CN1403571A - 麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA－2 CGMCCNO.0521及诱导方法 - Google Patents
麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA－2 CGMCCNO.0521及诱导方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及通过将农杆菌导入麻黄属植物，诱导麻黄属植物产生麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA－2 CGMCCNO.0521以及诱导方法。本发明诱导的麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA－2，已经于2000年12月11日保藏在中国微生物保藏中心。该麻黄冠瘿瘤细胞具有在含有少量激素的蔗糖琼脂培养基上，于23～32℃左右培养本菌株10～15天，麻黄冠瘿瘤细胞形态呈现不规则类球形团块状，表观为浅黄色至深绿色，直径在0.5～15毫米。本发明的诱导方法是以麻黄属植物，利用农杆菌Ti质粒作为载体，将外源基因导入麻黄属植物在培养液中诱导麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA－2 CGMCCNO.0521；所诱导的麻黄冠瘿瘤细胞可以在1.0～5.0％糖的培养基中进行继代培养，在23～32℃下培养5－60天，获得的麻黄冠瘿瘤细胞的增殖量为接种时的2～8倍，麻黄碱的含量为0.1～25wt％。
Description
技术领域
本发明涉及利用生物技术从麻黄属植物诱导麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO.0521。更具体地，本发明涉及通过将农杆菌导入麻黄属植物，诱导麻黄属植物产生麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO.0521及其诱导方法。
背景技术
麻黄植物中主要含有麻黄碱、伪麻黄碱、L-N甲基麻黄碱、d-N甲基伪麻黄碱、L-去甲基麻黄碱、d-去甲基伪麻黄碱等。麻黄草是一种常用中草药，具有发汗，平喘，祛风等作用。麻黄碱与肾上腺素一样能够兴奋交感神经，但麻黄碱可以口服，且作用时间长，此点为肾上腺素所不能。麻黄碱能使支气管扩张，鼻黏膜收缩，并使血压升高，临床用于特效治疗咳嗽、气喘、枯草热和百日咳等，并能减低月经痛病的疼痛，亦能作散瞳药物。
众所周知，在生物反应器内实现天然植物细胞培养是近年来生物技术研究的一个重要方向。然而迄今为止，反应器培养所产生的目标活性物质(如许多天然药用活性组分)含量还不高，为提高产量，植物学家做了大量的育种以及基因调控的研究，生化工程研究者则正在从培养工艺等方面寻找突破。
印度、美国和英国的研究人员通过麻黄植物诱导愈伤组织，利用麻黄细胞培养生产麻黄碱。研究了光照条件、改变培养基的各种成分和比例等外界条件对麻黄细胞生产麻黄碱的影响。麻黄细胞培养物中麻黄碱的含量为0.17～0.6％。
愈伤组织培养物是松散的，细胞组织颗粒的直径不等，大约在2～200μm，在利用细胞培养物生产次生代谢产物的过程中，特别在生物反应器内培养植物细胞生产代谢产物的过程中，培养液和细胞培养物不易分离。此外，愈伤组织培养物的生长和代谢产物的合成往往矛盾。
而一般冠瘿瘤细胞呈团块状，冠瘿瘤细胞组织颗粒直径较大。冠瘿瘤细胞内部有细胞或组织的分化，因此其产生次生代谢产物的能力要高于分散的细胞，同时这种组织又有较快的生长能力。
发明内容
本发明的目的在于通过麻黄植物诱导麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2CGMCC NO.0521；利用麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO.0521得到的培养物可以大幅提高生物量和培养物中麻黄碱的含量，目的之二是克服已有在生物反应器内培养植物细胞生产代谢产物的过程中，培养液和细胞培养物不易分离，愈伤组织培养物的生长和代谢产物的合成往往矛盾的缺点，从而提供一种麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO.0521及其诱导的方法。
