌滤膜过滤后用于HPLC检测。
一种鉴定、分离玫瑰黄链霉菌NKZ-259的次级代谢产物中存在IAA的方法在鉴定、分离IAA产生菌方面的应用。
一种鉴定、分离玫瑰黄链霉菌NKZ-259的次级代谢产物中存在IAA的方法在开发和制造天然植物生长调节剂和微生物生物肥料中的应用。
本发明的有益效果为：使用分析型色谱仪探索得到合适的液相条件，用制备型色谱仪进行分离收集，可以快速分离得到IAA纯品。通过发酵罐大量发酵得到发酵液，直接用制备型色谱进行收集，方便快捷。
玫瑰黄链霉菌NKZ-259能够产生IAA，显著提高作物苗期的生长速度，从而促进作物生长。玫瑰黄链霉菌NKZ-259制备的发酵液促生效果明显，适合蔬菜作物产区大面积使用。
附图说明
图1是iaaM基因扩增图；
图2是TLC检测的结果条带图；
图3是500ppm-IAA标准溶液的保留时间图；
图4是1000ppm-IAA标准溶液的保留时间图；
图5是组分3保留时间图；
图6是组分4保留时间图；
图7是试验组发酵液稀释50倍与CK组清水浇灌的辣椒叶对比图；
图8是试验组发酵液稀释100倍与CK组清水浇灌的辣椒叶对比图；
图9是试验组发酵液稀释50倍与CK组清水浇灌的辣椒茎秆对比图；
图10是试验组发酵液稀释100倍与CK组清水浇灌的辣椒茎秆对比图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1玫瑰黄链霉菌NKZ-259产生IAA的基因预测
将在MS固体培养基上培养7d的玫瑰黄链霉菌NKZ-259菌株切下约1cm2的菌块接种于液体培养基YEME中，28℃,200rpm下培养2d，采用GENMED链霉菌属细菌基因组DNA纯化试剂盒提取该菌株的基因组DNA。
从Genbank中找到模式菌天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor A3(2))IAA生物合成关键基因iaaM(Genbank accession No.：NP-625735)，根据iaaM基因设计引物：
iaaM-3F(5'-3')：GCCGATCACCATGTTCGGGC(序列1)
iaaM-3R(5'-3')：CTAGTCCTCGGGGAGTTCCA(序列2)
以玫瑰黄链霉菌NKZ-259(保藏号为CGMCC No.13416)DNA为模板扩增iaaM基因全长，扩增得到的基因序列如序列3，如图1所示。使用软件DNAMAN将扩增得到的基因与iaaM进行比对，相似性为88.8％。因此可初步推断玫瑰黄链霉菌NKZ-259次级代谢过程中能够产生IAA。
实施例2玫瑰黄链霉菌NKZ-259中IAA的检测
(一)TLC法检测玫瑰黄链霉菌NKZ-259次级代谢物中是否有IAA存在
TSB发酵培养基：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，L-色氨酸5.0g，水1L，调PH至7.2±0.2
(1)将玫瑰黄链霉菌NKZ-259用无菌牙签涂布接种到MS培养基上，置于28℃、黑暗培养7天；
(2)用手术刀切1cm2的菌块接种到发酵培养基中，震荡发酵6d(28℃，200rpm)；
(3)将得到的发酵液用滤纸过滤后，用5N HCL调PH至2，用乙酸乙酯：发酵液＝1:1萃取2次，合并乙酸乙酯相，在旋蒸仪中40℃蒸干，用少量甲醇溶解。
(4)将甲醇溶解的样品上硅胶柱进行分离。开始时先用100％的二氯甲烷洗脱，洗脱体积至少为两倍柱体积，然后更换洗脱剂逐步增大洗脱剂极性，依次为二氯甲烷/甲醇＝30/1、/25/1、20/1、15/1、10/1、5/1、1/1直至100％甲醇，分别收集洗脱液，每50mL作为一个组分。然后将收集得到的各组分洗脱液浓缩至10mL，用于TLC检测。
(5)用GF254硅胶板进行TLC试验，首先在距硅胶板底部1cm处用铅笔划细线，然后用直径为0.5mm的毛细管分别吸取洗脱液和IAA标准溶液，点在细线上，两点之间保持1.5cm的距离，待样品风干后，持续点3-5次，然后风干。在层析缸中加入展层剂，盖上盖子，使层析缸中溶剂气体饱和，然后将硅胶板放入层析缸中，但不能使展层剂没过所划细线。依次对每个组分进行TLC检测。不断尝试各种洗脱剂检测IAA。当展层剂为丁酮：乙酸乙酯＝3：5时，可以看到与IAA标准品在同一位置有条带出现如图2，因此通过TLC检测可以证明玫瑰黄链霉菌NKZ-259菌株次级代谢过程中能够产生IAA。
(二)HPLC法检测玫瑰黄链霉菌NKZ-259次级代谢物中是否有IAA存在
(1)将实例2(一)收集得到的各组分用0.22μm的无菌滤膜过滤后用于HPLC检测。
(2)标准品配制：用色谱甲醇在避光条件下配制1000ppm IAA标准溶液，并稀释至500ppm备用。
(3)进样：使用Agilent 1260LC液相色谱仪，SymmetryC18，5μm，250mm反相色谱柱，流动相为甲醇：1％乙酸水＝40:60(V/V)，流速为1mL/min，进样量为20μL，检测信号为254nm和280nm。