本发明提供的麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2已于2000年12月11日保藏在中国微生物保藏中心(其简称为CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.0521。
麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO.0521的微生物特性：
(1)麻黄冠瘿瘤细胞的生态特征
在含有少量激素的蔗糖琼脂培养基上，于23～32℃左右培养本菌株10～15天，麻黄冠瘿瘤细胞形态呈现不规则类球形团块状，表观为浅黄色至深绿色，直径在0.5～15毫米。
(2)生理生化特征
麻黄冠瘿瘤细胞的生长可以利用多种糖原，合适的培养温度为23～32℃，高于40℃细胞组织生长缓慢直至死亡；合适的生长pH值为5.0～6.0；麻黄冠瘿瘤细胞组织内部有一定的组织分化结构。在光照和无光照的条件下均可以生产麻黄碱。过氧化物同工酶是麻黄冠瘿瘤细胞生长的活性标志，苯丙氨酸转氨酶是合成麻黄碱的关键酶，其与麻黄碱的合成成正比关系。
本发明提供了利用外源基因导入麻黄属植物细胞，产生麻黄冠瘿瘤细胞的方法。本发明中所用的麻黄属植物有：木贼麻黄Ephedra equisetina Bunge，草麻黄Ephedra sinica Stapf，中麻黄Ephedra intermedia Schrenk，膜果麻黄Ephedraprzewalskii Stapf；木麻黄Casuarina Adans，以及单子麻黄，蓝枝麻黄，双穗麻黄，细子麻黄等。
本发明利用农杆菌Ti质粒作为载体，将外源基因导入麻黄属植物诱导麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO.0521的步骤按如下顺序进行：
(1)将麻黄属植株用洗涤剂溶液洗净，蒸馏水冲洗三遍；再用消毒剂灭菌10～30分钟，用已灭菌的蒸馏水洗净，得到灭菌的麻黄属植株；所述的消毒剂如：1-5％次氯酸钠或10～15％双氧水(按体积比计)，或0.1～1.0％升汞水溶液(按重量/体积比计)；
(2)将上述步骤(1)已灭菌的麻黄属植株切成0.3～1.0厘米长短，放入装有已经稀释5～20倍(OD600为0.6～0.8)的农杆菌的培养液的摇瓶中，将摇瓶放在转速为150rpm摇床上共同培养5～60分钟，培养温度为23～32℃，得到被农杆菌感染的麻黄属植株；
(3)将上述步骤(2)的被农杆菌感染的麻黄属植株放在含有0.5～5.0wt％抗生素的培养基中培养5～20天，培养温度为23～32℃，麻黄属植株上逐渐生长出麻黄冠瘿瘤细胞；所述的抗生素包括羟苄青霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素等；
(4)将上述步骤(3)所获得的麻黄冠瘿瘤细胞从其生长的植株上切下，转移至新配制的步骤(3)的培养基中培养10～20天，培养温度为23～32℃，得到继代培养的麻黄冠瘿瘤细胞；
为了提高麻黄碱的含量，还可以包括以下的继续培养方法：
将上述步骤(4)所获得的麻黄冠瘿瘤细胞放在步骤(3)的培养基中连续培养10～60天，培养温度为23～32℃，得到含有麻黄碱0.1～25wt％的麻黄冠瘿瘤细胞培养物。
其中所述的培养麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 0521的培养基(步骤(3)-(5)所用的培养基)组成如下：
| 硝酸钾 | 1～20mmol/L | 维生素C | 0.01～0.5mmol/L |
| 磷酸二氢钠 | 0.5～3.0mmol/L | 维生素B12 | 0.01～10mmol/L |
| 硫酸镁 | 1.0～5.0mmol/L | 烟酸 | 0.1～10mmol/L |
| 硼酸钠 | 0.001～0.0075mmol/L | 盐酸吡哆醇 | 0.01～2.0mmol/L |
| 硫酸钠 | 0.5～4.0mmol/L | 6-盐酸硫胺素 | 0.01～2.0mmol/L |
| 氯化钙 | 0.3～5.0mmol/L | 6-糠氨基腺嘌呤 | 0.01～0.5mmol/L |
| 硫酸锌 | 0.01～0.5mmol/L | 吲哚乙酸 | 0.01～0.1mmol/L |
| 硫酸铜 | 0.001～0.2mmol/L | 2，4-二氯苯氧乙酸 | 0.01～0.6mmol/L |
| 乙二胺四乙酸钠铁 | 0.1～3.5mmol/L | 葡萄糖 | 0.5～5.0％ |
| 氯化钴 | 0.001～0.2mmol/L | 蔗糖 | 0.5～5.0％ |
为了提高麻黄冠瘿瘤细胞培养过程中生物量和麻黄碱的含量，还可以在所述的培养麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 0521的培养基中加入0.1～100mmol/L苯丙氨酸。
为了提高麻黄冠瘿瘤细胞培养过程中生物量和麻黄碱的含量，还可以在所述的培养麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 0521的培养基中加入0.01～150mmol/L甲酸钠。
为了提高麻黄冠瘿瘤细胞培养过程中生物量和麻黄碱的含量，还可以在所述的培养麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 0521的培养基中加入0.1～50mmol/L丝氨酸。
为了提高麻黄冠瘿瘤细胞培养过程中生物量和麻黄碱的含量，还可以在所述的培养麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 0521的培养基中加入0.05～150mmol/L甲硫氨酸。
为了提高麻黄冠瘿瘤细胞培养过程中生物量和麻黄碱的含量，还可以在所述的培养麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 0521的培养基中加0.01～200mmol/L酪氨酸。
为了提高麻黄冠瘿瘤细胞培养过程中生物量和麻黄碱的含量，还可以在所述的培养麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 0521的培养基中加入0.025～250mmol/L色氨酸。
为了提高麻黄冠瘿瘤细胞培养过程中生物量和麻黄碱的含量，还可以在所述的培养麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 0521的培养基中加入1.0～50％体积比真菌发酵液。
为了提高麻黄冠瘿瘤细胞培养过程中生物量和麻黄碱的含量，(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 0521，还可以在所述的培养麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 0521的培养基中加入0.01～300mmol/L苯甲酸。
本发明的优点在于：本发明利用农杆菌Ti质粒作为载体，将外源基因导入麻黄属植物，产生麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 0521。所得的产物是麻黄冠瘿瘤细胞是一种类球形的细胞团体，直径一般在5～15毫米，远大于一般的植物愈伤组织细胞，在悬浮培养时，培养液是澄清的，麻黄冠瘿瘤细胞容易与培养液分离。而且麻黄冠瘿瘤细胞内部有细胞或组织的分化，有较快的生长能力。导入外源基因，改变了细胞中麻黄碱的代谢途径，因此其产生次生代谢产物的能力要高于愈伤组织细胞，解决了细胞生长和代谢产物合成的矛盾。以进一步提高麻黄碱在细胞代谢过程中的生产能力和产率，便于在生物反应器中培养生产麻黄碱。
本发明的诱导方法优化细胞的生长条件，经过代谢调控，获得高产麻黄碱的麻黄冠瘿瘤细胞系，麻黄冠瘿瘤细胞的增殖量为继代时的2～8倍，麻黄碱的含量为0.1～25.0wt％；该麻黄冠瘿瘤细胞能够进行工业化生产，为生产麻黄碱提供了一种新的原料途径。
具体实施方式
实施例1
麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 0521，按以下步骤进行诱导：
1)木贼麻黄或草麻黄属植株用洗涤剂溶液洗净，蒸馏水冲洗三遍；用2％(重量/体积)次氯酸钠灭菌30分钟，用已灭菌的蒸馏水洗净，切成为0.5厘米长短，得到灭菌的麻黄属植株；