(4)通过对IAA标准溶液进行检测，可以看到IAA的保留时间在12.218min和12.207min(如图3-4)。通过对收集得到的组分3和组分4的检测，在误差允许的范围内这两个组分在12.218min和11.776min附近的峰与IAA标准溶液的保留时间(如图5-6)一致，因此通过HPLC检测可以证明玫瑰黄链霉菌NKZ-259菌株次级代谢过程中能够产生IAA。
实施例3玫瑰黄链霉菌NKZ-259中IAA生物活性检测
辣椒促生试验
(1)试验采用穴盘种植，营养土与蛭石按3:1配置基质，将其置于穴盘中，将营养土浇透，然后每穴撒2-3粒辣椒种子，再用少量的营养土覆盖种子，喷洒适量的水，并用保鲜膜覆盖。
(2)待辣椒苗出土长出2片子叶时去掉保鲜膜。将试验分为三组，试验组分别使用稀释50倍和100倍的NKZ-259发酵液灌根，对照组浇灌清水，每个处理20株苗，设置3次重复。于温室中25℃，相对湿度为60％的环境下培养。
(3)待辣椒苗长出2片真叶时，试验组开始浇灌发酵液，对照组仍然浇灌清水；之后每隔10天灌根一次，其它时间浇灌清水。在灌根3次后，即辣椒苗生长约45天时，小心将辣椒苗挖出，洗去根部泥土，测其生长指标：根长、株高、鲜重、干重。
表1玫瑰黄链霉菌NKZ-259发酵液对辣椒生长的促进作用
表2玫瑰黄链霉菌NKZ-259发酵液对辣椒生长各指标的影响
由表1和表2可以看出，用玫瑰黄链霉菌NKZ-259发酵液对辣椒苗进行灌根，明显促进了辣椒的生长，其中浇灌稀释50倍的发酵液与对照相比根长和干重增加明显，分别增加了18.92％和13.33％，浇灌稀释100倍的发酵液与对照相比根长、鲜重和干重均明显增加，分别增加了36.79％、45.81％、60％。
由图7、图8及表1可以看出，浇灌稀释50倍的发酵液后，与对照相比，辣椒叶子更加墨绿、茂盛，且茎秆粗壮，根长茂密；而浇灌稀释100倍的发酵液与对照相比，变化则不明显，因此发酵液的50倍稀释液促生作用更加明显。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 玫瑰黄链霉菌NKZ-259次级代谢物IAA的鉴定及应用
<130> 2010
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> iaaM-3F
<400> 1
gccgatcacc atgttcgggc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> iaaM-3R
<400> 2
ctagtcctcg gggagttcca 20
<210> 3
<211> 1567
<212> DNA
<213> 扩增得到的基因序列(iaaM)
<400> 3
tcctcgcgca cccggcgggt ctcggccaga tacccgcgac cgagcacggc gccgaggtcg 60
ccgtcatcgg cggcgggctc tccggcatcg tcgccgccta cgagctgatg aagatgggcc 120
tcaagcccgt cgtctacgag gccgaccaga tcggcggccg gctgcgcacc gtcggcttcg 180
agggctgcga cccgtcgctg accgccgaga tgggcgccat gcggttcccg ccgtcgtcca 240
ccgcgctcca gcactacatc gacctggtgg gcctcaccac ccagccgttc cccaacccgc 300
tcgccgagtc gacgccctcc accgtcgtcg acctcaaggg cgagtcgcac tacgcggaga 360
ccgtcgccga cctgccgcag gtctaccgcg acgtggcgaa ggcgtggaac gactgcctgg 420
aggagggcgc cgacttctcc gacatgaacc gcgcgctgcg cgagcgcgac gtgccgaaga 480
tccgcgagat ctggtcgaag ctggtcgaga agctcgacaa ccagaccttc tacggcttcc 540
tctgcgaatc cgaggccttc aagtccttcc ggcaccgcga gatcttcggc caggtcggct 600
tcggcaccgg cggctgggac accgacttcc ccaactccat cctggagatc ctgcgcgtcg 660
tctacaccga ggccgacgac caccaccgcg gcatcgtcgg cggcagccag cagctgccgc 720
tgcgcctgtg ggagcgcgag ccgcagaaga tcgtgcactg gccggcgggc acctccctca 780
gctcgctgca cgcggcgggc gagccgaagc cggccgtgac ccggctgcac cgcaccgcgg 840
gcaaccgcgt caccgtcacg gacgcctcgg gcgacatccg cacctaccgg gcggcgatct 900