2)将已灭菌的麻黄属植株，与已稀释了20倍的OD600为0.6的农杆菌培养液共同培养30分钟，培养温度为25℃，得到感染农杆菌的麻黄属植株；
3)将上述步骤2已感染农杆菌的植株放在含有2Wt％卡那霉素的生长培养基中培养15天，培养温度为25℃，植株上逐渐生长出麻黄冠瘿瘤细胞；
4)将上述所得到的麻黄冠瘿瘤细胞从其生长的植株上切下，转移至新配制的培养基中培养15天，培养温度为25℃，得到继代培养的麻黄冠瘿瘤细胞；
5)将上述所得到的麻黄冠瘿瘤细胞连续培养60天，培养温度为25℃，得到含有麻黄碱0.1～25wt％的麻黄冠瘿瘤细胞培养物。
实施例1中所用的培养麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 0521的培养基组成：
| 硝酸钾 | 5mmol/L | 维生素C | 0.01mmol/L |
| 磷酸二氢钠 | 0.5mmol/L | 维生素B12 | 0.02mmol/L |
| 硫酸镁 | 1.25mmol/L | 烟酸 | 0.1mmol/L |
| 硼酸钠 | 0.001mmol/L | 盐酸吡哆醇 | 0.025mmol/L |
| 硫酸钠 | 0.5mmol/L | 盐酸硫胺素 | 0.025mmol/L |
| 氯化钙 | 0.3mmol/L | 6-糠氨基腺嘌呤 | 0.01mmol/L |
| 硫酸锌 | 0.1mmol/L | 吲哚乙酸 | 0.01mmol/L |
| 硫酸铜 | 0.0025mmol/L | 2，4-二氯苯氧乙酸 | 0.02mmol/L |
| 乙二胺四乙酸钠铁 | 0.1mmol/L | 葡萄糖 | 0.5％ |
| 氯化钴 | 0.0025mmol/L | 蔗糖 | 3.0％ |
实施例2，3，4，5，6，7和例8
实施例2-8中所培养的麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO.0521与诱导过程以及诱导的条件与实施例1相同，但所用的麻黄植物可分列为：木贼麻黄、草麻黄、中麻黄、膜果麻黄、木麻黄、单子麻黄、蓝枝麻黄、双穗麻黄、细子麻黄，麻黄冠瘿瘤细胞诱导的培养基组成不同，培养基组成列表如下：
实施例9，10，11，12，13，14，15和16中所培养的麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO.0521与实施例1相同，并且，麻黄冠瘿瘤细胞由麻黄属植株的诱导过程以及诱导的条件与实施例1所述的也相同，但麻黄冠瘿瘤细胞诱导的培养基的组成不同，所述如下：
实施例9
在实施例1的方法基础上，还将培养基的组成中再加入40mmol/L苯丙氨酸。由于加入苯丙氨酸，提高了麻黄冠瘿瘤细胞的诱导率和麻黄碱的生产率。
实施例10
在实施例9的基础上，还将培养基的组成中再加入1.0mmol/L甲酸钠。由于加入甲酸钠，提高了麻黄冠瘿瘤细胞的诱导率和麻黄碱的生产率。
实施例11
在实施例10的基础上，还将培养基的组成中再加入5.0mmol/L丝氨酸。由于加入丝氨酸，提高了麻黄冠瘿瘤细胞的诱导率和麻黄碱的生产率。
实施例12
在实施例11的基础上，还将培养基的组成中再加入30.0mmol/L甲硫氨酸。由于加入甲硫氨酸，提高了麻黄冠瘿瘤细胞的诱导率和麻黄碱的生产率。
实施例13
在实施例12的基础上，还将培养基的组成中再加入8.5mmol/L色氨酸。由于加入色氨酸，提高了麻黄冠瘿瘤细胞的诱导率和麻黄碱的生产率。
实施例14
在实施例13的基础上，还将培养基的组成中再加入22.5mmol/L酪氨酸。由于加入酪氨酸，提高了麻黄冠瘿瘤细胞的诱导率和麻黄碱的生产率。
实施例15
在实施例14的基础上，还将培养基的组成中再加入5.6％体积比真菌发酵液。由于加入真菌发酵液，提高了麻黄冠瘿瘤细胞的诱导率和麻黄碱的生产率。
实施例16
在实施例15的基础上，还将培养基的组成中再加入2.0mmol/L苯甲酸。由于加入苯甲酸，提高了麻黄冠瘿瘤细胞的诱导率和麻黄碱的生产率。
Claims (14)
1.一种麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 0521，该麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 0521具有以下微生物特性：
(1)麻黄冠瘿瘤细胞的生态特征：
在含有少量激素的蔗糖琼脂培养基上，于23～32℃左右培养本菌株10～15天，麻黄冠瘿瘤细胞形态呈现不规则类球形团块状，表观为浅黄色至深绿色，直径在0.5～15毫米；
(2)生理生化特征：
麻黄冠瘿瘤细胞的生长可以利用多种糖原，培养温度为23～32℃，高于40℃细胞组织生长缓慢直至死亡；合适的生长pH为5.0～6.0；麻黄冠瘿瘤细胞组织内部有一定的组织分化结构；在光照和无光照的条件下均可以生产麻黄碱；过氧化物同工酶是麻黄冠瘿瘤细胞生长的活性标志，苯丙氨酸转氨酶是合成麻黄碱的关键酶，其与麻黄碱的合成成正比关系。
2.一种权利要求1所述的麻黄冠瘿瘤细胞(Ephedra)ZHA-2 CGMCC NO 05的诱导方法，其特征是：包括下列步骤：
(1)将麻黄属植株用洗涤剂溶液洗净，蒸馏水冲洗三遍；再用消毒液灭菌10～30分钟，用已灭菌的蒸馏水洗净，得到灭菌的麻黄属植株；
(2)将步骤(1)得到的已灭菌的麻黄属植株切成0.3～1.0厘米长短，与已稀释5～20倍的农杆菌培养液放在转速为150rpm的摇瓶中共同培养5～60分钟，培养温度为23～32℃，得到被农杆菌感染的麻黄属植株；
(3)将步骤(2)所得到的被感染的麻黄属植株放在含有0.5～5.0wt％抗生素的培养基中培养5～20天，培养温度为23～32℃，麻黄属植株上逐渐生长出麻黄冠瘿瘤细胞；
(4)将步骤(3)所获得的麻黄冠瘿瘤细胞从其生长的植株上切下，转移至新配制的培养基中培养10～20天，培养温度为23～32℃，得到继代培养的麻黄冠瘿瘤细胞。
3.根据权利要求2所述的诱导方法，其特征是：还包括采用进行继续培养步骤：将权利要求1所得麻黄冠瘿瘤细胞放在权利要求2的步骤(3)的培养基中，在培养温度为23～32℃下，连续培养10～60天；
4.根据权利要求2所述的诱导方法，其特征是：所述的消毒液包括：1-5％次氯酸钠或10～15％双氧水，以体积百分比计，或0.1～1.0％升汞水溶液，按重量/体积百分比计。
5.根据权利要求2或3所述的诱导方法，其特征是：所述的麻黄冠瘿瘤细胞培养基的组成如下：硝酸钾 1～20mmol/L 维生素C 0.01～0.5mmol/L磷酸二氢钠 0.5～3.0mmol/L 维生素B12 0.1～10mmol/L硫酸镁 1.0～5.0mmol/L 烟酸 0.1～10mmol/L硼酸钠 0.001～0.0075mmol/L 盐酸吡哆醇 0.01～2.0mmol/L硫酸钠 0.5～4.0mmol/L 盐酸硫胺素 0.01～2.0mmol/L氯化钙 0.3～5.0mmol/L 6-糠氨基腺嘌呤 0.01～0.5mmol/L硫酸锌 0.01～0.5mmol/L 吲哚乙酸 0.01～0.1mmol/L硫酸铜 0.001～0.2mmol/L 2，4-二氯苯氧乙酸 0.01～0.6mmol/L乙二胺四乙酸钠铁 0.1～3.5mmol/L 葡萄糖 0.5～5.0％氯化钴 0.001～0.2mmol/L 蔗糖 0.5～5.0％
6.根据权利要求4所述的诱导方法，其特征是：所述的培养基中加入的抗生素包括：羟苄青霉素、氯霉素或硫酸卡那霉素；
7.根据权利要求5所述的诱导方法，其特征是：所述的培养基中还加入0.1～100mmol/L苯丙氨酸。
8.根据权利要求6所述的诱导方法，其特征是：所述的培养基中还加入0.01～150mmol/L甲酸钠。
9.根据权利要求7所述的诱导方法，其特征是：所述的培养基中还加入0.1～50mmol/L丝氨酸。
10.根据权利要求8所述的诱导方法，其特征是：所述的培养基中还加入0.05～150mmol/L甲硫氨酸。
11.根据权利要求9所述的诱导方法，其特征是：所述的培养基中还加入0.025～250mmol/L色氨酸。
12.根据权利要求10所述的诱导方法，其特征是：所述的培养基中还加入0.01～200mmol/L酪氨酸。
13.根据权利要求11所述的诱导方法，其特征是：所述的培养基中还加入1.0～50体积％真菌发酵液。
14.根据权利要求12所述的诱导方法，其特征是：所述的培养基中还加入0.01～300mmol/L苯甲酸。
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