tcaccgccca gtcctggctg ctgctctcca agatcgagtg cgacgactcg ctgttcccca 960
tcgaccactg gacggcgatg gagcggaccc actacatgga gtcctccaag ctgttcgtcc 1020
cggtcgaccg gccgttctgg ctggacaagg acgagcagac ggggcgtgac gtcatgtcga 1080
tgacgctcac cgaccgcatg acgcgcggca cctacctgct cgacgacggc ccggacaggc 1140
ccgccgtcat ctgcctctcc tacacctggt gcgacgacag cctgaagtgg ctgccgctct 1200
cggcgaacga gcgcatggag gtcatgctca agtcgctcgg cgagatctac ccgaaggtcg 1260
acatcaggaa gcacatcatc ggcaacccgg tgaccgtgtc ctgggagaac gagccctact 1320
tcatgggcgc cttcaaggcg aacctgccgg gccactaccg ctaccagcgg cgcctgttca 1380
cccacttcat gcaggacagg ctccccgagg acaagcgcgg catcttcctc gcgggggacg 1440
acatctcctg gacggcgggc tgggccgagg gcgccgtcca gaccgcgctg aacgcggtct 1500
ggggcgtgat gcaccagctc ggcggcgcca cggacccgac caacccgggc ccgggcgacg 1560
gtacata 1567
Claims (9)
1.玫瑰黄链霉菌NKZ-259在产植物激素IAA和/或促进植物生长中的应用。
2.根据权利要求1的应用，其特征在于：将玫瑰黄链霉菌NKZ-259的次代谢产物进行分离获得IAA，将获得的IAA制备调节液、生物肥料。
3.一种鉴定、分离玫瑰黄链霉菌NKZ-259的次级代谢产物中存在IAA的方法，其特征在于：包括步骤如下：
第一步，根据基因iaaM(Gebank accession No.：NP-625735)设计引物；
第二步，以玫瑰黄链霉菌NKZ-259的DNA为模板进行基因扩增，将扩增得到的基因与iaaM基因比对；
第三步，当所述第二步中扩增基因与所述iaaM基因相似性大于80％时，利用TLC法或HPLC法检测NKZ-259菌株次级代谢物中是否存在IAA。
4.根据权利要求3所述的鉴定、分离玫瑰黄链霉菌NKZ-259的次级代谢产物中存在IAA的方法，其特征在于：所述第一步中的引物为：
iaaM-3F(5'-3')：GCCGATCACCATGTTCGGGC；
iaaM-3R(5'-3')：CTAGTCCTCGGGGAGTTCCA。
5.根据权利要求3所述鉴定、分离玫瑰黄链霉菌NKZ-259的次级代谢产物中存在IAA的方法，其特征在于：所述基因iaaM为模式菌天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor A3(2))IAA生物合成关键基因。
6.根据权利要求3所述鉴定、分离玫瑰黄链霉菌NKZ-259的次级代谢产物中存在IAA的方法，其特征在于：所述第三步中用TLC法检测的步骤如下：
(1)将玫瑰黄链霉菌NKZ-259用无菌牙签涂布接种到MS培养基上，置于28℃、黑暗培养7天；
(2)将菌块接种到发酵培养基中，在温度为28℃，转速为200rpm的条件下震荡发酵6d，得到发酵液；
(3)将得到的所述发酵液用滤纸过滤后，调节PH值至2后萃取2次，合并乙酸乙酯相，在旋蒸仪中40℃蒸干，用甲醇溶解；
(4)将所述甲醇溶解的样品上硅胶柱进行分离，将收集得到的各组分洗脱液浓缩至10mL，用于TLC检测；
(5)用硅胶板依次对每个组分进行TLC试验。
7.根据权利要求3所述鉴定、分离玫瑰黄链霉菌NKZ-259的次级代谢产物中存在IAA的方法，其特征在于：所述第三步中用HPLC法检测的步骤如下：
(1)将玫瑰黄链霉菌NKZ-259用无菌牙签涂布接种到MS培养基上，置于28℃、黑暗培养7天；
(2)将菌块接种到发酵培养基中，在温度为28℃，转速为200rpm的条件下震荡发酵6d，得到发酵液；
(3)将得到的所述发酵液用滤纸过滤后，调节PH值至2后萃取2次，合并乙酸乙酯相，在旋蒸仪中40℃蒸干，用甲醇溶解；
(4)将所述甲醇溶解的样品上硅胶柱进行分离，将收集得到的各组分洗脱液浓缩至10mL，将各组分用无菌滤膜过滤后用于HPLC检测。
8.权利要求3-7中的任一方法在鉴定IAA产生菌方面的应用。
9.权利要求3-7中的任一方法在开发和制造天然植物生长调节剂和微生物生物肥料中的应用。
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-
2018
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